（海洋生物学专业论文）管形藻属sinotubimorpha+wxli+et+zfding的分子系统学研究.pdf

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y l i a n gs p n o v 2 0 0 8 ) 序列一致并通过形态观察发现 二者具有相同的外部形态特征。故认定该种为g r a t e l o u p i ao r i e n t a l i s 的中国大陆新 纪录。 关键词：管形藻；蜈蚣藻；形态学：分子系统学；r b c i 基因； am o l e c u l a ra s s e s s m e n to ft h eg e n u ss i n o t u b i m o r p h aw x l ie tz f d i n g ( h a l y m e n i a c e a e ，r h o d o p h y t a ) a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h ec h i n e s ep l a n t ，i d e n t i f i e da sg r a t e l o u p i ap o r r a e c a ( m e r t ) w 。x l i e t z f d i n g ，l ie ta l ( 19 9 8 ) e s t a b l i s h e dan e wg e n u ss i n o t u b i m o r p h aw x l ie tz f d i n gw h i c h i sd e s c r i p e dd e t a i l yi n c h i n aa l g a ec h i n o w t h e r ea r e f i v es p e i c e si nt h i sg e n u sa n d d i s t r i b u t ei nq i n g d a o ，b e i d a i h e ，g u a n g d o n g s c h o l a r sh a v eb e e ne s p e c i a l l yc o n c e r n e do n p r o v i n c eo fc h i n a s i n c ei t s e s t a b l i s h m e n t ， t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ni t a n dt h eg e n u s g r a t e l o u p i aw h i c hi sa l s ob e l o n g e dt ot h ef a m i l yh a l y m e n i a c e a t h i se x p e r i m e n ta l s of o c u s e s o nt h er e s e a r c ho ft h e s ep r o b l e m s o nt h eb a s i so ft h ec o m p a r i t i o no fm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s a n dr b c lm o l e c u l a rs y s t e m a t i ca n a l y s i so ft h es p e c i e se n t i t i e sw h i c hw e r ec o l l e c t e d i n d a n d o n g ，q i n g d a o ，h a i n a n ，b e i d a i h ea n dl a o l o n g t o u ，w e f i n dt h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n s ： 1 c o n d u c tac o m p r e h e n s i v ea n a l y s i so nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns i n o t u b i m o r p h aw x l i e tz f d i n ga n dg r a t e l o 印缸c a g a r d h m a k eam o r p h o l o g i c a la n dm o l e c u l a rs y s t e m a t i c r e s e a r c h ( r b c ls e q u e n c e s ) o nt h ec h i n e s ee n t i t i e so f t h i sg e n u s m a k ea c o n c l u s i o nt h a ta l lt h e s p e c i e ss h a r i n gt h es a m eg e n es e q u e n c eo f t h i sg e n u sa ss a m ea sg r a t e l o u p i ac a t e n a t aa n d s u g g e s ti ta st h es y n o n y mn a m e o ft h eg e n u sg r a t e l o u p i a 2 f i n gs o m ee n t i t i e so ft h eg e n u ss i n o t u b i m o r p h aw h i c h a lec o l l e c t e di nh a i n a na r en o t b e l o n g e dt ot h i sg e n u sb u ta n e ws p e c i e so ft h eg e n u sg r a t e l o u p i a w en a m e di tg r a t e l o u p i a r a m a o s aw a n ge tl u a ns p n o v a n dm a k ead e t m l e ds t u d ya n dd e s c r i p t i o no ni t sa n a t o m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ，p a r t i c u l a r l yt h er e p r o d u c t i v ec h a r a c t e r i s t i c s 3 f i n dg r a t e l o u p i ao r i e n t a l i ss - m l i ne th y l i a n gs p n o vw h i c hi so r i g i n a li nt a i w a n b u tn o wi nh a i n a nd u r i n go u re x p e r i m e n ta san e wr e c o r di nc h i n a , a l t h o u g ht h ee x t e r n a l m o r p h o l o g yo ft h i ss p e c i e sa r es i m i l a rt os i n o t u b i m o r p h aa l g a e ，i np a r t i c u l a rt h eh o l l o w a x i s a n dt h es a m ea u x i l i a r ye e l la m p u l l at y p e k e yw o r d s ：s i n o t u b i m o r p h a ：g r a t e l o u p i a ：m o r p h o l o g y ：m o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ：r b c lg e n e ； _ i i _ 辽宁师范人学硕十学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i 1 绪论1 1 1 管形藻属的国内外研究进展l 1 2 本实验的主旨和意义2 2 材料和方法3 2 1 材料的选取与处理3 2 1 1 材料的选取3 2 1 2 材料的处理4 2 2 实验试剂和仪器4 2 2 1 实验试剂4 2 2 2 实验仪器4 2 3 形态观察方法。4 2 3 1 解剖观察方法4 2 3 2 冷冻切片的制作和细胞结构观察方法5 2 4d n a 的提取方法5 2 4 1c t a b 法抽提d n a 5 2 4 2u n s e tb u f f e r 法抽提d n a 6 2 4 3 试剂盒法抽提d n a 6 2 5 引物的选择与保存7 2 5 1 引物的选取与设计7 2 5 2 引物的稀释与保存8 2 6p c r 反应条件和程序8 2 6 1p c r 反应体系8 2 6 2p c r 反应程序8 2 7p c r 产物的电泳检测方法8 2 8p c r 产物的纯化及测序方法8 2 9r b c l 序列分析方法8 3 结果1 1 3 1 管形藻属( s i n o t u b i m o r p h aw x l ie tz f d i n g ) 的修订1 1 3 1 1 形态比较1 1 管形藻属( s i n o t 3 1 2r b c l 序列分析1 4 3 1 3 讨论2 4 3 2 蜈蚣藻属新种多枝蜈蚣藻( 6 r a t e l o u p i ai 8 $ f l a o s 8w a n ge tl u a ns p n o v ) ：2 6 3 2 1 外部形态特征2 6 3 2 2 内部构造2 8 3 2 3r b c l 序列结果和分析3 0 3 2 4 讨论4 l 3 3 中国大陆新纪录锄芒e - d 印妇o r i e n t a l i ss - m l i ne th - y l i a n g 4 4 3 3 1 形态观察和比较4 4 3 3 2 序列比对和分析4 5 3 3 2 讨论5 0 结论5 2 参考文献5 4 攻读硕士学位期间发表学术论文情况5 6 致谢5 7 辽宁师范大学硕士学位论文 1 绪论 1 1 管形藻属的国内外研究进展 中国海藻志中记载的管形藻属( s i n o t u b i m o r p h aw x l ie tz f d i n g ) 隶属于红藻 门( r h o d o p h y t a ) 隐丝藻目( c r y p t o n e m i a l e s ) 海膜科( h a l y m e n i a c e a e ) ，源自湛江水 产大学的李伟新教授多年来致力于对蜈蚣藻属( g r a t e l o u p i ac a g a r d h ) 的模式种 g r a t e l o u p y af i l i c i n a ( 蜈蚣藻) 的节荚变型( o m e n t a r i a ) 和中空变型( p o r r a c e a ) 等形态学特征的研究训基础上建立的。 h o w e ( 1 9 2 4 ) 首次描述了蜈蚣藻节荚型和中空型特征，发现二者的成熟个体均内部 中空，小枝特点相同，都具有末端尖细如节荚状突起 1 。y e n d o ( 1 9 2 0 ) 曾经将这种特 殊的节荚状特征称为“c a t e n a t a ，并根据这一特征提出蜈蚣藻属内的一个新种 g r a t e l o u p i ac a t e n a t a ( 链状蜈蚣藻) ，尽管他的论述要早于h o w e ，但是并没有被采纳 8 ，h o w e 认为这种节荚状小枝的特点其实是蜈蚣藻( g r a t e l o u p i af i l i c i n a ) 的一种 变型体而将其描述为“l o m e n t a r i o i d ，同时报道了最早在印度西部海域发现的蜈蚣藻 属内的一个种g r a t e l o u p i ap o r r a e c a ( m e r t ) 在中国也有分布9 1 ，并认为该种其实也 是蜈蚣藻( g r a t e l o u p i af i l i c i n a ) 的一种内部中空的变型体，称之为蜈蚣藻中空变型 而非新种。o k a m u r a ( 1 9 3 6 ) 将这些统称为岔f i l i c i n av a r p o r r a c e a ( m e r t ) ，并提 出蜈蚣藻节荚变型其实是蜈蚣藻中空型的成熟阶段，建议将二者合一为v a r p o r r a e c a z o m e n t a r i a ( h o w e ) o k a m u r a ，并取消了g r a t e l o u p i ac a t e n a t a 的种名。 李伟新等人( 1 9 8 4 ) 对分布于我国北戴河和青岛等地的蜈蚣藻的中空型和节荚型进 行了跟踪式地定点研究和形态观察，发现随着时间的推移，特别是水温条件的不断升高， 自五月到六月中旬开始出现蜈蚣藻中空型变种，而从七月开始，这些标记过的中空型蜈 蚣藻开始出现节荚状的小枝，成为蜈蚣藻的节荚变型。通过比对内部结构特别是生殖器 官的构造后发现二者应为同一种，节荚变种其实是中空变种的发育后期，提出取消节荚 型，将该种重新命名为g r a t e l o u p i af i l i c i n azp o r r a c e a ( m e r t ) h o w e 的建议，该 结果也印证了o k a m u r a ( 1 9 3 6 ) 提出的节荚变型其实是中空型的成熟阶段的结论，但是 也有学者仍然采用蜈蚣藻节荚变型这个说法。通过进一步研究，李伟新、丁镇芬等 指出蜈蚣藻中空变型是在早期发育阶段就已经中空，提出其并不是一种变型而应该是蜈 蚣藻属内的单独的一个种中空蜈蚣藻，支持g r a t e l o u p i ap o r r a e c a ( m e r t ) 的命名嫡3 。 而后，李伟新等将g r a t e l o u p i ap o r r a e c a 从蜈蚣藻属内分离出来并以其为模式种建立 了管形藻属( s i n o t u b i m o r p h aw x l i e tz f d i n g ) 哺1 ，并将该种重新命名为 s i n o t u b i m o r p h a p o r r a e c e ( m e r t ) w x l ie tz f d i n gc o n b n o v 。王茜、安利佳等 管形藻属( s i n o t u b i m o r p h aw x l ie tz f d i n g ) 的分子系统学研究 ( 2 0 0 0 ) 运用r a p d 技术对采自大连地区的管形藻和蜈蚣藻进行了比较，实验结果支持李 伟新提出的管形藻属成立的结论”。 w a n ge ta l ( 2 0 0 0 ) 运用形态比较和，6 乩序列分析相结合的方法，对产自于西太平 洋的蜈蚣藻中空型、节荚型、中空蜈蚣藻( m e r t ) 以及中国的管形藻等进行了系统分类 学地位的重新评估。形态分析结果表明它们具有相同的内部中空，节荚状小枝等特点， 与蜈蚣藻( 岔尸i l i c i n a ) 相比助细胞瓶状体( 海膜科内鉴别属间分类关系的传统形态学 分类依据c h i a n g ，1 9 7 0 ) 的类型也均为g r a t e l o u p i a 型。分子系统学的研究方法尤 其是柏乩基因的应用，在区别属间亲缘关系的问题上得到了很好的应用n 钉，w a n ge ta l 通过分子系统比较后发现所有实验样品的而乩序列均与岔c a t e n a t a ( 链状蜈蚣藻) 一 致且系统树显示它们与岔f i l i c i n a ( 蜈蚣藻) 关系最近，碱基差异为4 2 - 4 6 ，与蜈 蚣藻属内的各种属于种间差异，分子结论和形态分析结果相吻合。这些结果表明分布于 西太平洋的蜈蚣藻中空型、节荚型、中空蜈蚣藻( m e r t ) 以及中国的管形藻等其实就是 一种岔c a t e n a t a ( 链状蜈蚣藻) ，而岔c a t e n a t a ( 链状蜈蚣藻) 与岔f i l i c i n a ( 蜈蚣 藻) 之间为种间差异，应被区分为蜈蚣藻属内的两个种，而不是变种( 中空型或节荚型) ， 更不是一个新属( 管形藻属) ，最终提出岔c a t e n a t a ( 链状蜈蚣藻) 才是最早提出的有 效命名胡并恢复了该种名的使用。 1 2 本实验的主旨和意义 w a n ge ta l ( 2 0 0 0 ) 的实验结论在当时有着重大的理论依据和科学意义，但是并没有 被国内的某些学者接受，特别是现在的中国海藻志中仍然有管形藻属( s i n o t u b i m o r p h a w x l ie tz f d i n g ) 的记载和对其详尽的形态特征描述。该属建立之初只有一个模式 种( s i n o t u b i m o r p h a p o r r a e c e ) ，2 0 0 4 年出版的中国海藻志中描述了该属五个不同的 种，分别是繁枝管形藻( sr a m o s i s s i m a ，) 、棒形管形藻( & c l a v i f o r m i s ) ，广东管 形藻( sg u a n g d o n g e n s i s ) 、链状管形藻( sc a t e n a t a ) 和青岛管形藻( sq i n g d a o e n s i s ) ，该属内的这几个种是否具有种间差异，是否同属于管形藻属，管形藻属究竟存不 存在等问题也接踵而来，所以对管形藻属的真正分类学地位仍然需要进一步的研究。 本研究通过采用传统的形态学观察，特别是对生殖器官构造等特征的观察，结合分 子系统学方法，利用，6 乩基因进行序列比对和通过构建系统树进行比对分析相结合， 对分布在我国各海域的管形藻属内的各种进行了详细的形态学和分子系统学研究，旨在 探明我国管形藻属内各个种的分类地位，以及管形藻属与蜈蚣藻属之间的亲缘关系等问 题。 2 2 材料和方法 2 1 材料的选取 2 1 1 材料的选取 实验材料的选 属内四个种的外部形态特征描述以及它们的地理位置分布而分别选取自辽宁省月东市 大鹿岛，代表种是链状管形藻( s i n o t u b i m o r p h ac a t e n a t a ( y e n d o ) w x l ie tz f d i n g c o m b n o v ) ，采集日期为2 0 0 9 年1 0 月2 0 日：海南省陵水新村与海南乐东莺歌海，代 表种是广东管形藻( sg u a n g d o n g e n s i sl ie td i n gs p n o v ) ，采集日期为2 0 0 9 年2 月6 日；青岛市鲁迅公园，代表种是青岛管形藻( sq i n g d a o e n s i s l ie td i n gs p n o v ) ， 采集日期为2 0 0 9 年1 0 月2 0 日；河北省山海关老龙头和北戴河的棒状管形藻，代表种 为棒状管形藻( 5 ：c l a v i f o r m i sl ie td i n gs p n o v ) ，采集日期是2 0 0 9 年1 1 月l 同， 为增加实验结果的准确性，实验中四种管形藻每种都选择了2 - 3 个样品编号如表2 1 所 示。 表2 1 样品编号和相关信息 t a b l e2 1n u m b e r sa n dr e l a t e di n f o r m a t i o n s 种名采集地编号 链状管形藻 d l d 0 1 8 s l n o t u b i m o r p h ac a t e n a t a 辽宁省丹东市大鹿岛 ( y e n d o ) w x l ie tz f d i n g d l d 0 3 1 c o m b n o v 广东管形藻海南陵水新村 h n 2 0 0 9 2 0 21 & g u a n g d o n g e n s i sl ie td i n g 海南乐东莺歌海 h n 2 0 0 9 2 0 4 6 s p n o v 青岛管形藻q d l x g y 0 01 sq i n g d a o e n s i sl ie td i n g 青岛市鲁迅公园q d l x g y 0 0 2 s p f l o v q d l x g y o i o 棒状管形藻 l l t 0 9 l1 0 1 m s 0 2 5 5 ：c a v i f o z 留i sl ie td i n g 河北省山海关老龙头 l l t 0 9l1 0i m s 0 2 6 s p n o v l l t 0 9 l1 0 i m s 0 2 7 管形藻属( s n o t u b i m o r p h aw x l ie tz f d i n g ) 的分子系统学研究 2 1 2 材料的处理 实验材料被分别制作成腊叶标本、硅胶干燥标本和1 0 福尔马林溶液液浸标本( 福 尔马林与海水比例1 ：9 ) ，其中腊叶标本主要用来进行形态观察，福尔马林液浸标本用 来进行组织切片制作和电镜解剖观察，硅胶干燥标本主要用于d n a 的提取。 2 2 实验试剂和仪器 2 2 1 实验试剂 ( 1 ) 实验药品有：2 c t a b ；蛋白酶k ；1 0 c t a b ；沉降c t a b ；乙酸钠；t e ；4 mn a c l ； 1 0 0 酒精；7 0 酒精：氯仿：异戊醇；p c i ( 苯酚：氯仿：异戊醇2 5 ：2 4 ：1 ) ：夕一巯基 乙醇；氯仿；l t a e ；琼脂糖；e b 。 ( 2 ) 缓冲液种类 u n s e tb u f f e r ：8 m 尿素( u r e a ) ；2 s d s ；0 1 5 mn a c l ：0 0 0 1 me d t a ：0 1 mt h i s h c l 。 清洗缓冲液( w a s h i n gb u f f e r ) ：0 1 mh e p e s ；n a o h ( p h8 0 ) 。 ( 3 ) 植物d n a 提取试剂盒：缓冲液g d ( 按配比加入无水乙醇) ；缓冲液g p l ；缓冲 液g p 2 ：沈脱缓冲液t e ；漂洗液p w ( 按配比加入无水乙醇) 。 ( 4 ) 2 * t a qp c rm a s t e r m ix ：0 1 ut a qp o l y m e r a s e “l ；5 0 0 i md n t pe a c h ；2 0 m m t r is h c l ( p h 8 3 ) ；l o o m mk c l ；3 m mm g c l 2 。 2 2 2 实验仪器 三用紫外分析仪( w f h _ 2 0 3 b ，上海精科实业有限公司) ；电泳仪( d y y - _ 6 c 型，北 京市六一仪器厂) ；三用恒温水箱( h h v ，江苏省金坛市医疗仪器厂) ：电子分析天 平( j y l 0 0 3 型，常州科源电子电器厂) ；迷你离心机( l x 一2 0 0 ，海门市其林贝尔仪器) 冷冻离心机：离心管；移液枪；高压灭菌锅：旋涡混合器：吸附柱c b 3 ；研钵：烘干箱； 冷冻石蜡两用切片机；烘片机；显微成像系统。 2 3 形态观察方法 2 3 1 解剖观察方法 选择福尔马林固定过的或者新鲜的实验材料，用清水冲洗表面杂质或者残存的福尔 马林液体后置于培养皿中于解剖镜下观察。纪录其分枝特点，小枝结构和囊果分布情况 等并照相。 4 辽宁师范大学硕+ 学位论文 2 3 2 冷冻切片的制作和细胞结构观察方法 ( 1 ) 选择福尔马林固定过的或者新鲜的实验材料，用清水冲洗表面杂质或者残存的福 尔马林液体后置于培养皿中，解剖镜下观察并选取合适的部位并将其切下( 卜2 c m ) 。 ( 2 ) 为冷冻切片机接通水后启动装置进行预冷。 ( 3 ) 用滴管滴水将小枝冰冻与刀台上( 切面垂直于刀口) ，并调整好刀台与刀之间的 距离以及选择好所切材料的厚度。 ( 4 ) 转动摇手即刻切下组织，需用毛笔刷将其轻轻刷入装有清水的培养皿中。 ( 5 ) 在解剖镜下挑选合适的组织薄片，制成临时装片。 ( 6 ) 制作冷冻切片后，用n i k o n2 1 6 9 8 7 显微镜对皮层的厚度、髓丝的排列方式、生 殖器官的构造、助细胞及其周围联络丝关系以及果胞形态等进行观察并用n i k o nh f x i ia 照相机进行拍照，照相纪录结果。 2 4d n a 的提取方法 本实验中d n a 的提取先后采用了三种方法，c t a b 法、u n s e tb u f f e r 法和提取植物 d n a 的试剂盒法。 2 4 1c t a b 法抽提d n a ( 1 ) 取干燥的材料加入1 5 m l 离心管，高度不能超过离心管的1 3 ，否则会影响实验 效果。 ( 2 ) 加入l m l2 的c r a b 裂解液( 6 5 预热) ，4 9 l9 一巯基乙醇，裂解1 小时2 0 分 钟后加入蛋白酶k1 0 1 - l 1 ( 5 0 ) 裂解4 0 分钟。 ( 3 ) 4 c 离心机3 5 0 0 r 离心1 分钟后取上清液加入等体积的p c i ，用手轻摇匀1 0 分钟， 再1 2 0 0 0 r 离心1 0 分钟后取上清液( 注意不能取到中间层杂质) ，再加入1 1 0 上清液 体积的1 0 c t a b ，6 5 裂解3 0 分钟，再加入p c i 进行复抽提。 ( 4 ) 取出上清液加入到灭菌管中，加入3 1 0 体积的沉降c r a b ，1 l o 体积的乙酸钠， 2 倍体积的无水乙醇，摇匀后放入冰柜沉淀3 0 分钟或者过夜。 ( 5 ) 1 2 0 0 0 r 离心1 0 分钟后弃掉上清而留沉淀，再用l o g l 移液器吸掉沉淀上的残液 后置于室温干燥1 0 - 2 0 分钟，等沉淀透明后加入t e4 0 - 5 0 “1 ，6 5 c 裂解3 0 分钟后加入 等同于2 倍t e 体积的无水乙醇，放入冰箱沉降到有沉淀形成后取出。 ( 6 ) 4 c 下离心1 0 分钟后取出沉淀加入7 0 乙醇l m l 洗l _ 2 次，弹匀后再离心5 分钟， 将上清液倒掉，用吸水纸和移液器吸取残液，待2 0 分钟沉淀透明后加入3 0 4 0 n 蒸馏 水，- 2 0 保存。 5 管形藻属( s i n o t u b i m o r p h aw x l ie tz f d i n g ) 的分子系统学研究 2 4 2u n s e tb u f f e r 法抽提d n a ( 1 ) 称取所需材料5 0 m g 左右，并用滤纸吸干水分或者用烘干箱烘干水分，把烘干处 理后的材料放入研钵中，倒入适量液氮并研磨粉碎。 ( 2 ) 将粉碎后的材料放入1 5 m l 离心管中并加入清洗缓冲液( w a s h l n gb u f f e r ) 搅 拌并用离心机离心后弃掉上清液，反复操作这一步，直到上清液的红颜色消失为止( 约 3 - 8 次) 。 ( 3 ) 加4 0 0 0 , 1 的u n s e tb u f f e r 搅拌至泡沫丰富，混匀后放到冰上约4 0 分钟，在此 期间需将离心管上下颠倒混匀。4 0 分钟后加入4 0 0 p 1p c i ，慢慢震荡并静置l o 分钟后 放于4 度离心机中1 0 0 0 0 r 离心2 5 分钟。 ( 4 ) 将上清液移至新的离心管中，注意不能取到中间的蛋白质层，再加入等量的p c i 进行复抽提( p c i 抽提3 回) 。 ( 5 ) 3 次离心后取上清液至新的离心管中，加入等量的氯仿：异戊醇，慢慢震荡5 - 1 0 分钟。 ( 6 ) 1 0 0 0 0 r 离心2 5 分钟，取上清于新的管中加入4 mn a c l 2 0 肛l ( 每4 0 0 p 1 ) ，加入 已经冷却的1 0 0 酒精1 0 0 0 i t l ( 比例同上) 立即出现絮状物，充分震荡并放于冰上5 分 钟。 ( 7 ) 4 度离心机1 2 0 0 0 r 离心2 1 5 分钟，沉淀附在管底并弃掉上清液。加入冷却的 7 0 酒精后再用4 度离心机1 2 0 0 0 r 离心2 1 0 分钟并弃掉上清液反复两次。将得到的沉 淀进行干燥( 2 0 分钟) 并保存于5 0 - 1 0 0 肛i 的蒸馏水中。 2 4 3 试剂盒法抽提d n a ( 1 ) 称取干燥的海藻材料3 0 m g 左右，加入液氮充分研磨。 ( 2 ) 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有7 0 0 肛1 缓冲液g p l 的离心管中( 实验前将 g p l 加入b 一巯基乙醇，6 5 水浴锅预热2 0 分钟，期间颠倒离心管数次以便充分混匀) 。 ( 3 ) 加入7 0 0 p 1 氯仿并充分混匀1 2 0 0 0 r 离心5 分钟。小心地将上层水相转移到一个 新的离心管中，加入7 0 0 p 1 缓冲液g p 2 。 ( 4 ) 充分混匀后将液体转移到吸附柱c b 3 中( 吸附柱容积为7 0 0 p i 左右，可分次加 入离心，吸附柱可放入于普通离心管中，离心管剪去顶盖) ，1 2 0 0 0 r 离心3 0 秒，弃掉 废液。 ( 5 ) 向吸附柱c b 3 中加入5 0 0 p i 缓冲液g d ，1 2 0 0 0 r 离心3 0 秒后倒掉废液。将吸 附柱c b 3 放入收集管中，加入7 0 0 1 1 1 漂洗液p w ，1 2 0 0 0 r 离心3 0 秒，倒掉废液后将吸附 柱c b 3 放于收集管中并加入5 0 0 p i 漂洗液p w ，1 2 0 0 0 r 离心3 0 秒并倒掉废液。 6 ( 6 ) 将吸附柱c b 3 放 分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 ( 7 ) 最后将吸附柱c 8 3 转移到一个干净的离心管中( 此管必须有盖以便保存d n a ) ， 向吸附膜的中间部位悬空滴加5 0 - 2 0 0 i q 洗脱缓冲液t e ，室温放置2 - 5 分钟后，1 2 0 0 0 r 离心2 分钟，将溶液收集到离心管中( 为增加基因组d n a 的得率，可将离心所得的溶液 再加入吸附柱c b 3 中，室温放置2 分钟后1 2 0 0 0 r 离心2 分钟) ，最终所得的d n a 需在一2 0 的条件下进行保存。 2 5 引物的选择与保存 2 5 1 引物的选取与设计 参照w a n ge ta 1 ( 2 0 0 0 ) 而沈序列扩增所采用的引物设计，共有七个引物分别是： f 8 ，r 6 4 6 ，f 4 8 1 ，r 11 5 0 ，f 7 6 5 - i ，f 7 6 5 一ii ，r 1 3 8 1 - ii 。引物组合方式为f 8 一r 6 4 6 ，f 4 8 l r 1 1 5 0 和f 7 6 5 m i x ( f 7 6 5 - i 与f 7 6 5 - i i 等体积混合) 一r 1 3 8 1 一i i 。此后经过多次试验和 反复论证后又增加了3 个引物：f i ，f 7 3 5 和r 7 8 5 ( 表2 2 ) 。实验中另外发现的两个组 合同样可以得到很好的p c r 效果：( 1 ) f 8 一r 1 3 8 卜i i ( 2 ) f l r 1 1 5 0 ，f 7 3 5 一r 1 3 8 卜i i 。 需要说明的是试验中选择的引物组合是根据试验效果的不同而选取的，不论是选取任何 一个组合，都是对同一段，6 乩基因( 全长1 3 8 1 b p ) 进行p c r 扩增。 表2 2r b c l 序列p c r 扩增所需引物( 海膜科) t a b 2 2p f i m e 璐o fr b c ls e q u e n c e sr e q u i r e df o rp c r 引物代号合成方向引物序列 f 1 正方向 5 c 从g g a l v r a a g a a t g 从c g c t a - 3 f 8 正方向5 喵t g 从t t c c a t a c g c t 从a t g 一3 f 4 8 1 正方向5 g t 地从c g t g a g c g t a t g g a 一3 r 6 4 6 反方向 5 一a t c l v r r c r 丌c c 屹g c a t 一3 f 7 3 5 正方向 5 一a t g t a t g a a a g a g c t g t t t 一3 f 7 6 5 - i 正方向5 - t g j m g a g c t g 从1 t r g c t 从一3 f 7 6 5 - i i 正方向 5 一t g 从a g a g c t g a a t t c g c t 从一3 r 7 8 5 反方向5 一t t g t m g g t t a t a c a g c a a - 3 r 1 1 5 0 反方向5 - g c a t t t g t c c g c a g t g a a t a c c - 3 r 1 3 8 1 一ii 反方向5 - a t c t t t c c a t j 呲t c t a a a g c - 3 7 管形藻属( s i n o t u b i m o r p h aw x l ie tz f d i n g ) 的分子系统学研究 2 5 2 引物的稀释与保存 粉末状引物需用干净的蒸馏水稀释1 0 倍，用旋涡混合器震荡混匀后1 0 0 0 r 离心3 0 秒于一2 0 c 存储，实验使用时用干净的蒸馏水稀释1 0 倍后使用。 2 6p c r 反应条件和程序 2 6 1p c r 反应体系 反应总体积为5 0 “1 ，其中模板d n a 选取l “l ，上游引物和下游引物各选取l p - 1 ，2 * t a q p c rm a s t e r m j x 选取1 2 5 p l ，蒸馏水3 4 5 p 1 。 2 6 2p c r 反应程序 配好反应体系后将反应管置于p c r 反应仪上，9 3 c 变性1 分钟，5 5 c 复性2 分钟， 7 2 c 延伸3 分钟，反应进行3 5 个循环( 可根据结果检测改变反应循环数，但循环数过 多时，目的基因条带纯度越差，杂质和拖尾现象越明显) ，最后一次延伸后于4 c 保存。 2 7p c r 产物的电泳检测方法 制小胶需称取o 2 9 琼脂糖，加入2 0 m l 的1x t a e ( 大胶量需加一倍) ，混匀后放入 微波炉，选择中低温档加热1 5 2 分钟( 大胶需3 - 4 分钟) ，加热后观察胶是否透明无 杂质后等待液体微凉后倒入电泳板中直至完全冷却成胶( 3 0 分钟) 。轻轻取出电泳梳( 孔 最好比较整齐正规) 后放入电泳槽中( 胶面应与电泳缓冲液基本持平) ，电泳2 5 分钟 左右( 电压1 2 0 v ) 。后经过e b 浸泡2 0 3 0 分钟后取出在紫外分析仪下观察、记录结果 并照相 2 8p c r 产物的纯化及测序方法 p c r 产物的纯化及测序工作由大连宝生物公司完成。 2 9 柏c l 序列分析方法 基因库中选取4 0 个而c l 序列进行管形藻属的分子系统学研究，见表2 3 。