（食品科学专业论文）腌制蔬菜中复合防腐剂的开发和应用研究.pdf

腌制蔬菜中复合防腐剂的开发和应用研究 摘要 防腐剂对保持食品的风味具有重要作用。本文以腌制蔬菜的保鲜保质为目 的，通过筛选复配制备出高效的复合防腐剂，研究评价复合防腐剂对腌制蔬菜 中腐败菌的抑制作用，并将其应用于腌制蔬菜的保鲜。 1 对腌制蔬菜样品进行加速腐败实验，按照微生物筛选的办法和标准， 从腌制蔬菜中共筛选得到7 株腐败菌，其中有6 株细菌，1 株酵母菌，没有发 现霉菌和放线菌。细菌经革兰氏染色后显示都为阳性菌。对腐败菌的耐盐性、 耐温性、耐酸性实验表明其中1 号菌，5 号菌，6 号菌有比较强的耐受性。实 验过程中将上述腐败菌结合食品中常见的腐败菌( 金黄色葡萄球菌 ( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ) 作为防腐剂选择 实验的指示菌株。 2 脱氢醋酸钠、乳酸链球菌素、尼泊金复合酯钠、富马酸钠、壳聚糖对各 种腐败菌的抑制效果的单因素实验表明，脱氢醋酸钠、乳酸链球菌素、尼泊金 复合酯钠对受试腐败菌的抑制效果良好。将上述三种防腐剂复配后得到复合防 腐剂，正交试验优化得到的最佳配比为：乳酸链球菌素浓度0 0 4 ，脱氢醋酸 钠浓度o 0 3 ，尼泊金复合酯钠浓度0 0 2 。该配比下对受试腐败菌的抑制率 可达到9 9 以上。 3 将所得到的复合防腐剂添加到腌制蔬菜中，对比按照国标最大量添加苯 甲酸钠和山梨酸钾的腌制蔬菜，在3 7 下恒温培养3 0 天，每5 天测定其蛋白 质含量、还原糖含量、总酸含量、菌落总数及大肠杆菌m p n 值的变化，并对 储藏后满足卫生标准的腌制蔬菜进行感官评价。其结果表示，添加复合防腐剂 的腌制蔬菜组在维持理化性质的稳定性和良好的卫生情况方面最优。 关键词：腌制蔬菜，乳酸链球菌素，尼泊金复合酯钠，脱氢醋酸钠，抑制率， 复合防腐剂 s t u d yo ne x p l o i t a t i o na n da p p l i c a t i o no fc o m p o u n dp r e s e r v a t i v e i np i c k l e dv e g e t a b l e s a b s t r a c t p r e s e r v a t i v e sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ef o rm a i n t a i n i n gt h ef l a v o ro ff o o d t h i s c o m p o u n dw a sp r e p a r e db ys c r e e n i n gac o m p o u n de f f e c t i v ep r e s e r v a t i v e s ，s t u d ya n d e v a l u a t et h em e t a m o r p h i c c o m p l e xo fp r e s e r v a t i v e so nt h ei n h i b i t i o no fs p o i l a g eb a c t e r i ai n v e g e t a b l e sa n da p p l i e di tt ot h ea c t u a lp i c k l e dv e g e t a b l e s 1 p u tt h es a m p l e so ft h ep i c k l e dv e g e t a b l e si na na c c e l e r a t e dt e s to fc o r r u p t i o n i n a c c o r d a n c ew i t hm e t h o d sa n ds t a n d a r d sf o rm i c r o b i a ls c r e e n i n g t h e r ea r e7s p o i l a g e b a c t e r i as c r e e n e df r o mp i c k l e dv e g e t a b l e s ，i n c l u d i n g6s t r a i n so fb a c t e r i a , ay e a s ta n dd i d n o tf e n dm o l da n da c t i n o m y c e t e s a l lt h eb a c t e r i aa r eg r a m - p o s i t i v e t h et e s to fr e s i s t a n c e o fs a l t ，t e m p e r a t u r ea n da c i do ns p o i l a g eb a c t e r i as h o w e dt h a tn o1 , n o5a n dn o6b a c t e r i a h a dar e l a t i v e l ys t r o n gt o l e r a n c et oc h a n g e so fe n v i r o n m e n t ，s op u tt h e ma st h eg u i d i n g b a c t e r i a a ss t 印h y l o c o c c u sa u r e u sa n db a c i l l u ss u b t i l i sw e r et h ec o m m o ns p o i l a g e b a c t e r i ai nf o o d ，s op u tt h e ma st h eg u i d i n gb a c t e r i at o o 2 s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t so ft h ei n h i b i t o r ye f f e c tt ov a r i o u ss p o i l a g eb a c t e r i ao f d e h y d r o g e n a t i o no f s o d i u ma c e t a t e ，n i s i n , s o d i u mn i p a g i nc o m p l e xe s t e r s ，f u m a r i ca c i d s o d i u ma n dc h i t o s a ns h o w e dt h a tt h ed e h y d r o g e n a t i o no fs o d i u ma c e t a t e ，n i s i n , n e p a l h y d r o x yc o m p o u n ds u l f a t eh a d b e t t e re f f e c t o p t i m i z e db yo r t h o g o n a lt e s ts h o w e dt h er a t i o o n i s i nc o n c e n t r a t i o no f0 0 4 ，d e h y d r os o d i u ma c e t a t ec o n c e n t r a t i o no f0 0 3 s o d i u m a c e t a t en i p a g i nc o m p o u n dc o n c e n t r a t i o no f0 0 2 w a st h eb e s ta n dt h ei n h i b i t o r yr a t e c o u l dr e a c h9 9 3 t h ep r e s e r v a t i v ew o u l db ea d d e dt ot h ec o m p o s i t ep i c k l e dv e g e t a b l e s ，c o m p a r e dt o p i c k l e dv e g e t a b l e sw h i c ha d d e dt h em a x i m u ma m o u n to fs o d i u mb e n z o a t ea n dp o t a s s i u m s o r b a t ei na c c o r d a n c ew i t hn a t i o n a ls t a n d a r d s c u l t u r e da t3 7 c o n s t a n tt e m p e r a t u r ef o r 3 0d a y s ，a n dd e t e r m i n e dt h ec h a n g e si np r o t e i nc o n t e n t ，r e d u c i n gs u g a rc o n t e n t ，t o t a la c i d c o n t e n t ，t o t a ln u m b e ro fc o l o n i e sa n dm p n o fe c o l i t h e nt a k es e n s o r ye v a l u a t i o nf o r p i c k l e dv e g e t a b l e sm e e tt h eh e a l t hs t a n d a r d sa f t e rs t o r a g e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e g r o u po fp i c k l e dv e g e t a b l ea d d e dc o m p o s i t eo fp r e s e r v a t i v e si st h eb e s ti nt h em a i n t e n a n c e o f p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so fs t a b i l i t ya n dg o o dh y g i e n e k e y w o r d s ：p i c k l e d v e g e t a b l e ；n i s i n ； s o d i u m n i p a g i nc o m p l e x e s t e r s ； d e h y d r o g e n a t i o no fs o d i u ma c e t a t e ；i n h i b i t i o nr a t i o ；c o m p o u n dp r e s e r v a t i v e i i 插图清单 图1 1n i s i n 的结构图4 图2 1 图2 6 细菌显微观察形态图1 4 15 图2 7酵母菌显微观察形态图4 图2 8腐败菌生长曲线4 图2 9含盐量对腐败菌生长的影响4 图2 1 0 温度对腐败菌生长的影响4 图2 1 1 培养基p h 值对腐败菌的生长的影响一4 图3 11 号菌标准曲线2 5 图3 25 号菌标准曲线2 5 图3 36 号菌标准曲线2 5 图3 4 金黄色葡萄球菌标准曲线2 6 图3 5枯草芽孢杆菌标准曲线2 6 图3 6 不同浓度n i s i n 对腐败菌的抑制效果2 7 图4 1 腌制蔬菜保藏过程中蛋白质含量的变化4 0 图4 2 腌制蔬菜储存过程中还原糖含量的变化4 0 图4 3 腌制蔬菜保藏过程中总酸含量的变化4 1 图4 4 腌制蔬菜保藏过程中总菌落数的变化4 2 i 表格清单 表2 1 腐败的腌制蔬菜中细菌的种类及菌落形态1 4 表2 2 腐败的腌制蔬菜中酵母菌的种类及菌落形态1 4 表2 3 腌制蔬菜中腐败细菌革兰氏染色结果1 6 表3 1 单因素实验水平表2 4 表3 2 复合防腐剂优化的正交试验因素水平表2 4 表3 3 正交实验结果极差分析3 1 表3 4 实验结果的方差分析表3 2 表3 5 复合防腐剂验证实验结果3 2 表4 1 腌制蔬菜感官评判标准3 8 表4 2 防腐剂的报价3 9 表4 3 腌制蔬菜在储藏过程中大肠杆菌数的变化4 2 表4 4 不同防腐荆感官评定结果4 3 表4 5 防腐剂的成本核算表4 3 v i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所 知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得金g 巴：些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同i ：作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签字：硎磊签字日期：汤p 年钞月髟日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金目巴：e 些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权盒胆! ：些盔 兰l 可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名： 孙磊 签字日期：劢7 0 年乒只髟日 导师签名： 签- 7 日期：年 砂j ￥ 日 7 目矿 致谢 本课题的研究及论文的完成是在我的导师姜绍通教授的悉心指导下进行 的。姜绍通教授在研究领域内眼光敏锐、学识渊博，从论文的选题到试验方案 的制定、论文的修改完稿，都给予了我无微不至的关怀和帮助。姜老师严谨求 实的治学作风、对科学的执着追求以及高瞻远瞩的开阔眼界，都使我受益匪浅。 我将铭记姜老师的教诲，踏实做事，苦心钻研。在此，我向姜老师表示最诚挚 的感谢。 本论文的完成是对我两年半研究生所学知识和技能的一个系统的锻炼，更 是对以前知识的巩固和提升，不仅使我的动手能力得到了提高，也使我对现实 企业的生产有了具体的了解。感谢校、院、系领导和实验室老师们为我们营造 了一个的浓厚的学术氛围和良好的实验环境。 感谢潘丽军教授，郑志副教授、罗水忠老师、李兴江老师、王华林老师， 蔡克舟老师给我的许多指导和帮助。此外，对本科生莫陈芳在实验过程中给予 我的启发和协助，表示感谢，同时感谢实验室的范婷婷、易守连、刘新新、张 巧兰、唐晓明、杜威、方坤、吴洁方、周会喜、张原箕、孟君等同学，感谢他 们陪伴我一同度过这美好的时光。 感谢我的家人，他们的支持和鼓励，使我能够顺利完成这篇硕士论文，这 里谨向他们致以最衷心的感谢! 三年的研究生生活是我人生最宝贵的财富，再次感谢所有关心和帮助我的 领导、师长、家人、同学及朋友们! i i i 作者：孙磊 2 0 1 0 年0 4 月 第一章绪论 蔬菜腌制是利用有益微生物活动的生成物以及各种配料来加强产品的保 藏性。在腌制中，起主要作用的是食盐、微生物以及蛋白质的变化【l 】。腌制蔬 菜在我国具有悠久的历史，其成本低廉，加工简易，保存容易，并具有独特的 色、香、味，是其他加工品所不能代替的，所以其产量至今仍在逐步上升1 2 j 。 腌制蔬菜在我国也有极其广泛的分布，各地都有其各具特色的腌制蔬菜品种， 如酱渍腌菜，腌渍菜等。 腌制蔬菜作为一种饮食的佐餐调剂，备受人们喜爱。蔬菜经过腌制以后， 其中含有大量的乳酸菌，对人的健康十分有益，不仅可以抑制肠道中腐败菌的 生长，减弱腐败菌在肠道中的产毒作用，而且具有帮助消化、防止便秘、降低 胆固醇、抗肿瘤以及调节人体生理机能等保健和医疗作用【3 】。此外，腌制蔬菜 中含有丰富的膳食纤维，具有预防糖尿病、高血压，促进胃肠蠕动等功效，并 且腌制蔬菜中还含有丰富的有机酸，可以调节人体能量，加快体内多余脂肪的 代谢【4 1 。 在韩国，泡菜( k i m c h i ) 是各种腌制蔬菜的总称。韩国的泡菜是三国时期由 中国传入的，现在已经成为其居民餐桌上不可缺少的一部分。该国的腌制菜的 变革都源于泡菜。日本是首先倡导“低盐、增酸、低糖 健康泡菜的国家之一， 其市场上用低盐方法生产的“浅渍”、“新渍类腌菜销售势头很旺盛，大约占 其腌制菜的两成左右。我国虽然是腌制蔬菜的起源国，但是由于我国的腌制菜 行业基础很薄弱，与日韩等腌制蔬菜业发达的国家相比，还存在着很大的差距 【5 1 。 1 1 蔬菜腌制风味形成的机理 1 1 1 微生物的发酵作用 1 1 1 1 乳酸发酵 蔬菜在盐渍过程中，其表面上附着天然的微生物。酱腌菜的腌制过程实质 上也是微生物发酵的过程【6 】。蔬菜上天然附着着一些乳酸菌和酵母菌，在腌制 过程中，这些乳酸菌会发酵生成乳酸等风味物质，酵母菌发酵则会形成乙醇等 物质。乳酸菌发酵有两种类型，即同型发酵和异型发酵。其反应式如下所示【7 j ： 同型发酵c 6 h 1 2 0 6 2 c h 3 c h o h c o o h 异型发酵c 6 hx 2 0 6 - - c h 3 c h o h c o o h + c h 3 c h 2 0 h + c 0 2f 1 1 1 2 酒精发酵 蔬菜上天然附着一些酵母菌，酵母菌在厌氧的条件下会利用食品中的糖类 物质进行酒精发酵【8 】。其反应式如下所示： c 6 h12 0 6 - - 2 c h 3 c h 2 0 h + 2 c 0 2t 乳酸菌发酵产生的乳酸，与酵母菌发酵产生的乙醇，经过反应可以生成乳 酸乙酯，这便是腌制蔬菜的特殊香味的主要成分，其主要反应式如下所示f 7 】： c h 3 c h o h c o o h + c h 3 c h 2 0 h - c h 3 c h o h c 0 0 c h 2 c h 3 1 1 2 蛋白质的分解作用 蔬菜中的蛋白质在发酵过程中被分解为氨基酸，不同的氨基酸具有不同的 风味，丙氨酸、甘氨酸、色氨酸具有显著的甜味，谷氨酸和食盐中的钠结合生 成谷氨酸钠，也就是我们平时所称的味精，其对保持泡菜的鲜味有着重要的作 用，此外，天冬氨酸盐也有明显的鲜味。氨基酸也可与戊糖或者甲基戊糖的还 原产物4 羧基戊烯醛反应生成含有氨基类的烯醛类的香味物质。氨基酸的种类 不同，与戊糖作用所生成的香味风味物质也有差别【9 1 。 1 2 腌制蔬菜腐败菌的种类 腌制蔬菜一般盐度较高，这大大限制了微生物的生长。腌制蔬菜中的腐败 菌主要是细菌，如比较耐高温的芽孢杆菌，环境中比较广泛存在的球菌等，其 次还有一些霉菌和酵母菌。王敏l lo j 在高盐酱腌菜坯中发现了1 0 种腐败菌，其 中腐败菌经过鉴定，显示其分别为：坚强芽孢杆菌( b f l r m u s ) 、嗜热脂肪芽孢 杆菌( b s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 和巨大芽孢杆菌佃m e g a t e r i u m ) 。吴丹等】在腐败 的榨菜中分离出了7 株细菌，4 株酵母菌，经过鉴定后发现其为坚强芽孢杆菌 和蜡状芽孢杆菌。 对于腌制蔬菜特别是袋装腌制蔬菜，保证其品质的稳定性和较长的保质期 是十分必要的。延长食品的保质期，既可以减少企业的运营成本也可以避免材 料的浪费。现今食品加工企业，大都采用高温灭菌结合添加食品防腐剂的方法 来进行食品的保鲜。对于防腐剂的使用，国家也有具体的标准规定了种类和用 量，目前关于新型防腐剂的研究也很广泛。 1 3 防腐剂的研究进展 防腐剂是用以保持食品原有品质和营养价值为目的的食品添加剂，它能抑 制微生物的活动、防止食品腐败变质，从而延长保质期。防腐剂只能延长细菌 生长滞后期，所以只有未遭细菌严重污染的食品，添加化学防腐剂才有效，防 腐剂并不能改善低质食品的品质引。在食品的储藏期间，添加适量的防腐剂不 仅仅可以延长货架期，还可以保持食品的理化性质，维持食品中的蛋白质及糖 类物质的含量，保持食品的风味和营养l l3 1 。开发广谱、高效、低毒的食品防腐 剂仍是食品科学研究的热点之一。目前，不论是在防腐剂的种类上还是抑制效 果方面都取得良好进展。 防腐剂按照合成方式来分主要有两大类型：天然防腐剂和人工合成防腐 剂。我们生活中常用到的化学防腐剂基本上都是合成的。随着人们生活水平的 2 不断提高和对健康的日益关注，人们对食品防腐剂的安全性提出了更高的要 求，毒性较小的天然防腐剂也越来越受到人们的关注。天然食品防腐剂一般是 指从植物、动物或者微生物中直接提取分离的，具有防腐作用的一类物质，其 具有资源丰富、抗菌性强、水溶性好、安全无毒、抑菌谱广等优点，近年来逐 步成为食品保鲜防腐领域的研究热点。但是，天然食品防腐剂由于其成本较高 导致在实际生产中的应用并不广泛【l4 1 。 化学防腐剂具有对微生物的抑制效果比较好，价格低廉等优点。目前主要 使用的化学防腐剂有苯甲酸及其盐类，山梨酸及其盐类，尼泊金酯类等等。但 是由于其化学合成的本质，大量长期的食用可能会对人体会造成一定的不良影 响。 有些天然防腐剂不但对人体的健康没有危害，还具有定的营养价值。并 且有些天然防腐剂已经达到了人工合成防腐剂的防腐效果【l 引。按照防腐剂的来 源来分，天然防腐剂又可以分为植物源防腐剂、微生物源防腐剂和动物源防腐 剂。植物源防腐剂主要有一些香料、精油、植物提取物，例如一些果胶分解物， 茶多酚，琼脂低聚糖等；微生物源的防腐剂现在主要包括溶菌酶，乳酸菌细胞 及其代谢物，乳酸链球菌素，聚赖氨酸等。动物源的防腐剂主要包括鱼精蛋白、 壳聚糖、蜂胶等【i 引。 本课题主要是筛选适用于传统腌制蔬菜中的高效复合防腐剂。所以综合考 虑化学防腐剂的低廉价格和生物防腐剂的高安全性，旨在复配出一种既价格低 廉适用于工业生产中，又具有比较高的安全性的复合防腐剂。通过文献的阅读， 本课题主要从国标中挑选出防腐剂进行复配。下面对于挑选的防腐剂成分进行 介绍。 1 3 1 乳酸链球菌素( n i s i n ) 乳酸链球菌素是细菌素的一种。所谓细菌素是指由抗菌素合成的一种核糖 体，它是由很多种细菌包括乳酸菌在内合成的 1 1 5 】。其又称乳酸菌肽，英文名 为n i s i n ，是由属于n 型血清的某些乳酸链球菌( 1 a c t o c o c c u sl a c t i s ) 在代谢过 程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的小肽，为灰白色固体粉末，是一种高效、 无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂【l9 1 。其可用于罐装食品、植物蛋白食 品，肉制品和酒精饮料等食品的保鲜，对革兰氏阳性细菌有较强的抑制作用。 1 3 1 1 乳酸链球菌素的结构特性 乳酸链球菌素的分子式为c 1 4 3 h 2 2 8 n 4 2 0 3 7 s 7 ，它的成熟分子仅由3 4 个氨基 酸残基组成，相对分子量为3 5 1 0 。n i s i n 含有4 种异常氨基酸，分别是脱氢丙 氨酸( d h a ) 、1 3 一甲基脱氢丙氨酸( d h b ) 、羊毛硫氨酸( a l a s a l a ) 和1 3 一甲基羊毛硫氨酸( a b a s a l a ) ，它们通过硫醚键形成5 个环。到目 前为止，已发现n i s i n 的种类包括a 、b 、c 、d 、e 和z ，对n i s i n a 和n i s i n z 研究较多，区别在于n i s i n a 的第2 7 位a a 为h i s ，而n i s i n z 的第2 7 位a a 为 a s n ，它们的抗菌特性几乎无差别。n i s i na 的分子结构见下图所示【2 0 1 。 图1 1 n i s i na 的结构 f i g 1 - 1s t r u c t u r eo fn i s i na 1 3 1 2 乳酸链球菌素的理化性质 乳酸链球菌素是一种白色的粉末，其易溶于酸性溶液中，溶解性随着p h 值的增大而逐渐降低。当n i s i n 溶于p h 3 的盐酸溶液中经1 2 1 ，加热1 5 分钟 后仍能保持1 0 0 9 6 的活性。乳酸链球菌素是热稳定的，在酸性条件下对链霉蛋白 酶、胰蛋白酶及胃蛋白酶不敏感，但易被胰凝乳蛋白酶失活【2 。 1 3 1 3 乳酸链球菌素的抑菌机理 目前，广泛被人们接受的抑菌机理是乳酸链球菌素要起到抑菌的作用就必 须先要吸附在微生物的细胞质膜上，但是吸附后继续如何作用，人们的分歧还 比较大【2 2 1 。一种观点认为在一定膜电位存在的条件下，乳酸链球菌素与细菌细 胞膜结合形成通透性孔道结构，导致k + 从胞浆中流出，a t p 泄漏，从而引起胞 外水分子进入，最终导致细胞自溶 2 3 - 2 4 】。另一种观点认为n i s i n 单体中的 d h a ( 脱氢丙氨酸) 和d h b ( 1 3 甲基脱氢丙氨酸) 可以与敏感性细胞膜中的某些 酶的巯基发生作用【25 1 ，从而导致细胞裂解。 1 3 1 4 乳酸链球菌素的安全性 乳酸链球菌素的安全性很高，它在人体内可以降解为无毒的化合物【2 6 1 。 1 9 9 2 年3 月，我国卫生部在批准乳酸链球菌素可以用于实际实施的文件中就明 确指出：“可以科学地认为乳酸链球菌素作为食品保藏剂是安全的。 1 3 1 5 乳酸链球菌素在食品中的应用 乳酸链球菌素作为一种天然、无毒的防腐剂，在食品工业中的应用相当广 泛，如今已应用到乳制品、肉制品、酿酒、果汁饮料、焙烤食品等领域。 ( 1 ) 肉制品 硝酸盐，亚硝酸盐是肉类产品中常用的发色剂，但是亚硝酸盐具有致癌性， 4 对人体有较大的危害。n is i n 是美国联邦肉类检验法规认可的可适用于干香肠 和半干香肠中的防腐剂，添加n is i n 可以降低肉类产品中亚硝酸盐的含量，提 高肉制品的安全性。罗欣【2 7 l 等通过实验证明7 5 m g l 的n i s i n 在冷却牛肉的保 鲜中起到明显的抑菌作用，并且其保鲜效果随质量分数的增加而逐渐增强。 n i s i n 能有效控制肉制品中微生物的生长，尤其是抑制能产生毒素的肉毒梭状 芽孢杆菌的活性，并且n i s i n 本身呈酸性，可以降低周围介质的p h 值，从而 降低残留的亚硝酸盐的含量，减少亚硝胺的形成，增强产品的安全性。于见亮 【2 8 】等利用响应面法对n i s i n 、茶多酚、壳聚糖进行复配组合，应用于冷却羊肉 的保鲜中，结果表明：三种保鲜剂的抑菌效果依次为n i s i n 壳聚糖 茶多酚； 复合保鲜剂n i s i n 、壳聚糖、茶多酚的最佳比例分别为0 1 3 7 、1 3 9 5 、0 1 5 8 。 ( 2 ) 乳制品 乳制品属于热敏性的食品，在乳制品的加工过程中，必然会遭受外晁微生 物的污染，虽然现在多数的乳制品是采用巴氏杀菌的方法，但是其中仍然会残 留部分耐热的芽孢杆菌，这大大缩短了乳制品的货架期。n i s i n 有很强的抑菌 效果，所以结合使用n is i n 作为防腐剂，可以抑制乳制品中的微生物的生长， 延长乳制品的货架期，避免不必要的经济损失。 1 3 2 脱氢醋酸钠 脱氢醋酸钠是国家批准可以使用的一种广谱、抑菌力极强的食品防腐剂， 对霉菌、酵母菌、细菌都有很强的抑制作用。脱氢醋酸钠是无味的白色粉末， 在人体内可以降解为乙酸，对人体无害并且不会影响食品的口味。脱氢醋酸钠 现已广泛应用于豆制品、泡菜、炝菜、蜜饯、罐头、果酒、渍酸菜、成熟腐乳、 酱油、豆酱、什锦酱菜、桔浆原汁、果汁等产品中【2 9 1 。 1 3 2 1 脱氢醋酸钠的结构 脱氢醋酸钠的分子式是c s h 8 0 4 ，学名3 一乙酰基一6 一甲基一2 ，4 ( 3 h ) - - - 酮。 1 3 2 2 脱氢醋酸钠的理化性质 脱氢醋酸钠其为白色或近白色结晶性粉末，易溶于水，2 5 时的溶解度为 3 3 9 1 0 0 9 t 3 0 】，无臭，热稳定性较好。 1 3 2 3 脱氢醋酸钠的抑菌范围 其属于广谱类防腐剂，对于霉菌，细菌和酵母菌都有很强的抑制作用。一 般抑制的有效浓度在0 0 5 0 1 ，一般用量为0 0 3 一o 0 5 。 1 3 2 4 脱氢醋酸钠的应用 目前脱氢醋酸钠在面类食品，肉制品，豆类食品中都已经有所运用。 ( 1 ) 肉制品 脱氢醋酸钠在肉类食品中的应用也属于刚刚起步阶段，其应用的实验研究 也在广泛的开展。连军强【3 l 】以脱氢醋酸钠为主防腐剂复配使用乳酸钠、柠檬酸 钠和e d t a ，应用到低温灌肠肉制品中显示其可以延长低温灌肠肉制品的保质 期。段会轲【3 2 1 将脱氢醋酸钠与乳酸链球菌素【3 3 1 、双乙酸钠、甘氨酸等复配保鲜 低温肉，达到了很好的预期效果。 ( 2 ) 面制品 彭家泽【3 4 】发现，在面包中复配使用脱氢醋酸钠，丙酸钙，月桂酸单甘油酯， 其防腐效果最好，面包的各项指标在3 0 d 内均符合标准要求。林金莺【3 5 】的研究 表明，在湿面条中添加0 0 5 脱氢醋酸钠和3 乳酸钠复合保鲜，面条在3 0 下可以保鲜2 4 小时。杜荣茂【36 】等在试验中发现，在面包中添加脱氢醋酸钠和 丙酸钙均能有效地延迟面包的霉变时间，且随着用量的增大，效果越来越好， 通过复配试验表明，在脱氢醋酸钠和丙酸钙的配比为2 ：3 时的抑菌性能达到 最好。 ( 3 ) 腌制蔬菜 目前在腌制蔬菜中应用的防腐剂大都为酸性防腐剂，比较普遍的有苯甲酸 钠及山梨酸盐类。但是，由于脱氢醋酸钠的高效抑菌性和安全性，也有一些厂家开 始尝试使用此种防腐剂。谢田【37 】等在试验中，通过分析脱氢醋酸钠对糟辣椒发酵 及保藏过程中品质的影响，发现，在发酵前添加脱氢醋酸钠可以抑制槽辣椒的 发酵，在储藏期间添加脱氢醋酸钠，可以使槽辣椒的p h 值升高。维生素c 损 失率、亚硝酸盐增加量、菌落总数等低于对照组，并低于苯甲酸钠组，且添加 量达到0 0 3 以上可以达到很理想的保鲜效果。在泡菜中添加脱氢醋酸钠，可 以延长泡菜的保质期。在制作酸菜时添加些脱氢醋酸钠，可以使酸菜不腐烂， 无异臭，可保鲜一年，酸菜仍香脆【3 引。 1 3 3 尼泊金酯类化合物 1 3 3 1 尼泊金酯的结构 腑n 尼泊金酯亦称对羟基苯甲酸酯，其结构通式为n , f f 如9 0 0 r 。尼泊金酯r 基团 的越大，毒性越低、抗菌性越高、在水中的溶解度越小、但是脂溶解度越大。 1 3 3 2 尼泊金酯的理化性质 为白色块状或针状晶体，在空气中很稳定，耐低温和高温，几乎不溶于水 【3 9 1 。由于其在水中的溶解性很小，但是其盐类在水中的溶解性良好，所以在实 际生产中常常使用尼泊金酯的盐类，来达到防腐保鲜的目的。 1 3 3 3 尼泊金酯类化合物的抑菌机理 对于尼泊金酯的抑菌机理，人们也在广泛的研究。现在被大众接受的说法 是其可以作用于微生物的细胞膜上，使细胞膜裂解，使细胞内的蛋白质变性， 并且还可以大大降低细胞的呼吸酶系和电子传递酶系的活性，从而使微生物的 生长受到抑制【4 训。 1 3 3 4 尼泊金酯的安全性 6 国家规定尼泊金酯类防腐剂中可以使用的有甲酯钠、乙酯钠、丙酯钠。尼 泊金酯类防腐剂的a d i 值明显地大于苯甲酸防腐剂，这说明在同样条件下尼泊 金酯类防腐剂的使用量比苯甲酸类防腐剂多，也间接说明了尼泊金酯的安全性 要高于苯甲酸。 1 3 3 5 尼泊金酯的应用 因为尼泊金酯在p h 从4 - 8 的范围内都有明显的抑菌效果1 4 1 】【4 2 1 ，所以属于 广谱高效低毒的食品防腐剂。尼泊金酯类防腐剂不但相互间复配使用效果良 好，而且还能和其它食品添加剂复配使用以提高防腐效果【4 3 1 。尼泊金酯类应用 于食品工业已经有7 0 多年的历史。世界上很多国家包括美国，日本，欧洲等 都允许在调味品工业中添加尼泊金酯钠【4 4 】【45 1 。在我国，关于尼泊金复合酯在食 品工业中应用的研究也一直在进行，国标也有望进一步加宽尼泊金酯的适用范 围。 邹玉萍【4 6 】研究了尼泊金酯添加到蒸煮袋装熟鱼的防腐实验，发现各单酯的 抑菌能力为丁酯 丙酯 乙酯；并且当尼泊金乙酯：尼泊金丙酯：尼泊金丁酯 质量分数比1 ：1 ：3 时能达到最优的抑制效果；在尼泊金复合酯质量分数为o 0 2 5 时能使蒸煮袋熟鱼在4 c 的保质期比不加防腐剂的空白对照延长1 0 d ，并且 不会影响熟鱼制品的口感。刘岩【4 7 】等在酱油中添加尼泊金乙酯和丙酯的混合 物，发现当尼泊金丙酯和尼泊金乙酯以2 ：l 的比例混合使用时，对酱油的保鲜 效果最好。蒋予箭【4 8 j 研究了国标范围内几种常用化学防腐剂在蛋黄酥月饼中的 保鲜效果，发现尼泊金酯的抑菌防腐效果明显好于山梨酸钾、脱氢醋酸钠，可 使蛋黄莲蓉月饼的保质期延长1 5 天以上。综上可以看出，尼泊金酯类化合物 在食品工业上的应用越来越广，并且通过实验可以看出其保鲜效果是很好的。 1 3 4 壳聚糖 1 3 4 1 壳聚糖的结构 壳聚糖又称为脱乙酰甲壳素，甲壳胺，是通过甲壳素脱乙酰基而制成的， 其化学名为( 1 ，4 ) 一2 氨基一2 一脱氧一d d 一葡萄糖。其是氨基葡萄糖和 n 乙酰氨基葡萄糖通过p l ，4 键连接而成的一种多用途生物聚合物，其是甲壳 类、昆虫和真菌类生物中含量最丰富的天然聚合物【4 9 1 。 1 3 4 2 壳聚糖的理化性质 壳聚糖是一种白色或者灰白色的半透明固体，平均分子量为1 2 1 0 5 ，壳 聚糖不溶于水，浓酸，碱液及酒精、丙酮等有机溶剂，但是其溶于弱酸和稀酸 溶液。 1 3 4 3 壳聚糖的抑菌机理 a l l a n 等【5 0 】首次于1 9 7 9 年提出了壳聚糖的广谱抗菌性，此后很多学者研究 了壳聚糖的抑菌机理，发现了壳聚糖对各种细菌，酵母菌都有很好的抑制活性 【5 1 1 。根据壳聚糖的分子量的大小，对微生物有不同作用机理。小分子的壳聚糖 7 可以进入微生物的细胞内部，与核酸或蛋白质结合，影响微生物的遗传物质的 代谢和传递【5 引。大分子的壳聚糖可以在微生物表面形成一层高分子膜，隔断细 胞与外界的能量及营养交换，最终导致细胞的凋亡【53 l 。 1 3 4 4 壳聚糖的安全性 壳聚糖是一种天然的多糖，其具有很多生理活性，并且没有任何毒副作用。 壳聚糖可以与体内的胆固醇前体结合，降低人体胆固醇，还可以抑制脂肪的吸 收，控制血压的上升，还能改进人体的小肠吸收和保护人体组织器官【5 钔。 1 3 4 5 壳聚糖的应用 壳聚糖因其天然性，无毒性，并且保鲜性能好的特点，虽然现今还没有在 工业上大规模使用，但是已渐渐的成为研究的热点，有很多研究显示了其广泛 的应用，有很大潜力应用于各种食品工业中。 余毅【55 j 等人复配了壳聚糖、柠檬酸、茶多酚等多种天然活性成分研制出适 用于酱腌菜的天然防腐保鲜剂，此复配防腐剂不但保持了酱腌菜原有的风味， 而且大大增加了产品的安全性。 壳聚糖由于其良好的成膜性，经常用于食品的涂膜保鲜。周守勇等【56 】使用 壳聚糖膜保鲜鲜切蒲菜，发现2 壳聚糖被膜可以显著的降低鲜切蒲菜的失重 率，抑制蒲菜的褐变，具有良好的保鲜效果。陈天等【5 7 】对壳聚糖常温保鲜猕猴 桃的研究结果显示，采用壳聚糖涂膜能显著提高果实的保鲜期。壳聚糖在冷鲜 肉的保鲜中也有较广的应用，台湾学者用羧甲基壳聚糖制成肉类食品的防腐 剂，用量仅为0 0 3 就可以使肉制品在常温下保存8 d 而不变质【5 引。日本已将 壳聚糖与乳酸钙或醋酸钙制成一种水溶性的保鲜剂，具有高杀菌性且安全无 毒，将该保鲜剂与大米混合蒸熟后，在2 8 下可存放1 8 d 之久。 1 4 本课题研究的目的、意义及主要内容 1 4 1 研究的目的 以腐败腌制蔬菜为原料，对其中腐败菌类型和数量进行初步鉴定，并且对 其理化特性( 耐盐性，耐酸性，耐温性等) 进行了研究。通过单一防腐剂的筛 选实验，筛选出对腐败菌抑制效果较好的防腐剂种类并确定浓度范围，再通过 正交试验优化防腐剂的配方，得到高效的复合防腐剂。最后将此复合防腐剂应 用于腌制蔬菜中，对此复合防腐剂实际保鲜效果及应用可行性进行评价。 1 4 2 研究的意义 腌制蔬菜是日常饮食中一种重要的调味菜。随着人们的生活水平日益提 高，对食品的健康、安全的要求也与日俱增。苯甲酸钠和山梨酸钾类化学制剂 是目前广泛使用的防腐剂，由于具有一定的潜在危害性，受到人们的质疑，开 发安全性腌制蔬菜防腐剂被提上日程。本实验从国标中挑选出低毒高效的化学 防腐剂，联合现今备受瞩目的生物防腐剂n i s i n ，这样既可以降低化学防腐剂 的使用量，又可以降低单纯使用生物防腐剂的高额成本，在实际生产中有一定 8 的可行性。此外，本实验的筛选方法为以后的防腐剂筛选提供一定的思路和参 考。 1 4 3 研究的主要内容 ( 1 ) 通过对充分腐败的腌制蔬菜进行菌种筛选和初步鉴定，得出腌制蔬 菜中腐败菌的种类和数量。并且测定各腐败菌对盐度、温度、酸度等的耐受能 力。 ( 2 ) 比照国标中的防腐剂添加的标准、用量及文献记载的资料，通过单 因素实验，从乳酸链球菌素( n i s i n ) ，脱氢醋酸钠，尼泊金复合酯钠，壳聚糖， 富马酸钠中挑选出对于腌制蔬菜中腐败菌有较好抑制作用的制剂。最后通过正 交试验优化复合防腐剂成分及配比。 ( 3 ) 将所得到得复合防腐剂添加到腌制蔬菜中，同时对比不添加防腐剂 和添加了传统的苯甲酸钠和山梨酸钾防腐剂的产品，在加速腐败的储藏期内， 研究三种产品的理化性质( 蛋白质含量，总酸值，还原糖的含量) 及卫生状况 的变化规律( 总菌数和大肠杆菌数) ，并对筛选得到复合防腐剂进行成本核算。 9 第二章腌制蔬菜中腐败菌的筛选、初步鉴定及其生物学性质研究 腌制蔬菜在我国有悠久的历史，蔬菜腌制后由于其特殊的香味和香脆的口 感，备受人们的喜爱。近年来，为了使腌制蔬菜便于携带并且提高其安全性， 袋装腌制蔬菜越来越流行。在袋装腌制蔬菜中，由于腐败菌的作用，经常发生 涨袋的现象，导致了大量的经济损失。 本章主要是通过对已经充分腐败的腌制蔬菜，进行菌种的分离纯化和初步 鉴定，得出其中的菌种的数量和类型。并且对于所筛选得到的菌种进行生物学 性质和对外界环境的抗性研究，进而选择抗性较强的菌种作为后续的实验的指 示菌种。 2 1 材料和方法 2 1 1 原料 安徽露仙调味食品有限公司提供的腌制蔬菜 2 1 2 主要试剂 蛋白胨 b r北京奥博星生物技术有限责任公司 营养琼脂 b r北京奥博星生物技术有限责任公司 可溶性淀粉 b r北京奥博星生物技术有限责任公司 虎红琼脂 b r北京奥博星生物技术有限责任公司 氯化钠a r合肥工业大学化学试剂厂 葡萄糖a r天津英博生化试剂有限公司 琼脂 a r 天津市福晨化学试剂厂 结晶紫a r广东汕头市西陇化工厂 磷酸氢二钾a r上海化学试剂有限公司 硫酸亚铁a r广东汕头市西陇化工厂 碘a r广东汕头市西陇化工厂 草酸铵a r广东汕头市西陇化工厂 乙醇a r广东汕头市西陇化工厂 碘化钾a r广东汕头市西陇化工厂 蕃红a r广东汕头市西陇化工厂 2 1 3 仪器与设备 恒温培养箱 数显恒温水浴锅h h 2 型 电子天平 l o d h p 9 0 8 2 型恒温培养箱 国华电器有限公司 上海精科天平f a l 0 0 4 型 s w c j 1 f 单人双面净化工作台 y x q s g 4 6 2 8 0 s 手提式压力蒸汽灭菌锅 生物显微镜 数码相机 苏州净化设备有限公司 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 麦克奥迪实业集团有限公司 佳能a 9 5 2 1 4 培养基 ( 1 ) 细菌培养基：营养琼脂培养基 ( 2 ) 酵母培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基 ( 3 ) 霉菌培养基：虎红琼脂培养基 ( 4 ) 放线菌培养基：高氏一号培养基 2 2 实验方法 2 2 1 革兰氏染色法 取菌制成涂片，干燥、固定。用草酸铵结晶紫染液染色l m i n ，用水冲洗。 滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖l m i n ，用水冲去碘液。然后斜置载片 于一烧杯上，滴加9 5 乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色为止( 约 0 5 m i n ) 。立即用水冲洗净乙醇并用滤纸轻轻吸干。用蕃红染液复染l m i n ，水 洗。最后吸干并镜检。在显微镜下观察到的细胞，紫色的是革兰氏阳性菌，红 色的是革兰氏阴性菌。 2 2 3 比浊法： 比浊法是在浊度计或比色计上测定培养液中微生物的数量。某一波长的光线，通 过浑浊的液体后，其光强度将会被减弱。入射光与透过光的强度比与样品液的浑浊度 和液体的厚度相关。 地 k c d i t ：透射光的强度； i o ：入射光的强度； k ：吸光系数； c ：样品液的浑浊度； d ：液层厚底； 争称为透过度： l o g 百i o 称为吸光系数，简称。 o d 值与样品的浊度相关，所以，可通过测定样品中的o d 值来代表培养液的浊度及 微生物量。 2 3 实验方案 2 3 1 样品预处理 将1 0 袋包装完好没有加入防腐剂的腌制蔬菜，置于3 7 恒温光照培养箱中培养 3 0 d ，使腐败菌充分生长。 2 3 2 腐败菌的分离 ( 1 ) 在无菌条件下，称取2 5 9 腌制蔬菜样品于食品料理机中绞碎，然后加入到 一个