（生物医学工程专业论文）不同周期光暗循环对小鼠生长和摄食的影响.pdf

摘要 目的： 研究不同周期光暗循环对小鼠生长、活动的影响，探讨生长发育 与近日节律系统和直接光应答系统的关系与机制。 方法： 动物选用i c r 小鼠。小鼠在控制环境条件下，人工提供光线， 分别测定l d 3 3 组( 光照：3h ；黑暗：3h ) 、l d 5 5 组( 光照：5h ； 黑暗：5h ) 、l d 7 f 7 组( 光照：7h ：黑暗：7 h ) 、l d l 2 1 2 组( 光照： 1 2 h ：黑暗：1 2 h ) 、l d l 6 1 1 6 组( 光照：1 6 h ；黑暗：1 6 h ) 、l d 2 2 2 2 组( 光照：2 2h ：黑暗：2 2h ) 、l d 2 5 2 5 组( 光照：2 5h ；黑暗：2 5 h ) 和d d 组( 全黑) 的活动性情况；小鼠在控制环境条件下，人 工提供光线，3 组的光暗循环分别为l d s 5 、l d l 2 1 2 和l d l 6 1 1 6 ，饲 养6 周。检测指标包括：小鼠的活动性、血浆皮质激素和生长激素( 放 射免疫法) 和小鼠生长速度、摄食、食物效率。 结果： 在l d l 2 1 2 光暗循环条件下，小鼠的活动性和血浆皮质激素等的 节律与外界环境的光暗循环保持一致。小鼠在l d 5 1 5 和l d l 6 1 6 的光 暗循环条件下与l d l 2 1 2 比较，活动性较高，血浆皮质激素和生长激 素水平较高，小鼠的生长速度较快、摄食量较高、食物效率较高。在 l d 5 5 和l d 2 2 2 2 的光暗循环条件下，小鼠的生长加快可能与小鼠的 皮质激素和生长激素水平增高有关。 结论： 小鼠活动性周期与光暗循环同步；不同的光暗循环对小鼠血浆皮 质激素和生长激素水平产生不同的影响；不同的光暗循环能够影响小 鼠的生长速度，其结果可能与近日节律系统和直接光应答系统的共同 作用有关。 关键词： 时间生物学，近日节律，生长速度，摄食，食物效率，光暗循环， 皮质激素，生长激素，活动性。 t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tl i g h t - d a r kc y c l e so n g r o w t hr a t ea n df o o di n t a k eo fm i c e o b j e c t i v e ： a b s t r a c t t h ea d a p t a t i o no ft h ee n d o g e n o u sr h y t h mo fa no r g a n i s mt oe x t e r n a l c y c l e sm a yb ei n f l u e n c et h ed e v e l o p m e n to fp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e so n a n i m a l s t h i ss t u d yw a sd e s i g n e dt o i n v e s t i g a t ee f f e c t so fd i f f e r e n t l i g h f f d 盯k ( l d ) c y c l eo ng r o w t hr a t e ，f o o di n t a k e ，t h el e v e lo fp l a s m a c o r t i c o s t e r o n ea n dg r o w t hh o r m o n eo fm i c e ，a n dt h er e l a t i o n s h i pa m o n g t h e m m e t h o d ： 2 - w e e k - o l dm a l em i c ew e r gr a i s e du n d e rd i f f e r e n tp e r i o dl e n g t ho fl d c y c l ei n c l u d i n gl d 5 5 ( 1 i g h t ：5 h ；d a r k ：5 h ) ，l d l 2 1 2 ( 1 i g h t ：1 2 h ；d a r k ： 1 2 h ) a n dl d l 6 1 6 ( 1 i g h t ：1 6 h ；d a r k ：1 6 h ) f o rf o u rw e e k sa n dm e a s u r e dt h e g r o w t hr a t ea n df o o di n t a k ee v e r yw e e k p l a s m ag r o w t hh o r m o n ea n d g r o w t hh o r m o n el e v e l sw e r em e a s u r e db ys t a n d a r dr a d i o i m m u n o a s s a y r e s u i t s ： m i c ei nl d 5 5a n dl d i6 1 6g r o u p sm a n i f e s t e dh i g h e rl o c o m o t o r a c t i v i t y ，l e v e l o f p l a s m a c o r t i c o s t e r o n e a n d g r o w t h h o r m o n e c o n c e n t r a t i o n s ，a n dg r o w t hr a t e t h a nt h a ti nl d l 2 1 2g r o u p ，t h e l o c o m o t o ra c t i v i t yo ft h ea n i m a l so fg r o u p sl d 5 5 a n dl d l 6 1 6 ， 3 e x p r e s s e da sn u m b e ro fc o u n t sp e rh o u r ，w a sh i g h e ri n t h o s ea n i m a l s c o r r e s p o n d i n gt og r o u p l d l 2 t 1 2f p o 0 0 1 ) t h el e v e lo fp l a s m a c o r t i c o s t e r o n ei nl d l 2 1 2g r o u pw a sl o w e rt h a nt h a t i nl d 5 5a n d l d l 6 1 6g r o u p s 伊= 0 0 2 2 ) ，t h el e v e lo fp l a s m ag r o w t hh o r m o n ei n l d l 2 1 2g r o u pw a sl o w e rt h a nt h a t i nl d 5 1 5a n dl d l 6 1 6g r o u p s ( p = 0 0 1 0 ) t h ei n c r e a s eo f b e d yw e i g h ti na n i m a l sw a sl o w e s ti nl d l 2 1 2 g r o u pn 0 e e l ) g r o u pl d l 2 1 2h a dt h el o w e s tf o o de f f i c i e n c yl e v e l f p = o 0 0 3 ) c o n c l u s i o n s ： t h er e s u l t ss u g g e s tt h a td i f f e r e n tl dc y c l em a ya f f e c tm a n y p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e si n c l u d i n gg r o w t hr a t ea n df o o di n t a k e ，a n d t h e c h a n g eo fg r o w t hr a t ei nd i f f e r e n tl dc y c l em a y b er e l a t e dt ot h el e v e lo f c o r t i c ：o s t e r o n ea n dg r o w t hh o r m o n ec o n c e n t r a t i o n s ；f o o de f f i c i e n c ys e e m s t ob er e l a t e dt ot h ea n i m a l se n d o g e n o u sp e r i o da n dt h ep e r i o do fe x t e m a l l dc y c l e ，i n d i c a t i n gt h ei m p o r t a n c eo ft h ec i r c a d i a ns y s t e mi ni n f l u e n c i n g g r o w t hr a t e ，f o o di n t a k ea n d ，p e r h a p s ，m e t a b o l i s m k e yw o r d s ： c h r o n o b i 0 1 0 9 y ；c i r c a d i a n ；l i g h t d a r kc y c l e ；f o o di n t a k e ；f o o de f f i c i e n c y ； c o r t i c o s t e r o n e ；g r o w t hr a t e ；l o c o m o t o ra e t i v i t y ；m o u s e 4 第一章前言 生物节律存在于包括人在内的大多数生物的各种生命活动中。无 论是单细胞生物还是高等哺乳动物都存在生物节律，尤其是近日节 律，这说明生物节律是自然界基本的生理现象。生物节律是内源性的， 但它是随着生物的发育，在一定时空条件下逐步发育成熟的，在此过 程中许多因索( 环境的或内源的) 都可影响它。这也是不同生物个体 的生物节律存在很大地域、时间、年龄、种族、性别和个体差异的原 因之一。如近日节律是最重要的生物节律之一，它在地球上近似2 5 小时的周期就与地球自转而引起的以2 4 小时为周期明暗交替变化的 环境密不可分，而不同纬度、不同国家居民近日节律在位相等方面的 差别又与各地环境的具体差异有关。生物节律形成、稳定后，他不但 在生物适应环境方面起着重要作用，而且在调节和协调各个系统的功 能等方面也发挥着极其重要的作用，其地位十分重要。 各种生物节律在目前来说以近日节律研究最为深入。近日节律是 最为重要的生物节律之一，它存在于生物体各个器官、各个系统，以 致生物体整体活动中，如睡眠觉醒、激素分泌、行为活动以及体温脉 搏等基本生命体征无不表现出近日节律。近日节律的产生是由“生物 钟”控制的。现在的研究表明，近日节律的产生的最基本层次是单个细 胞，即便是哺乳动物复杂的s c n 系统，其节律产生最终也来自单个细 胞m 刘。这说明近日节律的产生，也就是近日钟的运作是在分子水平 进行的。因此，对近日节律的研究也就在三个主要方向展开：近日钟 的在分子水平的运作方式，即近日钟的基因基础；细胞内的生物节律 如何响应外界环境的变化并与环境同步，即近日钟是如何被重置；近 日节律是如何输出的。 生物钟在进化上的起源非常古老，其结构和功能也是随着进化而 不断发展，因此不同的物种的生物钟虽然存在各自的特殊结构，但近 日节律产生的分子基础是类似的。它们都有一个核心元件的循环变化 来引导节律的产生，也就是说近日节律的产生都有其起搏点 ( p e a c e m a k e r ) ，都通过钟基因的转录和转录后调控产生的分子振荡 引起。如蓝菌的k a i ，哺乳动物的p e r 、c l o c k 等基因的作用。 近日节律的产生是在一定环境条件下产生的，环境因素对其影响 是不可忽视的。高等生物的近日钟系统包括近日节律的输入、近日节 律中枢和近日节律的输出，其外周感受器可以感受同步因素( 授时因 子) 的作用，通过近日节律系统做出反应，导引近日节律的重置，影 响近日节律的表达，同时也影响相应的生命过程。在哺乳动物，这些 过程由称为光内分泌系统或近日节律系统完成。该系统由相互连接的 多个部分组成，包括：视网膜、s c n 和松果体。视网膜为感受器，s c n 为内源性近日节律起搏点，其时钟基因的相互作用即为分子振荡器， 通过钟控基因控制近日节律的输出。松果体为s c n 的输出的靶器官之 一，其产生的褪黑素能够影响s c n 本身的功能，而且作为近臼节律的 输出信号作用于周围组织，可调节机体的行为、激素分泌、新陈代谢 等众多功能。对近日节律的研究对人类更好的了解自己指导生产、 生活有重要意义。 一、近日钟系统 目前认为，近日钟机制主要包括钟振荡器( o s c i l l a t o r ) 、信号输入 ( i n p u t ) 、( o u t p u t ) 和钟的整合或调节( i n t e g r a t i o n o rr e g u l a t i o n ) 几大部分【3 1 ： 1 、信号输入，是外界环境因素为生物所感知的过程。随着昼夜 的变化，最易被生物所感知的外界就是光周期。光周期对维持生物较 长时间的昼夜节律意义重大。哺乳动物近日节律系统的光感受器和视 觉光感受器一样位于眼球的视网膜，但是，近日节律系统的光感受器 不是传统的视觉光感受器的视干细胞和视锥细胞，现在研究表明，近 日节律系统的光感受器位于视网膜深层，为部分含有m e l a n o p s i n 的视 网膜神经节细胞”、s op c r l 基因的光诱导作用很可能是s c n 钟系统中 相位移动过程的关键步骤【6 l 。光通过视网膜下丘脑束( r u t ) 的谷氨酸 能神经通路，调节p e r l 的诱导。r h t 传递外界的光状态的信息到达 s c n ，也将这些信号传递给s c n 邻近区域和大脑的其他核团。其在 s c n 及其周围区域和其他脑区的精确投射，在不同种属的动物有一定 的不同。在大鼠，r h t 的投射目标主要位于s c n 的v i 区域。也有少 数的神经纤维投射于d m s c n ，同时与之并行的部分纤维投射于i g l 。 在人类的神经示踪研究发现，r h t 主要分布于s c n 的前腹部【7 1 。 另外还有两条途径：一为由视网膜投射到i g l 的神经肽y ( n p y ) 免疫反应阳性的神经元的间接途径，通过g h t 投射到s c n l 8 1 。在光 暗循环条件下，v l 区s c n 的神经肽y ( n p y ) 水平存在近日节律变化， 并同时出现两个高峰，一个高峰位于明转暗时，而另一个高峰位于暗 转明时。在全黑状态下，高峰不出现。r h t 和g h t 在s c n 的投射， 提示i g l 涉及近日节律系统对光反应的调节。i g l 和g h t 除传输光 信号到s c n 外，还涉及非光信号的传输。另一条途径为从中缝核到 s c n 的输入途径疆】。递质为5 h t 。s c n 的5 - h t 含量存在近日节律。 在光暗循环条件下，5 - h t 的高峰在光照期。在全黑状态下，5 h t 的 高峰在c t l 6 左右。5 h t 输入s c n 的活性同时受s c n 和光输入的调 节。通过对大脑5 - h t 的处理，如化学耗竭或激动剂的应用，无论是 在l d 还是d d 状态下，均能够影响大鼠和仓鼠活动性的近日节律的 周期和位相。另外通过注射p - c h l o r o p h e n y l a l a n i n e 耗竭5 - h t ，导致自 天低点的v i p ( 血管活性肠肽) m r n a 的减少，但不影响夜间的m r n a 的水平。这些资料与5 - h t 在白昼的活动高峰一致。5 - h t 耗竭对 v i p m r n a 水平的作用可以解释为对视网膜下丘脑神经传输存在两个 水平。一是通过s c n 的r h t 轴突的突触前5 h t 受体，影响谷氨酰 胺的释放。或是通过突触后的5 - h t 或s c n 神经元的5 - h t 的受体产 生相应效应。破坏5 - h t 系统，在主观自昼的中期给予光脉冲可以导 致增加5 0 的位相延后。刺激中缝核或5 - h t 的前体t r y ( 色氨酸) ， 或应用5 - h t 的激动剂可以抑制光诱导的相位延后和相位提前。 2 、振荡子，是维持生物节律的关键组分。振荡子是指生物体内 的关键基因表达随昼夜节律而有规律的振荡，导致蛋白水平也随昼夜 节律有规律地振荡，进而调节其他基因表达。对动物近日钟的分子机 制的研究主要是对其振荡子的研究。近日钟的振荡子调节属于负反馈 调节回路，可分为中枢振荡子和外周振荡子。在哺乳动物中，中枢振 荡子位于视交叉上核( s c n ) 中。它可通过褪黑素等调节外周振荡子， 实现机体节律的统一。但外周振荡子也可独立的工作，如肝脏和胃中 食物的摄入就可以调节它们中的振荡子的节律【9 】。近日钟的振荡子调 节属于负反馈调节回路。哺乳动物近日钟依赖于c l o c k b m a l l 等 蛋白因子的正反馈环路和依赖于c r y 等蛋白因子的负反馈环路共同 维持。c l o c k b m a l l 作为转录因子与一些时钟基因，如：p e r l 、 p e r 2 、p e r 3 、c r y l 、c r y 2 等的e b o x 结合，启动这些时钟基因的转录。 c l o c k b m a l l 的活性高低决定这些时钟基因转录的效率。另一方面， p e r 蛋白( p e r l 、p e r 2 、p e r 3 ) 与c r y 蛋白( c r y l 、c r y 2 ) 相互作用 形成二聚体，其中，p e r 2 蛋白进入细胞核。在细胞核内，c r y 蛋白 阻止c l o c k f b m a l i 复合体形成，从而抑制，p r 和c r y 的转录，而 p e r 2 蛋白则激活b m a l l 基因的转录。所以当p e r l 、p e r 2 、p e r 3 、 c r y l 、c r y 2 等基因的蛋白产物进入细胞核后可反馈性的抑制 c l o c k b m a l l 的活性，这种抑制反过来使n r j 、p e r 2 、n r 3 、c r y l 、 c r y 2 等基因的转录减少，进藕又解除对c l o c k b m a l l 的抑制，使近 日钟分子振荡得以产生和维持。由于基因的转录和蛋白进入细胞核需 要一定的时间，使得整个反馈环活动的完成需要大约2 4 小时，从而使 分子振荡的周甥正好2 4 h 左右，形成近日节律的周期变化( 圉1 1 ) 。 图1 1 近日节律振荡子模式 但是这种正、负反馈环产生的节律并不十分稳定，机体通过p e r 等蛋白的作用来维持近日节律的稳定性，且在必要时候对节律振荡做 出调整1 1 2 】。p e r 蛋白在受至l j c k l e 激酶的作用后被磷酸化，导致其稳 定性降低，它们与c r y 等其他成分相互作用的能力也发生了改变，从 而影响节律的表达。另外。b m a l l 基因的节律表达可能受到 c 【d c k b m a l l 的抑制，可能与p e r 蛋白激活b m a l l 基因表达有关。 在上述过程中，p e r l - 与p e r 2 的作用相似。但它们表达的峰值不同： 9 p e r l 在c t ( 自主时间) 4 - 6 小时，p e r 2 在c t 9 1 2 d 时。提示它们可能分 别与晨间振荡和晚上振荡有关【”j 。 总之，近日钟的振荡是多种基因共同作用的结果，它们通过对下 游基因( 钟控基因) 表达的调控输出其影响，调节众多生命过程。 3 、输出途径，指分子水平上的振荡导致宏观上可观测的生命活 动的周期性过程。近日节律中枢的靶器官涉及众多系统。如：松果体、 心血管系统、消化系统、神经内分泌系统等等，近日节律中枢通过直 接和间接途径调控这些系统的功能。其中最重要的是松果体分泌的褪 黑素，褪黑素作为重要的节律输出激素作用于多种靶器官，其在近日 钟中枢控制下，不但调节其他各个系统，而且可以影响近日钟中枢的 功能。生物钟控制的基因涉及到转录、翻译、蛋白折叠、代谢、免疫 反应、细胞周期、离子转运和信号转导等各个方面，并且这些钟控基 因的转录是互相协调的【l 钔。这一结果提示：在一定程度上，细胞和机 体内的几乎所有生理生化事件都可能受近日钟的影响。 二、近日钟系统的作用 近日节律系统是一个复杂的系统，它的作用与功能也是多方面 的，而这种广泛的作用与功能也从另一个侧面反映出近日节律的重要 性。那么近日节律到底有哪些作用呢7 结合前人的研究，可以从下面 几个方面进行探讨。 1 、适应环境近日节律【l5 j 是机体对环境条件可预见变化的适应 性，近日钟系统通过重置作用，使机体的生理、生化、代谢和行为与 外界环境保持一致，特别是与外界环境的光暗循环同步。这样使机体 的各种行为和功能与所处的环境相适应。如睡眠觉醒、饮水、摄食等 都出现与环境相适应的节律，体温等生命体征、代谢亦与之相适应， l o 各器官功能如血压、心率等也都受近日节律影响。 2 、对内分泌的影响近日节律可对各种激素的分泌产生影响。 如：下丘脑一垂体一肾上腺皮质轴【1 6 】，下丘脑促肾上腺皮质激素释放 激素、垂体促肾上腺皮质激素和肾上腺皮质分泌的皮质醇都具有相同 的昼夜变化节律。一般在入睡前后的6 8 h 是这3 种激素分泌的低谷 所在，随后逐渐增加，在睡眠后半段进入高峰期，到清晨觉醒后的l 小时左右达到峰值，约持续4 小时，此后分泌量减少，转入一个持续 约n 小时的间歇期。生长激素也有节律性分泌【1 7 j ，生长素的分泌都与 睡眠保持同步，呈现昼夜节律。在觉醒期血中生长索的浓度保持在一 个稳定的低水平，呈脉冲分泌；进入睡眠状态后，特别是入睡后一小 时左右在慢波睡眠时相。生长素分泌迅速增加，出现高峰，不久后又 快速回落。 3 、对免疫与酶活性的调节各种免疫细胞的数量和功能都具节 律性 18 1 ，与机体能量、代谢、活动相适应。人体外周血中中性粒细胞、 单核细胞、自杀伤细胞、t 淋巴细胞的数量白天高于夜间，峰值出现 在中午1 2 点左右。而总白细胞、b 细胞、辅助性淋巴细胞、巨噬细胞、 酸性粒细胞的数量则是在夜间睡眠期高于白天活动期，峰值出现于凌 晨0 点左右。人血清i g g 、i g m 、i g a 等都有昼夜变化。由于这些因素 的存在，免疫应答本身也与近日节律相适应，如结核菌素在健康人体 上引起的迟发型变态反应以早上7 点注射者反应最强，晚上1 0 点注射 者最弱【l 叭。另外肝脏的某些酶类也受近日节律影响。 4 、稳定内环境为了适应环境，机体的不同系统在不同时间的 功能状态不同。近日钟系统调节这些系统的功能状态，使之相互协调， 达到稳定内环境的目的。近日钟系统具有“预期稳态”的作用。在环境 条件某时相( 如光照期) 来临之前，近日节律系统预先调节各个系统 的功能状态，以尽快适应这一时相。 5 、其他作用近日钟系统控制着至少几百个基因的表达【2 0 1 ，它 的作用十分广泛，目前所做研究在许多方面还不能清楚的说明近日钟 系统的作用。下面还有一些生理病理现象与近日节律密切相关。 近日钟系统与多种疾病相关，近日钟系统一旦失调可能引起一系 列严重疾病发生，如：淋巴瘤，自血病，乳腺癌，卵巢癌，抑郁症， 睡眠障碍等。睡眠相位提前症( a s p s ) 患者睡眠时间发生前移，通常在 黄昏时极度嗜睡1 2 ”，这与有些哺乳动物短周期节律突变体的表型相 似。近日节律失调与多种肿瘤有关已得到证实。大规模的流行病学调 查研究发现，经常从事夜班工作的女性患乳腺癌的风险明显增高1 2 3 2 4 。2 5 1 。啮齿动物持续暴露于光照下引起不规律的节律周期，其肿瘤发 生率也明显升高1 2 6 1 。在近日钟基因方面发现p e r 3 基因的多态性与乳 腺癌的发生有关，提示节律基因可能传递机体对肿瘤的遗传易感性 1 2 7 1 ，n 门为机体维持正常节律所必需，当其突变后会引起节律系统紊 乱，表现为周期缩短或失去节律性口踟。心心突变小鼠与野生型小鼠 比较，前者发生肿瘤的风险性明显增高【2 9 l 。n ，2 突变小鼠在y 射线 照射后，与野生型小鼠相比，其对射线的敏感性增加，发生肿瘤的风 险更高。p e r 2 突变后，c y c l i nd 1 、c y c l i na 和m d m 2 等与细胞周期 和凋亡相关的基因表达发生紊乱。 近日钟系统与药物依赖有关，p e r l 不但在近日节律的产生和维持 方面起重要作用，而且可能参与调节机体的其他功能。重复应用甲基 苯丙胺能够引起小鼠的药物依赖，同时导致p e r l 表达的增加【3 0 i 。p e r 突变果蝇对可卡因不形成药物依赖3 2 1 。小鼠n r j 基因突变的小鼠对 可卡因的成瘾作用消失， 丽p e r 2 基因突变的小鼠对可卡因的成瘾性增 强。这些研究说明近日节律基因在药物成瘾方面也起一定作用。 三、近日节律系统的调控 近日节律是内源性的，它的出现与环境条件密切相关。灵长类新 生儿出生后1 3 月才会出现较稳定的近日节律l n3 4 瑚】，且其近日节律 的发育可能受低强度光的调节l 弘。3 7 l 。其实近日钟系统可受多种授时因 子的影响，如光，社会因素，温度等。 所谓授时因子实际上就是各种环境因素，包括光照、温度、饮食、 社会因素、多种化学物质( 激素、维生素、氨基酸、血清) 等，它们 对生物钟近日节律都具有重新调节设置的作用。授时因子对近日钟中 枢的重置，使其与新的环境节律相适应。比如在连续照明条件下，增加 照度将使昼行动物的周期缩短，而使夜行动物的周期延长。昼行性动物 处于连续光照之中时，其昼夜节律的周期比处于连续黑暗之中更短，夜 行性动物则相反，处于连续黑暗之中比处于连续光照之中更短口8 ”l 。 授时因子对生物节律的这种重调使机体具备对环境条件可预见变化 的适应性。 环境的光暗循环是最重要的授时因子。近e l 节律光感受器负责接 受近日时钟的光信号。该感受器位于眼球。双侧眼球摘除以后，光对 近日钟的重置效应消失。但缺乏视干细胞和视锥细胞的盲小鼠显示正 常的光重置效应，近日钟光感受器不同于视锥、视杆细胞，而独立存 在。 目前研究认为位于视网膜内层的部分视网膜神经节细胞是近日 节律光信号的感受器。这类神经节细胞能够表达对光敏感的一种视紫 红质样蛋白m e l a n o p s i n 。m e l a n o p s i n 在视网膜神经节细胞( r g c s ) 的 一个不同于视干细胞和视锥细胞的光受体的亚群中存在【4 0 】。含有 m e l a n o p s i n 的r g c s 的轴突通过视网膜下丘脑神经束( r h t ) 传输光 信号到s c n 。研究证明m e l a n o p s i n 作为光敏感的r g c s 的光受体，在 光依赖方式重置s c n 时钟过程中发挥作用。在m e l a n o p s i n 敞出小鼠， r o o s 的光敏感性消失，提示m e l a n o p s i n 在细胞光反应的作用是不可 替代的。另外一些试验表明，m e l a n o p s i n 敲出小鼠的行为节律仍然能 够与外界光暗循环同步。只有在同时缺乏视锥和视杆系统和 m e l a n o p s i n 的小鼠中光熏置效应才完全消失。说明视锥和视杆系统和 m e l a n o p s i n 在近日节律光受体中起互补的作用。其中m e l a n o p s i n 起主 要作用4 2 1 。 视网膜下丘脑神经束( r h t ) 释放的递质是谷氨酸和p a c a p ，作 用于s c n 神经元的受体。s c n 中p e r l 和n 门以及几个及早基因表 达，调节节律的产生【4 3 1 。需要注意的是，所有的基因表达只能在夜晚 发生。而光依赖产生的p e r l 基因在中枢时钟的重置中占有重要的地 位。利用针对p e r l 的反义核苷酸技术可以抑制这种光导致的时钟的位 相移动。同样，p e r 2 基因的变化可以涉及位相的延迟，但它不涉及位 相提前。而n r j 和n 力缺失的小鼠光依赖的位相提前或延迟均不再 出现。 在这个过程中，s c n 的c a m p 反应元件介导的基因表达是激活 n r j 基因所必须的，p e r l 基因含有c r e t 4 4 1 。在夜晚给予光，能够导 致转录因子c r e b 的s e r l 3 3 磷酸化。c r e b 的s e r l 4 2 在光的刺激下 也在酪氨酸激酶作用下磷酸化。s e r l 4 2 突变可以减少光导致的n r j 基因的转录，但对此门没有作用。通过磷酸化s e r l 4 2 ，c r e 介导的 凡r j 基因对中枢时钟起着关键的作用，特别是在光重置的位相提前。 s e r l 3 3 的磷酸化作用可能与s e r l 4 2 磷酸化相似。另一方面，在缺乏 e g m p 依赖的蛋白激酶i i ( p k g i i ) 的小鼠，p e r 2 光效应受到严重的 抑制。在这些突变小鼠，只有光导致的位相延迟受到中等抑制，提示 心一引起的位相延迟需要p k gi i ，在此方面n r 不起作用。 m a p k 通路在s c n 神经元光信号输入到起搏点核心的过程中起 重要作用【4 5 】。抑制m a p k 能够减轻光导致的位相延迟和提前。m a p k 重置时钟有可能通过p e r l 基因的表达激活，通过c r e b c r e 转录途 径转录。另外，钙钙调蛋白激酶( c a m k ) 抑制剂能够减轻光导致的 m a p k 磷酸化，提示c a m k 信号可能作为m a p k 通路的上游调节因 子。在c a m k 家族中，c a m k i i 可能参与时钟的位相延迟，以及光依 赖的n r 和p e r 2 表达。同时，光可导致穿膜糖蛋白( b i t ) 的磷酸 化。b i t 的磷酸化亦可激活m a p k 通路，重置时钟，提示b i t 可能通 过调节m a p k 对光输入途径起作用。 哺乳动物s c n 在解剖和功能上有明显不同的亚群：v l s c n 和 d m s c n t 47 l 。v l s c n 接受r h t 的输入。光导致的p e r 表达和m a p k 磷 酸化仅局限于v l s c n 。在小鼠、大鼠和仓鼠处于持续黑暗的条件下， p e r 的表达和m a p k 的磷酸化均不表现为近日节律。钙结合蛋白也在 这一区域特异性表达，调节光的时钟的位相。而在d m s c n 存在p e r 表达和m a p k 磷酸化的节律，它们的峰值均在白昼。在光暗循环的条 件下，d m s c n 的m a p k 的磷酸化表现出近日节律，峰值位于夜晚。 与v l s c n 和d m s c n 的功能不同一样，环境中光暗循环位相的改变引 起这两个区域的p e r 表达不同形式的变化。在v l s c n 的基因表达立即 与环境中的光暗循环同步，而在d m s c n 的时钟位相逐渐移动。 在外界环境授时因子的作用下，内在的近日节律通过重置调整 内在近日节律的位相，达到与外界环境的同步。光刺激视网膜，导致 r g t 分泌兴奋性神经递质进入含有v i p 的s c n 腹侧( v i s c n ) 。含有 谷氨酰胺的视网膜神经节细胞亚群，存在垂体腺苷酸环化酶活化肽 ( p a c a p ) ，为光信号传递给s c n 的中转站。在s c n ，激活谷氨酰胺 的作用，除了r h t 的直接通路，光和非光信号可以通过丘脑内侧膝 状体( i g l ) 的n p y 免疫反应细胞到达s c n 。光照对s c n 有两个作用： 立即兴奋s c n 神经元的活性和s c n 电活动的近日节律的位相移动。 光的位相移动能够导引生理和行为与光暗循环变化同步。光在主观黑 夜的刚开始阶段，引起位相的延后，而在主观黑夜的刚结束阶段，引 起位相的提前”。无论夜行还是昼行动物，在一天中的其他时间，光 均不能引起位相的移动。在位相的移动方面起着重要的作用的是p e r 系列基因。 授时因子对不同的振荡子( 中枢或外周) ，以及不同的授时因子 对同一振荡子的作用是有差别的，中枢和外周振荡子对授时因子的反 应也有差别。 1 、中枢生物钟 中枢生物钟在高等动物是指视交叉上核( s c n ) ，视交叉上核在 维持机体行为节律以及外周生物钟节律方面起着重要的作用。研究表 明，中枢生物钟对光暗周期变化敏感，主要调节因子是夜间光，而且 作用时段应是自由节律的夜晚和白昼的早期。其它因素如饮食并不能 影响s c n 生物钟基因表达。光信息由视网膜传递到s c n ，递质为谷氨 酸盐，谷氨酸盐受体激活c a 2 + 通道引起c a 2 + 的内流，最终导致靶基因 的激活h 引。其间，乙酰胆碱可能也参与了信息传递过程。该刺激的靶 基因很可能是p e ，j 和n 心基因，这两个基因在收到光信息后反应强烈， 但它们的反应各不相同。通过基因突变研究表明，在光诱导中枢生物 钟节律重新设置的过程中，p e r l 和p e r 2 基因是必需的。其它基因如c r y 和c r y 2 基因nn - - i 能是非必需的，因为在她们突变的小鼠中，光仍然能 使p e r 基因的表达节律发生改变。光能迅速激活p e r 基因表达，可能 与转录因子c r e b 磷酸化和m a p 激酶的激活有关【4 叭。 在中枢s c n ，心r 系列基因的表达呈近日节律，其峰值位于主观 白昼。在黑夜，光能诱导p e r l 和p e r 2 m r n a 和蛋白的表达，在主观 黑夜的开始阶段，引起位相的延后，而在主观黑夜的结束阶段，引起 位相的提前。但在n ，系列基因表达量已经很高时，如白天，增加该 系列基因的表达对分子振荡的位相没有影响。 2 、外周生物钟 外周生物钟对光- 暗循环的反应较中枢慢。如肝生物钟在光诱导 1 6 日后，也不能完全适应新的节律周期【5 0 】。有研究发现，非光授时 因子却能诱导外周生物钟节律的重设，这可能与进化过程有关，因为 光不能直接到达肾、肝等外周器官组织中。但也有研究表明光照捆窝 可引起褪黑素分泌节律改变。b a l s a l o b r e 等发现，糖皮质类激素能 改变外周生物钟p e r 基因的节律表达，从而对外周生物钟的节律进行 重新设置，但该激素对中枢生物钟节律几乎无影响。而且与仅在夜 间的光刺激能激活p e r 基因的表达，相对糖皮质激素却在任何时间都 能诱导p e r 基因表达。m e n a m a r a 等【5 2 1 的研究表明，视黄酸即能改变 体内心r 基因表达节律。也能改变体外培养( 含血清) 的血管平滑肌 细胞n ，基因表达节律。在这过程中，视黄酸受体r a r s 能与 c l o c k b m a l i 和m o p 4 b m a l l 异源二聚体相互作用，从而引起生 1 7 物钟基因表达节律发生变化。另外发现，人的p e ，j 启动子也能被白 t l 一6 激活，这与c a m p 信号路径有关。还有实验表明，干扰素咄能 破坏小鼠的行为节律、体温节律和生物钟基因表达节律。在体外实验 中，血清能诱导大鼠成纤维细胞生物钟基因节律表达【5 3 l 。另外发现动 物进食周期变化也能影响生物钟近日节律“1 。 由此可见近日钟系统是一个复杂的系统，有着众多功能，对生命 活动意义重大。国内外已有不少应用近日节律的成功例子，如时间治 疗学对高血压的的治疗，对肿瘤的择时治疗，对药物的应用等。对授 时因子的利用有光照等影响植物的生长，影响农作物的产量等，光照 影响鱼类的生长，影响奶牛产奶，影响畜禽生长等。相关研究应该也 必然会在高等动物更多的展开。 四、本研究的目的 时间生物学是- i - j 古老而又年轻的科学，随着相关学科的发展， 时间生物学已经成为生命科学的研究热点。近几年，生物钟基因的陆 续发现，对近日节律产生和维持的分子机制的深入研究，将时间生物 学的研究推入了一个新的阶段。但其广泛作用和机制的许多方面仍未 阐明。 本研究以小鼠为研究对象，通过不同周期光暗循环的作用，研究 小鼠活动性与光暗循环的关系，探究不同光暗循环条件下小鼠生长速 度的变化以及相应血浆皮质酮和生长激素的变化，并对其相互关系和 机理作初步探讨，以期为近日节律系统的广泛作用和生长发育的机制 提供新的线索。 参考文献 【1 b l o c k ，g d ，g e u s z ，m ，k h a l s a ，s ，a n dm i c h e l ，s s e m i n n e u r o s c i 19 9 5 ，7 ，3 7 - 4 2 【2 】j l d i t t y ，s b w i l l i a m s ，s s g o l d e n a n n u ac y a n o b a c t e r j a l c i r c a d i a nt i mi ng m e c h a n i s r e v g e n e t 2 0 0 3 3 7 ：5 1 3 4 3 【3 】徐军，童建生物钟基因研究进展生物化学与生物物理进展 2 0 0 l ，2 8 ：1 8 l - 1 8 3 4 】i b r a h i mh a l i lk a v a k l 夕a n da z i zs a n c a r c i r c a d i a np h o t o r e c e p t i o ni n h u m a n sa n dm i c e m o l e c u l a ri n t e r v e n t i o n s2 0 0 2 ；2 ( 8 ) ：4 8 4 4 9 2 【5 】k a v a k l ii h ，s a n c a ra c i r c a d i a np h o t o r e 圮e p t i o ni nh u m a n sa n dm i c e m o li n t e r v 2 0 0 2 ；2 ( 8 ) ：4 8 4 - 9 2 6 】j u n gh ，c h o ey ，k i mh ，e ta 1 i n v o l v e m e n to fc l o c k ：b m a l i h e t e r o d i m e ri ns e r u m 2 r e s p o n s i v em p e r li n d u c t i o n 【j 】n e u r o r e p o r t ， 2 0 0 3 1 4 ：1 5 1 9 【7 】m o o r er y o r g a n i z a t i o no ft h ep f i m 砒ec i r c a d i a ns y s t e m jb i o l l m y t h m s 1 9 9 3 ；8s u p p l ：s 3 9 【8 】m o r s ed ，s a s s o n e - c o r s ip ，t i m ea f t e rt i m e ：i n p u t st oa n do u t p u t s f r o mt h em a m m a l i a nc i r c a d i a no s c i l l a t o r s t r e n d sn e u r o s c i 2 0 0 2 ； 2 5 ( 1 2 ) ：6 3 2 7 【9 】y a m a z a k is ，n u m a n or ，e ta 1 r e s e t t i n gc e n t r a la n dp e r i p h e r a l c i r c a d i a ni nt r a n s g c n i cr a t s s c i e n c e 2 0 0 0 ，2 8 8 ：6 8 2 8 5 9 【1 0 】k u m ek ，z y l k amj ，s r i r a ms ，c ta 1 m c r y la n dm c r y 2a r e e s s e n t i a lc o m p o n e n t so ft h en e g a t i v el i m bo ft h ec i r c a d i a nc l o c k f e e d b a c kl o o p c e l l ，9 8 ( 2 ) ：19 3 - 2 0 5 【11 】e d e r yi c i r c a d i a nr h y t h m si nan u t s h e l l p h y s i o lg e n o m i c s ，2 0 0 0 ，3 ： 5 9 - 7 4 1 2 】r u t t e rj ，r e i c km ，m c k n i g h tsl m e t a b o l i s ma n dt h ec o n t r o lo f c i r c a d i a nr h y t h m s k r l n ur e vb i o c h e m ，2 0 0 2 ，71 ：3 0 7 - 3 31 【1 3 】d a a ns ，a l b r e c h tu ，v a nd e rh o r s tg tj ，e ta 1 a s s e m b l i n gac l o c k f o ra l ls e a s o n s ：a r ct h e r ema n deo s c i l l a t o r si nt h eg e n e s ? jb i o l r h y t h m s ，2 0 0