（材料学专业论文）niti合金表面制备habmp、hacolbmp复合涂层.pdf

摘要本文在模拟体液中加入骨形态发生蛋白、胶原蛋白，在n i t i 合金表面仿生生长法制备h a b m p 、h a c o l b m p 复合涂层。利用扫描电子显微镜( s e m ) 、x射线衍射仪( x r d ) 、x 射线光电子能谱( x p s ) 、红外光谱( 1 r ) 和透射电子显微镜( t e m ) 等分析手段对涂层表面形貌、物相组成、成分、内部结构等进行表征，对涂层的生长过程进行了初步探讨。结果表明：高钙磷离子浓度模拟体液( m s b f ) 中，b m p 浓度为1 0 m g l 1 0 0 m g l 时对涂层生长具有促进作用。m s b f 、含胶原的m s b f ( c m s b f )中生长3 天，涂层为均匀的网状结构。晶体呈片状，长约1 0 0 3 0 0 n m ，垂直于基体表面生长。蛋白质的羧基与c a 2 + 存在化学作用。骨形态发生蛋白在涂层中呈球形颗粒状均匀分布，胶原纤维呈纤维状分布。n i t i 合金表面有机一无机复合涂层的生长过程分晶体成核和晶体生长两个阶段。适当的蛋白质浓度使基体形核能力增强，基体表面形核数量增多，有利于网状结构的形成。在晶体生长过程中，蛋白质的官能团主要和c a 2 + 结合，从而进一步影响对p 0 4 孓的吸附。最终在试样表面形成羟基磷灰石一骨形态发生蛋白、羟基磷灰石一胶原蛋白一骨形态发生蛋白复合层。关键词：n it i 合金；h a b m p 复合层；h a c o l b m p 复合层；仿生生长；生物矿化a b s t r a ctt h i sw o r ki sm a i n l v 撇i b u t e dt 0f o mh a b m p h a c o l b m pc o m p o s i t ec o a t i n 2 so nt h es u r f a c eo fn 汀ia l l o ya f t e ra d d i n gb o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n ( b m p ) ，c o l l a g e n ( c o l ) i n t os i m u l a t eb o d yf l u i d s ( s b f ) a n dm o d i 6 e ds i m u l a t eb o d yf l u i d s ( m s b f ) t h ec o m p o n e n t sa n dm i c r o g r a p ho fc a l c i u mp h o s p h a t ec o a t l n g sw e i i ei n v e s t i g a t e db ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) ，x - r a yd i f f - r a c t i o n ( x r d ) ，p h o t o e l e c t r o ns p e c t r o s c o p y ( x p s ) ，1 h n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) ，a n di n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( i r ) m o d i n e dp r o c e s sc o n d i t i o n sa n dt h eg r o 、v t hm e c h a n i s mo fh a b mp ，h c o l b m pc o m p o s i t ec o a t i n g so nt h es u r f a c eo fn 汀ia l l o yw a sd i s c u s s e d t h er e s u l t si n d i c a t e d ：w h e nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g e df r o m10 m g lt o10 0 m g l ，l tw i l lp r o m o t et h ec o a t i n gf o m a t i o n a f t e rd e p o s i t e di nm s b f ，c m s b fw i t h5 0 10 0 m g ，lb m pf o r3 d a y s ，i tf o m e du n i f o r m i t ) ，m e s h yc o m p o s i t ec o a t m g so nt h ea l l o ys u r f a c e c r y s t a lw a sn a k ep e r p e n d i c u l a rt ot h es u b s t r a t es u r f a c e s i z e db e t w e e nl0 0 3 0 0 n m p r o t e i ni nt h ec o a t i n g si n t e r a c t e dw i t hc a 2 + t h em o r p h o l o g i e so fb m pi nt h ec o a t i n gi sg r a n u l a ta n dt h ec o l l a g e ni sf i b r i f o n n t h eg r o 、仉hp r o c e s so fc o m p o s i t ec o a t i n go nt h es u r f a c eo fn it ia l l o yc o u l db ed i v i d e di n t ot w os t a g e s ，i e c r y s t a ln u c l e a t i o na n dc r y s t a lg r o 、t h w i t hp r o t e i ni ns b fc r i t i c a ln u c l e u ss i z ew a sr e d u c e d ，g r o w i n gt i m ew a sd e l a y e da n dq u a n t i 够o fn u c l e u sw a si n c r e a s e d ，w h i c hw a sp r o p i t i o u st of o r mm e s hs t r u c t u r e f u n c t i o n a ig r o u po fp r o t e i ni n t e r a c t e dw i t hc a 2 +p r i m a r i l yt h e na b s o r b e dp 0 4 j 一f i n a l l yc o m p o s i t ec o a t i n g sw e r ef o r m e do nt h es u i r f 孔eo f n i t ia l l o y k e yw o r d s ：n 汀ia l l o y ；h a b m p ；h a c o l b m p ；b i o m i m e t i cg r o 、t h ；b i o m i m e “cm i n e r a l i z a t i o n独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得基鲞盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：欧骋移签字日期：沙8 年6 月d 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解基鲞盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。特授权墨洼盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名：政修枷签字日期：必l 喃年月d 日导师签名：惕经岔签字日期：枷扩年彩月p 日第一章绪论1 1 引言第一章绪论生物医用材料是指用于医疗的能植入生物体或能与生物组织相结合的材料。用作生物医用材料的金属或合金称为医用金属材料。医用金属材料具有高机械强度和抗疲劳性能，是临床应用最广泛的承力植入材料。主要用于骨和牙等硬组织修复和替换、心血管和软组织修复以及人工器官制造中的结构元件。医用金属材料除应具有良好的力学性能及相关的物理性质外，还要求其有优良的抗生理腐蚀性和生物相容性。钛合金具有高强度、低密度、无毒性以及良好的生物相容性和耐蚀性等性质，已被广泛用于医学领域。近年来，美国、欧洲等多国极为重视钛合金的研发工作，不断开发出新型医用钛合金材料，扩大了钛及其合金在医学领域的应用，满足了各类肢体伤残、牙病患者康复的愿望。由近等原子比的n i 、t i 组成的n 汀i 合金具有良好的稳定性、生物相容性，并具有独特的形状记忆效应和超弹性，对n it i合金进行表面改性，进一步改善其表面生物活性已成为生物材料领域的研究热点之一。1 2 生物医用n i t i 合金自从19 6 3 年美国海军军械研究室发现n i t i 合金的形状记忆效应至今，n 汀i合金因其优良的机械性能、形状记忆效应、超弹性、优良的抗腐蚀性、耐磨性和生物相容性等性质广泛应用于医学领域。其中大部分是作为异物器械植入人体。表1 一ln i t i 合金和人体硬组织机械性能对比【2 】f i g 1 1m e c h a l l i c a lp r o p e r t i e so fn i t ia u o y sa n dh a r dh s s u e 【2 】第一章绪论n t i 合金是n i 与t i 等原子比的金属间化合物。密度为6 4 5 9 c m 一，与骨组织接近，适合于硬组织修复。熔点为1 2 7 0 13 5 0 ，无磁性，可进行核磁共振成像造影，同时植入人体后不会受外来磁场的影响。1 3 骨的成分骨是构成身体支架的器官，骨组织是坚硬而有一定韧性的结缔组织。在人体中，骨组织不断更新和改建，以适应成年前机体的生长发育和成年后机体支持功能的变化需求。人体9 9 以上的钙及8 5 的磷以磷灰石的形式贮于骨组织中，因而骨又是人体的钙、磷贮存库。长骨由骨松质、骨密质、骨膜、关节软骨吸血管、神经等构成。骨基质中的主要有机成分是胶原( 2 0 w 阮) ，无机成分是磷酸钙盐类即骨盐( 6 5 w 慌) ，主要以结晶羟基磷灰石的形式存在，此外还有一定的水分( 9 叭) 【3 】。骨组织中的胶原主要为1 型胶原，此外还有少量的型、v 型和x 型胶原。胶原纤维由许多胶原单位结成柬而形成纤维。在骨基质形成的某些阶段，型、v 型和x 型这几种少量胶原可调节胶原纤维束直径的大小。骨中矿物质分子的主要成份是羟基磷灰石。羟基磷灰石以针状或板状结晶的形式沉积在胶原纤维束中间隙内，使骨基质的硬度及力学强度得以大大增强。骨基质中的羟基磷灰石纯度比自然界的羟基磷灰石低。由于碳酸盐、柠檬酸盐、镁盐、氟化物和锶盐等杂质被吸附于羟基磷灰石的结晶表面或晶格内，使羟基磷灰石结晶的纯度大大降低，而其溶解度却大大增高。因此骨基质中的矿物质可在必要时被溶解而进入体循环，以满足机体矿物质代谢的需要，而起到矿物质储存库的作用。在钙化过程中，许多亲钙物质在机体浓度增高到一定程度时也会被吸附在羟基磷灰石的结晶表面或晶格内 4 】。自然骨内部微孔分布均匀，相互贯通，以让血管及骨细胞长入，通过非常复杂的方式巧妙的将有机的骨基质结构与无机的骨盐框架结构互相紧密地结合起来，在人体中实现生物力学上要求【5 】。骨中羟基磷灰石针晶的定向分布大大增加了骨的力学性能。在设计骨替代材料的过程中，骨组织的这些特点给材料工作者提供了非常重要的启发和思路。第一章绪论1 3 1 胶原蛋白( c o l l a g e n )胶原蛋白是蛋白质中的一种，它主要存在于动物的皮、骨软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织及其重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。胶原是哺乳动物中含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的2 5 3 0 ，相当于体重的6 。不同组织中的胶原，其化学组成和结构都有差异。一般可以按胶原所在的组织称之为皮胶原、骨胶原、齿胶原等 6 】。胶原是一个蛋白质家族，从皮肤和骨骼中分离出了i 型胶原。i 型胶原蛋白的组合方式有两种：由2 条仅1 链和l 条仅2 多肽链组成的异相聚合物l 型胶原蛋白分子，由3 条完全相同的仅1 链组成均相1 型三聚体胶原蛋白。两种组合的方式都是构成直径为6 7 n m 的原纤维的主要成分，两种组合方式的胶原分布不同，前者主要分布于骨、角膜、皮肤和肌腱中，后者则主要位于肿瘤和皮肤中。胶原和其他蛋白质一样，具有四级结构f 7 】。一级结构又称为化学结构。指的是蛋白质中有多少氨基酸，每种氨基酸有多少个，这些氨基酸是怎样连接成多肽链。胶原蛋白分子中的具有a 链组成的三螺旋构象被称作“胶原域 。胶原蛋白分子中至少应有一个胶原域。在胶原蛋白的胶原域中具有“甘氨酰脯氨酰羟脯氨酸”或“甘氨酰脯氨酰x ”和“甘氨酰一x y ”( x 、y 代表除甘氨酰和脯氨酰以外的其它任何氨基酸残基) 这样一些三肽重复存在。胶原蛋白的二级结构是由3 条肽链组成的三螺旋结构。胶原蛋白的基本结构单位是原胶原蛋白分子，基本结构单位直径( 1 5 1 0 。u ) m ，长( 2 8 0 0 x 1 0 1 0 1 0 )m ，相对分子量约3 0 0 0 0 0 。基本结构单位首尾相连，并排成束，形成胶原纤维，胶原蛋白的二级结构直接关系到它的功能。三级结构描述了整个肽链，包括主、侧链在内的空间排布。胶原的三级结构是由3 条螺旋链拧成的一股绳状的右手螺旋。三级结构主要揭示蛋白质分子中肽键之间的次级键的作用，也就是氨基酸残基侧链的极性基团产生的离子键、氢键和范德华力和非极性基团产生的疏水键、范德华力等作用，使得三级结构得以保持稳定。除了这些次级键外，胶原分子内和分子间还有3 种交联形式：醇醛缩和交联、醛胺缩和交联、醛醇组氨酸交联。这三种交联把胶原的3 条肽链牢固的连接起来，使胶原具有很高的抗张强度。i 型胶原蛋白是骨力学性能的主要决定因素。骨中的胶原纤维同时也是矿化位点，赋予骨特殊的物理性能。四级结构指的是各个亚基的空间排布，亚基间的相互作用与接触部位的布局。第一章绪论1 3 2 羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e )羟基磷灰石( h a ) 是人体硬组织的主要无机成分，是最具有活性的生物材料，并具有良好的生物相容性，因此得到了人们的普遍重视和广泛深入地研究。羟基磷灰石的化学式为c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 ，晶体属于p 6 3 m 空间群，六角晶系，密排六方结构，氧原子彼此相切，第二层球排列的位置是每三个球中再放入1 个球。第三层排列的位置与第l 层球相同。h a 晶格常数为a = 9 4 2 3 a ，c = 6 8 7 5a 。体外合成的骨磷灰石晶体也具有和骨组织中h a 同样的形态，这说明了h a 的形成具有内在的性质，而不是因为生物因素造成的 8 】。羟基磷灰石的应用是在1 9 7 1 年作为骨和人工牙齿而被提出来的。德国的b h a s k a r s 对羟基磷灰石陶瓷进行开发性研究，将其制成多孔体，对动物骨骼进行置换，试验证明，这些材料作为生物材料具有极大的优越性，在体内有无害的化学反应发生。近年来，通过在医用金属材料基体表面制备羟基磷灰石涂层成为各国学者的研究热点。1 4 骨形成机制骨组织的形成是一个由多种因素调节的复杂而有序地过程。从分子水平上看，骨组织的形成过程就是生物大分子在细胞与细胞之间，细胞与细胞外间质之间的信息转导过程。异位骨的形成过程与胚胎时期的骨化过程和骨折骨痂的形成相类似，均受到机体某种激素和某些局部生长因子的调控。一般认为影响骨组织形成的激素主要有甲状旁腺素、生长素、甲状腺素、降钙素、雌激素等。影响骨组织形成的局部生长因子主要有骨形态发生蛋白( b m p ) 、转移因子( t g f ) 、血小板衍生生长因子( p d g f ) 、胰岛素样生长因子等。在骨组织形成过程中，激素与生长因子之间既相互独立，又相互联系。两种调节与神经系统共同形成了神经一内分泌一免疫一局部生长因子调节网络，参与骨组织形成的整个调节过程。一般认为，局部生长因子在骨组织形成的调节过程中起着主导作用，其中骨形态发生蛋白( b m p ) 是唯一能够单独诱导间充质细胞向骨组织方向分化的生长因子，是骨组织形成过程中最关键的调节因子 9 】。第一章绪论1 5 骨形态发生蛋白及其缓释体研究进展1 5 1 骨形态发生蛋白( b m p )早在2 0 世纪6 0 年代u r i s t 1 0 】用实验的方法最先发现了骨形态发生蛋白的存在。他将动物脱钙的骨基质种植于动物的肌肉组织内，种植后3 周作组织切片发现，在种植部位有大量的软骨组织和骨组织形成。这个实验结果显示在骨基质中可能存在一种活性蛋白质，这种活性蛋白质具有使未分化的间充质细胞定向分化为骨细胞，从而形成骨组织的能力，并被命名为骨形态发生蛋白( b m p ) 。骨形态发生蛋白( b m p ) 是广泛存在于骨基质中的一种低分子糖蛋白多肽，可以作用于间充质细胞表面受体，诱导血管周围的未分化间充质细胞和骨髓基质细胞转化为软骨和骨细胞，具有诱导骨形成的生物特性。1 9 8 8 年，人们首次分离出天然b m p 2 ，这是一种碱性降解糖蛋白，分子量约为3 0 k d s ，降解分子量为：人骨l7 6 8 4 k d ，牛骨18 k d ，猪骨19 7 k d ，兔骨2 4 k d 。等电点5 o 士0 2 ，含1 0 种氨基酸。是生长因子t g f d 超家属中的一亚家族f l1 】。到现在为止，已发现的骨形态发生蛋白有3 0 多种，不同的骨形成蛋白其表达方式和生理功能不同。目前，人们利用基因重组技术已经表达出人类基因重组b m p 2 ( r h b m p 2 ) ，并且在常位和异位成功诱导出新骨。但是，与天然b m p 2相比，r h b m p 2 的骨诱导活性相对较低f12 。b m p 的理化性质主要有：能与羟基磷灰石结合，不含碳水化合物，疏水性强，碱性环境不稳定，冻干品呈白色海绵状【1 3 。在对b m p 的生物活性分析中发现，b m p 的诱导成骨作用大致分为四个时期：趋化期、分化期、骨质形成期和重塑期。首先是间充质细胞发生化学趋向、聚集、分化形成软骨和骨，最后形成骨髓，故认为b m p 的靶细胞是一类未分化的、在一定刺激下有成骨潜能的间充质细胞。已有实验表明，不论是胚胎期还是成年期，骨组织细胞均来源于一种未分化的间充质细胞，并且成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和成纤维细胞均是由未分化的间充质细胞衍生而来的，间充质细胞在分化过程中受多种调节因子的控制，定向分化为具有各种表征的细胞。如果不受b m p 等因子的作用，它在整个生命中都不会分化形成软骨和骨。成骨细胞的分化过程中至少可分化为两个阶段：第一阶段是由未分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞的前提细胞；第二阶段是由前体细胞转化为成熟的成骨细胞。b m p的主要生物学作用就是诱导间充质细胞分化为成骨细胞，进而产生新生骨。b m p诱导成骨的方式主要是软骨内化骨，但也可以膜内化骨方式成骨。实验表明，低浓度的b m p 能够诱导间充质细胞向骨组织形成区移行，中等浓度b m p 可以促进间充质细胞向成软骨及成骨细胞方向分化，而高浓度的b m p第一章绪论则能促进间充质细胞的增生。研究认为，b m p 2 主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到募集和分化作用。在骨形成早期，b m p 2 不仅可使未分化间充质细胞向骨形成中心募集，并分化为骨系细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓的基细胞逆转分化为骨系细胞。对于成骨细胞，b m p 2 则可使之维持其特有细胞表型，并诱导成骨细胞标志物的增高，促进细胞外基质钙化。在骨形成后期，b m p 2 还作为一种破骨细胞分化因子与其它支持破骨细胞分化因子直接或间接刺激破骨细胞分化，参与骨的重建。1 5 2b 缓释载体研究进展u r i s t 首次发现骨形态发生蛋白之后，很多学者多次从人、动物骨中提取或通过基因重组法获得b m p ，并证明其具有一定的诱导成骨活性。但b m p 在实际应用中的诱导成骨作用并不理想，在临床的应用中也未得到相应的认可和推广。究其原因主要有三：一是b m p 的纯度或活性不足；二是在应用b m p 的过程中，使用技巧，剂量掌握等方面的差异对b m p 的诱导成骨作用的发挥也有重要的影响；三是b m p 的活性发挥需要有合适的载体，使b m p 在局部组织内能较长时间保持在一个合适的浓度范围。直接将b m p 植入机体组织内，与组织液接触，一方面机体内处于不断的新陈代谢下的组织液很快就将b m p 稀释或运走。另一方面组织液中的各种蛋白质酶很快的将b m p 分解。如果有一个很好的b m p 载体，能较长时间的缓慢的释放b m p ，使局部在一定时间内保持较高浓度的b m p ，就能避免和减轻b m p 浓度下降或活性降低，促进b m p 发挥诱导成骨作用。因此，很多学者致力于寻找b m p 的优良载体。目前大家认可的理想的b m p 载体必须具有以下特点【1 4 ：能够控制其缓慢释放，减缓代谢；生物相容性较好；无细胞毒性；无抗原性或抗原性较低；生物降解与新骨形成同时进行，对新骨形成无影响；负重部位骨缺损要求移植物有一定机械强度；制作简单，价格低，对b m p 活性影响不大；易消毒和贮藏；可吸收性强。1 5 2 1 金属载体研究较多的b m p 金属载体是钛合金。p u l e o 等 15 】研究了t i 合金表面固定b m p 4 的工艺，预处理过程中采用等离子激发烯丙基胺( a l l y la m i n e ) 聚合物，使钛合金表面氨基化，2 ，4 ，6 三硝基甲苯( t n b s ) 与基体表面反应测定钛合金表面氨基密度。接着采用溶解效素( l y s o z y m e ) 研究b m p 4 的固定以及释放的模拟分子，固定b m p 4 采用了两种方法：一步固定法和两部固定法。前者由于交联作用破坏了溶解效素的固定效果，故采用两部固定法在钛合金表面复合b m p 。第一章绪论生化磷酸酶检测结果表明表面高氨基化的基体更有利于b m p 的复合。近年来多孔钛得到广泛研究，在多孔钛表面复合b m p 也得到了关注。解放军总医院的李众利等【1 6 】研究了三维连通( 3 d ) 多孔钛结构复合骨形态发生蛋白植入肌肉中组织的变化情况。植入l o d ，2 0 d ，3 0 d 后取出观察组织结构变化。1 0 d组，未复合b m p 多孔钛孔隙内无组织长入，复合b m p 组多孔钛组织长入孔隙内，2 0 d 后复合b m p 组多孔钛纤维长满孔隙，其中有血管形成，3 0 d 后孔隙中可见胶原纤维，孔内周边出现钙化沉积带，可见复合b m p 的多孔钛促进了骨生长。1 5 2 2 磷酸钙载体磷酸钙陶瓷是一种具有不同钙磷比的陶瓷材料，骨对其产生良好的响应，是一种得到大力发展的骨替换材料，近年来作为骨形态发生蛋白的载体材料也得到了大量的研究。其中钙磷比为1 6 7 的羟基磷灰石( h a ) 以及钙磷比为1 5 的磷酸三钙( t c p ) 研究最为广泛。何智勇等【l7 】最早研究了将r h b m p 2 复合h a 涂层植入动物骨组织中，检测其骨诱导性。基体材料为t i 6 a 1 4 v ，将有、无h a 涂层，以及复合了r h b m p 一2的h a 涂层3 种植入体分别植入犬骨中。h a 涂层采用等离子喷涂法制得，涂层具有从致密至多孔的结构梯度变化，致密底层的空隙率1 ，表面层的孔隙率为2 0 左右，该涂层的成分亦具有梯度分布，纳米羟基磷灰石从基底至涂层表面的梯度分布范围为2 0 1 0 0 。r h b m p 2 的复合方法为直接涂抹吸附法。将r h b m p 2 溶于醋酸溶液中，一定量的混合液涂于植入体表面，使其充分吸收复合。r h b m p 2 复合植入体由于r h b m p 2 的骨诱导性明显加速了新生骨矿化、改造塑形速度，在早期的效果尤其显著。m d i m r a n u la l a m 等ll8 】的研究了双相磷酸钙陶瓷作为r h b m p 2 载体，生物陶瓷中的磷酸钙主要为h a 和p t c p ，依据成分不同分为5 组，依次为：10 0 h a ，7 5 h a 和2 5 t c p ，5 0 h a 和5 0 t c p ，2 5 h a 和7 踹t c p ，1 0 0 t c p 。9 0 0 烧结得到复合陶瓷粉末的粒径约为2 0 0 5 0 0 岬，7 0 8 0 m g h a 厂r c p加入l ，5 ，l o gr h b m p 2 。不含r h b m p 2 的试样作为对照组。动物植入2 周后对试样进行a l p 测定，所有实验组均有新骨生成，对照组只有纤维缔结组织。植入4 周后组织观察发现，1 0 0 h a p 实验组新骨生成最多，2 5 h a p 7 5 t c p实验组生成量最少。结果显示新骨生成主要与h a p 含量和r h b m p 2 的含量有关。复合了b m p 的h a p 的异位成骨优于单纯应用h a p 组，随着b m p 含量的增加，成骨量和细胞分化成熟的程度也很大提高。h e m i nn i e 等在文献l9 ，2 0 】中制备了p l g a 胴a 复合支架作为b m p 2 的载体，主要研究了不同h a 的含量、不同的b m p 负载方式对b m p 一2 作用的影响。第一章绪论h a 纳米颗粒作为一种添加剂分散在p l g a 支架中，随着h a 含量的提高b m p的体外释放持续时间延长。实验对比研究了微囊法和表面涂附法负载b m p ，体外细胞培养结果显示微囊法将b m p 注入复合支架中更有利于b m p 的持续释放。p q u i n t e n 【2 l 】针对多孔磷酸钙水泥负载r h b m p 2 的骨诱导性作了动物实验，对照组为可降解的胶原海绵负载r h b m p 2 ，将其植入兔头盖骨缺陷中2 ，1 0 周，取出试样后组织分析结果显示磷酸钙组具有很好的骨诱导性，与胶原海绵负载组相比，前者具有更好的稳定性，但降解性较差。尹绍雅 2 2 等制备了两种含量b m p ( 1 、2 ) 的b m p 危t c p 复合材料，测定两种样品经过相同处理后蛋白质的含量、样品固化2 4 小时及b m p 释放4周后复合材料强度。结果表明，b m p 以扩散的方式释放，3 天内有一爆发性释放，1 0 天之内一直保持较高的释放速度。持续4 周后仍有缓慢的释放。b m p 不影响复合材料的强度及其向h a 的转化。l i a n g 等【2 3 】研究证实多孔肛t c p 复合r h b m p 2 具有诱导尾骨形成和血管形成的作用。磷酸三钙植入机体后与骨直接融合，与临近骨组织间无明显纤维组织界面。磷酸三钙在体内有残存，不利于骨恢复。y o s h i t a k e 等 2 4 1 用化学交联法制得了明胶p t c p 的复合胶体，研究其负载b m p 2 后的骨诱导能力。实验表明，胶体内连通孔平均孔径约为2 0 0 岬，与p t c p含量无关。加入p t c p 后的多孔性改善了明胶对细胞的细胞的吸附和增殖能力。此外，该复合胶体具有良好的可塑性，便于缺损修复中形状的切割和匹配。b m p 2的体内释放曲线也与p t c p 含量无关，鼠皮下植入结果显示，体内b m p 2 的保持时间大于2 8 天。张伟【2 5 等研究了c p c 型钙磷盐对b m p 的缓释作用，实验采用单纯c p c为对照组，将试样浸入磷酸盐缓冲溶液中，分别在1 ，2 ，3 ，4 ，7 ，1 4 ，3 0 ，9 0 ，1 8 0 ，3 6 0 天的时候取出用高效液相色谱分析不同时间r h b m p 的缓释量。该文认为在释放前7 天，所载的b m p 的释放主要是表面和表层的b m p ，这是一个简单的溶解过程，b m p 释放速度较快。c p c 内部b m p 的释放是通过c p c 内部相互连通的微孔结构，在体内各种因素的作用下，c p c 内部发生重结晶，微孔结构内的管腔相互连通，不断释放b m p ，呈现典型的多孔缓释载体释放行为。c p c主要存在的问题为：孔径较小，孔隙率较低，不利于材料的降解和新骨长入，其与骨诱导因子b m p 复合后b m p 的释放速度缓慢，不利于充分发挥b m p 诱导活性。第四军医大学的费正奇 2 6 】首次采用复乳一溶剂挥发法制备了b m p 聚乳酸聚乙醇酸共聚物( p l g a ) 载体微球与c p c 复合，在材料植入早期p l g a 微球不仅可作为b m p 的载体微粒提高b m p 的释放，同时可维持材料一定的强度，随第一章绪论着微球的降解可在c p c 内形成规则的空隙，快材料的降解和b m p 的释放。1 5 2 3 天然聚合物载体天然聚合物主要包括胶原、透明质酸、基质、凝胶和纤维胶原质。从而提高c p c 的孔径及孔隙度，加纤维蛋白等。胶原包括去矿物质骨文献【2 7 报道采用松质骨基质作为载体，复合材料植入小鼠股部，t g f b r h b m p 2 组的新生骨在成熟时间上提前，其成熟程度提高，在适宜的剂量条件下，t g f d 和r h b m p 2 在骨诱导、骨形成过程中存在协同效应。在该实验中，牛松质骨作为载体保护r h b m p 2 不发生非特异性蛋白水解，并对其释放起到缓释作用，同时也为靶细胞的粘附，增殖提供了一个良好的三维空间。松质骨基质来源于动物骨组织萃取，含有许多内生因子的非胶原蛋白，故有潜在致病风险，还有在骨缺损处的残留问题【2 8 】。h i d e t s i g u f 2 9 1 等对i 型去端肽胶原( a t e l o c o l l a g e n ) 作为r h b m p 2 的载体作了细胞实验和碱性磷酸酶( a l p ) 测定。试样的制各过程为，将去端肽胶原溶解于p h值为3 o 的稀盐酸中，加入缩合试剂w s c 得到溶液浓度为1 m g m l ，在4 放置2 h 后，往其中加入r h b m p 2 ，在4 放置2 4 h 使其充分反应。反应结束后试样在稀盐酸中透析2 4 小时以去掉w s c 。研究结果表明，r h b m p 2 的浓度高，更有利于细胞增殖。在文献f 2 l 】中对比研究了可降解胶原负载r h b m p 一2 和多孔磷酸钙负载r h b m p 2 的动物植入实验，结果表明，胶原负载组比磷酸钙负载组降解性好，但稳定性较差。随着研究的深入，很多学者将聚合物与无机物复合作为b m p 的载体，研究复合载体对b m p 的缓释作用及其骨诱导性。c h u n m e il i 等【3 0 】用静电纺丝法制备了含b m p 2 的蚕丝蛋白纤维，研究其复合n h a p 后的体外成骨性。实验分为三组，丝蛋白聚氧化乙烯b m p 2 ，丝蛋白聚氧化乙烯n h a p ，丝蛋白聚氧化乙烯n h a p 倍m p 2 ，其中聚氧化乙烯作为第二相加入促进成键、交联作用。加入b m p 2 后钙磷盐的结晶性更高。刘玲蓉【3 1 等采用相分离法构建了胶原基复合骨组织工程支架，羟基磷灰石粉末加入胶原溶液中，混合均匀后于3 0 迅速冷却，真空冷冻干燥成型。一系列交联反应后采用物理吸附法将r h b m p 2 加入支架中。体内异位诱导成骨研究结果显示，该支架材料作为b m p 的载体，能使b m p 在组织局部聚集成较高浓度，诱导成骨。第一章绪论1 6 钛合金的表面改性方法近等原子比的n i t i 合金以其独特的形状记忆效应、超弹性、低弹性模量、高耐磨性等优势在口腔科、骨科、心血管可等临床领域得到了广泛应用。n i t i 合金的生物相容性和腐蚀行为与其表面状态密切相关。一般情况下，n i t i 合金因钝化表面有一层氧化膜，这层氧化膜有助于使n t i 合金在生理环境下保持相对惰性。但合金表面因钝化而自然形成的氧化膜并非理想，这层氧化膜容易发生变形和脱落。当氧化膜遭到破坏时，就会促使n i t i 合金发生局部腐蚀，此时n i t i 合金的抗蚀性急剧下降，合金中的n i 2 + 溶出会引起细胞变形和染色体损坏等现象，n i 2 +也能取代酶和蛋白质中的二价金属，从而改变其分子结构【3 2 】。n i t i 合金在应用中暴露出两点问题：材料的安全性，n i 元素溶出引起炎症反应和毒性作用，材料植入人体的宿主反应，即不能实现骨整合而形成致密的纤维结缔组织【3 3 】。因此，有必要对其进行表面处理，以抑制镍元素的析出，提高其生理耐蚀性，改善其表面活性。h a 人工骨材料应用于临床始于7 0 年代，早期仅局限于口腔颌面和牙槽增高，由于其良好的生物相容性及骨引导作用，逐渐被临床各科使用。但是，与自然骨相比，人工制备的h a 韧性远低于承载部位的自然骨。种植体在体内不能自行调节，就要求种植体在体内代替骨骼时必须比骨骼有更高的强度和弹性模量以及抗疲劳性能。f e l s e n f e l d 【3 4 】研究发现，多孔陶瓷板植入骨创面2 年，其孔内仅有1 7 的新骨组织，而4 4 仍为软骨组织。颗粒状羟基磷灰石由于颗粒松散，不能凝结塑形，植入骨创面后，材料容易流失，因此单一的陶瓷也很难满足承载部位骨替换要求。因此在钛合金基体上涂敷羟基磷灰石涂层，可综合医用金属材料良好的机械性能与羟基磷灰石良好的生物相容性，已成为医用金属材料研究最为活跃的领域。目前在医用钛合金基体材料上涂敷羟基磷灰石的方法大致有：等离子喷涂、溶胶凝胶法、激光涂敷法、电化学法沉积法、水热合成法、磁控溅射法、仿生生长法等。下面分别介绍其进展。1 6 1 等离子喷涂法等离子喷涂技术是应用较多的一种羟基磷灰石涂层方法，该法采用热喷涂法，把2 0 5 0 斗m 大小的陶瓷粉料注入高温高速的等离子体喷射器中，粉料熔化经加速后装机金属材料基底，快速冷却后再基地表面形成陶瓷涂层，涂层厚度5 0 4 0 0 m 不等，可以对种植体进行局部或整体涂层，并能控制涂层的气孔率，表面形貌、粗糙度、化学成分、结晶度等特性 3 5 】。第一章绪论等离子喷涂获得涂层时间短，但是它本身也存在一些缺点：涂层厚度不均匀；喷涂后的冷却过程中h a 涂层易开裂；在涂层中易存在非晶h a 组织，涂层的表面结构不够致密：成本较为昂贵【3 6 】。1 6 2 溶胶凝胶法溶胶凝胶法是将涂层材料制成溶液，使之均匀敷盖在基体表面，由于溶剂迅速挥发，涂层材料发生缩聚反应而胶化，再经干燥和热处理，即可获得涂层。曲海波等【3 7 】采用溶胶凝胶法在钛合金基体上制备含氟羟基磷灰石涂层，晶粒尺寸约为1 2 0 1 5 0 n m ，实验结果表明，涂层在模拟体液中有良好的生物相容性。m m e t i k o sh u k o v i c 等【3 8 】采用溶胶凝胶法在纯钛和钛合金表面制备了钙磷层，实验结果显示薄膜主要由内层的t i 0 2 层和外层的多孔h a p b t c p 层组成。钙磷层结晶性好，实验结果表明具有良好的抗蚀性。该法的合成温度较低，能避免涂层材料的高温分解，涂层的化学均匀性好，化学纯度高，但是也存在诸多缺点 3 9 1 ：凝胶在烧结过程中存在较大的收缩，在后期的烧结过程中也存在因为涂层与基体材料的热膨胀系数相差较大导致涂层开裂；涂层与基体界面的结合强度不高；生产周期相对较长，只适用于实验室小批量生产。1 6 3 激光涂敷法激光涂敷法是在激光束的作用下，将预先涂敷c a 3 c 0 3 与c a h p 0 4 的混合粉末在金属基体表面迅速加热并熔化而得到h a 生物活性涂层。激光涂敷法冷却速度快，与基体呈良好的物理冶金结合，工艺易于实现自动化。g a 眄j 等【4 0 】研究了在纯钛表面激光涂敷法制备羟基磷灰石生物陶瓷涂层，在钛基体上预先涂敷h a 粉末和纯t i 粉，丙酮清洗试样，干燥后丙酮挥发，在其体表面制得了儿气涂层。实验结果表明，快速的加热和冷却后，主要得到三层结构：多孔h a p 涂层，h a p t i 键和层和钛基体。1 6 4 电化学沉积法p i n gp e n g 等 4 1 研究了在钛基体上电沉积法制备钙磷涂层，电解液为改进的模拟体液，钙磷层为分散的多孔结构，孔径大小约为1 p m ，钙磷比为1 6 5 ，与h a p 的钙磷比1 6 7 很接近。王月勤等【4 2 】采用阴极电沉积法在钛基体上制备羟基磷灰石，试样金相打磨后进行化学抛光，随后对其进行阳极氧化，在钛基体上得到了二氧化钛纳米管，第一章绪论随后在电沉积过程中在电解液中加入双氧水，在纳米管上沉积羟基磷灰石涂层。1 6 5 仿生溶液生长法仿生溶液生长法模拟自然界生理磷灰石的矿化机制，其基本原理为：先对金属基体进行预处理，在其表面形成金属氧化物层，配制与人体体液组成几乎相同的模拟体液s b f ，将金属基体材料置入该模拟体液中，在仿生物环境条件下，金属材料表面金属氧化物层与s b f 中离子作用形成羟基磷灰石涂层。k o k u b o 等 4 3 4 7 】白4 0 年代初期开始探索用碱( n a 0 h 或k o h ) 溶液活化钛及其合金表面。指出经5 10 mn a o h ，6 0 ，2 4 小时处理的钛及合金表面可形成网状多孔的钛酸钠凝胶层，在s b f 中，凝胶层转变为水合二氧化钛，使金属表面原位形成许多t i 0 h 基团，诱导体液中的钙、磷沉积，形成磷灰石层。显然，钛酸钠凝胶是基体表面生物活性的源泉。为使其更稳定地发挥作用，通常对凝胶进行6 0 0 、l h 的热处理。高温下，n a + 离子不断向基体晶格中扩散，使钛酸钠凝胶层加厚，在金属钛表面形成带有n a + 阳离子的t i 0 2 阴离子网络，从而为磷灰石与基体的结合构筑了桥梁。y w g u 等【4 8 】将n i t i 合金在空气中加热至3 0 0 、4 0 0 、6 0 0 和8 0 0 的热处理方式，在n 汀i 合金表面得到t i 0 2 氧化层。热处理后的n 汀i 合金在浸入模拟体液中仿生生长。结果表明在6 0 0 热处理条件下的n i t i 合金的表面生成了锐钛矿和金红石型的t i 0 2 ，而3 0 0 和4 0 0 热处理的n i t i 合金的表面没有t i 0 2 相，8 0 0 时只有金红石型的t i 0 2 。同时，研究发现6 0 0 热处理后的n 汀i 合金的表面诱导生成了含有碳酸根离子替代的h a ，而3 0 0 和4 0 0 热处理的试样表面并没有磷灰石的生成。这是由于6 0 0 和8 0 0 处理后的试样表面有锐钛矿和或金红石矿的生成，它们可以在各自的晶体结构中为磷灰石的晶体生长提供所需要的原子排列。而且锐钛矿要比金红石型的t i 0 2 具有更好诱导磷灰石的能力。钙磷比在1 5 3 左右，与骨的接近。在s b f 溶液中生长3 天的表面改性后的模拟体液具有优良的生物活性。c l c h u 等f 4 9 l 首先将n 汀i 合金试样经过在k r o l l s 试剂中( 2 m l 的4 0 氢氟酸，4 m l 的4 0 硝酸和9 9 4 m l 的去离子水) 化学抛光，n i t i 合金先经过3 0 h 2 0 2 溶液处理2 h 后，经过超声清洗，放入6 0 1 mn a 0 h 溶液处理2 4 小时，再在s b f 溶液中浸泡，仿生生长。研究表明，经过化学处理后的n i t i 合金在诱导磷灰石形核方面具有更短的诱导期，缩短至6 小时。长时间的浸泡，在n 汀i 合金表面出现了更多的磷灰石，但是对比试验中却没有磷灰石涂层的生成。在s b f中浸泡4 8 h ，化学处理后的n 汀i 合金完全被致密的羟基磷灰石涂层。化学处理过程中生成的t i 一0 h 和n a 2 t i 0 3 加速仿生生长过程中磷灰石涂层的生长。j o n g s i k第一章绪论等 5 3 】同样将n i t i 合金放入煮沸的3 0 h 2 0 2 处理6 0 分钟后，清洗后，在1 2 0的4 mk o h 溶液中处理3 0 分钟或用l7 0 的饱和c a ( 0 h ) 2 处理2 h 代替k o h ，然后将处理后的n i t i 合金放入过饱和的钙化溶液( s u p e r s a u l t u r a t e dc a l c i n c a t i o ns 0 1 u t i o n ) ：1 8 m mk + ，3 0 m mc a p ，1 8 m mh 2 p 0 4 一，6 0 m mn 0 3 。2 4 小时的浸泡后，在表面得到1 0 u m 左右的厚度层。研究还发现，涂层主要有磷酸八钙( o c p )和h a 组成。涂层对形状记忆效应和超弹性显示了足够的机械稳定性。即使最上层去除的情况下，当与过饱和的钙磷溶液接触时，还留有一个薄层可以诱导钙磷盐的沉积。n i t i 合金的形状记忆效应并没有因为涂层的存在而改变。1 7 本课题的研究思路和方法在n i t i 合金表面制备与骨组织无机成分相近的类骨磷灰石涂层可改善其耐蚀性和生物相容性。在各种n i t i 合金表面钙磷层制备方法中，仿生溶液生长法具有独特的优势，简单易操作。本课题组已经对n i t i 合金表面仿生生长发制备钙磷盐涂层进行了多年的研究f 5 0 5 6 】，逐步摸索出了一系列n i t i 合金表面改性制备钙磷涂层的方法，取得了较好的生物复合效果，改善了n t i 合金的表面性能，前期的动物实验结果也证明材料与骨组织的结合良好，能传导新骨的形成，具有很好的生物相容性。人体环境中具有多种生长因子，在实验室条件下对硬组织修复和替代材料在体外复合生长因子，使其更好的从成分、结构、性质以及细胞外环境与人体环境更加接近，可以进一步扩大n i t i 合金的应用范围。本研究利用仿生生长矿化原理，在模拟体液中加入骨形态发生蛋白b m p 、胶原c o l ，在n i t i 合金预处理表面用仿生生长法制备有机无机复合活性涂层，改善n i t i 合金的生物相容性，进一步扩大其在硬组织修复材料领域的应用。主要内容如下：1 2 3 研究骨形态发生蛋白浓度、生长时间、模拟体液浓度对n i t i 合金表面有机无机复合层形成的影响，确定合适的涂层生长工艺。通过扫描电子显微镜( s e m ) 、x 射线衍射( x r d ) 、红外光谱( i r ) 、x 射线光电子能谱( x p s )