（微生物学专业论文）中国香菇自然种质遗传多样性srap和igs2分析.pdf

黝y 1 黝7 9 黼9 栅8 9 缈 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：导岛 时间： 和年 占月夕日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书 靴做储摊：关拓 别醛名吨鲋莎 签名日期： 伽f 。年6 月罗日签名日期：沙i 。年f 月l 。日 摘要 a b s t r a c t 英文缩略表 1 前言 1 1 香菇 1 1 1 1 1 2 1 2 分子 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 2 4 1 2 5 1 2 6 1 3d n a 1 4 分子 1 4 1 1 4 2 1 4 3 1 4 4 1 5 本研 2 材料和方法1 4 2 1 试验材料1 4 2 1 1 供试菌株1 4 2 1 2 供试培养基15 2 1 3 供试试剂16 2 1 4 试验所用仪器设备l9 2 2 试验方法2 0 2 2 1 香菇基因组d n a 的提取2 0 华中农业大学2 0 10 届硕士研究生学位论文 2 2 2s r a p 反应体系正交设计优化及反应程序2 0 2 2 3p a g e 电泳及银染操作步骤2 1 2 2 4i g s 2 p c r 、i g s 2 r f l p 及克隆i g s 2 片段测序试验方法2 3 2 2 5 数据分析2 6 2 2 6 野生香菇菌株出菇试验2 7 3 结果与分析2 8 3 1s r a p 遗传多样性分析2 8 3 1 1 香菇基因组d n a 的提取2 8 3 1 2s r a p p c r 体系的优化2 8 3 1 3 反应体系稳定性检测2 9 3 1 4s r a p 引物筛选2 9 3 1 5d n a 扩增产物的多态性3 0 3 1 6 试验材料的遗传相似性分析3 1 3 1 7 聚类分析3 2 3 2 中国香菇野生菌株的i g s 2 r f l p 分析及i g s 2 序列分析3 6 3 2 1 。i g s 2 p c r 体系优化及结果分析3 6 3 2 2i g s 2 一i 心l p 结果分析3 7 3 2 3i g s 2 测序结果分析3 8 3 3 野生香菇菌株栽培试验4 0 3 3 1 栽培袋菌丝生长速度测定4 0 3 3 2 转色及现蕾4 0 3 - 3 3 农艺性状方差分析4 1 3 3 4 不出菇菌丝形态及原因4 6 3 3 5 香菇形态描述与出菇菌株子实体照片4 7 4 讨论：4 9 4 1 中国野生香菇菌株的遗传多样性s r a p 分析4 9 4 2 中国野生香菇菌株i g s 2 r f l p 遗传多样性及i g s 2 序列分析。5 0 4 3 中国野生香菇菌株栽培特性分析。5 0 参考文献5 2 致谢。5 8 附录i g s 2 序列5 9 中国香菇自然种质资源多样性s r a p 和i g s 2 分析 摘要 采用s r a p 技术对分布在中国9 个省份的5 3 个香菇野生菌株进行了遗传多样性分 析。选用1 1 对s r a p 引物共扩增出4 9 1 条d n a 带，其中9 5 7 的条带具有多态性，供 试菌株在d n a 遗传相似性系数上的差异表明中国香菇自然群体遗传多样性丰富，其 中横断山脉和云南高原菌株多样性尤其丰富。用平均连锁聚类法构建了样本的遗传 相关聚类图，大多数来自同一区域或相邻区域的菌株优先聚成小类，表明菌株的分 组与其地理来源明显相关。根据u p g m a 聚类结果，以0 7 7 的相似性为切割点，供试 菌株可以分为2 大类群类群a 和类群b ，其中a 类群还可以分为2 个亚类：亚类a l 和亚 类a 2 。类群a 中，亚类a 1 主要由9 个西北地区和2 个东北地区的菌株，以及1 个华中地 区和1 个云南高原的菌株组成；亚类a 2 主要由西北地区的5 个菌株和华中地区的1 3 个 菌株组成；类群a 还包括2 个西北地区的菌株和2 个横断山脉的菌株；类群b 主要是由 分布在云南高原的l o 个、横断山脉的6 个以及台湾的菌株组成。 采用i g s 2 r f l p 技术对5 3 个野生香菇菌株进行了遗传多样性分析，以0 7 1 相似性 为切割点，可以将5 3 个菌株分为4 个类群，大部分同一地区的菌株聚为一类群。第一 类群构成比较复杂，其中包括东北地区的全部菌株，大部分云南地区的菌株，湖北 地区的3 个菌株，陕西的2 个菌株和台湾的菌株；第二个类群由陕、甘、川、云四个 地区的菌株组成；第三类群主要由湖北、湖南等地区的菌株组成，还包括个别四川、 云南和山西的菌株；第四类群包括湖北和陕西的菌株和1 个四川的菌株。 对8 个菌株的i g s 2 扩增片段切胶回收克隆并测序，结果表明香菇i g s 2 序列中的 s r 2 区域由5 种亚重复单位组成，亚重复单位又由6 种重复元件组成。s r 2 中亚重复单 位的数量不同造成了i g s 2 长度异质性。 对5 3 个野生香菇菌株进行了代料栽培出菇试验，其中1 4 个菌株正常出菇，经方 差分析检测农艺性状差异，认为野生菌株之间的平均单袋产量、菌盖直径、菌盖厚 度以及平均单菇重的菌株间差异较大。本试验为利用香菇野生资源改良现有栽培菌 株提供了重要的试验依据。 关键词：香菇，种质资源，s r a p ，i g s 2 ，r f l p ，序列分析，遗传多样性，方差分 析，农艺性状 本课题由国家科技支撑计划( 2 0 0 8 b a d a l b 0 2 ) 、公益性行业科技专项( n y n y z x 0 7 - 0 0 8 ) 及湖北省自然科学基金重点项目( 2 0 0 9 c a d l 0 9 ) 资助。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 a bs t r a c t i nt h i ss t u d y , s r a pm a r k e r sw e r eu t i l i z e dt or e v e a lt h eg e n e t i cd i v e r s i t yo f 5 3s t r a i n s o fl e n t i n u l ae d o d e sg r o w ni nc h i n a , w h i c hc o l l e c t e df r o m9p r o v i n c e s at o t a lo f 4 9 1 d n ab a n d sw e r ed e t e c t e dt h r o u g h 11 p r i m e rp a i r s ，o fw h i c h ，9 5 7 b a n d sw e r e p o l y m o r p h i c t h ev a r i a t i o n so fd n as i m i l a r i t ya m o n g t h es t r a i n sr e v e a lt h a tt h e r ei sg r e a t g e n e t i cd i v e r s i t yi nt h en a t u r a lg e r m p l a s mo fl e n t i n u l ae d o d e si nc h i n a a c c o r d i n gt o u p g m ac l u s t e r i n g ，t h e5 3s t r a i n sw e r ec l a s s i f i e di n t o2g r o u p s ，a n d2g r o u p sa l s o c l a s s i f i e di n t o2s u b g r o u p s g r o u pa im a i n l yc o n s i s t e do fs t r a i n si nt h en o r t h w e s tc h i n a a n dn o r t h e a s tc h i n a ；g r o u pa 2m a i n l yc o n s i s t e do fs t r a i n si nt h en o r t h w e s tc h i n aa n d c e n t r a lc h i n a , w h i l eg r o u pbc o m p r i s e dt h es t r a i n so fy u n n a np l a t e a u ，h e n g d u a n s h a n m o u n t a i n sa n dt a i w a n t h ep r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i sa l s oc l a s s i f i e dt h es t r a i n si n t o3 g r o u p s ，s u p p o r tt h eu p g m a c l u s t e r i n gr e s u l t s f i 御t h r e ew i l ds t r a i n so fl e n t i n u l ae d o d e sw e r ea s s e s s e df o rd n ap o l y m o r p h i s m u s i n gi g s 2 r f l pt e c h n i q u e a c c o r d i n g t ou p g m ac l u s t e r i n g ，t h e5 3s t r a i n sw e r e c l a s s i f i e di n t o4g r o u p s ，g r o u pa l m a i n l yc o n s i s t e do fs t r a i n si nt h ey u n n a na n dn o r t h e a s t c h i n a , g r o u pi im a i n l yc o n s i s t e do fs t r a i n si nt h es o u t h w e s tc h i n a , g r o u pi i ic o m p r i s e d t h es t r a i n so fc e n t r a lc h i n a , w h i l eg r o u pi vc o n s i s t e do fs t r a i n si nh u b e ia n ds h a n x i i g s 2f r a g m e n t so f9s t r a i n sw e r ee x c i s e df r o ma g a r o s eg e l ，c l o n e da n ds e q u e n c e d t h er e s u l t sd i s p l a y e dt h a tt h es r 2w a sc o m p o s e do ff i v et y p eo fs u b r e a p t s ，a n dt h e s u b r e a p tw a sc o m p o s e do fs i xt y p eo f s h o r tr e p e a te l e m e n t s t h eh e t e r o g e n e o u sl e n g t h so f i g s 2a r ec a u s e dm a i n l yb yt h en u m b e ro fd i f f e r e n tt y p e so fs u b r e p e a t sw i t h i ns r 2 t h ef i f t y t h r e es t r a i n sw e r ec u l t i v a t e dw i t hs u b s t i t u t em a t e r i a l so ns a w d u s t , a n dt h e f r u i t b o d i e sw e r es u c c e s s f u l l yp r o d u c e db y l4s t r a i n s t h er e s u l t so fv a r i a n c ea n a l y s i s s h o w e dt h e i ra g r o n o m i cc h a r a c t e r s ，e x p e c i a l l yf o ra v e r a g ef r u i t b o d yw e i g h t , p i l e u s t h i c k n e s s ，p i l e u sd i a m e t e ra n da v e r a g ef r u i t b o d yw e i g h tp e rb a g , a r ed i f f e r e n t t h i ss t u d y c o u l db eh e l p f u lf o rh y b r i db e t w e e nw i l da n dm a s sp r o d u c t i o ns t r a i n s k e y w o r d ：l e n t i n u l ae d o d e s ，g e r m p l a s m ，s r a p , i g s 2 ，r f l p , s e q u e n c ea n a l y s i s ，g e n e t i c d i v e r s i t y , v a r i a n c ea n a l y s i s ，a g r o n o m i cc h a r a c t e r 2 中国香菇自然种质资源多样性s r a p 和i g s 2 分析 英文缩写 a f l p a m p a _ p p c r b p c t a b d n a e b e d t a e s t i g s i s s r i t s m r n a m t d n a p c r r a p d r d a r d n a i 沛l p r p m r p p c r 删a s a g e s c a r s n p s r s s s l p s s r s t s t r i s 英文缩略表 英文全称 a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a m p i c i l l i n a r b i t r a r i l yp r i m e dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n b a s ep a i r c e t y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e d e o x y r i b o nt t l e i ca c i d e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et i e t r a a c e t i ca c i d e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s i n t e r g e n i cs p a c e r i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r m e s s e n g e rr n a m i t o c h o n d r i a ld n a p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s r i b o s o m e ld n a r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m r o t a t i o np e rm i n u t e r a n d o mp r i m e rp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i b o s o m e lr n a s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s h o r tr e p e a ts e q u e n c e s i m p l es e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m s i m p l es e q u e n c er e p e a t s e q u e n c et a g g e ds i t e 嘶s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 3 中文名称 扩增片段长度多态性 氨苄青霉素 任意引物聚合酶链反应 碱基对 十六烷基三甲基溴化铵 脱氧核糖核酸 溴化乙锭 二乙胺四乙酸 表达序列标签 基因间隔区 简单重复序列区间 内转录间隔区 信使核糖核酸 线粒体基因 聚合酶链反应 随机扩增多态性脱氧核 苷酸 特征性差异分析 核糖体脱氧核苷酸 限制性片段长度多态法 每分钟转数 随机引物聚合酶链反应 核糖体核糖核酸 基因表达系列分析技术 特征性片段扩增区域 单核苷酸多态性 短重复序列 简单序列长度多态性 简单重复序列 序列标签位点 三羟甲基氨基甲烷 中国香菇自然种质资源多样性$ r a p 和i g s 2 分析 l 刖吾 1 1 香菇概述 香菇( l e n t i n u l ae d o d e s ( b e r k ) p e g l e r ) ( 佩格勒等，1 9 9 3 ) 隶属于担子菌亚门 ( b a s i d i o m y c o t i n a ) ，层菌纲( h y m e n o m y c e t e s ) ，伞菌目( a g a r i c a l e s ) ，口蘑科 ( t r i c o l o m a t a c e a e ) ，香菇属( l e n t i n u l a ) ( 张树庭等，1 9 9 2 ) 。香菇子实体单生、丛生或 群生。表面茶褐色，有深色鳞片。菌肉厚实，白色，有韧性。它是一种木腐菌，主 要腐生在壳斗科、桦木科和金缕梅科的阔叶树的倒木上( 杨新美等，1 9 9 6 ) 。其野生 自然分布很广，其分布受环境条件和自身生长条件的限制。以亚洲东南部为主，主 要分布于中国、朝鲜、日本、菲律宾、印度尼西亚、新西兰、泰国等国。在我国主 要分布于云南、贵州、四川、福建、湖北、江西、广西、广东、安徽、陕西等地( 杨 新美等，1 9 8 8 ) ，分布十分广泛。 1 1 1 香菇生活史及其食药用功效 香菇是典型的异宗结合担子菌，担孢子萌发产生的不同交配型的可亲和单核菌 丝通过结合进行质配，产生具有锁状联合的次生双核菌丝。在适当环境下，该菌丝 可扭结形成子实体。在子实体形成过程中，双核体中两个不同交配型的细胞核发生 核配，形成双倍体合子，然后进行减数分裂，形成4 个单倍体的单核担孢子，从而 完成整个生活史。在自然界中，香菇以有性及无性繁殖的方式来繁衍后代，远距离 传播则以有性繁殖为主，有性繁殖过程中，环境中诱变因素引起的遗传物质结构的 改变以及遗传物质的重组，导致了物种的遗传变异。 香菇是世界上产量仅次于双孢蘑菇( a g a r i c u sb i s p o r u s ) 的第二大栽培食用菌，其 药用、食用价值极高，在古代，香菇被列为“山珍”之一。我国不少古籍中记载香菇“益 气不饥，治风破血和益胃助食”。大量实践证明，香菇防治癌症的范围广泛，已用于 临床治疗。香菇多糖能提高辅助性t 细胞的活力而增强人体体液免疫功能。香菇还 含有多种维生素、矿物质，对促进人体新陈代谢，提高机体适应力有很大作用。香 菇含有水溶性鲜味物质，可用作食品调味品。 1 1 2 香菇遗传育种方法 我国是最早进行香菇栽培的国家，已有八百多年的栽培历史。2 0 世纪3 0 年代 以前，香菇栽培主要是砍花法，利用自然界中的孢子进行自然接种，尚没有菌种的 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 概念( 张寿成，1 9 9 3 ；潘迎捷，1 9 9 8 ) 。2 0 世纪3 0 年代，日本率先得到了香菇纯菌种， 为后来香菇的商业化生产奠定了基础。到目前为止，香菇育种方法大致包括人工选 择育种、诱变育种、原生质体融合育种、杂交育种和基因工程育种。 人工选择育种是采用人工方法定向选择自然条件下发生的有益变异，并不断积 累利用，获得人类需要的新品种。人工选择育种是各种育种方法的基础，是初期选 育优良品种简单而有效的方法之一。优良香菇品种7 4 0 1 、7 4 0 2 、7 4 0 5 、广香5 、7 、 9 号、2 4 1 和8 2 1 0 等均是通过人工选择法筛选得到的( 吴学谦，2 0 0 5 ) 。 诱变育种是通过物理和化学诱变方法，使香菇菌丝部分细胞的遗传物质发生改 变，从而引起遗传性状的变异，然后从中选出具有优良性状的香菇新菌株。目前在 香菇中使用的诱变育种主要是以菌丝片段和原生质体为诱变材料，梁枝荣等( 2 0 0 1 ) 和邵伟等研究者( 2 0 0 4 ) 通过紫外线和太空辐射( 边银丙等，2 0 0 1 ) 的方法，使食用菌生 理生化和遗传特性发生变化进行新品种的选育。 原生质体融合是7 0 年代发展起来的新技术，它是指通过脱壁后的不同遗传类型 的原生质体，在融合剂的诱导下融合，最终达到部分或整套基因组的交换和重组， 产生新的品种和类型。原生质体融合技术是在细胞水平上使亲缘关系较远的不同种 。属间物种的遗传物质进行交换，扩大了遗传物质交流的范围，增加了变异创造的途 径和选择范围。但属间融合子稳定性差以及生产性能差，在短时间内要获得突破有 一定的难度( 付立忠等，2 0 0 5 ) 。 杂交育种是通过基因的自由组合、交换或其他方式产生不同于亲本基因组合的 过程，它着眼于双亲性状的优势互补或借助于一个亲本的优点去克服另一亲本的缺 点。福建三明真菌研究所蔡衍山等( 2 0 0 0 ) 选育的c r 系列即是由杂交育种选育出的香 菇代料主栽品种。 基因工程育种在食用菌中主要包括以下两个方面的应用：一是利用食用菌作为 新的基因工程的受体菌，生产人们所期望的外源基因编码的产品。二是利用基因工 程技术定向培育食用菌新品种，包括抗虫、抗病的新品种，以及将编码纤维素或木 质素降解酶基因导入食用菌基因内，以提高食用菌菌丝体对栽培基质的利用率或开 拓新的栽培基质，最终提高食用菌产量和质量( 王丕武，2 0 0 1 ) 。 1 2 分子标记技术的研究 分子标记( d n am o l e c u l a rm a r k e r s ) 是以个体间的遗传物质核苷酸序列的变异为 6 中国香菇自然种质资源多样性s r a p 和i g s 2 分析 基础的遗传标记。与形态学标记、细胞学标记和生化标记等相比，分子标记以其显 著的优势广泛应用于动植物遗传育种、连锁图谱的构建、基因定位与克隆、物种鉴 定、居群遗传学与系统进化发育等诸多方面。目前已开发出数十种分子标记，分子 标记在食用菌中的应用起步较晚，其中r f l p 、r a p d 和r d n a 应用的研究报道居多。 d n a 分子标记具有以下特点( 1 ) 具有较强的多态性；( 2 ) 直接以d n a 为表现形式， 不受环境和季节限制，不受个体发育阶段的影响，不存在基因表达与否的问题，没 有组织及器官特异性；( 3 ) 许多分子标记表现为共显性；( 4 ) 数量的丰富性；( 5 ) 表 现为“中性”( 既无基因多效性) ；( 6 ) 经济方便和易于观察记录( 王晓梅等，2 0 0 0 ) 。 1 2 1r f l p 标记 r f l p 标记作为以s o u t h e r n 杂交为核心的第一代分子标记的代表性技术，是于 1 9 7 4 年由g r o d z i c k e r 等创建，8 0 年代中期发展起来的一种分子标记。r f l p 是由于 d n a 中限制性内切酶酶切识别序列中出现碱基的变异而导致酶切位点的增减所引 起的限制性片段长度的差异。基本原理是：将d n a 用已知的限制性内切酶消化后， 产生大小不等的d n a 片段，电泳分离、s o u t h e r n 印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射 性标记探针与膜上变性d n a 杂交，放射自显影，显示出不同材料的多态性图谱。r f l p 具有以下优点：( 1 ) 变异丰富；( 2 ) 比形态学变异更稳定；( 3 ) 比生化变异范围更广；( 4 ) 无显隐性之分，均为共显性，非等位基因间无上位效应；( 5 ) r f l p 是直接研究基因的 构成，而其他变异均是从表型或基因作用产物来研究遗传和变异的；( 6 ) 构建连锁图 时要比传统的方法快；( 7 ) 可探测到数量性状基因位点( 周洪生，1 9 9 2 ) 。 1 2 2r a p d 标记 r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i ed n a ，d n a 随机扩增多态性) 是由 w i l l i a m s 和w e l s h 等人创立的一种分子标记，是建立在p c r 基础上的一种可对整个 未知序列的基因组进行多态性分析的d n a 分子标记技术。以样品d n a 为模板，以 一个1 0 个左右碱基人工合成的随机寡核苷酸序列为引物，通过p c r 非定点扩增d n a 片段，用凝胶电泳分析扩增产物d n a 片段的多态性( w i l l i a m se ta l ，1 9 9 0 ；w e l s ha n d m c c l e l l a n d ，1 9 9 0 ) 。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一个随机引 物单独进行p c r ，单- 7 1 物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。 r a p d 具有技术简单、检测迅速、灵敏度高、特异性强、检测容易、d n a 样品用量 少的特点，但r a p d 为显性遗传，不能提供完整的遗传信息，无法鉴别纯合子和杂 合子的差异，并且重复性较差。可能有假带出现，给实验结果分析带来困难( 张日清， 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 2 0 0 1 ) n - i 将r a p d 转化y 寸s c a r 标记，s c a r 通常为显性标记，通过转化可以增加 r a p d 标记的稳定性和信息量。 1 2 3i s s r 标记 随机引物标记一s s r 是由z i e t k i e w i c z 等1 9 9 4 年创建的种简单重复序列间 扩增多态性分子标记( z i e t k i e w i c ze ta 1 ，1 9 9 4 ) 。该标记利用植物基因组中广泛存在的 微卫星序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 设计引物，通常引物长度为1 6 - 1 8b p ， 由1 - 4b p 组成的串联重复序列和几个非重复序列的锚定碱基组成，使引物与基因组 d n a 中s s r 的5 或3 末端结合，对两侧具有反向排列s s r 的一段d n a 序列进行 扩增。i s s r 标记具有如下特点：( 1 ) 直接利用s s r 对基因组d n a 进行p c r 扩增， 适用于任何物种，可同时提供多位点信息，并揭示不同s s r 位点个体间变异的信息； ( 2 ) 多为显性标记；( 3 ) 稳定性和可重复性高；( 4 ) 引物具有通用性。但i s s r 标记多 为显性标记，不适于研究交配系统、计算杂合度和父系分析等问题。由于i s s r 技 术能提供较大数目的d n a 片段，可以扫描基因组内的多态性位点，因而也是一种 用于分析物种、种群、不同品系、甚至是个体间遗传差异的理想方法( z i e t k i e w i c z ， 1 9 9 4 ：k a n t e t y ，1 9 9 5 ) 。它更多地揭示基因组中的多态性，是一种很好的d n a 指纹 标记，因此该技术在种质资源坚定方面显示出比其他方法更高的优越性( 王建波， 2 0 0 2 ) 。 1 2 4s s r 标记 特异引物标记s s r ( 简单重复序列) 又称微卫星序列，一般以1 - 6 个碱基为核心序 列，首尾相连组成的串联重复序歹i j ( b e c k m a n ne ta 1 ，1 9 9 0 ) 。真核生物基因组中s s r 是广泛随机分布的，它既可以存在于外显子中，又可以存在于内含子中。由于基本 核心序列的重复次数不同，因而在不同菌株的d n a 间存在多态性。s s r 多态性产 生的首要原因是复制时的d n a 链滑动( s t r a n de la l ，1 9 9 3 ) 。与其他技术相比，s s r 标记有如下优点：( 1 ) 具有较多的等位性变异；( 2 ) 广泛分布于整个基因组；( 3 ) 重复性 好，多态性高( 4 ) 共显性标记，可以鉴别杂合子和纯合子( 5 ) 高度的种间转移扩增性， 即相同引物可在近缘物种间使用( t a u r a z ，1 9 8 9 ：忻雅等，2 0 0 6 ：蒋彩虹等，2 0 0 7 ) 。 肖扬在2 0 0 9 年采用数据库搜索法及i s s r 抑制p c r 法开发香菇s s r 标记并利用s s r 技术分析了中国野生香菇菌株的多态性。 8 1 2 5a f l p 标 a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，扩增片段长度多态性) 是由 z a b e a u 等在1 9 9 3 年创建的，是利用p c r 技术检澳, t j d n a 多态性的一种方法，利用限制 性酶切片段的选择性扩增来显示片段长度的多态性( 罗培高等，2 0 0 1 ) 。a f l p 的基本 原理是对d n a 限制性酶切片段进行选择性扩增，具体操作为基因组d n a 经限制性内 切酶双酶切后，形成大小不等分子量的片段，再在这些d n a 片段的两端用双链人工 接头( a r t i f i c i a la d a p t e r ) 连接，形成一个带接头的特异片段作为扩增反应的模板，扩增 片段经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测( 伍春莲等，2 0 0 1 ) 。利用放射性标记a f l p 在 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上可检测到5 0 1 0 0 个扩增片段，可用于没有任何分子生物 学研究基础的物种，其引物在不同物种之间通用。因而a f l p 非常适用于遗传多样性 研究、品种指纹图谱的绘制、基因定位、分子标记育种、基因组多样性检测、遗传 连锁图谱的构建等领域。a f l p 技术的不足主要表现在：对基因组d n a 质量要求较高， 操作成本也相对较高，且所得到的分子标记多为显性标记( 翁跃进，1 9 9 6 ) 。 1 2 6s r a p 标记 s r a p ( s e q u e n c e r e l a t e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ，相关序列扩增多态性) 是2 0 0 1 年由美国加州大学作物系l i 等开发出来的。它是一种无需任何序列信息即可直接 p c r 扩增的新型分子标记技术，通过检测基因的可阅读框( o r f ) 区域，克服了r a p d 重复性差、a f l p 技术复杂、成本昂贵的缺点，具有成本低、可靠性好、重复性高、 操作简便迅速，易于测序等特点。目前此项技术在植物遗传图谱构建、作物遗传多 样性分析、基因定位及比较基因组学等方面得到了充分的应用。该标记通过一个1 7 个碱基的正向引物( f - p r i m e r ) 和一个1 8 个碱基的反向引物( r p r i m e r ) 对开放读码框 ( o r f s ) 进行扩增。正向引物含有一段1 4 个碱基的核心序列，5 端前1 0 个为填充序 列t g a g t c c a a a ，无任何特异组成，接着c c g g 序列，随后为3 端的3 个不同的 选择性碱基，与相同的核心序列组成一套正向引物。反向序列5 端前1 1 个为填充 序列g a c t g c g t a c g ，接着为a a t t ，随后为3 端同样为3 个不同的选择性碱基。 研究表明外显子一般处于富含g c 区域，正向引物中的c c g g 序列目的是与位于富 含g c 区域的开放读码框( o r f s ) 中的外显子进行特异结合。但是，外显子序列在不 同个体中通常是保守的，这种低水平多态性被反向引物的组合扩增所弥补。由于内 含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，富含a t 的区域序 列通常见于启动子和内含子中，s r a p 中使用的反向引物的3 端含有a a t t ，以特 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 异结合富含a t 区，这就使得有可能扩增出基于内含子与外显子的s r a p 多态性标 记( l ia n dq u i r o s ，2 0 0 1 ) 。 1 3d n a 序列分析方法内转录间隔区( i t s ) 幂i 基因内间隔区 ( i g s ) r d n a 是基因组中具有转录活性的d n a 重复序列，其拷贝数在不同生物之间有 很大的差异。不仅不同物种真核生物r d n a 的拷贝数不同，同一物种的不同品系之间 r d n a 拷贝数也往往也不相同。在进化上，由于r d n a 不同区域所受的选择压力不同， 各区域的保守程度呈明显的差异。1 8 s ，5 8 s ，2 8 s 和5 sr r n a 基因区的d n a 序列高 度保守，而i t s 序列为中度保守区域，主要应用在真菌近缘种的鉴定和系统发育研究； i g s 贝i 是r d n a 序列中最不保守的区域，主要应用在真菌属内种间、种内变种以及菌 株间的比较和遗传多样性分析。目前有许多学者利用不同物种间或同一物种不同菌 株间i t s 序列的差异来进行真菌系统发育学或分类鉴定等方面的研究( b u n y a r de ta 1 ， 1 9 9 6 , b r o w e re ta l ，1 9 9 6 ) 。 在食用菌中，i g s 常被用于菌株鉴定、多样性分析和遗传标记。真菌遗传学研究 表明，几乎所有的担子菌的基因内间隔区( i n t e r g e n i cs p a c e r s ，i g s ) 都含有5 s r n a 的编 码基因，使i g s 被分成2 个区域( i g s l 和i g s 2 ) ，i g s 2 区域较i g s l 区域长，变异性大， 进化较快，可用于种间和种内遗传多样性研究( b u n y a r de t a l ，1 9 9 6 a ) 。在i g s 2 中含 有许多重复序列或亚重复序列，在有丝分裂时经常发生不均等交换，某些重复单位 数目的变化造成i g s 长度的变异( a u s t e ne ta 1 ，1 9 9 8 ；m a r t i ne ta 1 ，1 9 9 9 ) ，这种差 异在电泳中表现为迁移率的不同，呈现不同大小的多态性条带。 在大多数真核细胞中r d n a 位于一条或多条染色体上成串联重复排列，依次成 为不同的组群。不同生物体r d n ai g s 区域重复单元的组成和拷贝数也不同。在香 菇菌株鉴别研究中证实，香菇i g s l 包括一个亚重复区，命名为s r l ，i g s 2 包括一 对正向重复区和一个亚重复区，命名为s r 2 。在s r l 发现了3 个类型的亚重复单元， s r 2 中发现有5 个亚重复单元。i g s l 和i g s 2 在长度上差异主要由s r l 和s r 2 各亚 重复单元的数量的不同而造成的。根据s r l 和s r 2 靶区域序列设计的引物进行随机 扩增，可出现多态性丰富的条带，将1 6 个香菇供试菌株区分开来，每个菌株都具特 异性条带。s r l 和s r 2 靶区域的d n a 指纹能有效用于香菇栽培菌株的鉴别( s a i t oe t a l ，2 0 0 2 ) 。水稻r d n a 被i g s 区域2 5 4b p 的亚重复序列的拷贝数不同而分成3 类， i 0 中国香菇自然种质资源多样性s r a p 和i g s 2 分析 大小在7 9 2 8 8 9 3 4b p 之f 司( k a n a m o r ie ta 1 ，2 0 0 6 ) 。近来，人们还发现i g s 区域含有 转录因子和终止子信号，而且亚重复单元的存在能使生物体适应本地的环境条件 ( g o r o l d a o v ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 4 分子标记在食用菌研究中的应用 1 4 1 菌株遗传多样性和亲缘关系分析 食用菌菌株的遗传多样性和亲缘关系的研究中，在过去我们通常依靠不稳定且 容易受环境条件影响的形态特征、地理来源、生态类型等指标来分析。而利用较稳 定的分子标记揭示出的多态性，通过系统学进行聚类、排序等分析，并由此可以推 断出个体或群体间的遗传差异及亲缘关系，这方面的研究也日渐丰富和成熟。 m a t s u s h i t a 等( 2 0 0 5 ) n 用r d n a r f l p 分析，研究了北半球松茸和北欧松茸的遗 传关系，将供试菌株可以分为3 个r f l p 型，并且认为生活在针叶和阔叶树林中的 松茸和北欧松茸可能为同一遗传学种。徐学锋( 2 0 0 5 ) 研究测定了来自中国1 5 个省份 的6 0 个野生香菇菌株的i t s 序列，系统全面地分析了全球l e n t i n u l a 属菌株的系统 发育关系，并基于此来评估亚洲香菇群体在全球香菇谱系中的地位。s u n 等( 2 0 0 6 ) 首次将s r a p 技术应用于灵芝属菌株的遗传多样性，将灵芝组和紫芝组区分开来， 中国灵芝和南斯拉夫灵芝也可区分，聚类结果反映出遗传多样性与地理来源间的相 关性。肖扬等( 2 0 0 9 ) 和j 用s s r 技术分析了中国1 4 个省份的5 6 个香菇菌株的d n a 多 态性，s s r 带型和d n a 平均相似性系数的差异表明，中国自然香菇种群具有丰富 的遗传多样性，云南高原、横断山脉、台湾和华南地区菌株的遗传多样性尤为突出。 1 4 2 种质资源评价及菌株鉴定 我国食用菌种质资源普遍存在同名异物，异物同名等现象，菌种