（分析化学专业论文）基于金纳米颗粒局域表面等离子共振吸收lspr生物传感的研究.pdf

苏州大学学位论文使用授权声明 l i i iiiir l r l1111111 1u i y 17 31710 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所( 含万方数据电子出版社) 、 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属 在年一月解密后适用本规定。 非涉密论文 论文作者签名；益二l 日 期：j 业哔 导师 签名：l 玉嫜日期：翌旦珥 基于金纳米颗粒局域表面等离子共振吸收( l s p r ) 生物传感的研究 中文摘要 中文摘要中文捅斐 局域表面等离子体共振吸收( l s p r ) 与贵金属纳米粒子的组成、尺寸、形状、 粒子间距和周围介质折射率等因素有关，可以有效提高传感器的灵敏度、选择性、 空间分辨率、可集成性，成为探测传感领域研究和应用的一个重要方向。 本论文第一部分研究了球状金纳米粒子大小对l s p r 的影响。通过电解氯金酸 在i t o 玻璃上直接电沉积了平均粒径2 5 n m 9 5 n m 的金纳米球，并用扫描电镜、紫 外可见光度法对其进行了表征。研究了三种粒径( 3 0 n m 、5 0 n m 、9 5 n m ) 金纳米球周 围介质折射率对其局域表面等离子体共振吸收的影响，结果表明3 0 n m 金纳米球的 灵敏度为7 4 n 珈爪n7 ，5 0 n m 金纳米球的灵敏度为1 0 3 舢刚u ，9 5 n m 金纳米球的灵 敏度可达1 3 3 n m r i u 。研究了球状金纳米粒子在吸附蛋白质分子后l s p r 发生变化 的规律，发现金纳米粒子的粒径越大，其灵敏度越高，证明金纳米l s p r 性质与其 尺寸有关。选取了两个体系，分别为s t r e p t a v i d i n b i o t i n 和m i g g g o a ta n t i m i g g 体系，利用发生特异性反应，通过紫外分光光度计来检测其l s p r 带的红移，从而 实现对生物分子的检测。 论文的第二部分研究了聚集状的金纳米粒子对l s p r 的影响。通过优化电沉积条 件在i t o 玻璃上电化学沉积了簇状金纳米粒子，并用扫描电镜、紫外可见光度法对 其进行了表征。研究了簇状金纳米粒子在吸附蛋白质分子后l s p r 发生变化的规律， 研究了簇状金纳米周围介质折射率对其局域表面等离子体共振吸收的影响，发现灵敏 度可达1 5 8 n m r i u 。实验证明金纳米l s p r 性质与其形貌有关，可控聚集状金纳米 粒子具有更高的灵敏度。采用s t r e p t a v i d i n b i o t i n 和m - i g g g o a ta n t i - m - i g g 体系， 利用发生特异性反应，通过紫外分光光度计来检测其l s p r 带的红移，从而实现高 灵敏度的传感，制备基于金纳米粒子的高灵敏l s p r 生物传感器，拓宽l s p r 生物 传感器的应用领域。 关键词：金纳米粒子，局域表面等离子共振，免疫分析，生物传感器 作者：宋燕 指导教师：狄俊伟 s t u d yo nt h eb i o s e n s o r b a s e do nl o c a ls u r f a c ep l a s m o n r e s o n a n c e ( l s p r ) o f g o l dn a n o p a r t i c l e s a b s t r a c t l o c a ls u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ( l s p r ) o fn o b l em e t a l l i cn a n o p a r t i c l e si sr e l a t e d t ot h es i z e ，a p p e a r a n c e ，d i s t a n c e ，r e f r a c t i v ei n d e xa n ds oo n i tc a nb eu s e di nb i o s e n s o r a r e ad u et ot h e i ra d v a n t a g e so fl a b e l - f r e e ，h i g hs e n s i t i v i t y , r e a l t i m ea n dr a p i dd e t e c t i o n i nt h i sp a p e r ，w ed e v e l o p e das y n t h e t i cm e t h o dt oc o n t r o l l a b l ep r e p a r em e t a l l i c n a n o - p a r t i c l e sb ye l e c t r o l y z i n gh y d r o g e nt e t r a c h l o r o a u r a t e ( h a u c l 4 ) g o l dn a n o s p h e r e s f o ra v e r a g ed i a m e t e ri nt h er a n g eo f2 5 - 9 5n r f lw e r ed i r e c t l yd e p o s i t e do n t ot h ei n d i u m t i l lo x i d e ( i t o ) g l a s ss u r f a c eb yc y c l i cv o l t a m m e t r i cm e t h o d t h eg n p so i li t o s u b s t r a t ew e r ec h a r a c t e r i z e db ym e a n so fs c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) a n d u v - v i ss p e c t r o s c o p y t h et h r e ed i f f e r e n ts i z e so fg o l dn a n o s p h e r e sf o ra v e r a g ed i a m e t e r o f3 0 ，5 0 ，9 5n i nw e r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h ec h a n g e so fl o c a l i z e ds u r f a c ep l a s m o n r e s o n a n c e ( l s p r ) p r o p e r t i e sd u et os m a l lc h a n g e si nt h er e f r a c t i v ei n d e x ( r i ) o f t h e s u r r o u n d i n gm e d i u mc l o s e t ot h ep a r t i c l es u r f a c e r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e s e n s i t i v i t yo fr e f r a c t i v ei n d e x s e n s o ri n c r e a s e da sg o l dn a n o p a r t i c l e sb e c a m el a r g e r t h e s e n s i t i v i t yo ft h e30n l l lg o l dn a n o s p h e r ew a s7 4 n m r i u t h es e n s i t i v i t yo ft h e5 0 n m g o l dn a n o s p h e r ew a s 10 3 n m r i u ，a n dt h es e n s i t i v i t yo ft h e9 5 n mg o l dn a n o s p h e r e r e a c h e d13 3 n m r i u w ec h o o s et w ot y p e so fs y s t e m ，o n ei ss t r e p t a v i d i n b i o t i ns y s t e m ， t h eo t h e ri sm - i g g g o a ta n t i - m - i g gs y s t e m b e c a u s eo ft h es p e c i a lr e a c t i o n ，w ec a l l d e t e c tt h er e ds h i f tb yu v v i ss p e c t r o s c o p ya c h i e v i n gt h eh i g hs e n s i t i v i t ys e n s o r t h i s p a r tp r o v e st h a tl s p r o fg o l dn a n o s p h e r ei sr e l a t e dt ot h es i z e so fg o l dn a n o s p h e r e s o nt h eo t h e rh a n d ，w ee l e c t r o c h e m i c a ld e p o s i t e dg o l dn a n o c l u s t e r so n t oi t o s u r f a c e t h eg o l dn a n o c l u s t e rg n p so ni t os u b s t r a t ew e r ec h a r a c t e r i z e db ym e a n so f s e ma n du v v i ss p e c t r o s c o p y t h e nt h eg o l dn a n o c l u s t e r sw e r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h e r e s p o n s eo f d i f f e r e n to r g a n i cs o l v e n t sa n ds h o w e das e n s i t i v i t yo f158 n m r i u ，w h i c hi s 玎 h i g h e rt h a nn a n o s p h e r e s w ea l s oc h o o s et h et w ot y p e so fs y s t e m b e c a u s eo ft h e s p e c i a lr e a c t i o n ，w ec a nd e t e c tt h er e ds h i f tb yu v v i ss p e c t r o s c o p ya c h i e v i n gt h eh i g h s e n s i t i v i t ys e n s o r t h i sp a r tp r o v e st h a tl s p ri sr e l a t e dt ot h ea p p e a r a n c eo fg o l d n a n o p a r i c l e s k e yw o r d s ：g o l dn a n o p a r t i c l e s ，l o c a ls u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，i m m u n o a s s a y ， b i o s e n s o r i i i w r i t t e nb ys o n gy a n s u p e r v i s e db yd ij u n w e i -i 目录 第一章绪论1 1 1 表面等离子共振( s p r ) 及其应用1 1 2 局域表面等离子体共振( l s p r ) 及其应用2 1 3 金纳米粒子形貌对l s p r 的影响及其应用6 1 3 1 球状金纳米粒子6 1 3 2 棒状金纳米粒子6 1 3 3 核壳结构金纳米粒子8 1 4 本论文的选题目的1 0 参考文献”1 l 第二章基于球状金纳米颗粒局域表面等离子共振吸收( l s p r ) 生物传感的研究1 7 2 1 引言17 2 2 实验部分18 2 2 1 试剂l8 2 2 2 仪器1 9 2 2 3 实验过程1 9 2 3 结果与讨论2 0 2 3 1 球状金纳米粒子的制备2 0 2 3 2 球状金纳米传感膜对介质折射率的响应2 2 2 3 3 金纳米电极表面吸附蛋白质分子b s a 的研究2 3 2 3 4s t r e p t a v i d i n 生物传感器研究2 7 2 3 5 免疫传感器的研究j ”2 9 参考文献3 2 第三章簇状金纳米局域表面等离子共振吸收( l s p r ) 生物传感的研究3 3 3 1 引言3 3 3 2 实验部分一3 3 3 2 1 试剂3 3 3 2 2 仪器 “3 4 3 2 3 实验过程3 4 3 3 结果与讨论3 5 3 3 1 簇状金纳米粒子的制备3 5 3 3 2 簇状金纳米传感膜对介质折射率的响应3 9 3 3 3 簇状金纳米电极的表面吸附蛋白质分子b s a 的研究3 9 3 3 4s t r e p t a v i d i n 生物传感器研究4 0 3 3 5 免疫传感器的研究4 1 参考文献4 2 论文完成情况4 3 致谢“4 4 基于金纳米颗粒局域表面等离子共振吸收( l s p r ) 生物传感的研究第一章 第一章绪论1 帚一早三百了匕 纳米科技【1 1 ( n a n o m e t e rs c a l es c i e n c ea n dt e c h n o l o g y ) 是2 0 世纪8 0 年代末，9 0 年 代初才逐渐发展起来的前沿，交叉性新兴学科领域，它的迅猛发展在2 1 世纪将促 使几乎所有工业领域产生一场革命性的变化【2 1 。纳米材料的物理及化学性质与 粒子本身的形状及尺寸密切相关，制备各向异性的纳米材料变得越来越重要， 纳米材料制备技术的进展使得制备可控尺寸及形状的金属纳米微粒已成为现 实。 随着纳米材料技术的迅速发展，贵金属纳米粒子引起了人们极大的兴趣，由 于其良好的导电性、小尺寸效应、量子隧道效应及高的表面化学活性【3 】，使其在 化学传感器和生物传感器领域具有基础研究和实际应用价值。如将纳米颗粒引入 到葡萄糖氧化酶电极中，使响应电流提高两个数量级，很好的证明金属纳米颗粒 具有良好的化学活性和催化活性，从被还原的酶获取电子而使酶重新具有氧化性， 起到与阵列电极作用相似的“微电极 作用，这样就加速了酶的再生速度，从而 有效地提高电极的电流响应0 1 。同时也证明了金属纳米颗粒具有良好的导电性和 宏观隧道效应，可以作为固定化酶之间、固定化酶与电极之间有效的电子中介体， 从而促进葡萄糖氧化酶的f a d 中心与铂电极间通过金属颗粒进行的电子转移，酶 与电极间可以近似看作是由一种导线来联系的，这样就有效地提高了传感器的电 流响应。憎水纳米颗粒引入的反胶束可以为酶提供良好的微环境，保护酶的活性， 因此可以提高传感器的电流响应【1 1 。2 2 1 。 1 1 表面等离子共振( s p r ) 及其应用 表面等离子共振( s p r ) 是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同 折射率的介质界面( 比如玻璃表面的金或银镀层) 时，可引起金属自由电子的 共振，由于电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中， 使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为s p r 角。s p r 随表面折射率的变 化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此 可以通过获取生物反应过程中s p r 角的动态变化，得到生物分子之间相互作用 的特异性信号。 第一章基于金纳米颗粒局域表面等离子共振吸收( l s p r ) 生物传感的研究 镶 嵌瑚摹峨 饿盍精睫 图1s p r 基本原理和传感器芯片模式图 从表面等离子共振检测技术的建立到现在，在短短的二十多年内，利用该技术 在免疫检测、药物代谢及其蛋白质动力学等领域已经取得了很多的科研成果，并 且建立了一系列的检测和分析方法。 ( 1 ) 表面等离子共振技术在核酸中的应用。 b r y c ep 等人【2 7 】将未标记的1 8 个碱基的d n a 特异单链固定在金膜表面作为探 针，通过杂交直接检测从大肠杆菌分离出i 拘1 6 s r r n a 含量；s t e p h e na g 2 8 1 利用荧 光各向异。i 生( f l u o r e s c e n c ea n i s o t r o p y ) 矛1 s p r 技术，研究了艾滋病病毒的核衣壳蛋白 与核甘酸序列的相互作用。n g u y e nb 【2 9 】利用s p r 技术无标记，实时性研究了小分 子核酸间的相互作用，并且分析了不同小分子核酸之间的相互作用动力学。 ( 2 ) 表面等离子共振技术在药物代谢分析中的应用。 m o u r ir 等口9 1 研究了两性霉素b 与真菌卵磷脂之间的相互作用；在癌症药物治 疗中，由于每个患者的癌细胞有着特异性，同一种药物对不同的患者会产生不同的 药效，k o s a i h i r aa f 3 0 】将即将用药患者的癌细胞固定在金膜芯片的表面，然后用药 物浸没癌细胞，通过s p r 技术实时检测药物和癌细胞的相互作用，从而建立了一种 快速、无标记、实时的药物评价方法。 ( 3 ) 抗体抗原分子相互作用研究 k a r l s s o n 3 1 】等以s p r 技术研究h i v 1 核心蛋白p 2 4 与其单克隆抗体m a b 的结合 动力学由此证明了抗体重链片段为抗体亲和性的重要结构基础，而轻链片段则在 稳定抗体抗原互作时起作用，从而为免疫球蛋白结构功能研究提供重要依据。s p r 技术因其能实时动态反映生物分子的相互作用而在肿瘤研究及新药开发中得到广 泛的应用。其中应用s p r 在体外研究肿瘤细胞中r a s 癌基因的蛋白功能方面取得了 重要的进展【3 2 - 3 7 】。 1 2 局域表面等离子体共振( l s p r ) 及其应用 局域表面等离子体共振( l o c a l i z e ds u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，l s p r ) 是贵金属 2 董主垒垫鲞墅塾旦堡耋雪笠塑王基堡咝堕! 生! 呈盟竺望垡壁盟堑壅笙= 童 纳米粒子的传感性质最重要的光谱表现形式之一，是一种由入射光( 电磁场) 与金属 纳米粒子表面自由电子间相互作用产生的物理光学现象：入射光激发金属粒子表 面自由电子发生集体振荡，当入射光频率与自由电子集体振荡频率相等时达到共 振，并在紫外可见消光光谱中表现出特征消光峰【3 8 】。最简单的纳米颗粒光学响应 模型是m i e 理论【3 9 1 ，描述长波长段球形金属颗粒的消光量。具体形式如下： e ( 九) = 【2 4 i i n a a j e m 驯2 l l n ( 10 ) i ：i ( s r n 2 y - , m ) 2 + g i 2 ( 1 ) 其中，e ( 九) 为消光量，即吸收和散射的总和；n a 是纳米颗粒的局部密度；a 是 金属纳米球体的半径；m 是金属纳米球体周围介质的介电常数( 假设为正实数， 且与波长不相关) ；九是入射光波长，j 是金属纳米球体介电常数的虚部；，是金属 纳米球体介电常数的实部。容易看出，当分母中的共振项 ( 8 r + 2 m ) 2 + j 2 】接近零时， 即达至utl s p r 的共振条件【4 0 4 2 1 。 金、银、铂等贵金属纳米粒子均具有很强的局域表面等离子体共振效应，它 们在紫外可见光波段展现出很强的光谱吸收，且材料的微观结构决定其吸收光谱 峰值处的吸收波长【4 3 副】。当金、银、铂金属纳米粒子被入射光激发时，因内部自 由电子的协同振荡而产生局域表面等离子体共振，该金属纳米结构表面的局域电 磁场被极大增强，展现出强烈的表面等离子体共振吸收【4 5 1 。 l s p r 性质与纳米粒子的组成、尺寸、形状、粒子间距和周围介质折射率等因 素有关【46 。利用金纳米粒子的局域表面等离子共振对外围介质变化的敏感性可以 制备各种传感器件。例如利用外围介质的组成、形状、大小、局域传导率的变化， 从而获得局域表面等离子体共振光谱，对其光谱进行分析，可以研究纳米粒子的 微观组成。同时还可以作为化学传感器和生物传感器，运用光学来检测生化分子 相互反应的参数。这种技术在光电子器件、传感技术、生命科学等领域具有重要 的应用。 ( 1 ) 水相中的l s p r 生物传感应用 s a s t r y 47 】利用银溶胶的传感性质检测生物素抗生物素识别前后的光谱变化。 首先通过a g s 键将含巯基的生物素结合到纳米粒子表面，然后向其内加入一定量 的稳定剂确保与生物分子结合后溶胶的稳定性( 同样的实验，金溶胶包覆生物素 后较为稳定，无需稳定剂) 。最终实现对抗生物素的检测。 1 9 9 6 年，m i r k i n 等首次将胶体金的l s p r 性质应用于d n a 实验中【4 8 1 。此后该小 组利用金纳米粒子l s p r ( 对周围介质、粒子间距变化敏感) 性质以及互补d n a 链 第一章基于金纳米颗粒局域表面等离子共振吸收( l s p r ) 生物传感的研究 间碱基配对的特点，精巧地设计了多核苷酸单碱基缺陷的检测实f 4 9 1 。e n g l e b i e n n e 于1 9 9 8 年第一次真正意义上将金纳米粒子l s p r 性质应用于免疫传感【5 引，负载抗体 的金纳米粒子与相应抗原结合的过程中，引起粒子周围介质折射率的不断变化， 从而导致消光光谱的变化，通过实时跟踪6 0 0 n m 处消光峰强的变化，实现对免疫识 别过程的检测。自此揭开了金纳米粒子应用于生物传感的新篇章1 5 卜5 2 】。 ( 2 ) 局域表面等离子体共振传感膜【5 3 】生物传感应用 王烨等人提出了一种采用聚电解质作为自组装材料，通过静电相互作用，将 金纳米粒子组装于玻璃基片上制备l s p r 传感膜的方法。并利用p d d a 的强吸附力 与p v t c 结构上规整性的特点有效地控制了l s p r 传感膜中金纳米粒子的单分散 性，提高了传感膜的稳定性和重现性。具有制备过程简单、组装时间短且可进行 多层组装等特点。利用胶体金纳米粒子与聚电解质静电引力以及纳米粒子间静电 斥力共同作用，制备了粒子分布均匀、单分散性好、稳定性高和重现性好的l s p r 传感膜。这种聚电解质静电组装技术制备l s p r 传感膜的方法具有操作简单、无需 特殊仪器、能够实现大面积组装和纳米粒子密度可通过调整组装时间进行调控等 特点。采用该方法制各出的l s p r 传感膜消光峰半峰宽窄，对其表面附近折射率变 化敏感，具有较高的灵敏度；而其高稳定性、较好的重现性使得该l s p r 传感膜能 够应用于多种环境下的实时监测。 n a t a n 等在自组装方法制备l s p r 传感膜方面做了早期工作【5 4 巧5 1 。证明金纳米粒 子可以从溶胶中转移到玻璃基片表面，即羟基化的基片与具有氨基或巯基基团的 硅烷试剂通过共价键结合，再利用氨基或巯基与胶体金、银纳米粒子作用得到贵 金属纳米粒子单层膜。 2 0 0 0 年，o k a m o t o t b 组首次利用金纳米粒子膜表面悬涂聚合物，来证明这种自 组装膜对周围介质折射率的变化具有光学敏感性。而且随着聚合物膜厚度的增加， 峰位发生红移并伴随着峰强的增强【5 6 】。但o k a m o t o 并未将此工作延续到生物检测 中。直至t j 2 0 0 2 年，n a t h 和c h i l k o t i 才第一次将此方法制备的膜层材料成功地应用于 生物传感【5 7 】，将组装好的金纳米粒子单层膜用巯基丙酸( m p a ) 修饰，利用m p a 的 巯基与金共价结合并通过另一端官能团羧基与生物分子氨基的共价成酯，将抗体 固定于基片上，最终达到免疫检测的目的。 2 0 0 2 年v a nd u y n e 首次将此方法制备的银纳米粒子膜应用于生物传感【5 羽。成功 地将三角板( 约1 0 0 n m 宽，5 0 n m 高) 银纳米粒子传感膜应用于生物素链菌素这一 4 董主垒垫鲞墅塾旦丝垂亘笺塞王基堡咝堕! 兰兰垦2 圭塑堡壁塑堕壅笙二垩 体系。三角板银纳米粒子传感膜表面修饰生物素后，浸于1 0 0 n m 的链菌素溶液中， 引起l s p r 消光峰发生2 7 0 n m 的红移。2 0 0 3 年，v a nd u y n e 等在此实验的基础上做 了进一步地改进。将玻璃基片换成云母用以增强银与基片的结合能力，并对生物 素抗生物素体系的免疫识别过程进行实时监测，表明此传感膜在生物、医药和环 境科学等方面的应用前景【5 9 】。2 0 0 5 年v a nd u y n e 首次将此传感膜应用于临床诊断中 删。他们利用- - n 治实验模式，将a m y l o i d pd e r i v e dd i f f u s i b l el i g a n d s ( a d d l s ) 的抗 体a n t i a d d l 共价固定于传感膜上，对a d d l 以及二抗进行检测，以确定a d d l 的 浓度。a d d l s 和a n t i a d d l 抗体随着a d d l 的浓度变化l s p r 峰位发生不同程度的 位移，同时得至u a d d l 的两个抗原决定簇与a n t i a d d l 抗体的结合常数7 3 x 1 0 1 2 m 和1 9 5 x 1 0 8 m 。此实验是对病人脑提取液进行的检测，从而证明了此l s p r 传感膜 能够应用于临床诊断。 ( 3 ) l s p r 在光纤生物传感领域的应用【6 l 】 陈雯菁等人研究了金属纳米颗粒的局部表面等离子体共振( l s p r ) 行为，采用 离散偶极近似( d d a ) 的方法，从理论上分析了金属纳米颗粒的尺寸，形状对其传感 灵敏度的影响：椭球体纳米颗粒的消光谱对于外界折射率的变化最不敏感，而尺 寸最小的三角形纳米银颗粒具有最高的折射率灵敏度。 随着纳米加工技术的发展，金属纳米颗粒或阵列结构局域表面等离子共振技 术得到广泛的关注。入射光与金属纳米结构颗粒表面自由电荷密度振荡藕合，产 生局域表面等离子体共振，出现很强的共振吸收光谱。共振吸收波长与纳米颗粒 的结构、形状、尺寸、分布以及周围环境的介电系数相关。大量无序金属微纳米 颗粒的获得主要采用化学合成方法，有序微纳颗粒、阵列结构的制作则是采用聚 合物小球排列掩模、电子束刻蚀、聚焦离子束刻蚀等方法。后两种方法加工成本 昂贵，但能够获得任意大小、形状、间距的纳米颗粒阵列结构。 l s p r 的高场局域性使得基于l s p r 效应的纳米金属颗粒结构传感器可实现单 个分子探测，应用于d n a 分子生物识别和痕迹气体探测。将产生l s p r 场的金属微 纳结构结合拉曼光谱技术，可形成表面增强拉曼散射效应，它能将吸附在基底上 的分子的拉曼散射信号增强1 0 4 1 0 1 0 倍，提高对目标分子的识别能力。与传统的s p r 方法比较，l s p r 共振吸收波长可通过改变阵列结构或者颗粒形状调节，它的空间 分辨率高，达到单纳米粒子水平，即可将传感芯片做到非常小，甚至实现人体内 探测；l s p r 的小分子探测能力更为优异，单个纳米颗粒比阵列结构具有更高的灵 第一章 基于金纳米颗粒局域表面等离子共振吸收( l s p r ) 生物传感的研究 敏度；它与商用的仪器相比，探测方式更为简单，成本更低。因此研究金属微观 结构中表面等离子共振波( s p w ) 激发、传输、增强等特性可有效推动表面等离子体 共振技术在探测传感领域的发展和应用。 1 3 金纳米粒子形貌对l s p r 白c j 影响及其应用 很多文献报道过，l s p r 性质与纳米粒子的组成、尺寸、形状、粒子间距和周 围介质折射率等因素有关。 1 3 1 球状金纳米粒子 迄今为止，已有许多文献报道利用物理辐射的方法制备金纳米粒子【珏8 2 1 。化 学还原法制备金纳米粒子，还原剂使用柠檬酸钠【8 3 8 5 】是最经典、也是应用最广的。 早在1 9 5 1 年t u r k e v i t c h 8 6 】便报道了采用柠檬酸钠可以从金的三价化合物中还原出 金纳米粒子，1 9 7 3 年f r e n s 8 7 】通过改变柠檬酸钠与金之间的比例制备出尺寸在 1 6 1 4 7 n m 连续变化的金纳米粒子。沈理明等人【8 8 1 以金片作阳极，铂片作阴极，以 十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 、四辛基溴化铵、丙酮、环己烷的混合体系为电解 液，超声电解l o m i n ，制得粒径为1 0 4 0 n r n l 拘金粒子。w a n g 等【8 9 1 利用直接电沉积的方 法在i t o 导电玻璃上沉积了粒径2 0 3 5 n m 的金纳米球。 利用吸附于球状金纳米粒子表面的生物分子发生识别作用后引起纳米粒子不 同程度聚集，得到的l s p r 光谱是周围介质折射率与粒子间距共同变化的结果。本 实验室王媛已考察三种粒径( 3 5 r i m ，9 0 h m ，1 3 0 n m ) 金纳米球吸收峰对周围介质折 射率的响应：将金纳米直接电沉积于i t o 玻璃表面，改变周围介质的折射率进行 紫外可见吸收光谱检测。结果表明，随着折射率的增大，由于不同折射率溶剂对 局域表面等离子体共振电磁场微扰程度不同的结果，可见吸收光谱峰位发生红移 且伴随着峰强的增高，与m u l v a n e y 等【9 0 】通过m i e 理论计算得出的结论相似。大粒 径的纳米金粒子传感膜的灵敏度明显高于较小粒径金粒子。由此可以看出，在检测灵 敏度范围内，较大粒径的金纳米粒子膜的光谱吸收峰位对周围介质折射率变化的响应 可更好的应用于光学传感。另外，金属纳米粒子团聚可得到较强的s e r s 信号【9 l - 舛1 ， 可进一步提高s e r s 的灵敏度。 1 3 2 棒状金纳米粒子 根据m i e 理论【9 5 】，粒子粒径越大，其表面等离子体共振吸收对粒子周围介质 折射率变化越敏感。金纳米棒( 图2 ) 与球形金纳米粒子相比在长波长方向出现一 新的l s p r 峰。多数文献报道的金纳米棒的制备【9 6 】都需引入软模板，也有文献报道 6 墨主坌塑鲞塑塾旦蔓耋画笠曼苤堑堕堕! 坚! 墅竺塑焦壁堕堕壅 蔓二至 通过自组装将纳米金组装于载体上，引入表面活性剂，使金纳米在载体上呈线状 排列f 9 7 。9 8 】( 图3 ) ，这些方法都需引入模板剂 9 9 1 、表面活性剂【l 删以及巯基烷烃化合 物保护剂1 0 0 2 1 ，这些有机试剂的使用，尤其是高分子有机物模板剂，不仅会对环 境造成不同程度的污染，还会降低金属纳米粒子的表面活性。 以m u r p h y 和l i z - m a r z a n 领导的课题组为代表，在控制合成不同长短轴比率的金 纳米棒颗粒方面，做了大量的工作【1 0 3 0 4 。他们采用“晶种生长 的方法，使用高浓 度( 通常为0 2t o o l l ) 的十六烷基三甲基溴化铵( c 吖出) 为模板剂和稳定剂【1 0 3 - 1 0 4 ，制备 c t a b 分子保护的金纳米棒颗粒。然而，这些c t a b 分子对细胞、蛋白质等生物分 子具有生物毒性【1 0 5 舢6 1 ，而且金纳米棒表面吸附的c t a b 双分子层会阻碍金纳米棒 与生物分子的偶联【1 0 7 1 ，因而限制了金纳米棒在生物检测和医学等领域的广泛应 用。所以如何消除c t a b 的影响实现生物修饰是金纳米棒颗粒在涉及生物体系应用 中需要解决的关键问题。 l s p r 峰的位置主要取决于以下几个因素：纳米粒子的大小、形状、表面电荷、 环境介质条件等。与球形的纳米金颗粒相比，棒状的金纳米颗粒具有更为特殊的 l s p r 性质。球形的纳米金颗粒表现为单一的l s p r 峰，而棒状金纳米颗粒则具有 横向和纵向两个l s p r 峰【1 0 8 1 。其中纵l f i - l s p r ( s p r ) 峰的位置取决于金纳米棒颗 粒的长短轴比，因此通过制备不同长短轴比的金纳米棒颗粒，可以实现其人为 调控1 1 0 9 1 。 图2 棒状金纳米吲1 7 第一章基于金纳米颗粒局域表面等离子共振吸收( l s p r ) 生物传感的研究 图3生物修饰的金纳米棒示意图【1 1 0 】 1 3 3 核壳结构金纳米粒子 迄今为止，国际上不同的研究小组采取各种方法制备出不同的具有核壳结构 的纳米复合颗粒，包括化学镀、化学沉积、化学还原和自组装等【1 2 3 1 。对于金纳米 壳球体来说，比较常见的是h a l a s 等人制备的金纳米壳球体a u s i 0 2 ，制备过程通 常分为5 个步骤，如图4 所示。首先，制备一定粒径的s i 0 2 水溶胶，经离心、超声再 分散置换为乙醇相，重复3 次以除杂质；清洗好的s i 0 2 醇溶胶与y 氨基丙基三乙氧 基硅烷( a p t e s ) 混合，通过a p t e s 修饰s i 0 2 颗粒使其表面氨基化；接着用硼氢化钠 还原法制备1 3 r i m 的胶体金溶液作为后续实验的种子【l2 4 】；然后，金颗粒通过静电 作用吸附至u s i 0 2 颗粒表面，形成a u a p t e s s i 0 2 纳米复合颗粒；最后，在甲醛的 作用下，更多的金被还原，并以胶体表面的金颗粒作为晶核在s i 0 2 颗粒表面形成完 整的金壳，其核壳比可通过反应试剂的浓度自由控制。这种方法制备的金纳米壳球 体的核壳组成也可任意组合，常见的壳层金属为a u ，a g ，c u 和p t 等，常见的核为 s i 0 2 , a u 2 s 和t i 0 2 等。 o 一：q 图4 利用分子自组装和胶体还原化学制备具有一定 核壳比例的金纳米壳球体示意图 8 薹王垒绝鲞塑塾旦塑奏重量塑王苤堡堕堕! 兰苎里堕皇塑垡壁箜堑窒蔓二雯 将金纳米壳球体包埋于基体材料中，在共振波长处使其受到激光照射而产生 等离激元共振，从而发生光学吸收并转变成热释放到局部环境中。s e r s h e n 等人发 展光学活性的金纳米壳球体与热敏水凝胶的复合物，用来光热调制药物释放。氮 异丙基丙烯酸铵( n i p a a m ) 和丙烯酰胺( a a m ) 共聚物显示一个较低的临界溶解温度 ( l c s t ) ，只比体温稍高。当温度超过l c s t 时，水凝胶解体，引起水凝胶基体内可 溶药物的释放。另外，复合物水凝胶能够响应重复的近红外照射，多次释放蛋白 质，这样，人们可以自由地控制药物释放的时间和次数。 免疫分析自问世以来发展迅猛，建立了多种检测方法。但是，这些技术各自 存在不同程度的局限性【1 2 5 】。h a l a s d x 组探索建立了一种基于等离激元光学共振原理 的、以金纳米壳球体为基底的均相免疫分析新方法。与胶体金【1 2 6 】类似，金纳米壳 球体表面的金壳同样能稳定而又迅速地吸附蛋白质；而且通过改变核和壳层的相 对尺寸，其等离共振吸收峰能位移到可见光乃至中红外光；另外，由于金纳米壳 球体在全血中十分地稳定，在近红外区通过组织的透射也是最理想的【1 2 7 】。因此， 其近红外光学特征很可能使其成为一种理想的全血免疫检测手段。 在分析物存在的情况下，基于单分散纳米壳球体的聚合，利用吸收峰变化检 测抗原和抗体相互作用的实验原理如图5 所示。在添加抗原前，在近红外区，金纳 米壳球体的溶胶体系拥有一个强的消光峰。一旦样品中添加分析物，结合抗体的 金纳米壳球体，则通过抗原和抗体的桥联作用而发生聚合，其等离子共振光谱明 显地不同于单分散纳米壳球体的等离子共振光谱。检测金纳米壳球体聚合形成的 最直接方法是，在单个纳米壳球体等离共振频率处，监控单个纳米壳球体等离共 振消光峰下降来定量存在。 j ， 、，p。“：j 游 豢念j ，豢黪 每i 。私。# 、 图5 根据金纳米壳球体吸收峰变化检测抗原和抗体相互 作用的实验原理示意图 9 第一章基于金纳米颗粒局域表面等离了共振吸收( l s p r ) 生物传感的研究 t a m 等人【1 2 8 1 研究了包埋介质的折射率对金纳米壳球体等离激元共振的影响。 等离激元共振响应随着增长的绝缘体基体折射率而位移到较长的波长。对不变核 壳比例的纳米壳球体来说，等离共振消光峰的位移随着绝对颗粒尺寸的增长而增 长。另外，孙玉刚等人【1 2 9 】以银纳米颗粒为模板，制备出金纳米壳，这是一种空的 纳米壳。和接近大小的金胶体相比，这些金纳米壳的等离共振吸收峰红移较大。 另外，即使和比金纳米壳更小的金胶体相比，金纳米壳的表面等离共振显示出对 环境的变化更为敏感。 但是，由于这一领域的科研工作刚刚起步，许多问题仍需进一步深入探讨。 例如：金纳米壳球体的规模化制备工艺尚不成熟，单分散性和颗粒尺寸分布有待 提高，金纳米壳球体的生物学特性研究较少；在诸多应用中涉及的基本原理需要 进一步展开研究【1 3 们。 1 4 本论文的选题目的 纳米材料因其具有独特的光学性质成为纳米材料领域中热门的研究课题之 一，典型的光学特性有表面等离子体共振吸收，局域表面等离子体共振吸收，以 及表面增强拉曼性质。在生物传感器领域引入的纳米材料可以用来固定生物分子 或是标记生物分子，广泛应用于研制和发展具有超高灵敏度、超高选择性的生物 传感器。由于金纳米粒子的性质对粒子的尺寸、形状相当的敏感，因此，制备可 控尺寸及形状的金纳米微粒变得越来越重要。其中对球状金纳米的研究最多。虽 然球状金纳米粒子较其他形状的金纳米粒子的稳定性要高，但是其粒径的增长有 局限性，所以灵敏度也具有一定的局限性，已有报道称，棒状金纳米的灵敏度要 高于球状金纳米粒子，但是棒状金纳米粒子在制备过程中要加入稳定剂，表面活 性剂等，不仅会对环境造成不同程度的污染，还会降低金属纳米粒子的表面活性。 本文的理论基础是，金纳米粒子的光学性质受其尺寸，形状的影响，且金纳米粒 子的粒径越大，灵敏度越高，本文通过控制金纳米的聚集，形成金纳米簇，增大 金纳米粒子的尺寸，提高金纳米传感的灵敏度。 另外，为了更方便的应用，常将制备好的金纳米固定到载体上，常需引入偶 联分子，该方法过程冗长，操作复杂。本实验室曾采用一步电沉积的方法，电解 亚氰金化钾，在i t o 玻璃上合成了小粒径金纳米球，并将其很好的用于直接电催化 和固定酶。后又用无毒物质氯金酸代替亚氰金化钾，不引入模板剂、偶联剂等有 机分子，一步法在透明、导电、廉价的i t o 玻璃上可控合成不同粒径及形状的金纳 1 0 茎王全塑鲞塑蕉旦垡室亘笠查王基堡里堕( 坚墨2 生塑堡壁堕堕壅 釜二雯 米粒子。本文在此基础上，采用电化学沉积法合成了不同大小的球状金纳米粒子， 研究了不同尺寸的球状金纳米粒子局域表面等离子共振性质，并将其运用于生物 传感器中。为了进一步提高传感器的灵敏度，电化学合成了簇状金纳米粒子，优 化了实验条件，研究了介质折射率与局域表面等离子体共振吸收的关系，并以 s t r e p t a v i d i n b i o t i n 年i m - i g g g o a ta n t i - m - i g g 体系为例，研究了基于簇状金纳米粒子 l s p r 生物传感器的性质，为进一步拓展l s p r 生物传感器