（农产品加工及贮藏工程专业论文）猪皮胶原蛋白提取及理化特性的研究.pdf

中文摘要 猪皮胶原蛋白的提取及理化特性研究 农产品加工及贮藏工程专业硕士研究生刁雪洋 指导教师李洪军教授 中文摘要 我国畜牧业发展迅速，全国猪肉年产量、肉制品及副产品加工总值逐年上升。目前，对 猪皮提取的胶原蛋白的功能特性有很多报道，但是在提取方法及提取率研究上不够深入，尚 未获得较高的提取率。本文通过对比几种辅助提取方法，选取超声波辅助酶法提取提高其提 取率，对胶原蛋白的工业化生产提供理论依据和实验指导。 本文主要选取荣昌猪的猪皮作为原料，并研究其猪皮胶原蛋白的含量及理化特性；猪皮 中非胶原蛋白成分的去除；酶法提取工艺中影响因素的研究；应用多种辅助提取方法( 振荡、 微波、超高压、超声波) 的研究，找出最优的辅助提取方法；酶法结合超声波辅助提取的响 应曲面分析研究；提取的胶原蛋白的纯化；纯化后的胶原蛋白的鉴定、基本理化特性及凝胶 特性的研究。现将主要研究结果总结如下： ( 1 ) 本实验荣昌成年猪样品的总蛋白含量为2 5 6 8 0 4 2 ，粗脂肪含量为2 5 4 7 0 2 4 ， 水分含量为4 8 0 3 0 3 8 ，灰分含量为0 6 4 - 4 - 0 1 5 ，其中胶原蛋白含量占总蛋白含量为7 4 1 2 0 9 9 ，荣昌乳猪的总蛋白含量为2 3 2 4 0 2 7 ，粗脂肪含量为2 2 5 8 0 3 5 ，水分含量 为5 0 9 2 0 2 ，灰分含量为0 5 8 7 6 0 1 2 ，其中胶原蛋白含量占总蛋白含量为6 6 7 8 0 3 6 。 ( 2 ) 研究应用振荡、微波、超高压和超声波几种辅助提取方法对胶原蛋白进行提取，其 结果表明：振荡、微波、超高压辅助酶法提取胶原蛋白对胶原蛋白的产量没有显著的提高， 在运用超声波辅助酶法对胶原蛋白进行提取比单纯用酶法对胶原蛋白进行提取要高，提取率 达到7 9 0 2 ，并且通过响应曲面二次回归得出最佳工艺条件为：酶用量在1 3 7 6 ，提取温度 约为3 2 ，根据前面的实验，超声波功率为1 5 0 w 。 ( 3 ) 通过对纯化后的胶原蛋白进行v a ng i e s o n 染色、紫外光谱及红外光谱的扫描，其 结果表明：经过v a n g i e s o n 染色，胶原蛋白被染成特异性的红色，证明是目的蛋白；在2 1 0 n t o 处，实验所得胶原蛋白有最大吸收峰，在2 8 0 n m 下无吸收，证明该胶原蛋白纯度高；红外吸 收光谱说明提取的荣昌猪成年猪胶原蛋白结构得以较好的保护，荣昌乳猪胶原蛋白结构有一 定程度的改变，但相对于明胶，结构得以较好保护。 ( 4 ) 用胰酶提取荣昌成年猪的猪皮胶原蛋白的特征性粘度在l m g m l 下为8 9 5 d l g ，用胰 酶提取荣昌乳猪猪皮胶原蛋白的特征性粘度在l m g m 1 下为9 4 5 d l g 。两种胶原蛋白的变性温 度都在3 5 - 一4 0 c 之间，且荣昌乳猪提取的胶原蛋白比荣昌成年猪提取的胶原蛋白对温度更敏 感。 两南大学硕七学位论文 ( 5 ) 胶原蛋白的乳化性和乳化稳定性都是随着胶原蛋白的浓度的增加而增大，但是随着 胶原蛋白浓度从1 增加到5 的过程中，乳化性和乳化稳定性的增加趋势逐渐减小。在用6 m o l l 盐酸，并于1 1 0 1 恒温烘箱中沙浴水解2 2 小时的水解条件下，得到1 7 种氨基酸，其中 甘氨酸含量2 2 9 4 7 ，脯氨酸含量为1 3 9 0 1 。 ( 6 ) 随着蛋白质浓度的增加，凝胶强度在明显增加。且在蛋白质浓度为3 至1 2 5 之间， 凝胶强度呈显著上升趋势；蛋白质浓度达到1 2 5 之后，凝胶强度的上升趋势减弱；凝胶强度 随着p h 的增加，凝胶强度在不断减少。当p h 值超过8 时，随着p h 的增加，凝胶强度在的减 少趋势更加明显。 关键字：胶原蛋白提取超声波凝胶特性 a b s t r a c t i iinin l 一 a b s t r a c t t h ed e v e l o p m e n to fc h i n a sl i v e s t o c ki n d u s t r yi si nah i g hs p e e d ，t h en a t i o n a la n n u a lo u t p u to f p o r k , m e a tp r o d u c t sa n db y p r o d u c t sh a v e b e e ni n c r e a s i n gi nv a l u e c u r r e n t l y , t h e r ea 陀m a n yr e p o r t s a b o u tt h ef e a t u r e so fp i gs k i nc o l l a g e n , h o w e v e r , t h ey i e l do fe x t r a c t i o nm e t h o d sa n dr e s e a r c hi sn o t d e e pe n o u g hy e tt og e tab e t t e re x t r a c t i o n t h i sp a p e rc o m p a r e ss e v e r a la s s i s t e de x t r a c t i o nm e t h o d ， s e l e c tt h eu l t r a s o n i ca s s i s t e de x t r a c t i o nt oi m p r o v et h e i ry i e l d , i n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fc o l l a g e n p r o v i d et h et h e o r e t i c a lb a s i sa n de x p e r i m e n t a lg u i d a n c e t h i sp a p e rs t u d i e so nt h ep i gs k i nc o l l a g e n sc o n t e n ta n dt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ， r e m o v a lo t h e rc o m p o s i t i o no fp i g s k i n , e n z y m e e x t r a c t i o no fi m p a c t f a c t o r s ，a p p l i c a t i o n o f m u l t i a s s i s t e de x t r a c t i o nm e t h o d sw i t h ( v i b r a t i o n , m i c r o w a v e ，h i 曲p r e s s u r e ，u l t r a s o u n d ) ，a n df i n d t h eb e s ta s s i s t e de x t r a c t i o nm e t h o d , a n a l y s i st h ec o r r e s p o n d i n gs u r f a c ee n z y m ew i t hu l t r a s o n i cw a v e e x t r a c t i o n , p u r i f i c a t i o no fc o l l a g e ne x t r a c t e d , i d e n t yt h ep u r i f i e dc o l l a g e na n dd e t e r m i n et h e p r o p e r t i e so fb a s i cp h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a m e t e r i s t i c sa n dt h ep r o p e r t i e so fg e l t h em a i nf i n d i n g s w i l ln o wb es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) p i gs a m p l e s i nt h i se x p e r i m e n tr o n g c h a n gh o gt o t a lp r o t e i nc o n t e n to f 2 5 6 8 4 - 0 4 2 ，c r u d e f a tc o n t e n tw a s2 5 4 7 4 - 0 2 4 ，w a t e rc o n t e n tw a s4 8 0 3 4 - 0 3 8 ，a s hc o n t e n tw a so 6 4 4 - 0 15 ， c o l l a g e np r o t e i nc o n t e n to f 7 4 1 2 4 - 0 9 9 ，r o n g c h a n gp i g l e t so f t o t a lp r o t e i nc o n t e n t2 3 2 4 4 - o 2 7 ， c r u d ef a tc o n t e n tw a s 2 2 5 8 4 - 0 3 5 ，w a t e rc o n t e n tw a s5 0 9 2 4 - 0 2 ，a s hc o n t e n tw a s0 5 8 4 - 0 1 2 ， c o l l a g e nc o n t e n tw a s6 6 7 8 4 - o 3 6 ( 2 ) s t u d yo na p p l i c a t i o no fv i b r a t i o n , m i c r o w a v e , h i g hp r e s s u r ea n du l t r a s o n i ca s s i s t e de x t r a c t i o n m e t h o d so fc o l l a g e ne x t r a c t e d ，t h er e s u l t ss h o wt h a t t h ec o l l a g e np r o d u c t i o ni sn o ts i g n i f i c a n t l y i m p r o v e dw h e nu s i n gt h em e t h o do fo s c i l l a t i o n , m i c r o w a v e ，h i g hp r e s s u r ea s s i s t e de x t r a c t i o no f c o l l a g e n , t h ec o l l a g e np r o d u c t i o nw h e nu s i n gt h em e t h o do fu l t r a s o n i ca s i s i t a n te n z y m ee x t r a c t i o no f c o l l a g e ni sh i n g h e rt h a ns i m p l ee n z y m ee x t r a c t i o no fc o l l a g e n ，t h ee x t r a c t i o nr a t ei s7 9 0 2 ，a n d q u a d r a t i cr e g r e s s i o n s u r f a c et h r o u g ht h e c o r r e s p o n d i n go p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e ：e n z y m e c o n c e n t r a t i o ni n1 3 7 6 , t h ee x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e i sa b o u t3 2 ，a c c o r d i n gt op r e v i o u s e x p e r i m e n t s ，u l t r a s o n i cp o w e ri s15 0 w ( 3 ) u s i n gt h ev a ng i e s o ns t a i n i n g s c a nw i t hu va n di n f r a r e ds p e c t r ao np u r i f i e dc o l l a g e n , t h e r e s u l t ss h o wt h a t ：a f t e rv a ng i e s o ns t a i n i n g , i tw a ss t a i n e dr e ds p e c i f i c i t y , p r o v e dt ob et h et a r g e t p r o t e i n , a t2 10 r i m ，t h ec o l l a g e nh a sam a 姬m 岫a b s o r p t i o np e a k , t h e r ei sn oa b s o r p t i o na t2 8 0 n t o ， s h o wt h a tt h ec o l l a g e nh a sah i g hp u r i t y , i n f r a r e da b s o r p t i o ns p e c t r as h o w e dt h a tt h ec o l l a g e n e x t r a c t e df r o mr o n g c h a n gh o gh a sac o m p l e t es t r u c t u r e ，t h es t r u c t u r eo fc o l l a g e ne x t r a c t e df r o m r o n g c h a n gp i g l e ti sa l i t t l ec h a n g e ，b u tc o m p a r e dt og e l a t i n , t h es t r u c t u r ec a nb ew e l lp r o t e c t e d ( 4 ) t h ec h a r a c t e r i s t i cv i s c o s i t yw i t ht r y p s i ne x t r a c tc o l l a g e nf r o mr 0 n gc h a n gh o g ss k i ni s i 两南尺学硕l - 学位论文 8 9 5 d l gu n d e rl m g m l ，t h ec h a r a c t e r i s t i cv i s c o s i t yw i t ht r y p s i ne x t r a c tc o l l a g e nf r o mr o n gc h a n g p i g l e t ss k i ni s9 4 5 d f gu n d e rl m g m 1 t w ok i n d so fc o l l a g e nd e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r ei nb e t w e e n 3 5 4 0 c a n dt h ec o l l a g e ne x t r a c to fc o l l a g e nf r o mr o n g c h a n gp i g l e f ss k i ni sm o r es e n s i t i v et o t e m p e r a t u r et h a ni te x t r a c tf r o mr o n g c h a n gh o g s k i n ( 5 ) t h ec o l l a g e n se m u l s i f i c a t i o na n de m u l s i o ns t a b i l i t ya r ea g g r a n d i z e m e n tw i t ht h ec o l l a g e n c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e s ，h o w e v e r , w i t hc o l l a g e nc o n c e n t r a t i o n sf r o m1 t o5 ，t h ee m u l s i f i c a t i o n a n de m u l s i o ns t a b i l i t y 。si n c r e a s i n gt r e n dg r a d u a l l yd e c r e a s e d i nu s i n g6 m o l lh y d r o c h l o r i ca c i d ，a n d a l1io 。c 1 c o n s t a n tt e m p e r a t u r es a n db a t hi nt h eo v e n2 2h o u r so fh y d r o l y s i sh y d r o l y s i s c o n d i t i o n s ，t h e r ea r c17a m i n oa c i d sc a nb eg o t , g l y c i n ec o n t e n tw a s2 2 9 4 7 a n dp r o l i n ec o n t e n t w a s1 3 9 0 1 ( 6 ) 、i t ht h ei n c r e a s eo fp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n , t h es t r e n g t ho fg e li n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y a n d t h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o nf r o m3 t o1 2 5 ，t h es t r e n g t ho fg e lw a ss i g n i f i c a n t l yr i s e ，w h e np r o t e i n c o n c e n t r a t i o nr e a c h1 2 5 ，t h eg e l ss t r e n g t ht r e n do fu p w a r di si nt h ed e c l i n e ，a st h ep hi n c r e a s e d , t h eg e l ss t r e n g t hi sd e c l i n i n g w h e nt h ep he x c e e d s8 ，w i t ht h ei n c r e a s eo fp h ，g e ls t r e n g t hm o r e e v i d e n ti nt h ed e c r e a s i n gt r e n d , w h e nt h ep he x c e e d s8 ，a st h ep hi n c r e a s e s ，t h eg e l ss t r e n g t hi s m o r ee v i d e n ti nt h ed e c r e a s i n gt r e n d k e y w o r d s ：c o l l a g e n e x t r a c tu l t r a s o u n dt h ep r o p e r t i e so fg e l i v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：习字午 签字日期：凶f 。年6 月d 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。， ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：心不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者名： 刁智 导师签名： 签字日期：文f 。年( 月d 日签字日期： 磊乒 矿p 年乡月乙日 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 荣昌猪品质特性及研究动态 荣昌猪主产于重庆荣昌和四川隆昌，是我国著名的地方良种猪种，从选育到形成荣昌 猪品种已经有4 0 0 多年的历史。荣昌猪具有适应性强、杂交配合力好、遗传性能稳定、 瘦肉率较高、肉质优良、鬃白质好等优良特性，从而享有“国宝猪”的美誉【1 1 。 1 1 1 荣昌猪的外貌特征 荣昌猪的头大小适中，面微凹，耳中等大、下垂，额面皱纹横行、有漩毛；体躯较 长，发育匀称，背腰微凹，腹大而深，臀部稍倾斜，四肢细致、结实；荣昌猪的鬃毛， 以洁白光泽、刚韧质优载誉国内外。鬣鬃一般长1 1 1 5 厘米。最长达2 0 厘米以上，一 头猪能产鬃2 0 0 - 3 0 0 克，净毛率9 0 。除两眼四周或头部有大小不等的黑斑外，其余 皮毛均为白色，也有少数在尾根及体躯出现黑斑全身纯白的。按毛色特征分别称为“金 架眼”、黑眼膛”、“黑头”、“两头黑”、“飞花”和“洋眼”等，其中“黑眼膛”和“黑 头”约占一半以上【2 1 。 1 1 2 荣昌猪的生活习性 荣昌猪对环境的适应性强，耐粗饲，性情温顺，易于调教，公猪采精容易，母猪泌乳性能 好，护仔能力强，在海拔l o - - 2 0 0 0 m 的不同地区都可以饲养，在冬季气温低至1 ，夏季气 温高达4 0 c 以上，饲料种类及饲养管理条件也不尽相同，但荣昌猪一般都能正常生长、繁殖， 表现出较好的适应能力 3 1 。 1 1 3 产肉性能 日增重3 1 3 克，以7 - 8 月龄体重8 0 公斤左右为宜，屠宰率为6 9 ，瘦肉率4 2 - 4 6 ，腿臀比例 2 9 。荣昌猪肌肉呈鲜红或深红色，大理石纹清晰，分布较匀，2 4 、9 6 小时贮存损失分别为3 5 、 7 2 。股二头肌熟肉率为6 7 7 。背最长肌的含水率为7 0 8 ，脂肪3 2 ，蛋白质2 4 8 ；每 克干肉发热量为5 7 2 5 千卡1 5 1 。 1 1 4 荣昌猪的研究动态 荣昌猪是我国最优良的地方猪种之一。据文献记载，大约从明末清初的广东、湖南大量移 民四川时带来，经过人工定向选育和自然适应形成，在清朝康熙年间编纂的荣昌县志中 已有“白豕”的记载。对荣昌猪的研究历史也很长，2 0 世纪3 0 年代末期，对荣昌猪就进行了调 查研究，1 9 3 6 年，四川省家畜保育所在荣昌安富镇建立了“荣隆实验区”指导农家选种，推广 荣昌猪。 2 0 世纪9 0 年代培育出我国第一个低外血含量的专门化母系一新荣昌猪i 系。该品系既 保持了原荣昌猪繁殖力强、配合力好、肉质优良、适应性强及毛色特征等优良特性，又在瘦 肉率、生长速度和饲料转化率等重要经济性状指标上有较大幅度提高。该品系1 9 9 5 年1 1 月通 过农业部品系审定并正式命名。1 9 9 7 年6 月获9 7 中国新技术新产品交易博览会金奖”。荣昌 猪i 系，为我国养猪业向高产、优质、高效方向发展提供了宝贵的种源。2 0 0 0 年8 月，农业 l 两南大学硕七学位论文 部确定其为全国保护的1 9 个猪品种资源之一，次年农业部又将重庆市种猪场定为国家级荣昌 猪资源场。2 0 0 6 年荣昌猪列入国家级畜禽遗传资源保护名剥6 】。 近年来，对荣昌猪的研究主要集中保种育种的资源保护场的建立、主体风味物质的研究、 优良性状的研究及控制其优良性状的相关基因的研究和后续产品的开发。 1 2 胶原蛋白 胶原蛋白的英文是c o l l a g e n ，源自希腊文，意思是“生成胶的产物”。胶原蛋白是细胞 外基质的结构蛋白质，含有一个或几个由a 一链组成的三螺旋结构，其分子在细胞外基 质中聚集为超分子结构，约占胶原纤维固体物的8 5 ，占体内蛋白质总量的2 5 3 0 ， 相当于体重的6 。胶原蛋白同时也是一种多糖蛋白，含有少量的半乳糖和葡萄糖。根据提取 方法或者来源不同颜色有一定差异，一般为白色和黄色【7 1 。 一般蛋白质含有2 0 种氨基酸，胶原蛋白含有1 8 种氨基酸，其中缺少了胱氨酸和色氨酸， 但有一些文献中列出的胶原蛋白并不缺少这两种氨基酸，只是量少而已。因为对胶原氨基酸 组成的研究会由于氨基酸的分析测定方法和水解条件对分析结果产生影响，产生的结果也不 一样。其次胶原蛋白中含有大量的甘氨酸，约占总氨基酸的2 7 ，其一级结构均为“g l y x - y ” 重复序列，其中x 为脯氨酸，y 为羟脯氨酸，分别占1 4 左右，后两种是胶原蛋白质的特有 氨基酸，这两种氨基酸都是环状氨基酸，有文献认为正是由于其环状结构锁住整个胶原分子， 使之很难拉开，故使胶原具有微弹性和很强的拉伸强度。另外，胶原q 一链n 端氨基酸是焦 谷氨酸，它源自谷氨酰胺脱去一分子氨而闭环产生的吡咯烷酮羧酸，它在一般蛋白质中 是少见的 引。 1 2 1 胶原蛋白的存在 胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质。属于细胞外蛋白质。从低等的脊椎动 物到晡乳动物的组织中都能觅得其踪迹。广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏细胞间质 等部位，起着支撑器官、保护机体、与组织的形成、成熟、细胞分化及钙化作用等生理活动 密切相关。因此，对胶原蛋白及其基因的研究越来越引起人们的兴趣。 同时，胶原蛋白还是人们进行衰老研究的一种模型蛋白，李晓波等【9 l 对不同月龄苏尼特羊 不同部位的肌肉胶原蛋白特性进行相关分析表明，肌肉的剪切值与总胶原蛋白、可溶性胶原 蛋白为极显著正相关，胶原蛋白溶解度与剪切值成极显著负相关。 1 2 2 胶原蛋白的结构 胶原蛋白的每种q - 链可以分成许多亚型，每一条q - 链都对应一种基因编码。各 种基因产物以不同方式组合形成不同类型的胶原蛋白，理论上来说，2 0 多种a 一链可以 形成上千种不同类型的胶原蛋白，但是在目前只发现了2 7 种胶原蛋白类型。其中从动物的 皮肤或跟腱中提取出的i 型胶原蛋白，易于分离出来且产量较高，价格适中【1o n 】。还可根据胶 原蛋白存在的部位将胶原分成间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原，其中间质型胶原 蛋白分子占整个机体胶原的绝大部分。 2 第1 章文献综述 1 2 3 胶原蛋白的理化特性研究现状 胶原蛋白具有很强的延伸力，不溶于水，在酸中可溶解，根据所用可溶性溶剂的不同， 大体上分为中性盐可溶性及酸性可溶性胶原【1 2 】。构成胶原纤维的胶原蛋白分子量为6 0 ，0 0 0 左 右，等电点p i 为7 - - - 8 ，但若用酸或碱处理可使p i 接近5 1 13 1 。裴海燕测得碱法水解废弃铬鞣皮 屑得到的胶原蛋白水解物分子量在1 4 ，4 0 0 一- 9 7 ，0 0 0 之间；陈因良等1 5 1 测得小牛皮用酶结合酸提 取的胶原蛋白的分子量为1 8 0 ，0 0 0 ；陈申如等【16 】测得鲨鱼、鲢鱼、草鱼、罗非鱼等4 种鱼皮胶原 蛋白及的分子量大约都为2 0 0 ，0 0 0 ；傅燕凤测得鲢鱼、鳙鱼、草鱼鱼皮胶原的类型为i 型胶原 蛋白，分子量为2 5 0 ，0 0 0 ；有报道说骨胶原的摩尔质量为3 0 0 ，0 0 0 1 8 1 。 1 - 2 4 胶原蛋白的制备研究现状 1 2 4 1 中性盐萃取法 一般使用该方法提取组织材料中的可溶性的胶原蛋白中性盐溶剂一般采用0 1 5 m o l f l 、 0 4 5 m o l l 及l m o l l 的n a c l 溶液f 1 2 】；t r i s h c l 、磷酸盐、柠檬酸盐等，但如果盐浓度太低， 胶原是不能溶解的，通常盐浓度是o 1 5 一1 m o f l t l 9 1 由于成年动物组织中的胶原蛋白交联较多， 可溶性胶原蛋白较少，因此该法使用受到了限制。 1 2 4 2 酸法 酸性溶剂多采用p h 3 5 的0 0 5 0 5 m o f l 的醋酸或0 1 5 m o f l 的枸橼酸缓冲液【1 1 ，也有用 甲酸、盐酸f 1 6 , 1 7 1 、磷酸、亚硫酸、乳酸提取的。盐酸浓度一般用o o l m o l l ，稀酸溶液不但 可以用于提取可溶性胶原蛋白外，还可以使多数组织溶胀，打开其交联键，更利于提取胶原蛋 白，用酸法提取时，如果酸浓度、水解温度、水解时间等控制不好，可能会使胶原蛋白彻底 水解成氨基酸或使氨基酸，如色氨酸、丝氨酸等遭到破坏【1 8 】，且得到的胶原蛋白由于水解程度不 同，纯度也不能达到很高的统一。 1 2 4 3 酶法 应用酶制剂提取是近年来研究最多的方法，酶法是以追求高回收率为目标。胶原蛋白对 胶原酶以外的蛋白酶有抵抗作用，单独使用酶提取的研究相对较少，多是和酸或中性盐混合 使用，在酸性条件下用胃蛋白酶或中性条件下用木瓜蛋白酶处理，可切断胶原分子n 及c 端的 非胶原性肽，而不会改变胶原的三股螺旋结构【7 , 1 2 , 1 8 ，从而使更多的不溶性的胶原蛋白变得可 溶，所使用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、糜蛋白酶、中性蛋白 酶等。 1 2 4 4 重组d n a 法 近年来生物技术学家也尝试以重组d n a ( 遗传工程) 方法，将生产胶原蛋白有关的基因 剪接到牛或羊等家畜细胞，借由牛乳或羊乳的分泌，可由乳汁中萃取得到胶原蛋白，这种以“基 3 两南大学硕十学位论文 因转殖动物”( t r a n s g e n i ca n i m a l s ) 来生产胶原蛋白的方法叫动物工厂( a n i m a lb i o r e a c t o r ) ，但目 前仍处于研发阶段，尚未工业生产【1 9 】。 1 2 5 胶原蛋白的鉴定表征 通过化学法、物理法、组织化学法、专一抗体结合、免疫化学反应法等可以对胶原蛋白进 行定性和定量0 2 , 1 明。但是由于胶原蛋白中含有大量的羟脯氨酸是这类特殊的氨基酸，因此，在 定量测定中常用测定羟脯氨酸的方法来定量胶原蛋白。 1 2 5 1 胶原蛋白的定性 1 2 5 1 1 组织化学染色法 组织化学染色法主要有v a ng i e s o n 染色法、苦味酸天狼猩红偏振光法、复合染色法等， 其中如果单纯鉴定胶原蛋i 刍v a ng i e s o n 染色法较常用，如果要鉴定胶原蛋白的类型苦味酸天 狼猩红偏振光法较常用。 由于胶原蛋白富含碱性氨基酸，常可与酸性染料起强烈的反应。例如，酸性平红可与胶 原发生染色化学反应。该染色化学反应与染料分子的大小及组织的渗透性有关，相对于组织 结构疏松的材料，相应渗透性就大，染料的渗透不受相对分子量的限制；而当组织结构紧密 的材料，相应渗透性就小，因此需选择相对分子量小的染料进行染色【7 】o 1 2 5 1 2 紫外光谱分析 对于胶原蛋白的定性也可以应用紫外光谱分析法【2 0 矧，紫外光谱分析法是根据一般蛋白质 含有色氨酸和酪氨酸这两种氨基酸在2 8 0 n m 处有最大吸收峰，而胶原蛋白基本不含色氨酸和酪 氨酸，只有在2 3 0 n m 以下都有强吸收，因此，对于胶原蛋白的定性可以检测在2 8 0 n m 及2 0 0 - - - 2 3 0 n m 这两个波长段条件下的吸光度。对于一种纯蛋白质，当在2 8 0 n m 无吸收峰时，在2 0 0 - - - 2 3 0 n m 有最大吸收峰一般就可以认为有胶原蛋白存在 2 2 1 。孟宪敏等吲测定了纯化后的猪巩膜 胶原蛋白的吸光度值在2 3 0 n m 下有最大吸收峰；陈因良等阴1 测定了从小牛皮中提取的胶原蛋白 的吸光度值在2 2 6 n m t 有最大吸收峰；李彦春等测定了用酶法制得的牛皮胶原蛋白的吸光度 值在2 1 0 n m 下有最大吸收峰。但需要注意的是，此法只适用于纯胶原蛋白样品，若含有杂蛋白， 会导致一定程度的紫移。并会影响胶原蛋白在2 0 0 - - 2 3 0 n m 的吸光度值。 1 2 5 1 3 磷酸缓冲盐溶解检测 根据胶原蛋白的另一个特性：用磷酸缓冲盐( 1 m o l i l 、p h 6 6 6 8 的磷酸盐缓冲液，4 冷却一昼夜备用) 溶解的胶原冻干品在4 c 下呈液态，在3 7 下呈固态，也可以用于胶原蛋白 的定性检测【2 1 ，2 5 1 。 1 2 5 2 胶原蛋白的定量 1 2 5 2 1 羟脯氨酸含量测定 4 第1 章文献综述 该方法是目前最常用的定量测定方法。在我国常按g b 9 6 9 5 2 3 9 0 肉和肉制品中l ( ) 羟脯氨酸含量测定进行测定，此标准等效于国际标准i s 0 3 4 9 6 1 9 7 8 。根据胶原蛋白含有羟 脯氨酸的量一般占胶原蛋白干重的1 4 左右来定量测定，对于陆生动物常用7 1 作为换算系 数，水生动物则多采用1 1 1 。傅燕凤m 利用此法测定了淡水鱼鱼皮胶原蛋白的含量，以1 1 1 作为换算系数；秦玉青也按此法再进行了改进来定量鱿鱼皮中胶原蛋白的含量，以1 4 1 作 为换算系数；关静等口6 1 利用该法改进的方法测定了胶原海绵羟脯氨酸的含量。 1 2 5 2 2 天狼猩红法 此法是由m a r o t t a 根据苦味酸天狼猩红偏振光法改进而来j 刘秉慈等又作了一些改进，使 此法变得更灵敏、简便和省时。原理是利用天狼猩红与胶原特异性的结合，通 过n a o h 溶液洗 脱和离心后在5 4 0 r i m 下对红色复合物测定吸光度，确定胶原蛋白的含量。 该方法的灵敏度为1ug ，最适合的检测范围在3 1 0 0l l9 2 间。并且由于天狼猩红与胶原 蛋白的特异性结合较高，其他常见的蛋白对该法影响不大【2 7 2 剐。 1 2 5 2 3 免疫学检测法 免疫学检测的方法是根据已知的特性性抗体或抗原的特异性结合，通过对结合后的特性 性抗体上的标记呈现的一定颜色，并借助显微镜、电子显微镜等观察其颜色的变化，从而对 抗体结合的组织或细胞结构进行确定。 免疫学检测法包括酶联免疫检测法、双抗体夹心e l i s a 法测定血清型胶原、e l i s a 间接 法测定i 型和型胶原、免疫印迹法、放射免疫法、免疫荧光法、免疫电镜法等【2 9 , 3 0 1 。 1 2 6 胶原蛋白的应用现状 胶原蛋白因具有其特殊的生理生化特性，且具有比合成的高分子材料更高的生物相容性 和生物可降解性，广泛应用在食品、医药、美容保健、饲料等工业中。 1 2 6 1 在食品中的应用 胶原蛋白在食品中的应用主要是由于其功能性和营养性。且由于近年来对胶原蛋白的深 入研究，打破了其原来认为的不完全蛋白的认识，在营养方面的应用越来越引起人们的兴趣。 如今，在全世界范围，以胶原蛋白开发出了大量的营养保健品。在食品中的应用，具体表现 如下： 1 2 6 1 1 作为食品添加剂 作为食品添加剂应用于食品中主要是根据其优良的理化特性，即功能特性，通常包括： 食品乳化剂、稳定剂、澄清剂、增稠剂、黏合剂等。 胶原蛋白的水解产物明胶的分子链有亲水部分又有疏水部分，因此可作为乳化剂乳化能 力和乳化稳定性都随其浓度增加而增大，但随着浓度的增加，上升的幅度逐渐减少1 3 。 5 两南大学硕l 学位论文 w i l l i a m s o n , ak 3 2 】等人研究表明，产品应力与胶原蛋白含量的多少成正比，而应变则成反比。 胶原蛋白还能降低血甘油三酯和胆固醇，用胶原蛋白( 水解明胶) 、果胶和麸皮按一定 比例配制的食品，有利于降低体重和血脂。另据报道，胶原蛋白的水解产物卜羟脯氨酸的含 量与脂肪细胞的分裂能力与生长能力有关，羟脯氨酸的含量越高，分裂脂肪细胞的能力越强 1 。贾晓波等m 1 研究发现羟脯氨酸能使正常小鼠的摄食量明显增加，而不增加体重的增长速 率。李俊艳等3 5 1 以猪皮为原料，水解制备胶原多肽，与c r c b 6 h ：0 螯合制得胶原多肽一铬，动 物实验表明这种产物有降低血糖和血脂的功能。 近年来胶原蛋白的作用还引申到补钙的保健食品中，因为骨中的钙是通过骨胶原为粘合 剂而固定的，并且血浆中钙的运送要依赖于胶原中的羟脯氨酸，因此有学者提出：补钙先补 胶原蛋白。香港大学预防疾病研究所王凯教授指出，如果缺少胶原蛋白，用补钙来防治骨质 疏松，再多的钙也无法改善。李彦春等m 3 通过实验证明胶原多肽易于吸收，补钙的效果较好。 由于胶原蛋白的水解产品明胶可与单宁生成白色的絮状沉淀，且产生的絮状沉淀可将饮 料中的混浊物吸附、凝聚、成块而去除。因此，可作为澄清剂用于各类酒及果汁等产品的生 产【3 7 ，3 引。日本t a k a r as h u z o 开发出一种一种里面含有胶原蛋白低酒精含量的充入碳酸气的清酒； 日本的m e i i i 乳品公司也开发出了富含胶原蛋白的乳酸菌酸奶【3 9 , 4 0 。 由于认识到铝对人体得危害性，老年痴呆症、甚至可能导致癌变等都可能是与摄人过量 的铝有关。而胶原蛋白能促进体内铝的排出。黄碧霞等【4 l 】通过实验证明胶原的水解产物( 明 胶) 能有效的排除体内的铝。 1 2 6 1 2 用于生产可食性包装材料 塑料制成的包装材料因其极难降解，被称为“白色污染”。出于环保的考虑，对可降解、 可食用的食品包装材料的研究成为一种趋势。胶原蛋白因其特殊的分子结构，从而显示出比 其他蛋白膜以及多糖膜更高的韧性、强度和成膜能力。胶原蛋白的相对分子量直接影响着成 膜的拉伸强度。相对分子量越高，黏度越大，膜的拉伸强度越大。目前对添加剂对胶原蛋白 的成膜性有详细的研究。马春辉等n 2 1 对各种交联剂、定型剂、增塑剂、防潮剂对胶原蛋白成 模性的影响。罗爱平等h 3 1 用氯化钙做交联剂，增加了膜的机械强度，使膜更稳定。阚建全等 4 4 1 研究了加入琼脂对膜强度的影响，增加了膜的拉伸强度。 2 0 世纪早期，国外就对胶原肠衣的研究，我国在2 0 世纪8 0 年代在广西梧州建成了第一个 胶原肠衣工厂。近年来，国外又对多价离子和交联剂引入胶原肠衣的制作，制得得肠衣的效 果更好【4 5 舶 4 7 1 。 1 2 6 1 3 模拟食品 模拟食品是指以蛋白质或其他食品原料辅以食品添加剂为基础制备的食品。使其在成分、 外观、形状和综合性能方面接近于人们普遍接受的传统食品。胶原蛋白及其水解产物( 明胶) 的凝胶特性，可以通过交联而制成模拟食品。目前，已有胶原制成的人造海参、人工鱼翅、 6 第1 章文献综述 胶原蛋白丝、人工发菜等模拟食品。李雨红等【4 8 1 用胶原蛋白制成了仿生海参，且具有天然海 参的外观。杨贤庆等 4 9 1 对用胶原和海藻酸钠制作的鱼翅的综合性状的影响进行了研究，发现 海藻酸钠对口感的影响更大，而胶原的含量对鱼翅的外形影响更大。 1 2 6 1 4 用于制作食品调味品 日本曾以动物胶原蛋白为原料经胶原蛋白水解酶水解、调制开发出新型调味品，这种调 味品因其含有丰富的呈味氨基酸，具有很好的呈味性能，同时还能补充部分氨基酸。李光辉 等例通过复合调味品的制作原理与方法，利用畜禽类鲜杂肉骨等丰富胶原蛋白和鲜味物质配 制成胶原蛋白复合呈味肽。 1 2 6 2 在医疗上的应用 胶原是细胞外基质的结构蛋白，因其特殊的3 股螺旋结构及自身的交联结构决定其独特的 生物学功能。由于近年来对胶原的深入研究，胶原应用于生物医学材料方面展现出了其他例 如医用金属材料、医用高分子材料、医用陶瓷材料等不能比拟的优势。具体表现在：比其他 材料更低的免疫源性；比其他材料更易与寄主细胞及组织之间的协调作用；比其他材料更好 的物理机械性能；可生物降解；还具有一定的止血作用等【5 1 , 5 2 , 5 3 】。胶原在医疗领域的应用具体 介绍如下： 1 2 6 2 1 在手术材料上的应用 在外科手术中，需要对创面或血管进行缝合，因此需要用到手术缝合线。而由天然材料 制成德手术缝合线都存在一些不足，而胶原制作的手术缝合线具有与天然材料一样的强度、 平滑性和弹性，有便于吸收，而且还有辅助止血的作用。目前在手术缝合线上主要有胶原和 胶原与其他成分交联两种缝合线。张其清等【5 4 1 将胶原与聚乙烯醇交联，制成了复合纤维；华 坚等嗍用胶原与壳聚糖制备了复合纤维，得到了更高的湿打结强度；周波掣5 6 1 利用胶原与壳 聚糖制备复合纤维的同时添加聚丙稀酰胺制备了耐分解的复合纤维。 1 2 6 2 1 2 在止血方面的应用 胶原不仅可以诱导血小板附着，还可以激活一些凝血因子的作用，还由于自身的黏性可 以黏合伤e l ，其中胶原蛋白中游离的氨基使血小板凝聚，其凝聚力则是由于自身发达的四级 网状立体结构，因此具有止血作用。牛金柱等【5 7 1 通过体外实验表明，胶原制作的止血海绵和 止血纤维效果比其他止血材料好得多；李保强等【5 8 】对比了胶原蛋白、壳聚糖和多孔沸石止血 性能，在深部创面止血时间上，胶原止血纤维的止血时间最短。 1 2 6 2 1 3 在治疗烧伤中的应用 人体的皮肤是具有再生能力的组织，对于轻度的烧伤由于治疗得当而逐渐再生，对于二 度和三度烧伤，采用自体皮肤移植也能达到治疗目的。但对于重度烧伤的病人，则需要一种 7 两南大学硕十学位论文 暂时