（环境工程专业论文）深海适冷菌pseudoalteromonas+spsm9913胞外多糖的絮凝和吸附性能研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：盔壁垒 1 9 期：迦星：丝笙 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) ， 论文作者签名：查! 麴垄导师签名：乙董兰日期：之星：竺y 山东人学硕十学位论文 摘要 从深海沉积物中分离出来的深海适冷菌p s e u d o a l t e r o m o n a ss p s m 9 9 1 3 能分 泌大量具有较强絮凝能力的胞外多糖( e p s ) 。本论文对e p ss m 9 9 1 3 的絮凝性能 和吸附性能进行了系列研究。 首先，采用烧杯试验研究了e p ss m 9 9 1 3 对高岭土悬浊液的絮凝效果，考察 了多糖投加量、水样p h 、不同阳离子和阴离子、盐度和温度对e p ss m 9 9 1 3 絮 凝性能的影响，通过测定z e t a 电位和絮凝过程中絮体粒度的变化，探讨了e p s s m 9 9 1 3 的絮凝机理，并针对e p ss m 9 9 1 3 高度乙酰化的结构特点，通过脱乙酰 对比e p ss m 9 9 1 3 脱乙酰前后的絮凝效果，考察了大量乙酰基团的存在对e p s s m 9 9 1 3 絮凝效果的影响，此外本论文还考察了存储方式对e p ss m 9 9 1 3 稳定性 的影响。结果表明，在l g l 的高岭土悬浊液中，当e p s 投加量达1 0 m g l 时絮 凝活性达到最大值4 9 3 ( 4 5 5m mc a c l 2 ) 。p h 值在5 8 范围内e p ss m 9 9 1 3 絮 凝效果较好。二价阳离子c a 2 + 和f e 2 + 的加入可明显提高e p ss m 9 9 1 3 的絮凝活性， 而相同浓度的一价和三价阳离子则降低e p ss m 9 9 1 3 的絮凝活性。向溶液中加入 不同阴离子的钠盐，在n a + 浓度相同的条件下，在含有n 0 3 一的溶液中，e p s s m 9 9 1 3 的絮凝效果最好。在5 - - 4 0 范围内， e p ss m 9 9 1 3 的絮凝活性随温度 降低逐渐升高并在5 1 5 时达到最高值。当溶液中的盐度为5 1 0 0 时，e p s s m 9 9 1 3 的絮凝活性高于a 1 2 ( s 0 4 ) 3 的。此外，e p ss m 9 9 1 3 还能够有效地絮凝其 它分散体系。从尸s p s m 9 9 1 3 提取的胞外多糖和其他生物絮凝剂之间的比较表 明，该e p s 是一种相对高效的生物絮凝剂。z e t a 电位和絮体粒径的测定、扫描 电镜的观察显示，吸附架桥是e p ss m 9 9 1 3 絮凝的主要机理。乙酰基含量的减少 使得e p ss m 9 9 1 3 的絮凝效果有了明显的下降，在含盐模拟水样及低温下都失去 了以前的优势。可见，乙酰基的大量存在对e p ss m 9 9 1 3 保持良好的絮凝性能有 着重要的意义。多糖无须烘干或冻干，以湿糖形式在4 c 下即可保存，在长达一 年多的试验期间未观察到多糖絮凝效果的下降。 采用e p ss m 9 9 1 3 分别对p b 2 + 和c u 2 + 进行吸附试验，研究了胞外多糖用量、 p h 、吸附时间和共存离子对其吸附规律的影响及e p ss m 9 9 1 3 对p b 2 + 和c u 2 + 的 山东大学硕j j 学位论文 吸附热力学。结果表明，e p ss m 9 9 1 3 对p b 2 + 和c u 2 + 的吸附量随多糖投加量的增 加而减小。在p h 分别为4 5 5 5 和4 5 “时，e p ss m 9 9 1 3 对p b 2 + 和c u 2 + 的吸附 效果较好。e p ss m 9 9 1 3 对c u 2 + 的吸附平衡时问较短，9 0 m i n 后即可达到吸附平 衡，而对p b 2 + 的吸附平衡时间则长达1 8 0 m i n 。共存离子c a 2 + 、m 9 2 + 、n a + 、k + 的加入降低了e p ss m 9 9 1 3 对p b 2 + 的吸附量，c a 2 + 、m 9 2 + 的加入也降低了e p s s m 9 9 1 3 对c u 2 + 的吸附量，但低浓度的n a + 和实验范围浓度的k + 不仅没有降低反 而增加了e p ss m 9 9 1 3 对c u 2 + 的吸附量。f r e u n d l i c h 和d u b i n i n r a d u s h k e v i c h 方 程均能较好地描述e p ss m 9 9 1 3 吸附p b 2 + 和c u 2 + 的热力学过程，由 d u b i n i n r a d u s h k e v i c h 方程得到e p ss m 9 9 1 3 对p b 2 + 和c u 2 + 的最大吸附量分别为 2 4 3 3m g ( 1 0 c ) 和3 6 7m g g ( 4 0 。c ) 。胞外多糖吸附金属离子前后的红外光谱 分析表明，多聚糖中c o c 、乙酰基和羟基是起主要吸附作用的官能团。 关键词：深海胞外多糖，絮凝活性，絮凝机理，脱乙酰，p b 2 + ，c u 2 + ，生物吸附 2 山东大学颂f ：学位论文 a b s t r a c t p s e u d o a l t e r m o n a ss p s m 9 9 1 3 ，ap s y c h r o p h i l i cb a c t e r i u mi s o l a t e df r o m1 8 5 5m d e e p s e as e d i m e n tc a ns e c r e t sal o to fs t i c k ye x o p o l y s a c c h a r i d e t h ef l o c c u l a t i o na n d a d s o r p t i o na b i l i t ya n dm e c h a n i s mw a si n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r t h ef l o c c u l a t i o np e r f o r m a n c ei nk a o l i ns u s p e n s i o nh a sb e e ns t u d i e df i r s t t h e e f f e c t so fe p sd o s a g e ，p h ，c o i o n s ，s a l i n i t ya n dt e m p e r a t u r eo nt h ef l o c c u l a t i o no f e p ss m 9 913w e r ei n v e s t i g a t e d t h ef l o c c u l a t i o nm e c h a n i s mo fe p ss m 9 9 13h a d b e e ns t u d i e db yd e t e r m i n i n gz e t ap o t e n t i a l sa n df l o e ss i z e sd u r i n gf l o c c u l a f i o np r o c e s s b yd e a c e t y l a t i n ge p ss m 9 9 13a n dm e a s u r i n gt h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t yo ft h e d e a c e t y l a t e de p s ，t h ef u n c t i o no ft h ea c e t y lg r o u p sw a ss t u d i e d a d d i t i o n a l l y , t h eb e s t s t o r a g em e t h o do ft h i se p sw a s a l s od e t e r m i n e d t h er e s u l t ss h o wt h a te p ss m 9 913 h a sap e a kf l o c c u l a t i n ga c t i v i t yo f4 9 3i n1g lk a o l i ns u s p e n s i o nw i t l l4 5 5m m o l l c a c l 2a n dt h eo p t i m u mp hr a n g eo f5 - 8 i ta p p e a r st h a tt h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t yo f e p ss m 9 913i ss t i m u l a t e db yc a 2 + a n df e 2 + a n di sh i g h e s ti nn 0 3 一s o l u t i o na m o n g v a r i o u sa n i o n ss o l u t i o n t h i ss t u d ya l s of o u n dt h a te p ss m 9 913s h o w sab e t t e r f l o c c u l a t i o np e r f o r m a n c et h a na 1 2 ( 5 0 4 ) 3a ts a l i n i t yo f5 - 10 0 o rt e m p e r a t u r e so f 5 15o c i na d d i t i o n e p ss m 9 913i se f f e c t i v et of o c c u l a t es e v e r a lo t h e rs u s p e n d e d s o l i d s t h em e a s u r e dz e t ap o t e n t i a l s ，t h es i z eo ff l o e sf o r m e dd u r i n gt h ef l o c c u l a t i o n p r o c e s sa n dt h es u r f a c ep r o f i l eo ff l o c sr e v e a l e db ys c a ne l e c t r o nm i c r o g r a p hs u g g e s t t h a tb r i d g i n gi st h em a i nf l o c c u l a t i o nm e c h a n i s mo ft h es t u d i e de p ss m 9 9 13 d e a c e t y l a t i o no fe p ss m 9 9 13r e s u l t si nas i g n i f i c a n td e c r e a s ei ni t sf l o c c u l a t i n g a c t i v i t yi n d i c a t i n gt h a tt h el a r g en u m b e ro fa c e t y lg r o u p si ne p ss m 9 9 13p l a y sa l l i m p o r t a n tr o l ei ni t sf l o c c u l a t i o np e r f o r m a n c e e p ss m 9 9 13c o u l db es t o r e dw i t h o u t d e s i c c a t i o ni n4o c ，a si th a sn od e c r e a s ei nf l o c c u l a t i n ga c t i v i t yd u r i n gs t u d yp e r i o d b i o s o r p t i o no fp b 2 + a n dc u 2 + b ye p ss m 9 9 13w a sa l s o i n v e s t i g a t e d t h e i n f l u e n c e so fe p sd o s a g e ，p h ，e q u i l i b r i u mt i m ea n dc o e x i s t e d i o n so na d s o r p t i o n p r o p e r t ya n dt h ea d s o r p t i o ni s o t h e r mo ft h i se p s w e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a t t h ee q u i l i b r i u ma d s o r p t i o nc a p a c i t y ( q e ) d e c r e a s e sw i t ht h ei n c r e a s eo fe p sd o s a g e 3 山东人学硕七学位论文 t h e o p t i m u mp hf o r t h ea d s o r p t i o no fp b 2 + i sd u r i n g4 5 5 5 ，a n df o rt h ea d s o r p t i o n o fc u 2 + i sd u r i n g4 5 - - 6 t h ec u 2 + a d s o r p t i o ne q u i l i b r i u mi sa t t a i n e dw i t h i n9 0 m i n ， w h i l et h ep b 2 + a d s o r p t i o ne q u i l i b r i u mt i m ei s18 0 m i n o eo fp b 2 + d e c r e a s e sw i t ht h e a d d i t i o no fc o i o n sa sc a 2 + ，m 9 2 + ，n a + a n dk + a d d i t i o no fc a 2 + 、m 9 2 + a l s od e c r e a s e s t h eq eo fc u 2 + ，b u tl o wd o s a g eo fn a + a n dt h et e s t e dd o s a g eo fk + i ns t u d yi n c r e a s e s m eq co fc u 2 + b o t hf r e u n d l i c ha n dd u b i n i n r a d u s h k e v i c hi s o t h e r me q u a t i o n sc o u l d w e l ld e s c r i b et h et h e r m o d y n a m i c sp r o c e s so fp b 2 + a n dc u 2 + b yt h ee p s t h e m a x i m u ma d s o r p t i o nc a p a c i t yd e t e r m i n e db yd u b i n i n - r a d u s h k e v i c h i s o t h e r m e q u a t i o nf o rp b 2 十a n dc u 2 + a r e2 4 3 3m g c g ( 10 * c ) a n d3 6 7m g g ( 4 0 ) i ra n a l y s i s d e m o n s t r a t e st h a tt h eg r o u po fc o c a c e t y la n dh y d r o x y lo fp o l y s a c c h a r i d ea r e t h em a i nf u n c t i o n a lg r o u p sf o rb i n d i n gm e t a li o n s k e yw o r d s ：d e e p s e a e x o p o l y s a c c h a r i d e ，f l o c c u l a t i n ga c t i v i t y , f l o c c u l a t i o n m e c h a n i s m ，d e a c e t y l a t i o n ，p b 2 + ，c u 2 + ，b i o s o r p t i o n 4 山东大学硕一l ：学位论文 引言 微生物胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e e p s ) 是细菌、真菌和蓝藻等微生物在 次生代谢过程中产生的对微生物有保护作用的生物高聚物【l 】。微生物胞外多糖具 有产量高、质量稳定、受环境因素影响较小的特点，且因其安全、无毒和独特的 理化性质得到了欧美发达国家的广泛关注，在食品、医药和化工领域占据了较强 的市场竞争力，具有广阔的发展前景。 近年来，海洋微生物资源的研究与开发日益受到重视，成为海洋生物资源开 发的热点领域。海洋与陆地环境大相径庭，微生物资源丰富，e p s 分泌量大，为 了适应环境，这些区域微生物的e p s 组成和结构都与陆地微生物e p s 有很大的 不同，对水中h 2 s 、重金属和各类有机污染物的处理具有重要意义。由于深海样 品采集困难，微生物分离培养难度较大，国内外关于深海微生物的研究相对较少。 但由于其巨大的理论意义和应用潜力，深海微生物资源的研究与开发已经成为世 界各国，特别是发达国家竞争的热点和焦点，国外已经有关于深海微生物多糖的 专利被申请，内容涉及在食品、医药、生物技术领域中的应用。但关于深海微生 物多糖在废水处理中的应用还未见报道。过去十年，科学家对深海热液口微生物 分泌的胞外多糖的结构与功能进行了大量的研究，主要是热液口附近的中温菌和 嗜( 耐) 热菌分泌的多糖，如：交替单胞菌属么，胞加聊d 刀傩【2 一钉、假交替单胞菌属 p s e u d o a l t e r o m o n a s l s s 1 和弧菌属v i b r i o 9 邶】等。热液口微生物分泌的胞外多糖与其 它生态环境中微生物分泌的胞外多糖的结构不同，表现在糖醛酸含量高( 高达 1 0 - - , 4 0 ) 和高度乙酰化上，这些多糖粘度较高，对金属离子、微生物菌体自身 以及蛋白颗粒具有较强的结合能力。因此，热液口微生物分泌的胞外多糖对于微 生物适应深海热液口的极端环境具有重要的意义。深海热液口的微生物资源也被 认为是能够分泌新型特殊功能多糖的重要资源【6 j 。深海热液口微生物分泌的胞外 多糖的特殊结构，预示其具有新的潜在的生物学功能，在生物技术领域、环保领 域中将有新的用途，特别是对高盐的废水处理方面可能具有很好的应用前景。因 此，深海微生物多糖的研究日益引起了各国科学家的重视。2 0 0 4 年1 2 月，在厦 门召开的中法海洋生物技术双边会议中，两国科学家达成共识，合作研究和开发 深海微生物多糖。 山东人学硕十学位论义 过去关注更多的是深海热液口微生物分泌的胞外多糖的结构及其在微生物 适应热液口极端环境中的作用。但是，深海热液口在整个深海海底中所占的面积 很少，只是代表深海海底的一个特殊环境，而且，在该区域生长的微生物大多都 是嗜( 耐) 热菌或中温菌。而深海海底绝大部分区域是一个高压、低温、弱光、 寡营养的海水流动的环境，如深海冷泉口低温、高盐、重金属含量较高，这 些区域生长着大量的嗜( 适) 冷微生物【6 - 7 】，这些适冷微生物经过长期的进化适 应，已有着适应低温环境的特殊结构与代谢机制，它们在低温下能分泌大量的胞 外多糖，其结构和功能至今还未见报道。 深海适冷假交替单胞菌p s e u d o a l t e r o m o n a ss p s m 9 9 1 3 是从日本冲绳槽 2 5 0 5 6 n 、1 2 5 0 0 97 e 的1 8 5 5 m 深的海底采集的淤泥中筛选而得【】，该菌株最适生 长温度1 5 ，分泌的大量e p s 对于提高s m 9 9 1 3 的低温活性具有重要作用，并且 在1 0 3 0 c 之间随温度降低e p s 的分泌量大幅升高【1 2 】。我们在国内外首次利用各 种层析技术分离纯化了其分泌的胞外多糖，并解析了多糖的结构，结果表明，深 海适冷菌p s e u d o a l t e r o m o n a ss p s m 9 9 1 3 分泌的胞外多糖是一个高度乙酰化的葡 萄糖聚糖，其组成和结构与目前报道的各种海洋细菌多糖都有很大差别i l 引。对该 e p s 的生态学的研究表明该e p s 对重金属具有较好的的鳌合作用、对有机颗粒物 具有较强的絮凝作用。基于此，本文系统详细的研究了该e p s 的絮凝和吸附性能 及其作用机理，为深海微生物多糖的应用奠定理论基础。 6 山东大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 微生物胞外多糖概述 1 1 1 微生物胞外多糖的定义及分类 多糖是由多个单糖或其衍生物聚合而成的大分子物质。微生物胞外多糖是指 微生物在生长代谢活动中分泌到细胞壁外的多糖或多糖混合物，它们或依附于微 生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖( c a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d e sc p s ) ；或进入培养 基或环境形成粘液，称为粘液多糖( s l i m ep o l y s a c c h a r i d e s ，s p s ) ，它们均是微生物 自身适应于环境的产物【1 4 】。胞外多糖是相对于胞壁多糖和胞内多糖而言的，胞外 多糖和胞内多糖的组成及结构比较恒定，但胞外多糖的组成和结构变异大，性能 各异，特别是粘液多糖，易与菌体分离，因而很多具有工业应用价值i l 引。 根据多糖分子结构的组成不同分为同型多糖( h o m o p o l y s a c c h a r i d e ) 和异型多 糖( h e t e r o p o l y s a c c h a r i d e ) 。同型多糖结构中只有一种单糖单位构成，如葡聚糖、 硬结葡聚糖( s c l e r o g l u c a n ) 、凝乳胶、纤维素( c e l l u l o s e ) 及茁霉多糖等；异型多糖 是在多糖的每个糖单位中有两种或两种以上单糖单位构成，如海藻酸盐、黄原胶、 结凝胶及透明质酸等。微生物胞外多糖又分为中性杂多糖、酸性杂多糖和含氨基 杂多糖三类。酸性杂多糖为多聚阴离子，通常含有糖醛酸残基以及含有甲酸、乙 酸、丙酮酸、丙二酸、丁二酸等酞化残基，多数微生物胞外多糖都属于这类多糖。 含氨基糖的聚糖链，很少存在自由氨基，常见的是乙酞化的氨基糖残基【l6 】。 1 1 2 微生物胞外多糖的生理功能 微生物多糖通常是复杂的，具有不同成分和不同结构，在生物作用上也不尽 相同。它们的作用大致可分为以下几个方面： 1 保护作用：在微生物细胞周围形成亲水表面防止细胞干裂；鳌合重 金属离子防止被其毒害；防止噬菌体的侵噬；防止抗菌素破坏，抗菌素必须 在胞外多糖中达到饱和以后才能到达细胞壁；作为氧扩散屏蔽，防止高氧张力。 2 储备碳源：胞外多糖可作为储备碳源在需要时被微生物利用。但有些微 生物不能分解自身合成的胞外多糖，在混和培养时则能为其它微生物所利用。 3 致病性：有些胞外多糖在微生物的致病性上发挥重要作用，产胞外多糖 7 山东人学硕十学位论文 的细菌绝大多数是植物、动物和或人的致病菌【1 7 1 ，但有些丧失产胞外多糖能力 的变种也失去致病性。但胞外多糖单独并不足以致病，也不是微生物致病的必要 条件。事实上，很多无害的微生物也产胞外多糖f 1 8 】。 4 粘合作用：胞外多糖将菌体及菌体与其它物质粘接起来，有利于协调微 环境。 5 识别作用：一般来说，专门侵害夹膜菌的噬菌体通常有夹膜专一性，无 夹膜突变子能抵抗该种噬菌体的侵入。噬菌体首先识别并吸附到特异多糖分子 上，随后分泌内切酶打开糖链，便于噬菌体与胞壁多糖的识别19 1 。 6 营养物转移：胞外多糖通常含有糖醛酸，可从环境中提取出用于交换的 有机离子或无机离子，从而在细胞附近保持适宜浓度的矿物质和其它营养物 2 0 - 2 1 o 1 2 微生物胞外多糖的应用 微生物外多糖因其独特的功能特性，如粘稠性、凝胶性、乳化性、成膜性、 以及良好的稳定性，其应用的领域相当广泛。应用于食品工业可作为粘合剂、凝 胶剂、乳化剂、成膜剂、稳定剂、增稠剂、保水剂、填充剂、悬浮剂等，用于改 善食品的加工工艺及提高产品质量；应用于医药工业可作为药品加工成型及加工 助剂。应用于石油工业，提高出油率；应用于农业，改善土壤结构；在日用轻工 业方面，用于洗涤剂、护扶品和化妆品，以及作为纺织、印刷助剂；用于环境保 护方面如污水处理、治理沙漠；微生物多糖在实验室及生物工程方面也有重要应 用，如结凝胶可替代琼脂作为固体培养基胶凝剂，葡聚糖作为色谱柱填料及大分 子改性剂等。 我国微生物胞外多糖产业起步较晚，但发展迅速，从5 0 年代开始，中科院、 国家教委、轻工业部、化工部、国家医药管理局等单位所属的研究所、高校和企 业对黄原胶的研究已开始有所研究成果，并分别通过中试鉴定，陆续转化为工业 生产，开发出黄原胶、短梗霉多糖1 2 2 - 2 3 】、小核菌多糖2 4 。2 5 1 、产粘短杆多糖，海 藻酸盐【2 7 1 等多糖产品 “六五”、“七五”两个五年计划的技术攻关，先后有三个微生物多糖产品 通过了中试科技成果鉴定【2 8 1 。在应用方面，除食品工业外，黄原胶用于钻井采油、 陶瓷制造、灭火液取得了较好的效果。短梗霉多糖与其它防腐剂并用，在水果保 山东大学硕卜学位论文 鲜方面取得满意的结果。 ，从上个世纪9 0 年开始，微生物胞外多糖作为生物絮凝剂和吸附剂在环境中的 应用逐渐成为研究热点。 1 3 微生物絮凝剂的研究和应用 常用絮凝剂主要包括三大类：无机絮凝剂如铝盐、铁盐和无机高分子絮凝剂； 有机絮凝剂如聚丙烯酰胺( p a m ) 和聚乙烯亚胺；天然絮凝剂如海藻酸钠( s o d i u m a l g i n a t e ) 和微生物絮凝剂。其中，铝盐絮凝剂的使用通常会引起水中铝含量的 升高，铝是人体不需要的一种元素，是低毒物质。最近的流行病学、神经病学和 生物化学研究均显示铝对人体的神经毒害作用很可能引起老年痴呆症【2 9 3 0 1 。铁盐 絮凝剂的价格较高，且过量的铁会使水的色度和嗅味增加，并引起管道的腐蚀。 人工合成的有机絮凝剂使用非常广泛，但它不易被生物降解并且分解的单体如丙 烯酰胺对神经有毒害作用甚至有致癌的可能性剐。正是由于上述絮凝剂的不足， 微生物絮凝剂特别是微生物在生命活动中分泌的生物高分子成为了可能取代或 辅助传统絮凝剂的另个选择。 1 3 1 微生物絮凝剂的定义 微生物絮凝剂( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t s ) 是利用生物技术，从微生物或其分泌物 中提取、加以纯化而获得的一种安全、高效、且能自然降解的新型水处理剂【3 2 】。 一般由糖蛋白、多糖、纤维素、蛋白质、d n a 和聚氨基酸等高分子物质构成， 分子中含有多种官能团，能使水体中的胶体和悬浮颗粒相互凝聚、沉淀，从而改 良水质。微生物絮凝剂具有絮凝范围广、絮凝活性高、安全无害、无二次污染等 特点，因此越来越受到关注，成为当今世界絮凝剂方面研究的主要对象。 1 3 2 微生物絮凝剂的种类和结构特征 根据近些年对微生物絮凝剂的研究与报道【3 3 】，可把它分为4 大类： 1 从微生物细胞壁提取的絮凝剂，如酵母细胞壁葡聚糖、蛋白质和n 乙酞 葡萄糖胺等成分均可作絮凝剂使用。 2 从微生物细胞代谢产生絮凝剂，这类絮凝剂主要是细菌的荚膜和粘液质， 其主要成分为多糖及少量的多肤、蛋白质、脂类及其复合物等。 3 直接利用微生物细菌作为絮凝剂，如某些细菌、霉菌、放线菌和酵母等， 9 山东火学硕十学位论义 它们大量存在于土壤、活性污泥和沉积物中。 4 。利用克隆技术所获得的絮凝剂。这类絮凝剂是用基因工程技术和现代分 子生物学，把高效絮凝基因转移到便于发酵的菌中，构造高效遗传菌株，克隆絮 凝基因能在多种降解中产出有效的微生物絮凝剂。 近年来，国内外的研究者借助各种技术和手段对多种絮凝剂的组成和结构进 行了表征。刘紫鹃硎等研究表明絮凝齐i j b p 2 5 的主要成分是多糖类物质，胡筱敏【3 4 】 等研究表明絮凝剂m b f 9 主要分子量超过2 0 0 万，是线型高分子，含1 9 1 糖醛酸、 2 7 4 氨基酸和4 7 4 中性糖。y o k o i 等【3 5 1 研究发现絮凝剂p y 9 0 主要成分为聚合 谷胺酸。p r a s e r t s a n 【3 6 1 等发现e n t e r o b a c t e rc l o a c a ew d 7 所产絮凝剂的主要成分是酸 性杂多糖，含2 9 4 的中性糖，1 4 2 的糖醛酸和0 9 3 的氨基酸。此夕b s u h 3 7 1 等， k u r a n e 禾1 m a t s u y a m a d 8 1 ，y o k o i 3 5 ，3 9 】等，k u r a n e 和n o h a t a 【4 0 1 ， s a l e h i z a d e h 4 1 】等所 研究的微生物絮凝剂的主要成分均为多糖类物质，只是所含的具体成分及含量不 同。也有许多研究表明微生物絮凝剂的主要成分除了多糖还含有蛋白质、脂肪、 糖蛋白等 3 8 , 4 2 - 4 3 1 ，但几乎都是以多糖为主，通过硫化等方式将脂肪酸、蛋白绑定 在糖链上。由此可见多糖在微生物絮凝剂中的重要作用。 1 3 3 微生物絮凝剂的絮凝机理 1 吸附架桥 l a b i l l e 等】通过研究不同的酸性多糖的絮凝能力发现：加入的金属盐减弱了 多糖与胶体颗粒的静电排斥作用，多糖上正电荷量，特别是其在多糖上的分布位 置决定了架桥作用的大小和聚合物的张力( 多糖上正电荷之间的静电斥力使得链 条伸展开) 。另外，羟基可以提高多糖的絮凝效果。该研究还测定了不同p h 值 下多糖的絮凝能力，结果表明：酸性多糖通过在粘土小板的两性表面上发生的静 电作用而吸附，而中性多糖则通过弱静电作用发生吸附。聚合物表面强烈的反应 可增加絮体的粘性，从而增加了多糖在水溶液中的伸展度，为架桥提供了条件。 微生物絮凝齐i m b f a 9 4 5 】中含有较多的羧基和具有较大的分子量是其具有较 强絮凝性的主要原因。其产生的的作用如下：絮凝剂分子中一0 h 、- - c o o h 、 c o o 一等基团与颗粒表面的h + 、o h 一以氢键产生点吸附。絮凝剂m b f a 9 含有 高于一般微生物多糖的糖醛酸( 1 9 1 ) ，由于一c o o 一基的静电斥力作用，一方 面使得分子链具有较好的伸展性，另一方面使m b f a 9 水溶性增强，这都有效地 1 0 山东人学硕一j ：学位论文 发挥了吸附架桥的作用。 微生物絮凝齐u c b f 4 6 】为多糖物质，含有一c o o 一和一c 0 0 h ，通过z e t a 电位 测定及氢键和离子键检验并利用原子力显微镜观察，其絮凝机理为：通过搅拌作 用、布朗运动及范德华力作用下克服排斥力使c b f 与颗粒相互靠近，絮凝剂大分 子借助于离子键同时吸附多个无机或胶体颗粒，并在颗粒间产生“架桥”现象， 形成一种三维网块结构沉淀下来。 综上所述，可以认为，多糖类生物絮凝剂的的絮凝机理为吸附架桥。羟基、 羧基或氨基等活性基团与颗粒以氢键、离子键结合是发生絮凝作用的关键。生物 絮凝剂的分子量越大，在水中伸展性越好，絮体之间相互架桥作用就越强，最后 形成网状结构而下沉。其中，搅拌作用、温度、p h 值和离子强度等都是影响絮 凝过程的因素。 2 电中和作用 污水中胶体粒子的表面通常带有负电荷，当带正电荷的链状生物大分子絮凝 剂或其水解产物靠近胶体表面或被吸附到颗粒表面上时，将会中和颗粒表面上的 一部分负电荷，减少静电斥力，从而使胶体间能发生碰撞而凝聚，当胶粒足够大 时，因重力的作用就会沉降下来。而大多数的生物絮凝剂由糖类物质组成，呈负 电性，所以电中和作用在絮凝过程中起的作用比较小，但却不能忽视。通常在絮 凝过程中加入助凝n c a ：+ ，压缩双电层，或调节p h 值减少生物絮凝剂和胶体颗粒 之间的静电斥力，从而实现凝聚。 3 “化学反应”机理 生物大分子中某些活性基团与被絮凝物质相应的基团发生了化学作用，聚集 成较大分子而沉淀下来，通过对生物大分子改性、处理，使其添加或丧失某些活 性基团，其絮凝活性就大受影响。有学者认为这些絮凝剂絮凝活性大部分依赖于 活性基团。温度影响絮凝效果，主要是通过影响其化学基团活性从而影响其化学 反应的。 4 卷扫作用 形成微粒絮凝的絮凝剂在重力作用下的沉降过程中，犹如一个过滤网下降， 迅速卷扫水中胶粒产生沉淀，卷扫作用基本是一种机械作用。 上述4 种絮凝机理学说，分别从不同角度考虑，都只能部分地解释微生物絮 山东人学硕十学位论文 凝剂的絮凝现象，其实生物絮凝过程是非常复杂的，通常是综合了吸附架桥、电 中和、卷扫等作用。 1 4 微生物吸附剂 1 4 1 生物吸附剂和生物吸附 在重金属生物吸附剂的材料选型中发现，一些微生物对重金属有很强的吸附 作用，所以常把微生物体作为重金属生物吸附剂的首选材料。目前运用最多的是 细菌、真菌和藻类。 通常所说的生物吸附仅指失活微生物的吸附作用，而微生物活细胞去除金属 离子的作用一般称为生物累积。因此生物吸附过程不包括生物的新陈代谢作用和 物质的主动运输过程1 4 7 1 。生物吸附主要是生物体细胞壁表面的一些具有金属配位 能力的基团起作用，如巯基、羧基、羟基等基团。这些基团通过与吸附的金属离 子形成离子键或共价键来达到吸附金属离子的目的。与此同时，金属有可能通过 沉淀或晶体化作用沉积于细胞表面，某些难溶性金属也可能被胞外分泌物或细胞 壁的腔洞捕获而沉积【4 8 】。 1 4 2 生物吸附的原理 微生物吸附的原理包括：( 1 ) 离子交换原理；( 2 ) 表面配合原理；( 3 ) 无机微沉 淀原理；( 4 ) 氧化还原原理。 离子交换原理：离子交换是指细胞物质结合的金属离子被另一些结合能力更 强的金属离子代替的过程。 表面配合原理：这一机理已得到了试验证实。t e s z o s 4 9 1 等研究了非活性少根 根霉对钍和铀的吸附。他们通过电镜和x 一射线能谱仪分析发现，吸附铀后的细 胞壁上存在某种物质，而他们在细胞内部和吸附前的细胞壁上并不存在。当生物 体暴露在金属溶液中时，首先与金属离子接触的是细胞壁，细胞壁的化学组成和 结构决定着金属离子与它的相互作用特性。通常微生物的细胞壁由聚糖、蛋白质 和酯类组成，这些组成中可与金属离子相结合的主要官能基团有羧基、磷酰基、 羟基、硫酸酯基、氨基和酰胺基等。 无机微沉淀原理：重金属离子能在细胞壁上或细胞内形成无机微沉淀，它们 以磷盐、硫酸盐、碳酸盐或氢氧化物等形式通过晶核作用在细胞壁上或细胞内沉 1 2 山东人学硕：卜学位论义 淀下来。 氧化还原原理：变价金属离子有可能发生氧化还原反应。 1 4 3 多糖在生物吸附中的作用 多糖广泛存在于细胞壁内外，含有大量负电性配位基( 羧基、羟基或巯基) 对重金属的吸附有着很重要的作用。李志勇1 5 0 等人对藻类富集微量元素的研究发 现：藻类细胞中含有丰富的多糖，对微量元素的富集起着重要作用，尤其是其中 的海藻酸盐与硫酸多糖是富集的主要载体。藻类多糖生物吸附微量元素的机理是 络合基础上的离子交换机制。如今，国内外特别是国外十分关注对生物吸附的研 究，采用了多种生物吸附剂研究生物吸附的条件优化、吸附机理等，为其工业化 应用奠定理论基础。多数研究肯定了多糖在吸附过程中的作用，但单纯研究多糖 对总金属吸附的很少，国内仅见康春莉等剐进行了自然水体生物膜胞外多糖吸附 铅和隔的研究。 1 5 深海适冷菌p s e u d o a l t e r o m o n a ss p s m 9 9 1 3 简介 迄今为止，人们研究的大多数产多糖微生物都来自于土壤、污泥或自然水体， 海洋特别是深海微生物由于采集困难，分离培养难度较大，国内外的研究相对较 少。深海环境由于终年低温，存在着一个低温生态系统，包括多种低温动物和微 生物。深海低温生物经过长期的进化适应，有着适应低温环境的特殊结构与代谢 机制，它们所产生的多糖比生长在中温下的微生物产生的多糖更能适应低温含盐 的恶劣条件【1 2 】。 极端环境下微生物的生长特性及其适应极端环境的机制是目前微生物学研 究的热点。适冷菌是极端微生物之一，是指一群生活在永久低温环境下的细菌， 分为嗜冷菌( p s y c h r o p h i l e s ) 和适冷菌( p s y c h r o t r o p h i l e s ) 两大类，它们都能够在0 * c 下正常繁殖生长，前者的最适生长温度都在1 6 以下，后者的最适生长温度可在 1 6 上。嗜冷菌只能生长在2 0 以下的低温环境中，而适冷菌对温度的适应范围 则要广一些【5 2 。5 3 1 。 深海适冷菌p s e u d o a l t e r o m o n a ss p s m 9 9 1 3 为山东大学微生物技术国家重点 实验室从深海淤泥中分离得到，深海泥样由中国科学院海洋研究所地质研究室用 科学一号考察船采自日本冲绳槽海域2 5 d5 6 n ，1 2 5 0 0 9 e ，深度为1 8 5 5 米的海底。 该菌株最适生长温度为1 5 ，能够大量分泌蛋白酶或多糖，并在1 0 3 0 之 山东大学硕i ：学位论文 间随温度降 k 毛e p s 的分泌量大幅升高。利用分子筛层析、离子交换层析和h p l c 等技术对该菌分泌的胞外多糖进行了分离纯化，等到纯的多糖之后，由美国t h e o h i os t a t eu n i v e r s i t y 的d e p a r t m e n t so fb i o c h e m i s t r y & c h e m i s t r y 的p r o f e s s o rp e n g g e o r g ew a n g 的实验室利用质普和核磁共振等技术对多糖的结构进行了解析。结 果表明，p s p s m 9 9 1 3 分泌的胞外多糖是一个高度乙酰化的葡萄糖聚糖。其结 构与来自于热液口等其它区域的胞外多糖明显不同，它不含有在其它海洋细菌胞 外多糖中普遍存在的糖醛酸，分子量为4 x 1 0 4 d a ，远远小于热液口来源的胞外多 糖。虽然在其它南极或海冰细菌女i l c a m 0 2 5 和c a m 0 3 6 等细菌产生的胞外多糖中 也发现了乙酰化基团的存在，但是在海洋细菌胞外多糖结构中含有如此丰富的乙 酰化基团，到目前为止此胞外多糖是第一个发现【1 3 】，而其它热液口细菌的胞外多 糖不含或含有很少的乙酰基f 6 】。高度乙酰化的多糖结构能够改变多糖分子的定性 性和横向次序，从而改变多糖的物理性质；乙酰基的引入使多糖分子伸展变化， 最终导致多糖羟基基团的暴露，增加其在水中的溶解性，从而达到提高其生物活 性的效果。同时大量负电性乙酰基的存在和胞外多糖的粘稠性有助于菌体将海水 中的蛋白颗粒和一些金属离子吸附到细胞表面，维持菌体在寡营养环境中的生 存。正是由于该多糖的独特结构及其在p s p s m 9 9 1 3 适应深海低温、寡营养、不 断流动的极端环境中所起的重要生态学功能，我们推测在陆地类似的极端环境如 低温含盐废水中，该多糖也能较好的吸附胶体颗粒及金属离子，从而到达净化污 水的效果。 1 6 本文主要研究内容及创新之处 主要研究内容 1 、e p s 絮凝效果一一烧杯试验 ( 1 ) e p s 模拟水样处理效能：考察e p s 在不同温度和盐度的高岭土模拟水样中 的絮凝活性，同时考察包括温度、盐度、p h 和不同金属离子的加入对最佳投药 量和絮凝效果的影响； ( 2 ) e p s 与硫酸铝( a 1 2 ( s 0 4 ) 3 ) 在低温含盐高岭土模拟水样中的絮凝活性比 较； 2 、e p s 的电性、形貌和粒度分析及机理讨论 ( 1 ) z e t a 电位或电泳仪测定e p s 的电性； 1 4 山东人学硕= 卜学位论文 ( 2 ) 粒度测定仪在线监测絮凝过程中的颗粒粒度变化； ( 3 ) 机理分析讨论：针对e p s 高度乙酰化的特点，借鉴甲壳素脱乙酰的方法， 对该e p s 进行脱乙酰，对比脱乙酰前后的絮凝活性，考察大量乙酰基的存在对e p s 絮凝活性的影响； 3 、e p s 的热稳定性及其存储方式的选择 4 、e p s 重金属的吸附效能 ( 1 ) 考察温度、多糖浓度、吸附时间、共存离子等对e p s 吸附性能的影响； ( 2 ) e p s 对重金属离子的吸附热力学研究及吸附性能的初步探讨。 本论文的创新之处在于首次将深海适冷菌分泌的胞外多糖应用到水处理中， 根据该e p s 独特的结构对它的絮凝效能和吸附性能进行了探索性研究，考察了 e p ss m 9 9 1 3 在低温和或含盐模拟水样中的絮凝活性，为低温含盐废水的处理提 出了新思路、新方法，并对e p ss m 9 9 1 3 进行官