（生物化学与分子生物学专业论文）棉纤维特异表达基因及启动子的克隆.pdf

摘要 中国虽然是世界最大的棉花生产国和消费国，但在棉花纤维的内在品质方面却与美国等其它 一些产棉国存在很大差距，因此，培育品质优良的棉花是当前棉花育种的一项紧迫的任务，但由 于棉花纤维品质与产量之间的遗传负相关性，给用传统育种技术同步改良纤维品质与产量带来了 很大的障碍，纤维品质改良进展缓慢。 基冈工程作为棉纤维品质改良的一个新的研究领域，有两条途径，一是分离鉴定出与纤维品 质相关的基因，深入了解棉纤维发育的分子机制，通过增加和减少这些与棉纤维品质相关的蛋白 质或酶的表达水平，来达到改良纤维品质的目的，另一途径是从其它生物中选择有潜力的目的基 因，将其导入棉花，以提高纤维品质。组成型启动子c a m v3 5 s 虽然能驱动外源基因的稳定表达， 但其在整个植株中的表达消耗了棉花体内大量的基础物质，也影响了植物的生长发育。因此，克 隆在棉纤维中特异表达的启动子将为遗传工程改良棉纤维提供有效的工具，在品质改良中具有重 要的实际意义。 本研究以陆地棉苏1 2 为试材，对叶片和纤维进行差减杂交，得到l o 条在棉纤维中差异表达 的片断并克隆得到其中一条g h t i p 的基因全长及其部分启动子序列，研究结果如下： ( 1 )优化了棉花m r n a 差异显示体系，利用改良的c t a b 法分别提取棉花叶片和纤维的总 r n a ，并对影响m r n a 差异显示的三个关键因素：引物浓度、d n t p 浓度和m 9 2 + 浓度进行调整， 得到适合比较棉花纤维和叶片的差减体系。 ( 2 ) 通过m r n a 差异显示技术，共获得2 4 个差异条带。经过反向斑点杂交的筛选，得到1 0 条棉纤维特异表达片段，通过n c b i 的b l a s t x 和b l a s t n ，对他们进行了初步分析。 ( 3 ) 在差异片段序列的基础上，应用s m a r t 法获得了其中一条差异片段c y g l l 的全长 c d n a ，b l a s t n 分析发现它是编码酪氨酸激酶相互作用蛋白y 亚基的基因g h7 ，p ，通过与d n a 序列比对，发现它含有两段内含子区。 ( 4 ) 经染色体步移技术得剑g h t i p 基因部分5 端上游序列，经p l a n tc a r e 分析结果表明： 此序列中含有t a t a b o x 、c a a t b o x 及h s e 、s p l 、g t l 等启动调控元件。 ( 5 )将获得的g h 卿基冈部分启动子序列和g u s 基因连接，构建植物表达载体，转入烟草。 转基因烟草的g u s 组织化学染色确定了本段序列的启动功能。 关键词：m r n a 差异显示，组织特异性，启动子 a b s t r a c t c h i n ai st h el a r g e s tc o r o np r o d u c i n ga n dc o n s u m i n gc o u n t r yi nt h ew o r l d ，b u tt h ef i b e rq u a l i t yi s n o ta sg o o da st h a to ft h eu s a n do t h e rc o t t o n p r o d u c i n gc o u n t r i e s s oi t sa l lu r g e n tt a s kt od e v e l o p n e wc o t t o nv a r i e t i e sw i t hi m p r o v e df i b e rq u a l i t y t h r o u g ht r a d i t i o n a lb r e e d i n gt e c h n i q u e s ，i ti sv e r y d i f f i c u l tt oi m p r o v et h ef i b e rq u a l i t ya n di n c r e a s ec o t t o np r o d u c t i o ns i m u l t a n e o u s l y t w os t r a t e g i e sc a nb eu s e dt oi m p r o v ef i b e rq u a l i t yt h r o u g hg e n e t i ce n g i n e e r i n g o n es t r a t e g yi s i s o l a t i n ga n di d e n t i f y i n gf i b e rq u a l i t y r e l a t e dg e n e s ，s t u d yt h em o l e c u l a rm e c h a n i s m so fc o r o nf i b e r d e v e l o p m e n t ，t h e ni n c r e a s ea n dd e c r e a s et h ee x p r e s s i o no ft h e s eq u a l i t y r e l a t e dg e n e s a n o t h e rw a yi s s e l e c t i n gs o m eu s e f u lg e n e sf r o mo t h e rp l a n t sa n dt r a n s f o r m i n gt h e mi n t oc o t t o n c a m v3 5 sp r o m o t e r c a nm a k ef o r e i g ng e n ee x p r e s s e ds t a b l yi nc o t t o n ，b u tt h eg e n ei se x p r e s s e di nt h ew h o l ep l a n tr e s u l ti na l a r g ec o n s u m p t i o no fm a t e r i a la n d ab a da f f e c t i o no fp l a n tg r o w t h t h e r e f o r e ，t h ec l o n i n go f f i b e r - s p e c i f i cp r o m o t e rw i l lb ea ne f f e c t i v et o o lf o ri m p r o v i n gt h eq u a l i t yo fc o t t o nf i b e rt h r o u g hg e n e t i c e n g i n e e r i n ga n dh a sai m p o r t a n ta n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e i nt h i ss t u d y ，u p l a n dc o t t o ns u - 1 2w a su s ea sam a t e r i a la n ds p e c i f i ce x p r e s s i o ns e g m e n t so f c d n ai nc o r o nf i b e r sw e r es e p a r a t e df r o mt h o s ei nl e a v e sb ym r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a y 1 0c d n a s e g m e n t sw h i c ha r es p e c i f i ce x p r e s s i o ni nc o r o nf i b e r sw e r ei d e n t i f i e d ，f u l l - l e n g t hc d n a o fg h t i pa n d p a r to fi t sp r o m o t e rw e r ec l o n e d ，t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) c o t t o nm r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a ys y s t e mo p t i m i z a t i o n ：t o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o ml e a v e sa n d f i b e r su s i n gc t a bm e t h o d c o n c e n t r a t i o no fp r i m e r s ，d n l l pa n dm g ”，t h et h r e ek e yf a c t o r so fm r n a d i f f e r e n t i a ld i s p l a yt e c h n o l o g y ，w e r ea d j u s t e da n dt h ed i f f e r e n t i a ld i s p l a ys y s t e mw a so p t i m i z e df o r c o t t o nf i b e r sa n dl e a v e s ( 2 ) 2 4d i f f e r e n tc d n as e g m e n t sw e r es c r e e n e do u tt h r o u g hm r n a d i f f e r e n t i a ld i s p l a yt e c h n o l o g y 10 f i b e r ss p e c i f i cc d n as e g m e n t sw e r ei d e n t i f i e db ys c r e e n i n gr e v e r s ed o th y b r i d i z a t i o na n dp r e l i m i n a r y a n a l y s i sw a sc o n d u c t e dt h r o u g hn c b ib l a s t xa n db l a s t n ( 3 ) o nt h eb a s i so ff i b e rs p e c i f i cc d n as e g m e n t s ，af u l l - l e n g t hc d n aw a sc l o n e d u s i n gt h et o o lo f b l a s t n i ti sf o u n dt h a tt h ec d n ai st h eg e n eo fg o s s y p i u mh i r s u t u ma q u a p o r i ng a m m a t 疋a n dt h e d n as e q u e n c ec o n t a i n e dt w oi n t r o n s ( 4 ) p a r to ft h eg h t i p5 u p s t r e a ms e q u e n c ew a sc l o n e du s i n gc h r o m o s o m ew a l k i n gt e c h n o l o g y p l a n t c a r ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h es e q u e n c ec o n t a i n ss o m ep r o m o t e rc o m p o n e n t s ，s u c ha sc a a t - b o x ， t a t a b o x ，h s e ，s p la n dg t l ( 5 ) t h r o u g ht h el i g a t i o no fg h t l p5 u p s t r e a ms e q u e n c ea n dg u sg e n e ，p l a n te x p r e s s i o nv e c t o rw a s c o n s t r u c t e d g u sa s s a y so ft r a n s g e n i ct o b a c c oe x h i b i t e dt h ep r o m o t i n gf u n c t i o no ft h i sf r a g m e n t k e yw o r d s ：m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a y ，t i s s u es p e c i f i c ，p r o m o t e r 英文缩略表 v i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业 科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间：】刃年月j 2 ，e l 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即： 中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中 国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或 部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名： 导师签名：万厶澎 时间：z p 罗年 f 月肛1 7 1 时间：勿p 7 年 厂月f 乙日 中同农业科学院硕f 学位论文 第一章综述 第一章文献综述 棉花是纺织工业的重要原料，近年来随着纺织技术的发展以及国民需求的日益增长，人们对 棉花纤维在纤维强度和色泽等方面提出了更高要求，急需进行改良，以满足生产、生活的需求。 作为世界最大的棉花生产国和消费国，我国棉花在纤维的内在品质方面不及美国等其它一些产棉 国，而且品质单一。因此，培育品质更加优良的棉花是当前棉花育种的一项紧迫的任务，但由于 棉花纤维品质与产量之间为遗传负相关，给用传统育种技术同步改良纤维品质与产量带来了很大 的障碍，纤维品质改良进展缓慢。采用基因工程技术有望打破这类不良连锁，使棉花纤维品质与 产量得以同步改良( 刘进元，2 0 0 0 ) 。 基因工程改良棉纤维品质还是一个比较新的研究领域，但多方面的信息表明，它已成为棉花 研究方面优先考虑的领域。利用基因工程的手段，通过对棉花纤维发育相关基因以及基因间相互 关系的研究，了解它们在纤维发育不同阶段的功能及其与纤维品质的关系。既可以进一步了解棉 花纤维发育的分子机制，而且可以为定向改良棉花纤维品质提供有效的基因元件及纤维发育各个 阶段特异表达的调控序列。应用棉纤维特异表达启动子，可在棉纤维发育的特定阶段表达外源基 因，作为通过遗传工程途径改良棉纤维的有效工具，加速对纤维品质的重要指标如强度、细度、 长度等的改良，还可以给纤维增添新的品质性状，如抗皱、抗缩、色泽等( 于晓红，2 0 0 0 ) 。 因此，克隆棉纤维发育不同时期中启动活性较高的纤维特异表达的启动子是通过遗传工程途 径改良棉纤维的先决条件，在品质改良的整个过程中具有重要的理论和实际意义。目前世界上很 多实验室正在从事棉纤维优先表达基因的克隆及启动子的克隆，期望通过改变基因的表达来达到 棉纤维品质的改良。 1 1 棉纤维发育过程中基因表达的研究进展 棉纤维是由胚珠外珠被表皮层细胞经分化、突起、次生肇增厚等一系列过程发育而成的，其 发育过程受基因表达控制。利用基因工程的手段，从分子水平上阐明棉纤维细胞分化、发育的内 在机理，同时分离具有纤维细胞专一性的基因及启动子，将有助于人们通过遗传工程途径修饰棉 纤维发育进程、改良纤维品质。近几年来，通过分子手段研究棉纤维发育过程中基因与表达已取 得明显进展。 1 1 1 棉纤维发育过程概况 棉纤维发育的过程可人为的划分为四个时期：纤维原始细胞的分化突起、纤维伸长、次生壁 合成及脱水成熟。每个时期之间没有截然的界限，但都有其特定的内容和不同的特点，分别决定 着纤维的不同品质性状( r i n e h a r t ，1 9 9 6 ) 。 成熟的棉纤维由初生擘和次生肇组成，后者为棉纤维的主体部分。纤维细胞的分化和突起一 中国农业科学院硕 ：学位论文第。章综述 般发生在开花前数天到开花后l 2 天，胚珠外被表皮细胞开始出现两类细胞：亮细胞和暗细胞， 暗细胞于开花当天突起发育成纤维细胞( r a m s e ye ta l ，1 9 7 6 ) 。纤维细胞起始分化后，一般不再 分裂，而是持续地伸长，最后纤维长度可达其直径的1 0 0 0 3 0 0 0 倍，通常情况下胚珠表皮细胞 只有2 0 能最终分化为纤维( 尹承伊，1 9 9 4 ) 。 棉纤维细胞的伸长始于开花当天，持续约2 0 3 0d 左右，这一阶段的发育决定纤维的长 度性状。伸长期的纤维细胞核仁较大，说明生物合成旺盛，形成中央大液泡并占据了纤维的大部 分空间( t i w a r i ，1 9 9 5 ) 。纤维的伸长生长速率和其延续时间是决定棉纤维最终长度的关键因素， 海岛棉纤维长的原因就在于伸长最大速率期长，伸长停止期出现较晚( 董合忠，1 9 9 0 ) 。 次生壁合成开始于开花后1 6 4 0 天，与初生壁合成期有部分重叠，并延续至纤维成熟，生 长条件的不同可能造成合成期长短的差异。合成期纤维素迅速沉积，其沉积速率可达到初生壁纤 维素沉积速率的1 0 0 倍( a l e a n d e re ta l ，1 9 8 3 ) 。 开花后4 5 5 0d ，棉纤维细胞发育进入最后阶段，此时期纤维内的矿物质含量及酶活力、 水平等逐渐下降，成熟的纤维经脱水、坍缩，棉铃开裂吐絮并形成螺旋状捻曲，最后完成整个发 育过程( r i n e h a r t ，1 9 9 6 ) 。 1 1 2 纤维特异性基因及其表达 棉纤维发育是由基因控制的，这些基因在特定的内环境和外环境的相互作用下，以一定的时 间和空间顺序进行表达。应用现代分子生物学技术，通过对纤维细胞发育特定阶段的c d n a 文库的 差示筛选，自从1 9 9 2 年j o h n 和c r o w 首次报道纤维特异表达基冈e 6 的分子克隆后，用减法杂交等 差异筛选技术已分离出1 0 余个纤维发育相关基冈( 刘进元等，2 0 0 0 ) 。 基冈表达期特征功能 参考文献 ( 开花后 的天数) e 65 2 87 4 7b p 的开放阅读框编码一有2 3 8 朱知 j o h ne t a l ， 个氨基酸的信号肽1 9 9 2 1 9 9 6 h 61 0 3 07 1 1b p 的开放阅读框编码富含脯 形成次生壁的基质，j o h ne t a l ， 氨酸的2 1 4 个氨基酸是一种保温和防干1 9 9 5 燥的保护膜 r a c 9 5 3 55 7 9b p 的开放阅读框编码一含1 9 6 控制纤维素的沉积 p e a r 甜冽， 个氨基酸的蛋白，具有加工蛋白g1 9 9 5 的特性，其表达水平低f r a c l 3 r a c l 35 3 5 与r a c 9 蛋白有9 2 的同源性同r a c 9p e a r e t a l ， 1 9 9 5 f b 坨a1 5 3 51 0 6 4b p 的开放阅读框编码一长 形成次生壁，防止棉 r i n e h a r te t 3 5 4 富含谷氨酸和赖氨酸的氨基酸纤维失水是纤维的 冽， 2 中同农业科学院硕l 学位论文= 第。章综述 1 多肽 结构成分 1 9 9 6 f s 56 1 4与基因历具有9 6 相同的信 与细胞肇蛋白或蛋 o r f o r de t 号肽 白酶有关a l ，1 9 9 7 f s 66 1 4 3 6 0b p 的开放阅读框编码一含1 2 0 与初生壁蛋白形成 o r f o r dp f 个氨基酸的脂转移蛋白的信号肽有关 a l ，1 9 9 7 f s l 76 1 41 1 3 3b p 编码一含2 7 6 个氨基酸 与细胞结构蛋白有 o r f o r de t 富含脯氨酸的信号肽关讲，1 9 9 7 g h e x l6 2 47 7 4b p 的开放阅读框一含2 5 8 个 在膨压调控下与纤 o r f o r de t 氨基酸的信号肽维的伸长有关 a l ，1 9 9 8 b 61 5 3 57 8 9b p 的开放阅读框编码一含 未知 j o h n ，e t a l 2 3 6 个氨基酸的信号肽1 9 9 5 p 65 2 03 6 0b p 的开放阅读框编码长为2 3 6 参与蜡质层和角质m a e t a l ， 个氨基酸的脂转移蛋白的信号肽层纤维素的合成 1 9 9 7 c e l a j1 7 3 52 9 2 2b p 的开放阅读框编码- - 9 7 4 个 纤维素的合成 p e a r 甜耐， 氨基酸的纤维素合成酶的催化基 1 9 9 6 u p 35 2 23 6 0b p 开放阅读框编码的含1 2 0 参与蜡质层和角质 m ae t a l ， 个氨基酸的l t p 单肽层纤维素的合成1 9 9 5 g h 35 2 2 同即6同u 限6r u a n e t a l ， 1 9 9 7 g h a c p 2 2 04 0 8b p 开放阅读框编码一含13 6 与纤维合成的膜脂 s o n ge t a l ， 个氨基酸的酸基载体蛋白有关1 9 9 7 f s l 86 2 02 1 3b p 开放阅读框编码的含7 1 未知 o r f o r de t 个氨基酸的单肽 谢，1 9 9 9 s s 35 3 5编码蔗糖合成酶 与纤维细胞纤维素 r u a ne t a l ， 的合成有关1 9 9 7 ；1 9 9 8 g h c a p l o 1 71 4 1 3b p 开放阅读框编码一含4 1 7 与纤维细胞骨架的 k a w a ie t 个氨基酸的腺氨酸化酶蛋白形成有关 a l ，1 9 9 8 表中的人部分基因，虽然在其他组织中有低量表达，但在纤维中均是优势表达的。至于上述 基因在纤维发育过程中所起的作用，大部分还有待进一步深入研究。已经得到证实的研究包括： e 6 基因在纤维组织初生壁合成结束和次生壁合成开始时含量特别高，同时e 6 基因的启动子具有 纤维特异性和发育程序调控基因表达的功能，能启动外源基因在转基因棉花纤维细胞中特异表达 ( j o h ne ta l ，1 9 9 2 ) 。1 - 1 6 基冈在初生壁合成时期开始转录m r n a ，开花后l o 2 5 天的纤维中均 有h 6 m r n a 的存在，但仅在开花后1 5 天或更晚时期才开始在纤维中翻译蛋白，而在开花3 5 天以后 蛋白含量又开始下降，说明h 6 基因的表达既有转录水平又有翻译水平的调控。h 6 蛋白主要在纤 维素合成期表达，这很可能与次生壁合成有关( j o h ne ta l ，1 9 9 5 ) 。纤维特异基冈r a c l 3 在开花 后2 4 2 8 天，即次生壁合成开始时达到表达高峰，说明r a c l 3 蛋白可能调节纤维细胞骨架的建 成( d e l m e r e t a l ，1 9 9 5 ) 。l t p 6 ( s o n ge t a l ，1 9 9 7 ) 和g h 3 编码脂转移蛋白( l 1 p ) ，主要在纤 3 中国农业科学院硕l 学位论文第一章综述 维发育的伸长期表达，其功能可能是转运磷脂，合成细胞膜，或分泌到初生壁外形成蜡脂层。f b l 2 a 为多基因家族，主要在初生壁合成后期和次生壁合成初期表达，连结有f b l 2 a 基因5 ，末端上游 2 3k b 的d n a 片断的乙酰辅酶a 还原酶基冈转化棉花，仅在转基因棉花的纤维中检测到还原酶 活性，且开花后1 5 天内还原酶活性很低，之后活性逐渐增加，在开花后2 5 3 5 天左右达到 最大。这说明f b 上，2 a 基因不仅具有纤维特异性性，而且可以发育调控( r i n e h a r te ta l ，1 9 9 6 ) 。 如上所述，纤维发育过程中的基因呈现出组织特异性和发育阶段性。这些基因表达的调控主 要在转录水平，也存在转录后及翻译后的调控。尽管这些基因的确切功能目前还不清楚，但它们 都是受发育调控，它们的表达特征表明其功能可能与纤维发育和品质形成及其调控密切相关。利 用分子生物学手段，研究纤维发育不同阶段特异表达基因的上游调控序列，从而为进行棉花的遗 传转化提供高效的启动子元件( 刘进元等，2 0 0 0 ) 。 1 2 基因工程在棉纤维品质改良中的应用现状 目前，在棉花育种中基因工程的应用主要是抗病性、抗虫害、增加纤维长度、提高纤维强度 和细度的改良，并已取得令世人瞩目的成就。利用基因：【程成功地培育出抗虫棉就是基因工程在 作物育种中应月j 的典范。在棉纤维品质育种中，采用基因| t 程手段所取得的成就主要有： 1 2 1 利用角兔蛋白基因等改良棉纤维强度 利用强度好，韧性优的外源蛋白基因来改良棉花纤维强度是棉花品质改良的重要领域。例如 国内外一些学者正在试图将蚕丝蛋白基冈和蛛丝蛋白基因转入到棉花中，以提高棉纤维的强度。 于晓红等从白兔d n a 中扩增出编码兔角蛋白的基因序列，采用花粉管通道法将其导入s g k 3 2 1 双 价抗虫棉中，研究测定发现棉纤维的绒长，比强度，麦克隆值等综合品质都得到了明显的改善。 j h o n 等把从棉花中克隆到的过氧化物酶基因连接到棉纤维特异启动子e 6 和b 6 后导入棉花，结果 使转基因棉花的纤维强度显著改善。张震林等( 2 0 0 4 ) 利用棉纤维特异启动子e 6 将兔角蛋白导入 棉花，得到的转基因植株纤维强度明显改善。c a n d a c eh 等把棉花的蔗糖合成酶基因导入棉花，不 仅提高了棉花产量，而且也显著改善了棉花的纤维品质( c a n d a c ee ta l ，2 0 0 7 ) 。 1 2 2 利用色素合成酶基因改变棉纤维的色泽 天然棉花纤维色泽种类非常单调，主要为白色，而纤维产品的染色加工往往会造成环境污染， 因此科学家们试图利用从动物，微生物及相关植物中克隆到的一些可改变纤维色泽的目的基因， 对棉花纤维色泽进行快速有效的改良。m c b r i d e 将从抗生链霉菌中分离的两r a 和0 r f 4 3 8 基因 与棉纤维特异启动子连接，通过农杆菌转化棉花，通过合成靛蓝色素的单加氧酶或双加氧酶，获 得了纤维色泽深度不同的转基冈棉花；他义将来源于大肠杆菌的t n a 和来源于红球菌的p 函基 因与棉纤维特异启动子连接转化棉花，转基因棉花纤维成浅蓝色( m c b r i d ee ta l ，1 9 9 6 ；1 9 9 8 ) 。 c a l g e n e 公司将黑色素合成基因m e l a n i n 导入棉花，得到的能产生深褐色或黑色纤维的转基因棉 花，现已有6 0 0 0 0 多英亩的种植面积。 4 中冈农业科学院顾f 学f 节论文第章综述 1 2 3 利用p h b 合成酶基因提高棉纤维品质的研究 聚羟基丁酸( p h b ) 是一种天然的可降解的热塑性聚脂，它的合成需要三种酶，即编码乙酞 乙酞c o a 还原酶的砷n 曰，编码p h b 合成酶的p h a c 和编码b 一酮硫解酶的p h a a 。由于植物本 身具有b 酮硫解酶，因此，要使植物生产p h b ，只需使植物具有合成乙酞辅酶a 还原酶和p h b 合成酶的能力，则新产生的棉纤维将具有天然纤维素及新多聚物的综和特性，达到对棉纤维品质 改良的作用。 1 9 9 6 年，j h o n 等将p h a b 和p h a c 分别与棉纤维特异启动子历和f b l 2 a 的启动子连 接，构建植物表达载体，运用基因枪转化技术，将p h a 曰和p h a c 基因共转化到陆地棉品种中。 获得表达外源基因肋n b 和p h a c 的转基因棉花，通过g u s 染色和电子显微镜观察都证实，这 些基因能在棉纤维中表达，并最终合成p h b ，从而获得了吸热性提高，导热性降低的转基因棉花 ( j o n ee ta l ，1 9 9 6 ) 。这项研究充分说明了遗传上程在棉纤维品质改良中的应用潜力，同时也证明了 来源于其它物种的外源基因在改良棉纤维品质和增加纤维新性状方面的应用前景。 利用基因工程改良纤维品质有两条基本途径，一是增加和减少某些与棉纤维品质相关的蛋 白质或酶的表达水平，这一途径需要分离鉴定出与纤维品质相关的基因。另一途径是从其它生物 中选择有潜力的目的基因，将其导入棉花，以提高纤维品质。虽然纤维品质改良可通过改变相应 棉花基因的表达来实现，但目前对控制棉纤维品质的基因还缺乏了解，所以第二种途径用得较多。 1 3 启动子研究概述 生物体内基因的表达受到体内、外各种理化因素的控制。与原核生物以操纵子为单位的点调 控不同，真核生物具有转录前调控，转录水平调控，转录后调控，翻译水平调控和翻译后调控等 多种基因表达调控系统。转化的外源基因能否在植物细胞中表达，首先取决于其转录的启动。启 动子是一段位于结构基因5 端上游区的d n a 序列，能活化r n a 聚合酶，使之与模板d n a 准 确地结合，并具有转录起始的特异性( t o m a s ，2 0 0 2 ) 。 1 3 1 启动子的一般特征 通过对多种基因启动子区的研究发现，绝大多数基因的启动子都具有共同的结构模式，大部 分植物基因转录起点为a ( 腺嘌呤) ，且两侧多为嘧啶碱基( l i ，1 9 9 8 ) ，在一2 5 一3 0b p 处 含有t a t a 序列，7 0 7 8b p 处有c a a t 区，一8 0 1 1 0b p 区含有g c 盒。通常将t a t a 区上游的保守序列称为上游启动子元件( u p e ) ，这些特定序列和结构共同作用确保转录准确而有 效地起始。 t a t a b o x 又称h o g n e s s b o x ，位于基因转录起始点上游约一3 0 5 0b p 处，它是决 定基因转录起始的关键( b a s e h o a re ta l ，2 0 0 4 ) 。t a t a 盒作为接合蛋白因子组装的起始位点，首 先结合蛋白因子t a t a 盒接合蛋白( t b p ) ，随后它再吸引结合其它蛋白因子，组装成前转录起 始复合物，从而决定启动子的活性( p e r s e n g i e ve ta l ，2 0 0 3 ) 。其保守序列为5 t c a c t a t a t a t a g 5 中国农业科学院硕f j 学位论文第章综述 3 ，受不同调节因子的作用，序列也有一定变化。最初认为t a t a 序列参与决定转录的方向，但 近年来的研究表明，t a t a 盒是没有方向性的。在b s p ( b o n es i a l op r o t e i n ) 基因的启动子中，反 向的t a t a 盒，即5 t i t a t a 3 ，仍能指导下游方向的转录，而且与t b p ( t a t a b o x b i n d i n g p r o t e i n ) 的结合能力与一般5 t a t a a a3 的启动子的结合能力相似( j a c ke ta l ，1 9 9 5 ) 。也有一 些基因没有t a t a b o x 或含有两个以上t a t a b o x ，如a c 转座酶基因启动子无t a t a b o x 及c a a t b o x ，基因的转录受起始因子( i n i t i a t o r ) 的调控，通过蛋白因子与启动子中的某些d n a 基序相互作用( f r i d l e n d e re ta l ，19 9 6 ) 。 在t a t a b o x 的上游约一8 0 1 0 0 b p 处一段1 0 bp 的共有序列称为c a a t b o x ，其 功能是调控转录的起始频率，其保守序列是5 g g g ( c t ) c a a t c t3 ( b e z h a n ie ta l ，2 0 0 1 ) 。研究 发现，在兔子的p 一球蛋白基因中，如果缺失掉c c a a t 盒，则其转录效率只有原来的1 2 ( d e l v o y ee ta l ，1 9 9 3 ) 。此外，该框中碱基的缺失也会导致转录效率的急剧卜降。这表明c a a t b o x 可能控制着转录的效率，有增强基因转录的作用。植物中与c a a t b o x 相结合的转录因子 由多基因编码的，因此植物中可能存在多种c a a t b o x 结合复合物和组合调控方式( e d w a r d se t a l ，1 9 9 8 ) 。 此外，上游启动子成分( u p s t e a mp r o m o t e re l e m e n t s ，u p e ) 除了c a a t b o x 以外，还包括 上游几百个核苷酸其它不同的启动子成分，如g c b o x 、i b o x 等基因调控序列。g b o x 和i b o x 与t a t a b o x 一样，都是普通启动子元件，它们的协同作用决定了基因的起始转录效率 ( i n o u ee t a l ，1 9 9 3 ) 。 1 3 2 植物启动子的分类 目前，对已经得到的植物启动子，按其作用方式大体可以分为3 类，即组成型启动子、诱导 型启动子和组织特异性启动子。此外还有两类比较特殊的启动子双向启动子和可变启动子。但这 种分类是相对的，在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其他类型启动子的特性。如在转基 因水稻中，组成型启动子c a m v 3 5 s 具有了组织特异性；同一启动子可能具有两种或两种以上的 特异性，双向启动子往往是组成型表达的，而可变启动子的表达通常旱组织或器官特异性。 1 3 2 1 组成型启动子 组成型( c o n s t i t u t i v e ) 启动子能调控基因在植物各个组织中均可以表达，而且在不同的组织 部位的表达水平没有明显差异。其特点是表达具有持续性，r n a 和蛋白质的表达量相对恒定，没 有时空特异性，不受外界的诱导，活性高。在植物基因工程中，为了使外源目的基因在植物中持 久高效的表达，以充分发挥外源基因表达产物的功能时，一般都使用组成型启动子。 ( 1 ) 异源组成型启动子 烟草花叶病毒基冈的启动子c a m v 3 5 s 包括t a t a b o x 、c a a t b o x 、反向重复序列和增 强子核心序列四个部分。将该启动子分为几个区段研究发现，不同区段能够对基因表达产生组织 特异性。a 区( 9 0 至+ 8 ) 主要在胚根、胚乳及根组织内表达( b e n f e ye t a l ，1 9 8 9 ) ；b 区( 3 4 3 至9 0b p ) 主要在地上部分表达( c h u ae ta l ，1 9 9 0 ) ，若3 5 s 启动子中有两个b 区将能使3 5 s 6 中围农、l k 科学院硕f 学何论文第一章综述 启动子的活性提高1 0 倍( k a ye t a l ，1 9 8 7 ) ，完整的c a m v 3 5 s 启动子是植物基因工程中应片j 最 为广泛的组成型启动子。 ( 2 ) 植物自身的组成型启动子 a c t i n 启动子是植物自身的一个高效表达的组成型启动子，因为a c t i n 蛋白是植物细胞骨架 的基本组分，所以该启动子可能在所有组织中都有活性( s e a g u l lr w ，1 9 8 9 ) 。a c t l 启动子是a c t i n 基因家族中使用最广泛的启动子。m c e l r o y d 研究水稻a c t l 基冈发现，基因5 端存在许多重复 元件：如l2b p 的重复序列g g l r 丌t a a g t t 和16b p 的序列a a g c c c c ( t ) a a a g t g c c t a 等。a c t l 基因57 端有一个3 1 3b p 长的内含子，它的存在对基因的表达起着至关重要的作用 ( m c e k o y de ta l ，1 9 9 0 ) 。此外，单子叶植物常用组成型启动子有玉米泛素基因( u b i q u i t i n ) 的启 动子等。 1 3 2 2 诱导表达启动子 诱导犁启动子是指植物组织在某些物理或化学信号的刺激f ，能驱动目的基因的转录水平大 幅度地提高的启动子。启动子内常含有诱导特异性序列和增强子和沉默子或类似功能的序列元件， 在外部各种胁迫下将会诱导一些相关基因表达，使自身对不良环境产生抵御和驱避，对有利环境 产生趋向，从而达到健康生长的目的。诱导表达相关基因的研究和启动子的分离，将为我们提供 更多表达调控的信息。 ( 1 ) 伤诱导表达启动子 许多植物在遇剑人为创伤或害虫造成的机械损伤时，含有伤诱导顺式作用元件启动子的基因 将会表达产生多种蛋白，如结构蛋白、水解蛋白、木质素以及蛋白酶抑制剂等。c l a r k e 等利用w i n 6 启动子与g u s 基因构成的表达载体转化烟草，创伤信号会诱导受伤叶片甚至其它未受伤叶片g u s 基因的表达。已知的创伤诱导启动子还包括泛素核糖体蛋白融合基因u b i 3 、马铃薯p i n 2 基因启 动子( j o a ne ta l ，1 9 9 5 ) 。 ( 2 ) 病原诱导表达启动子 启动子受各种非转化性病原菌侵染诱导，激活相应基因的表达，诱发产生一系列的防卫反应， 从而提高其抗病性。目前已知的病原诱导表达启动子包括：p r 2 基因编码p 一1 ，葡聚糖酶基因 上游( 6 0 7 一3 2 1b p ) 存在s a 反应元件，受( s a ) 水杨酸诱导性启动( s h a h 鲥a l ，1 9 9 6 ) 。 烟草h s r 2 0 3 j 基因启动子一1 0 6 - 7 9b p 之间的2 8b p 顺式作用元件，包含一个1 0b p 的回 文结构是病原物激发子的结合部位( p o n t i e re ta l ，2 0 0 1 ) 。 ( 3 ) 激素诱导表达启动子 激素在植物生长发育中起着重要的作用，目前研究主要集中在a b a 、g a 和乙烯等植物激 素诱导基冈表达的信号转导途径上。激素诱导基因的启动子中含有多个顺式调控元件，可以对不 同植物激素产生效应，以组合形式调节转录。受a b a 诱导表达的基因启动子主要有h v a 2 2 启 动子( s h e ne t a l ，2 0 0 1 ) 、胚胎发育晚期丰富的d c 3 启动子( 飚m e t a l ，1 9 9 7 ) 、p k a b a l 启动子 ( y a m a u c h ie ta l ，2 0 0 2 ) 等。有些基因的诱导表达并非只受一种因子的影响，如谷物中a 一2 淀 粉酶基因的表达是受赤霉素和蔗糖饥饿诱导表达的( c h e ne t a l ，2 0 0 2 ) 。 7 中罔农业科学院硕 。学位论文 第帝综述 1 3 2 3 组织特异性启动子 组织特异性启动子亦称为细胞或器官特异性启动子( o r g a no rc e l ls p e c i f i cp r o m o t e r ) ，在这类 启动子的调控下，基冈的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位，并往往表现发育调控的特 性( 王关林等，1 9 9 8 ) 。利用组织特异性启动子指导外源基因在植株发育过程中某一特异时空表达， 不仅能增加目的基因在区域的表达量，也可避免植物营养不必要的浪费，而且控制基冈在特定部 位表达，对提高转基因植物的食用安全性具有重要作用。因此，对组织特异性启动子的研究已经 成为近年来植物分子生物学的热点。 到目前为止，人们己经分离得到和研究过的组织特异性启动子达近百种之多。在植物的分生 组织、维管束组织、薄肇组织、花粉、种子和胚乳等几乎各种组织中都发现有组织特异性驱动外 源基冈表达的启动子( e d w a r d se t a l ，1 9 9 0 ) 。 ( 1 ) 叶片特异表达启动子( g r e e nt i s s u es p e c i f i cp r o m o t e r ) 许多叶特异表达的基因产物都参与了光合过程，因此对叶片特异表达启动子的研究，对于研 究相应基因的表达调控机理具有重要的意义和价值。杨予涛利用接头p c r 技术克隆得剑的 p n z i p 基因启动子，已证明其在叶片组织中的启动子活性比3 5 s 启动子高9 倍( 杨予涛等， 2 0 0 3 ) ，m i t s u t a k a t a n i g u c h i 在玉米中发现的c 4 p d k 基因的启动子也具有叶肉和叶舌的组织特异 性( m i t s u t a k a t a n i g u c h ie ta l ，2 0 0 0 ) 。 ( 2 ) 韧皮部特异表达启动子( p h l o e o ms p e c i f i cp r o m o t e r ) 韧皮部是许多植物病虫害的直接侵害目标，对这类启动子的结构与功能的研究将为植物抗病 虫基因t 程的研究提供有应用价值的启动元件。蒋浩等将笋瓜韧皮部蚩白p p 2 通过农杆菌介导 转化烟草，首次用转基因植物证明笋瓜p p 2 基因启动子可驱动外源基因在异源植物韧皮部及分生 组织中特异性表达( 蒋浩等，1 9 9 9 ) 。它同时发现杨树的b s p 基因启动子也具有韧皮部表达特性， 可介导g u s 基因在转基因烟草韧皮部特异表达( 蒋浩等，1 9 9 9 ) 。除高等植物中已发现的重要的 启动子外，引起在韧皮部特异表达的的启动子还有：水稻东格鲁杆状病毒( r t b v ) 启动子、竹节 花黄斑驳病毒( c o y m v ) 启动子、椰子腐叶病毒( c f d v ) 启动子、玉米蔗糖合酶1 ( s h ) 基因 启动子、油菜伸展蛋白基冈启动子、发根农杆菌r o l a 和r o l c 启动子等( 张海利等，2