（发酵工程专业论文）氨肽酶高产菌株的选育及发酵条件优化.pdf

摘要 摘要 氨肽酶是一类从多肽链的氮末端顺序逐个水解氨基酸的酶，在蛋白水解液脱 苦和蛋白质的深度水解中有重要作用。本论文主要通过菌种诱变和培养基优化的 方法，提高米曲霉发酵生产氨肽酶的水平。实验中采取了c o 辐射和n + 离子注 入两种诱变手段，结果显示，n + 离子注入比c o “辐射更有效，氨肽酶活从2 3 1 5 u m 1 提高到3 2 3 1u m l ，提高幅度3 9 6 。对m 8 0 一1 0 7 菌株的发酵条件进行了 初步优化，使发酵水平提高到5 4 7 1 u m l 。研究发现该菌株利用单糖的效果较好， 延长发酵时间和添加表面活性剂能提高产酶。 用统计学实验方法对发酵培养基的配方进行优化。p l a c k e t t b u r m a n 实验表 明培养基中麸皮、果葡糖浆、k h ：p o 。三种组分是影响发酵产酶的显著因素。快速 登高实验使三种显著因素的取值临近最佳值区域。作b o x b e h n k e n 响应面实验， m i n i t a b 软件分析结果，求得最佳配方组合为麸皮8 1 o g 几、果葡糖浆3 6 o g l 、 k h 。p 0 。1 0 3 9 l 、玉米浆1 2 0 9 l 、m 。s o a 7 h z 0 0 4 0 9 l 、c a c lz 1 o g l 、( n h a ) 。s o t 1 o g l 、p e g l 0 9 几，优化后发酵水平达到6 4 3 9 u m l 。在5 o l 发酵罐上，保持 3 6 恒温发酵、生长后期控制p h 6 8 ，发酵水平达到7 2 3 8 u m 1 。 论文还研究了粗酶制备及其性质和应用的内容。该菌种所产氨肽酶最适反应 温度为6 0 ，最适反应p h 为8 0 ，氨肽酶的p h 稳定性范围大约在6 o 9 o 之 间。氨肽酶和中性蛋白酶复合酶解骨粉的最佳工艺参数为：温度4 5 、加酶量 2 、蛋白酶肽酶1 ：3 、p h 7 0 。 关键词：氨肽酶；c o ”诱变；n + 注入诱变；p l a c k e t t b u r m a n 实验；响应面实验 a b s a c t a b s t r a c t 枷n o p e p t i d a s e ，ac o l i e c t i o no fe n z y m e sw h i c hc 姐r e m o v ea m i n oa c i df r o mt h e n t e r m i 肌so fp 印t i d e so n eb yo n e ，i s v e r yi m p o n a n ti np m t c i nh y d r o l y s a t e o d u c t i 叫a 王1 dd e b j l f e f j n g 1 1 1 ep u 巾o s ei nt h ep 印e rj st om i s cp r o d u c t i “c yo f a i n j n o p 印t i d a s eb ym u t a t i o nb r e e d i n ga n d0 p t i i l l i z a t i o no ff c m l e m a t i o nn u t r i e m m e d i 啪t 、v 0t r e a n n e n tm e m o d s ，c o 叫m y sa n dn + i m p l a n t a t i o n ，w e r eu s e di nm e m u 诅t i o ne x p 谢m e n t s n + i m p i a n t a t i o ni sm o r ee f r e c t i v et 1 1 锄c o 川r a y st r e a 恤e n t ，a 1 1 d r a i s ep r o d u c t i v i t yf 幻m2 3 1 5 “m lt o3 2 3 1u m 1 a 矗e rp r e l i m i n a r yo p t i m i z a t i o no n f e 咖e n t a t i o nc o l l d i t i o nt h ey i e l dr e a c h5 4 7 1u m 1 s t u d yo nf e m l e n t a t i o nc o n d i t i o n s h o w st h a ts u p p l y i n gm o n o s a c c h a r i d ea 工1 ds u r f a c t a j l t ，1 e n g m e n i n gt 1 1 ef e m e n t a t i o n t i m ec a nr a i s ef e r m e n t a t i o np r o d u c t i v 畸 n u t r i e n tm e d i u mf o r m u l ai so p t i l n i z e du s j 力gs t a t i s t i cm e t h o d p l a c k e t t b l i n n 锄 e x p e r i m e n ts h o w st h a tw h e 砒b r a n ，s y m pa i l dk h 2 p 0 4h a v en o t i c e a b l ee 船c to nt l e a m i n o p e p t i d a s ep r o d u c t i v i 哆s e tt 1 1 ev a l u eo ft h et h r e ef a c t o r sn e a rt h er i g h tz o n ei n t h e r a p j d u p 埘i le x p e r i m e n ta n dc o n d u c tr s ae x p e r i n l e n t r e s u l ti sa n a h ，z e di n m i n i t 曲，a n dt h e ：o p t i m u mf o r m u l ai sw h e a tb r 锄81 o l ， s y r u p3 6 0 9 l ， k h 2 p 0 4 1 03 9 ，l ，c o ms t e e p1 2 o l 、m g s 0 4 - 7 h 2 0 0 4 l 、c a c l 2 1 o g 几、( n h 4 ) 2 s oa1 0 l 、 p e g l o g ，l a f t e ro p t i m i z a t i o nt h ep m d u c t i v i t yr e a c h6 4 3 9 “m 1 o n5 o lf e r m e n t a t i o n 伽m ，k e e pc o n s t a n tt e m p e r a t u r ea t3 6 a n dr e 窑u l a c ep ht o6 8a f t e rf e m l e n t a t i o n2 0 h o u r s t h ey i e l dg ou pt o7 2 3 8 “m 1 t h ea f n i l l o p e p t i d a s er e a c ht 1 1 em a x i m a la c t i “t ya t6 0 a n dp h 8 or e s p e c t i v e l v ， a n ds h o wr e l a t i v es t a b i l i 哆a tp h6 0 9 o t h eo p t i m a lt e c h n i q u ep a r a n l e t e r sf o rb o n e p o w 日d 铝饱d a o nw i t ha m i n o p e p t i d a s ea n dp r o t e a s ea r ea sf u 】o w s ：4 5 ，p h 7 o ，2 f o re n z y m eq u a n t i t y ，1 ：3f o rp r o t e i na 1 1 da m i n o p e p t i d a s er a t i o k e yw o r d s ：锄i n o p 印t i d a s e ；m u t a t i o nb yc 0 6 0 ；m u t a t i o nb yn + i m p i 姐t i l l g ； p 1 a c k e t t b l l r m a j ld e s i g n ；r e s p o n s es u r f k ea n a l y s i se x p e r i m e n t i i 独刨性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：芸盘星型日期：硼( ；年石月；瑁 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， “并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：昱盘墨! 导师签名： 日期：驷 第一章绪论 1 1概述 第一章绪论 1 1 1 氨肽酶的催化特性 氨肽酶是一类从多肽链的n 端顺序水解氨基酸、使氨基酸逐个游离出来的 酶。不仅能水解多肽，而且能水解完整的蛋白质分子。在许多生物中发现了各种 性质的氨肽酶。它不仅存在于高等动物的胰脏、肠液中，也广泛分布于多种真菌、 细菌和原生动物体内，一些真菌和细菌的种类还能向胞外分泌这种酶。其催化作 用的机理可以用以下公式表示： r ，r 2r -r z 氨肽酶 n i ：c h c 0 一n hc ii c o + n | 。一c h c o o h + n li 。一c h c o 氨肽酶有很多种，不同的氨肽酶对n 端氨基酸残基的水解能力表现差异性。 同一种氨肽酶剥不同的n 端氨基酸残基的水解能力也不同。 1 1 2 氯肽酶的分类 根据不同氨肽酶对水解n 端氨基酸残基专一性程度的不同，可以将氨肽酶分 为两大类：一类氨肽酶对n 端氨基酸残基专一性低，能水解几乎所有的氨基酸 残基，如亮氨酰氨肽酶( 1 。a p ) 、赖氨酰氨肽酶( p e pn ) 、苯丙氨酰氨肽酶( p e pm ) ； 区分这类氨肽酶可依据它们对不同氨基酸残基的水解速度的快慢，如亮氨酰氨肽 酶水解末端亮氨酸残基速度最快，而赖氨酰氨肽酶水解末端赖氨酸残基速度最 快。另一类氨肽酶对n 端氨基酸残基有f “格的专一性，只能特异地水解某一种或 几种氨基酸残基，如p e pa 只能水解天冬酰氨和谷氨酰氨残基；其中包含一类 很重要的脯氨肽酶，p e px ( 水解末端第二位为脯氨酸残基的肽) 、p e pp ( 水解 末端脯氨酸残基) 、p e pi ( 水解末端脯氨酸亚氨基) 。 1 1 3 产氨肽酶的菌种 由于动植物中的氨肽酶含量低，提取成本高，所以通过微生物发酵生产 氨肽酶既高效且低廉。产氨肽酶的微生物的种类很多，细菌、酵母、霉菌 中通常都含有一定量的氨肽酶。但各种微生物中氨肽酶的含量和种类有很 大的差异。米曲霉至少能产生7 种氨肽酶“1 。表l 列出的是部分已报道的 氨肽酶产生菌。 江南大学硕：i ：学位论文 表1 1 产氨肽酶的菌种 t a b 1 1m i c r o b e so fp r o d u c i n g a m i n o p e p t i d a s e 类群菌种名氨肽酶种类 l a c t o c o c c u si a c t i s s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h ii u s b r e v i b a c t e r i u ml i n e n s l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s l a c t o c o c c u si a c t i s l a c t o c o c c u si a c t i s a s p e r g i1l u sn i g e r d e b a r y o m y c e sh a n s e n i i a s p e r g i l l u sn i g e r a s p e r g i l l u s0 r y z a e a s p e r g i l l u s0 r y z a e p e n i c i l l i u mc a m e m b e r t l p e n i c i l l i u mc i t r i n u m p e px 3 1 p e pn “1 l a p 5 1 p e px 6 1 p e pn 7 1 p e pa 8 1 p e dp 【9 1 a a p 1 0 1 p e pm l a pi v 1 2 1 p e px p e dp 1 4 1 l a p 1 5 1 1 2 氨肽酶的应用 1 2 1 用于脱除蛋白水艇液的苦昧 当蛋白质大分子酶解时，肽链中含有的疏水性氨基酸暴露出来，接触味 蕾，产生苦味。因此，用蛋白酶水解后的蛋白质水解液通常都呈现苦味。 研究发现，疏水性氨基酸对苦昧的形成是必须的，且这些疏水性氨基酸一 般都位于肽链末端；如在肽链中残留一定量的脯氨酸其苦味明显增强。蛋 白酶解液的脱苦方法的研究以前主要采用物理、化学方法，即分离提取苦 味肽，或添加风味物质掩盖苦味。有研究报道，利用氨肽酶进一步水解蛋 白质的酶解液，可以脱除其苦味，1 9 6 9 年y s a t o 等用1 1 种蛋白酶处理酪 蛋白水解液，发现亮氨酰氨肽酶可以脱去蛋白质酶解液的苦昧“”，研究还 发现各种乳酸菌的粗酶提取物均能够除去或降低酶解液的苦味。此外，需 要特别说明的是，脯氨肽酶在脱苦上有特别重要的作用，因为肽链末端脯 氨酸残基除去后，其三维结构会发生显著改变，对酶解的敏感性增强， 第一章绪论 这种氨肽酶主要存在于乳酸菌中。 1 2 2 蛋白质的深度水解 与蛋白酶复合使用，可以大幅度提高蛋白质的水解度。在酱油酿造、干酪生 产及其它蛋白水解产品的制备过程中，可以提高蛋白质的利用率，节省成本。如 崔春、赵谋明等利用风味蛋白酶( 蛋白酶和氨肽酶的复合体) 深度酶解蓝园 鱼参蛋白，酶解6 h 后蛋白质的利用率即达到8 3 3 ，2 1 h 时水解度达到 5 9 7 。 1 2 3生物活性多肽的制备 生物活性多肽大部分是细胞生长因子，它们在体内含量极低，但生物活性极 高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥着生物调节作用。具有保健和美容的 功能。通过控制蛋白质的酶解来得到特定的活性肽是制备活性多肽的一种 安全且高效的途径。刘通讯等“”先用蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解，然 后再用氨肽酶进行水解，研究发现，产品中的多肽含量相对单一用蛋白酶 水解约能提高1 2 左右。 1 2 4 在医学上的特殊用途 脯氨肽酶能有效清除神经毒性化学毒剂及有机磷农药，既可用作医学 上的解毒剂，也可以用作环境消毒剂。亮氨酰氨肽酶等还可用作蛋白质序 列测定的分子工具。 1 3 国内外研究进展 1 3 1 国外研究进展 1 9 3 6 年j o h n s o n 和p e t e r s o n 从爿印e 增j “s p a ，a s j j c “s 中分离到三 种肽酶，并证实其中有能释放游离氨基酸的氨肽酶存在“”。 1 9 7 2 1 9 7 3 ，日本学者t a d a n o b u 等从卅印e 增，“so 珂r z a e4 6 0 中提取 到三种亮氨酰氨肽酶和一种羧肽酶。 不完全统计，国外学者已经从约3 0 种左右的微生物中提取到各种氨肽 酶。 研究人员对氨肽酶在脱苦方面的应用进行了大量研究，发现了脯氨肽 酶p e px 的特殊作用机理，及其在蛋白酶解液脱苦上的重要作用。c o e n e n 江南大学硕士学位论文 等研究了产自彳即日增j “s 门j 占盯的氨肽酶的毒性和致突变性，证明其应 用在食品工业上是完全安全的“”。 自1 9 9 0 年起，一些微生物产生的各种氨肽酶基因相继被克隆并测序。 m o t o s h i m a 等首次将一种极耐热细菌的氨肽酶t 的基因克隆、测序，并在 大肠杆菌中表达。研究人员对来源于a c d c d c c u s a c t j s 中的p e p x 基因 进行的研究发现，该基因的开放式阅读框包含2 2 8 9 个碱基对，编码一个由 7 6 3 个氨基酸组成的分子量约为8 7 0 0 0 的蛋白质分子“”。m e n g c h u nc h i 等通过定点基因突变的手段对助c 晒加船f 伽j 晒中的l a p 进行的研究， 发现其活性中心主要由l y s 2 6 5 ，a s p 2 7 0 ，l y s 2 7 7 ，a s p 2 8 8 ，a s p 3 4 7 ，g 1 u 3 4 9 和 a r 9 3 5 1 等组成”。 对氨肽酶三维结构的解析及其功能性也进行了非常深入的研究。b u r l e y 通 过同晶置换和x 射线衍射等手段，获得牛晶状体l a p 的2 7 埃分辨率的精确三 维结构模型，并确定金属离子的结合位点和活性中心的结构“”。 h i r o s h is a k i y a m a 等报道合成了氨肽酶活性中心的两种功能模拟物， 活性分别提高了2 5 0 倍和1 0 倍，对底物的亲合能力较天然氨肽酶也有所提 高，但稳定性有所下降”。 1 9 9 6 年，a u l t 食品公司的研发人员h c h o i 和l l a l e y e 进行的乳酸菌 ( a c d 6 a c j u sc a s 日js s p g a s 日j ) 发酵生产氨肽酶的研究资料显示，乳 酸菌发酵产氨肽酶的水平大致能达到o 1 6l a p m l ( 1l a p 为每分钟水解生 成l 岫o l p n a 的酶量) 。米曲霉发酵生产氨肽酶的水平比乳酸菌高很多，但 未能查阅到国外发酵水平的相关资料，有商品酶的资料显示，n o v o 和r h o d i a f o o d 公司生产的商品氨肽酶分别为5 0 0l a p g 。和2 2 0l a p g 一。 1 3 2 国内研究进展 国内在微生物生产氨肽酶方面进行的研究很少。与国外相比有相当大 的差距。目前能查询到的一些研究资料主要有：江南大学须英敏等从传统 食品豆腐乳中筛选到一株产氨肽酶的细菌，经1 6 sr d n a 序列测定和理化性 质分析确定该菌为枯草芽孢杆菌；浙江大学马晓航等从绮丽刺毛霉 c j ，7 删c 。，e 钾a 仃曲菌株中分离出一种甘氨酸氨肽酶“；军事医学研究院池 木根等发表研究论文“脯氨肽酶在s c e r e v i s i a e 酵母系统中的表达”；另有报 道，台湾学者y u w e nh u a 等将产自肋c j l “ss f e a 加如e 埘。_ 功j 船的l a p ( 亮 氨酰氨肽酶) 的c 一末端与a 一淀粉酶的生淀粉结合部位连接，该重组酶既能保持 l a p 的活力，又能够吸附生淀粉”。 相对于生产研究匮乏的情况，在应用方面，国内用诺维信公司生产的 风味酶f l a v o r z y m e ( 氨肽酶和蛋白酶复合产品) 进行的研究则较多。已经 第一章绪论 广泛用于各种动植物蛋白的水解实验中。如毛善勇、周瑞宝用风味酶水解 牛肉以提高其营养价值，制作成优质的营养保健食品。谷海先、周建明应 用复合风味酶和麸曲蛋白酶、糖化酶水解黄酒糟生产特鲜酱油，开创了酶 法生产酱油的新途径“”。李晓刚、张永丹等用a l c a l a s e 蛋白酶和风味酶复 合水解花生粕，将花生粕蛋白转化为可食用的花生多肽。章叶红、范宗泽 等用木瓜蛋白酶和风味酶复合水解鲣鱼头，将废弃的鲣鱼头制各成良好的 风味食品。利用陈刚、刘通讯等利用风味酶酶解低值鱼和不能被充分利用 的动物蛋白，将其制成鲜味剂，既解决了资源浪费的问题，又能用作食品 上的添加剂。 1 4研究背景与立题意义 随着食品工业生产规模的日益扩大，快餐食品的快速发展，有力地促进 了添加剂市场特别是天然鲜昧剂的快速增长。据报道，国外微生物鲜味剂 成为发展最快的产业。资料显示，2 0 0 4 年全球鲜味剂市场上，动植物蛋白 水解物( 干基) 年产量达到2 8 万盹”，这为氨肽酶的应用提供了宽广的市 场空间。我国近两年来蛋白水解物的产业也在迅速发展，特别是在利用鸡牛 肉、虾皮、鱼等生产调味料或营养液方面发展最快。氨肽酶的应用呈现出 愈来愈广阔的美好前景。 在我国，蛋白水解的传统工艺是用酸法水解。但是酸法水解蛋白的过 程中，由于盐酸和用于生产的蛋白质类物质上残余的脂类反应会产生少量 致癌的三氯丙醇，因此，酸解法水解物的应用都受到严格的限制。酶解法 具有高效、安全的优点，取代酸解法是必然趋势。但是由于成本的原因， 目前工业上仍以酸解法。因此，降低氨肽酶的使用成本成为很现实而紧迫 的需求。 在国外，已能通过曲霉和乳酸菌发酵生产氨肽酶，实现了总氨肽酶活 和p e px 酶活的商品供应“”。而在我国，氨肽酶的国产化还是空白，大家 使用的都是n o v o 公司供应的风味酶( f l a v o u r z y m e ) 产品，价格昂贵。实 现氨肽酶的国产化，可以提高我国相关产业的加工水平，降低成本，增强 行业竞争力。 国内在氨肽酶生产及应用方面所做的研究仅仅是刚刚开始。利用国内技术来 实现氨肽酶的规模生产还有一段很长的路。本实验室从米曲霉中筛选到一株产氨 肽酶活力较高的菌株“”，期望在此方面所做的研究工作能为氨肽酶的产业化创 造基础，作出一定的贡献。 江南大学硕士学位论文 1 5 本论文的研究内容 ( 1 ) 以本实验室保存的菌株米曲霉( 一印e 僧，“sd r r z 日e ) a n 2 0 0 2 作为出发 菌，采用c 0 6 0 照射和n + 离子注入等诱变手段，优化菌株遗传范围内的生产 性状，通过初筛和复筛，得到突变的氨肽酶高产菌株。并对该高产菌株进 行发酵条件的初步研究。 ( 2 ) 用统计学方法优化发酵培养基的配方。以p l a c k e t t b u r m a n 实验从众多 组分中筛选出显著影响因素，再对这几个显著因素进行响应面模拟，通过对拟合 方程的计算得到最优配方。在确定最佳培养基的基础上，优化发酵的温度和p h 条件。 ( 3 ) 采取分级盐析方法从发酵液中制备氨肽酶，对粗酶的酶学性质进行研究， 包括酶的最适反应温度、最适反应p h 以及酶对温度和p h 的稳定性等。 应用氨肽酶和蛋白酶复合水解骨粉，结合对游离氨基酸的分析，摸索一个合适的 深度水解骨粉蛋白的工艺条件。 6 第二章氨肽酶高产菌匮变育种及发酵条件的初步研究 第二章氨肽酶高产菌诱变育种及发酵条件的初步研究 2 1前言 c 0 6 。辐射和离子束注入诱变都是高能物理两变的手段。c o ”辐射常用于微生 物育种中。c o ”射线是一种电离射线，在生物体内能够产生活性氧自由基，引发 生物基因突变和染色体畸变。 离子束注入作为一种新的诱变源，在对微生物诱变育种的研究中表现 出比传统诱变方法更高的突变率和诱变效率。利用离子注入进行微生物菌 种改良已在生产实践中得到广泛的应用，并取得显著的经济效益和社会效 益。中科院等离子体研究所离子束生物工程实验室利用离子注入诱变育种 技术，选育得到v 。高产菌株，其糖一酸转化率达到9 5 ，发酵温度从2 8 提 高到3 3 ，使我国成为v 。的主要供应国；并且育成花生四烯酸高产菌，其 产酸得率达到5 8 9 l ，处于国内外最好水平，是美国专利技术的2 5 倍。 本课题以米曲霉作为产生氨肽酶的出发菌，主要有以下考虑：一是，从食 品安全性考虑，该菌种在食品发酵工业上应用已经有一段相当长的时间；二是， 该菌种有一定的氨肽酶活力，而且n o v o 和g e n e n c o r 等公司都以米曲霉作为氨肽 酶的生产菌”。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌种 米曲霉( 印e 昭j 惦。f 昭a 曲a n 2 0 0 2本实验室保藏 2 2 2 培养 2 2 2 1 培养基 分离培养基( g l ) ：蔗糖3 0 ，i n ao 5 ，大豆分离蛋白l o 0 ，m g s o 7 h ：o0 5 k h 。p 0 。1 o ，琼脂粉1 7 ，p h 6 4 ； 斜面培养基( g l ) ：麦汁培养基，5 6 。b 6 麦汁，琼脂1 7 ，p 6 o ； 种子培养基：麸皮：水= 1 ：l ； 发酵培养基( g l ) ：玉米浆3 0 ，麸皮6 0 ，m g s o 。7 f l ：0o 5 ，k i 。p o 。1 0 o c a c l21 o ，p h 6 8 。 2 2 2 2 培养条件 江南大学硕士学位论文 种子和平板培养在3 1 o 5 恒温箱中培养7 2 h ； 发酵培养3 1 1 ，2 2 0 r m i n 摇床振荡培养6 4 h 。 2 2 3 主要试剂及仪器 亮氨酸对硝基苯胺 玉米浆 麸皮 果葡糖浆 7 2 2 分光光度计 p h 计 分析天平 天平 水浴锅 德国f 1 u k a 生化公司 华北制药康欣公司 无锡太湖调味品厂 山东鲁洲生物 上海精密科学仪器公司 上海梅特勒一托利多集团 上海精天电子仪器 上海精天电子仪器 金坛富华仪器 2 2 4 实验方法 2 2 4 1 高产菌选育的思路 首先对本实验室保存的菌株米曲霉( 一印e 俘，坩d r 膳日曲a n 2 0 0 2 进行分离 纯化，挑选出发酵性能较好、活力较高的菌株作为诱变的出发菌。初筛从含底物 l n a ( l l e u c i n e 一4 一n i t r o a n 订i d e ) 的选择平板中挑选出有一定数量的菌株，l n a 无色，在氨肽酶作用下生成黄色对硝基苯胺( p n a ) ，根据生成的黄色水解圈和 菌落直径比值的大小来指示菌株的产酶能力。复筛以发酵产酶能力作为筛选的依 据，经多轮发酵测试筛选出高产菌。为了得到比较纯的变异株，在复筛前采取中 间培养措施，单菌落经斜面转接培养三代后，再接种发酵摇瓶，进行复筛“”。 2 2 4 2 c o 舶射线照射的诱变处理 ( 1 )孢子悬液的制备 取5m l 无菌生理盐水洗下新鲜斜面上的孢子，将其转移入盛有玻璃珠的 三角瓶，在摇床上振荡打散2 0m i n ，然后用4 层擦镜纸过滤，并进行梯度稀释， 于血球计数板计数并调整孢子浓度为5 1 0 6 个m l 左右。 ( 2 ) c o ”射线诱变 此项处理在我校社桥c o ”辐照室进行，将装有适量孢子悬液的试管置于一定 剂量率的辐照平面上，用c o 。射线进行辐照诱变，照射剂量分别为4 万、6 万、 8 万、1 0 万、1 2 万、1 6 万仑琴，处理后进行梯度分离，3 2 培养。挑选的菌落 第二章氨肽酶高产菌诱变育种及发酵条件的初步研究 转接到斜面培养基上。 2 2 4 3 n 注入的诱变处理 ( 1 ) 单孢子悬液的制备 取培养成熟的麸皮种子，置于2 5 0m l 的三角瓶中，放入3 0 个玻璃珠，在 一定转速的摇床中震荡打散，尽可能保证9 0 以上为单孢子，过滤并将浓度调至 1 0 7 1 0 8 个m l ，制备成单孢子菌悬液。 ( 2 ) 靶样的制备 吸0 1 m l 菌液于平皿中，用无菌涂布器涂布均匀，在超净工作台中自然风 r 【3 l 】 o ( 3 ) n 离子注入处理 在中科院等离子体所离子注入机上进行。将含菌的平皿放入真空室中进行 离子注入，以1 0 k e v 能量，2 6 l o ”i o n c m 2 s 剂量率，分别按1 0 s 、2 0 s 、4 0 s 、 6 0 s 、8 0 s 不同时间作注入处理“”，靶室真空度为1 0 3 帕。对照组只做真空处理， 不经离子注入。取出平皿，以5 m 1 无菌水洗脱，稀释涂布分离平i i l 。于3 l l 培养7 2 h 。 2 2 4 4高产菌株的筛选 从分离平皿中挑选生长状态良好、水解圈相对较大的单菌落，分别接斜面培 养基再培养，转接二代后接种子培养基，再接种于发酵摇瓶，经几轮发酵测定， 逐步筛选高酶活菌株；高酶活菌株进一步稀释分离，培养，再通过发酵测定，筛 选目标高产菌“”。 2 2 4 5 高产突变菌传代稳定性的实验 将复筛得到的目标菌接种麸皮培养，连续转接5 代，每代实验过程：单菌落 分离一麸皮种子一摇瓶发酵一测定酶活。以均值作为对照，比较各代之间的变异 幅度。 2 2 4 6 高产菌发酵条件的初步研究 在原有发酵培养基基础上，进一步优化碳源和氮源配方，确定最佳浓度、合 适的碳氮比、初始p h 条件；在此基础上，绘制该菌发酵产酶的过程曲线，确定 最佳发酵时间，以及研究表面活性剂对产酶的影响。 2 2 5 酶活测定及计算方法 ( 1 )测定方法：发酵滤液稀释数倍，取o 4 m l 加入6 m lp i l 8 o 的t r i s h c l 缓 江南大学硕士学位论文 冲液中，4 0 水浴预热5 m i n ，加o 4 m 12 6 m ml n a 乙醇溶液( 对照加蒸馏水) ， 准确反应1 0 m i n ，立即放冰浴中，5 m i n 后于4 0 5n m 处比色。 ( 2 ) 酶活定义：在4 0 、p h 8 0 条件下，每分钟水解生成1 p n a 所需 的酶量定义为一个酶活单位。 ( 3 )标准曲线和酶活的计算 配制一系列梯度浓度的对硝基苯胺标准溶液，以o 含量为对照，在4 0 5 n m 波长，分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对硝基苯胺浓度为横坐标，绘制标 准曲线如下， 笸 e 坦 毯 装 螫 3 5 0 3 2 5 o2 1 5 0l 0 5 0 uu 4u8lzlbzz qz 8j zj b4 对硝基苯胺浓度( m 1 ) 图2 1 对硝基苯胺的吸光度标准曲线 f i g2 1 t h es t a n d a r d0 dc u r v eo fp n a 酶活计算公式： 氨肽酶活力( u m 1 ) = 0 d 6 8 d ( k 1 0 o 4 ) ； 公式中，k 消光系数，在本实验中，k = o 0 8 1 2 ；6 8 反应总体积 0 4 酶液体积；1 0 恒温反应时间；卜稀释倍数。 2 2 6 计算方法的规定 存活率= 各注入剂量下的活菌数对照组的活菌数；对照组和实验组的活菌计 数均采用平板梯度稀释分离计数。 2 3 结果与讨论 在c o ”射线诱变之前， 还进行过两次紫外线诱变的实验，但未取得明显效 果。 2 3 1 c 0 ”射线照射的诱变效果 2 3 1 1 c o ”射线的不同剂量对出发菌株的诱变效应 采用6 组不同剂量c o ”射线对菌株米曲霉a n 2 0 0 2 进行辐照诱变处理，同时 以处理前孢子悬浮液作为对照。其诱变结果如表2 1 所示， 第二章氨肽酶高产菌诱变育种及发酵条件的初步研究 表21不同剂量c o ”射线对菌株的致死率 t a b21l e t h a 卜r a t eo fa n 2 0 0 2t r e a t e db yt h edf f e r e td o s eo fc o 帅- r a y s 致死率随c 0 6 0 射线照射剂量的增加而升高，当诱变剂量达到1 6 万伦琴时， 该条件下的致死率达到1 0 0 。1 0 万1 2 万伦琴之间，致死率达到g o 以上。有 资料报道，c 0 6 。射线辐照的剂量以致死率9 0 9 9 9 为宜“”。因此在初筛时可 多挑选高剂量( 1 0 万1 2 万伦琴) 下的菌落。 2 3 1 _ 2 突变菌的初筛 从平板上分别挑选出不同诱变剂量下的菌株，将其点样在选择平板上。选择 平板以l n a 为底物，l n a 无色，在氨肽酶作用下生成黄色pn a ，以自然分离平 板中的菌落作对照，变异菌株周围产生黄色变色圈较自然对照菌大者为正突变， 反之，为负突变或不突变。根据平板上单菌落变色圈大小和颜色变化情况，初步 筛选高产菌株。结果如表2 2 所示， 表22 不同剂量c o “射线对菌株的诱变效果 t a b2 2m u t a to ne f f e c to fa n 2 0 0 2t r e a t e db yt h edf f e r e td o s e o fc o ”一r a y s 从表2 可以看出，当辐照剂量为1 2 万仑琴时，变异菌出现正突变率的频率 较高，致死率达到9 6 5 。 2 3 1 3 高产菌的复筛 根据初筛结果，选取2 0 株正突变菌株进行发酵摇瓶复筛，经过两批摇瓶发 酵试验，筛选得四株产酶较高的菌株。对这四株菌重复筛选，每菌株三个重复， 结果如表2 3 所示 表23菌株复筛的结果 t a b2 3t h es c r e e n i n go fh i g h y j e i dm u t a t i o ns tr a i n 3 如表看出，突变株的产酶能力比出发菌既有提高，也有降低，说明突变菌的 遗传性状不稳定。最高平均产酶活力达到2 4 0 4u m 1 ，比出发菌株提高了5 8 。 实验中还发现，4 株产酶能力较高的变异菌株均来自辐照剂量为l o 万1 2 万伦 江南大学硕士学位论文 琴。 2 3 1 1 4 高产菌株的稳定性实验 由于菌株的诱变性状常常不稳定，尤其在连续传代培养时，容易发生变异 性状的丢失。为了考察变异菌株的产酶能力的稳定性，我们将其连续移接5 代， 进行发酵摇瓶试验，发酵产酶结果如表2 4 所示， 表2 4 菌株w j 0 5 1 遗传稳定性实验的结果 t a b 2 4g e n e t i cs t a b i i t yo fw j 0 5 1s tr a i n 表2 4 表明，变异菌株w j 0 5 1 产酶能力相对较为稳定，相对于出发菌，产 酶能力有一定提高。但是仍存在着回复突变的现象，可以利用该菌种进一步作 n + 注入的诱变处理。 2 3 2 旷注入的诱变效果 2 3 2 1 不同n 注入剂量对菌株的诱变效率 在前述实验条件下，按2 6 1 0 “2 0 8 1 0 “不同剂量注入各组菌样，考察 各剂量下的存活率、正变率、最高酶活等结果如表2 5 ，规定酶活高于出发菌5 为正突变菌株，反之为负突变；正突变率= 正突变菌株数活菌数。 表2 5不同旷注入剂量对菌株的诱变效果 t a b 25m u t a t i o ne f f e c to fs t r a i n su n d e rd i f f e r e n ti m p i a n t i n gd o s a g e s 可以看出，当注入剂量偏小时，突变率较低，存活率较高，随着注入剂量的 加大，存活率降低，正突变率有增大趋势。当注入剂量达到1 5 6 1 0 “i o n c m 2 以上时，存活率陡然降低，正变率显著提高。筛选得到的高产菌的水平也有相应 提高。可见，当注入剂量达到1 5 6 1 0 “i o n cm _ 2 以上时，对该菌株有比较好 的诱变效果。 第二章氨肽酶高产菌诱变育种及发酵条件的衲步研究 2 3 2 2 不同注入剂量下的致死效应 不同注入剂量与存活率l | 玎线如图2 2 所示 笆 精 蜒 站 图22 不同注入剂量下的存活率曲线 f ig 2 2s ur v j v a ir a t ec u r v ew i t hi m p la n t ln gd o s a g e s 这与其他文献所报道的“马鞍型”曲线吻合，孢子存活率随注入剂量增大， 先快速下降，而后呈现平缓上升再下降的过程。出现这一现象，一种机制认为离 子注入达到一定剂量，可以激活细胞的修复机制和修复酶，诱导产生m n s o d 活 性升高，使存活率回升”；另一种机制认为，中高剂量下连续注入的离子堆积 在细胞表面形成一个“保护屏障”，对细胞起保护作用，当电荷累计达临界值后 产生库仑爆炸，使屏障作用消失”。 2 3 2 3 突变菌的筛选和形态观察 菌株突变后，通常会伴随形态和发酵性状的变异。根据对菌落形态、孢子颜 色和丰度、发酵性状等特征的观察，将菌株的形态特征和发酵性能的数据列入表 2 6 ，以期发现菌株的高产性状，为筛选提供依据。 表26突变株的形态特征和发酵性能 t a b2 6 m o r p h o i o g ya n df e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r is t i c o fm u t a t i o ns t r a i n s 由表2 6 可以看出，有凝乳圈、孢子丰富可能是菌株的高产性状。孢子少、 生长慢影响菌体的生长，不利于产酶。所以在筛选高产菌株时，应该尽可能挑选 孢子丰富且带有凝乳圈的单菌落。 江南大学硕士学位论文 2 3 2 4 高产突变菌的筛选 筛选是获得高产突变菌株的重要步骤，为了保证高产菌株的检出，初筛工作 要扩大筛选量，初筛以后要复筛几次，才能挑准高产、稳定的突变菌株。 由分离平板初筛挑选出水解圈相对较大的菌株8 4 株，按以下步骤进行摇瓶 筛选： 每株1 个摇瓶表每株4 个摇瓶表8 每株4 个摇瓶 8 4 个单孢子菌株+ 挑2 4 个菌株+ 挑15 个菌株斗 表c分别稀释分离培养 每株1 个摇瓶表d每株4 个 4 株产酶最高菌 挑4 7 个单孢子菌株 挑1 6 个菌株+ 摇瓶表e每株4 个摇瓶 挑8 个菌株+ 得到2 株目标高产菌( m 6 0 一5 一1 3 、m 8 0 一1 0 7 ) 。 m 6 0 一5 1 3 和m 8 0 一1 0 7 平均产酶能力分别为3 1 4 2 u m l 、3 1 6 3 u m 1 ，均比出 发菌提高了3 0 以上。 表a e 列出筛选的部分或全部菌株的酶活。 表表b m 6 0 一3 m 2 0 一1 3 m 6 0 一1 0 m 8 0 一1 8 m 8 01 0 m 6 0 5 m 8 0 2 2 m 2 0 一5 m 4 0 一1 m 6 0 1 3 2 8 4 7u m l 2 7 6 9u m l 3 0 6 7u m 1 2 7 8 3u m l 3 0 3 8u m 1 2 9 6 7u m l 2 8 8 1u m l 2 7 5 3u m 1 2 8 4 7u m 1 2 7 6 3u m l 表d ( u 田i ) m 8 0 1 9 m 6 0 一5 m 6 0 一1 3 m 8 0 一1 8 m 8 01 0 m 6 0 1 9 m 8 0 2 4 m 4 0 一5 m 6 0 l o m 6 0 一1 1 2 8 9 3 u m l 3 1 2 5 u m 1 2 9 3 7 u m l 2 7 6 4 u m 1 3 2 7 8 u m l 2 8 2 6 u m l 2 9 0 8 u m 1 2 8 9 4 u m 1 3 1 8 9 u m l 3 0 7 4 u m l m 6 0 一1 0 一42 8 6 8 m 6 0 5 7 2 9 2 2 m 8 0 l o 一93 1 9 4 m 8 0 一1 01 33 0 6 6 m 6 0 一1 142 9 7 4 m 8 0 一1 0 62 9 8 9 m 6 0 5 1 3 3 1 6 7 m 6 0 1 0 一83 0 9 6 m 6 0 一1 0 1 72 9 6 4 m 6 0 5 一1 13 2 4 8 4 表e ( u i ) m 6 0 一1 0 1 72 9 4 9 m 8 0 一1 0 一63 0 5 8 m 6 0 一5 一1 13 1 5 6m 6 0 一5 一1 3 3 1 9 4 m 8 0 1 0 一73 1 7 3m 8 0 1 0 1 33 2 2 7 m 6 0 1 0 1 43 1 7 8m 6 0 1 l 一9 3 1 6 3 第二章氨肽酶高产菌诱变育种及发酵条件的初步研究 2 3 2 5 高产突变菌遗传稳定性 将m 6 0 一5 13 和m 8 0 一1o 一7 菌株连续传5 代进行发酵产酶能力考察，每代实验 过程：高产菌单菌落一麸皮种子一摇瓶发酵一测定酶活。结果如表2 7 ， 表27高产突变菌遗传稳定性( 传5 代) 实验结果( 单位：u m i ) t a b2 7g e n e t i cs t a b ij t yo fh ig h y i e idm u t a t i o ns t r a in s 以均值作对照( 1 0 0 ) ，m 6 0 一5 1 3 的相对酶活变化范围在9 3 o 1 0 3 8 之 间，m 8 0 一1 0 7 的相对活力变化范围在9 6 0 1 0 3 5 之间，显示m 8 0 一1 0 一7 是一 支高产、稳定的突变株。以下实验均采用m 8 0 一l o 一7 作实验菌株。 2 3 3 发酵条件的初步研究 2 3 3 1 复合碳源的选择 不同微生物对