（环境科学专业论文）光谱分析在蛋白质和药物分析中的应用.pdf

曲南大学硕士学伊论文a b s t r a c t a p p l i c a t i o n so fs p e c t r o s c o p i cm e t h o d s i n p r o t e i na n dp h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s e n v i r o n m e n ts c i e n c ep o s t g r a d u a t ex i a ow e is h e n s u p e r v i s o rp r o f e s s o ry u a nf a n gl ia n dc h e n gz h ih u a n g a bs t r a c t i nt h i sp a p e r , w ei n v e s t i g a t e dt h ea p p l i c a t i o n so fr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n ga n df l u o r e s c e n c e s p e c t i u mm e t h o d si nt h ef e l do f b i o c h e m i s t r yr e s e a r c ha sf o l l o w s ： f i r s t l y , t h ef o r m a t i o no fa un a n o p a r t i c l e s ( a ur e s ) a sar e s u l to ft h et h e r m o - a c t i v er e d o x r e a c t i o no fc h l o r a u r i ca c i d ( h a u c h ) a n dg l u c o s ei na l k a l i n em e d i u mw a si d e n t i f i e db ym e a s u r i n g r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) s i g n a l s ，t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) i m a g e sa n dt h e i r a b s o r p t i o nb a n d s i tw a sf o u n dt h a tt h er e s u l t e dr l ss i g n a l sc o u l db ee a s i l yd e t e c t e dw i t hac o m m o n s p e c t r o f l u o m m e t e r w 岫i n c r e a s i n gg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n s t h er l si n t e n s i t yd i s p l a y sl i n e a r r e s p o n s ew i t ht h eg l u c o s ec o n t e n to v e rt h er a n g ef r o m2 0t o2 5 0 0t t t m o l l t h u s ，an o v e la s s a yo f g l u c o s ew a se s t a b l i s h e dw i t ht h el i m i t so fd e t e r m i n a t i o n ( 3 口) b e i n go 2 1 p m o l l , a n dt h e d e t e c t i o n o fg l u c o s ec o u l db em a d e e a s i l y i nt h es e r n ms a m p l e so fd i a b e t e ss u f f e r e r s m e c h a n i s m i n v e s t i g a t i o n ss h o w e dt h a tt h ea c t i v a t i o ne n e r g ya n dm o l a rr a t i oo f t h er e a c t i o nw e r e3 4 8k jm o la n d 3 ：2 ，r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e ，w ef o u n dt h a tt r y p t o p h a nc a t r e a c tw i t hh a u c ha l s o , a n dp r o d u c ta u n a n o p a r t i c l e s ，w ec h o s em o r et h a n1 0k i n d so ff a m i l i a ra m i n oa c i d s ，a n do n l yt r y p t o p h a nc a nr e a c t w i t hh a u c hi nt h ec o n d i t i o no f p h1 9 8 ，a c c o r d i n g l y , w ee s t a b l i s h e dan e wm e t h o do f t r y p t o p h a n a s s a y , a n di t sl i n e a r r a n g ei s0 2 1 - 6 0 im m o l l ，l i m i t o f d e t e c t i o ni s2 1 3l a m o l l a r a p i da n ds e n s i t i v em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n si sp r o p o s e db a s e do ne n h a n c e d r e s o n a n c e l i g h ts e a a e d n gs i g n a l sb y an e ws c h i f fb a s e d y e ，w h i c hw a ss y n t h e s i z e db y o - p h t h a l a l d e h y d ea n ds u l f a n i l i ca c i d o nt h ea c i d i cc o n d i t i o n ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e s c h i f f b a s ed y ea n dp r o t e i n so c c u r sr a p i d l y , r e s u l t i n gi ng r e a t l ye n h a n c e dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gs i g n a l s w i t ht h em a x i m u mp e a kl o c a t e da t3 4 4 0n m b a s e do nt h el i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e ne n h a n c e d r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g i n t e n s i t u e sa n dp r o t e i n sc o n c e n t r a t i o n s ，an o v e l 西南大学硕十学伊论文 a b s t r a c t a s s a yf o rh s aa n db s ai se s t a b l i s h e dw i t ht h el i m i t so fd e t e c t i o n ( 30 ) b e i n go 0 9 1 0 1 m o l l a n d 2 5 0 1 0 4m o l lr e s p e c t i v e l y a sr e s u l t so fo u rr e s e a r c hw e f ec o n s i s t e n tw i t ht h ed o c u m e n t e d s p e c t f o p h o t o m e t r i c ( c b bg 2 5 0a s s a y ) m e t h o d ，w eb e l i e v et h a tt h ep r o t e i nc o n t e n to ft h es g r u m s a m p l e sc a nb es u c c e s s f u l l yd e t e c t e db yt h ed e v e l o p e dm e t h o d an o v e lf l u o r e s c e n ta s s a yf o rc a p t o p r i lb a s e do i lt h ec h e m i c a lr e a c t i o nb e t w e e nc a p t o p d la n d o - p h t h a l a d e h y d ei nt h ep r e s e n c eo fi s o l e u c i n ew a sp r o p o s e di nt h i sp a p e r t h er e s u l t e di s o i n d o l e g r o u pd i s p l a y sc h a r a c t e r i z e df l u o r e s c e n c es i g n a l sa t4 5 2 0n u lw i t ht h ee x c i t a t i o no f3 4 0 0n u l ，a n d s u c he n h a n c e df l u o r e s c e n c ee m i s s i o ni sl i n e a rw i t hc a p t o p d lc o n c e n t r a t i o n so v e rt h er a n g eo f 5 0 - 1 0 0 0 0n m o l l w h i l et h el i m i to fd e t e c t i o ni so 6 8u m o l l t h ep r o p o s e dp r o c e d u r ew a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no f c a p t o p r i li ni t st a b l e t sw i t hr e e o v e d e so f 9 0 5 9 6 8 a n dh u m a nu r i n es a m p l e sw i t hr e c o v e d e so f 9 5 3 1 0 4 9 k e y w o r d s ：g l u c o s e ；t r y p t o p h a n ：o - p h t h a l a l d e h y d e ；s u l f a n i l i ca c i d ；c a p t o p r i l 1 1 1 西南大学硕十学位论文 缩写符号对照表 缩写符号对照表 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者：诗莲名签字日期：炒厂年6 月日 ili 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者签名： 签字日期：砂年 学位论文作者毕业后 工作单位： 通讯地址： 去向： 导师签名： 日 签字日期： 。森隧 j 司年；目中b 邮编： 两南大学硕十学侍论文第一章绪论 第一章绪论 随着社会的进步，物质生活水平的不断提高，人们越来越关注自身健康，与 健康密切相关的生化药物，已成为全世界普遍关注的热点。同时，建立准确、快 速简便、灵敏度高的生化药物检测方法就具有非常重要的意义。目前所开发出的 方法主要有化学法、光谱法、薄层色谱法、化学发光法、单极扫描示波谱法、免 疫分析法、生物传感器法、气相色谱法、高效液相色谱法和气质联用法等。其中， 光谱分析是分析化学的一个重要分支，已成为生化药物研究的重要手段。本文主 要介绍光谱分析法，如紫外可见分光光度法、荧光分光光度法和共振光散射等在 蛋白质以及药物分析中的应用。 1 1 光谱分析在葡萄糖测定中的应用 葡萄糖是人体中的重要组成物质，其浓度的高低对身体的健康有着重大影响。 当前无创测量血糖浓度的方法主要分为两大类，即电化学法【l 巧1 和光谱分析法。 1 1 1 荧光分光光度法 目前荧光检测法在葡萄糖检测中的应用主要有以下6 种： 1 基于硼酸的荧光传感器检测法 该类传感器是由硼酸受体和荧光团通过化学作用而合成的。由于葡萄糖分子 中的o h 可与传感器中的硼酸阴离子形成2 个共价键而形成一个环状的硼酸酯， 使荧光团的电子或空间状态发生改变，从而使荧光强度改变 6 1 ，根据其改变量可 以间接测定葡萄糖的浓度。 2 葡萄糖氧化酶荧光检测法 最简单的葡萄糖荧光传感器就是建立在葡萄糖氧化酶自身荧光基础上的。 g a l b a n 7 1 等发现葡萄糖氧化酶中的色氨酸具有一定的荧光激发信号，同时葡萄糖 浓度与此荧光强度之间存在一定关系，因此，通过测定体系反应后的荧光强度来 对葡萄糖进行定量分析。 3 糖激酶荧光检测法 己糖激酶也是一种蛋白质，自身可以发射荧光，在催化氧化葡萄糖的过程中， 它的结构会发生变化，因而导致荧光猝灭【引。基于此，可以根据荧光信号的猝灭 程度来对葡萄糖进行定量分析。 4 伴刀血球蛋白荧光检测法 1 眄南大学硕十学伊论文第一章绪论 伴刀血球蛋白是( c o n a ) 一种能够与糖类结合的蛋白质，也是一种用来研究各 种葡萄糖的传感器。通常该类传感器都是由葡聚糖和c o na 组成。c o na 与右旋 糖苷( d e x t r a n ) 作用，缩短了荧光共振能量转移供体和受体之间的距离，使荧光强度 减少。由于被测体系中的葡萄糖也可与c o n a 发生相互作用，构成了葡萄糖和葡 聚糖与c o n a 的竞争作用，减弱了c o n a 与右旋糖苷相互作用，供体和受体之间的 距离拉大，从而使荧光强度增大【9 。】。 5 氧气敏感荧光团间接荧光法 在葡萄糖氧化酶的催化作用下，葡萄糖不断被氧化，被测体系中0 2 的含量逐渐 减少，对氧气敏感荧光团的荧光信号就会发生改变，通过测量荧光强度的改变量 可以间接测定葡萄糖的浓度 1 2 l 。 6 h 2 0 2 辣根过氧化物酶荧光检测法 葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成过氧化氢，由于在辣根过氧化物酶及其 模拟物催化作用下，h 2 0 2 氧化荧光底物既可以增强荧光强度【1 3 1 6 1 ，也可以猝灭荧 光 1 1 9 】，因此，通过测量体系反应前后荧光强度的改变来间接测定试样中葡萄糖 的含量。 1 1 2 紫外一可见分光光度法 由于葡萄糖自身没有发色基团，所以如果要用分光光度法对其进行测定，必 须先用显色剂将其衍生，方法如下： 1 铁邻菲罗啉显色体系 利用该方法检测葡萄糖的原理是：在碱性条件下，先用葡萄糖将a g + 还原为 a g ，再用生成的a g 将f e 3 + 还原为f e 2 + ，f e 2 + 在p h4 5 的介质中能与邻菲罗啉反应 形成桔红色络合物，在5 1 0 0n n l 波长处有一最大吸收 2 0 1 。 2 钼类杂多酸显色体系 钼类杂多酸与葡萄糖在适当条件下能有显色反应，其吸光度与葡萄糖浓度呈 线性关系口1 1 。该法的操作简便，但灵敏度不够高。 3 氨基偶氮苯显色体系 根据文献报道，以氨基偶氮苯氨基偶氮苯作为显色剂，用分光光度法可以定 量地检测葡萄糖的含量。同时，试验证明，本方法具有试剂简单，操作方便，发 色时间短，稳定性好等特点【2 2 1 。 2 两南大学硕士学付论文第一章绪论 4 4 - 氨基氨替比林偶联酚显色体系 根据文献，葡萄糖分子在葡萄糖氧化酶催化下，生成葡萄糖酸和过氧化氢。过 氧化氢能与试剂中的过氧化物酶反应并放出氧，在氧的作用下，还原型显示剂4 氨基氨替比林偶联酚会被氧化并与4 氨基氨替比林结合，生成红色醌类化合物， 通过测量吸收峰的改变值，即可测出葡萄糖浓度【2 3 1 。 1 1 3 共振光散射法 在浑浊介质中，散射特性取决于散射粒子和溶液的折射率的相对大小。在葡 萄糖溶液中，如果散射粒子和溶质的折射率大小差别越小，由葡萄糖浓度溶液所 引起的折射率差别就越小，那么，由葡萄糖浓度变化引起的浑浊介质散射系数的 变化越显著。b r u u l s e m a 等 2 4 2 刀便是利用这种方法，讨论了散射系数与葡萄糖浓度 之间的关系。此外，有文献报道，当被c o na 和右旋糖苷包被的金纳米粒子遇到葡 萄糖时【2 引，由于c o na 更容易和葡萄糖反应，它会从金纳米粒子上脱落，此时，金 纳米粒子的共振光散射信号就会发生改变，因此可用于葡萄糖的定量测定。该方 法不但克服了传统酶法测定葡萄糖时稳定性不好的弱点，同时还表现出了很宽的 线性范围。 1 2 光谱分析在氨基酸测定中的应用 氨基酸含量的测定是生命科学研究和化学研究中都是常见的测定项目。目前， 氨基酸的测定方法主要有光谱法、色谱法口9 捌1 和电化学法 3 9 - 4 2 1 等。 1 2 1 荧光分光光度法 目前，采用荧光光度法测定氨基酸的方法主要是邻苯二甲醛( o p a ) 衍生法： 即o p a 在p - 巯基乙醇( p - m c e ) 存在的条件下能与游离氨基酸迅速反应生成1 一硫代 2 烷基异吲哚，此生成物具有荧光，从而利用荧光光度法测定氨基酸含量。由于灵 敏度很高，目前，该方法已被广泛用于氨基酸的测定h 3 卅。 1 2 2 紫外可见分光光度法 1 染料结合法 有文献报道，在p h = 4 4 0 的n a a e h a c 缓冲溶液中，游离氨基酸氮与乙酰丙 酮甲醛试剂产生显色反应，于波长4 2 5 0n l t l 处可测定显色产物的吸光度值0 7 1 ；同 时，在p h8 0 4 的缓冲溶液中，茚三酮与氨基酸生成蓝紫色络合物，最大吸收波 长a 。= 5 7 0 0n m ，该法也可用于高含量氨基酸的测定1 4 8 1 。 2 金属配合物法 3 两南大学硕十学位论文第一章绪论 金属氨基酸络合物在生物体内金属元素的传输和生物功能的发挥中起着极为 重要的作用，在人的血清中，可迁移的铜主要以络合物的形式存在1 4 9 j 。在铜氨基 酸络合物的光谱电化学方面已有较多的研究报道 5 0 - 5 3 1 。在模拟生理环境下 ( p h = 6 7 ，t = 3 7 士0 5 。c ) 的水溶液中，c u ( ) 能与l o 种舡氨基酸配体( l = g i y ( 甘氨酸) 、 v a l ( 缬氨酸) 、a l a ( 丙氨酸) 、l e u ( 亮氨酸) 、p h e ( 苯丙氨酸) 、s e r ( 丝氨酸) 、c y s ( 半胱 氨酸) 、g l n ( 谷氨酰氨) 、t h r ( 苏氨酸) 、h i s ( 组氨酸) ) 形成二元配合物，所得的紫外 光谱，能用于氨基酸的测定5 4 1 。与此同时，有文献报道，被誉为人体第2 1 个必需 氨基酸的硒代半胱氨酸极易氧化为它的二硒化物一硒代胱氨酸( s e c ) 5 5 j ，该物质可 与c u ( i i ) 反应生成络合物，亦可用紫外分光光度计进行定量检测1 5 6 j 。 1 2 3 共振光散射法 近年来，有研究发现，具有生物活性的含硒、含硫氨基酸能与a u ( i i i ) 相互作 用生成具有较强共振光散射信号的纳米硒、硫、金以及金配合物或金缔和物，共 振光散射技术也随之成为氨基酸检测以及纳米制备领域中的研究热点【5 7 5 8 】。文献 表明，在适宜条件下，硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸都能与三氯化金反应生成单质金 和单质硒；含硫氨基酸与三氯化金形成配合物在3 9 8 0n l l l 处出现最大散射峰。同 时，随着反应物的浓度增大，散射强度也增大，所以，此法可用于这些特殊氨基 酸的检测【5 9 1 。 1 3 光谱分析在蛋白质测定中的应用 蛋白质的测定方法很多，如最早的浊度法 6 0 6 4 1 、凯氏定氮法 6 5 - 6 7 】，目前使用 最广的有荧光光度法、操作最简便的吸光光度法，以及后来发展起来的共振光散 射光谱法、毛细管电泳法 6 8 7 2 】、高效液相色谱法口3 刁7 1 和电化学法【7 2 1 等。 1 3 1 紫外可见分光光度法 测定蛋白质常用的紫外可见分光光度法主要包括双缩脲法【8 3 】、劳里法1 8 4 】、 喹啉甲酸法及染料结合法 8 5 - 9 5 】。其中，用得最广泛的便是染料结合法，它的稳定 性、简便性和精密度都优于前几种方法。被应用的染料的种类主要有偶氮类、三 苯甲烷类、羟基葸醌类、酸性咕吨类等。但因紫外可见分光光度法在灵敏度方面 的局限性，后来逐渐被荧光光度法和共振光散射法所取代。 1 3 2 荧光分光光度法 荧光法是一种常用的定量测定蛋白质的方法，它的灵敏度高于紫外可见分光 光度法，因此用得最广泛，常用的有自身荧光法、荧光探针法以及时间分辨荧光 4 两南大学硕十学位论文第一章绪论 法等。 i 自身荧光法 由于蛋白质中存在着色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等残基，因此能够吸收 2 7 0 0 3 0 0 0n l n 的紫外光而发出荧光惭，9 7 】。此法比紫外分光光度法灵敏，且核酸 的干扰较小，来自其他小分子化合物的干扰也比较小。但是由于不同蛋白质中荧 光氨基酸残基的含量可能有很大的差别，因而定量时要选择同一种蛋白质作为标 准。 2 荧光探针法 蛋白质与某些有机荧光试剂结合以后，能引起溶液荧光强度的变化，并且在 一定浓度范围内与蛋白质的浓度成正比，据此可用于蛋白质的定量测定。同时， 该法可以分为有机荧光探针法和稀土荧光探针法。最常用的稀土荧光探针主要有 铕o i l ) 、铽( i i i ) 、钇( i i i ) 以及稀土螯和物等等【9 8 d o o j ，有机荧光染料主要有2 对甲胺 萘6 磺酸1 1 0 1 1 、i - 苯胺基萘8 磺酸【1 0 2 1 、吖啶橙1 0 3 】、血管黄素“0 4 1 、曙红y t l 0 5 ，0 6 、 耐尔纠1 0 7 、赤鲜红【1 0 8 1 、铬天青1 睁1 1 1 1 、四磺基铝酞青【1 1 2 ，n 3 】、2 - 甲基5 ( 2 ，3 ，4 - 3 甲基苯酚) 环庚三烯酬儿4 1 、3 - ( 4 羧基苯甲酰基) 奎宁2 羧基乙酰【1 1 5 1 等。 3 时间分辨荧光法 该法是依据待测组分荧光衰减特性的差异而进行选择性测定，可以消除瑞利 和拉曼散射的干扰，又可以根据荧光寿命的差异对荧光光谱重叠组分进行测定， 为复杂的荧光体系提供了选择性基础【1 1 6 1 。 1 3 3 共振光散射法 共振光散射技术是一种新兴的测定生物大分子的简便、快捷、灵敏的方法， 目前使用该法测定蛋白质所使用的试剂主要有： 1 酸性三苯甲烷类，如四苯酚磺酞【1 1 7 】、铬天青1 1 扣1 1 9 】、酸性绿0 2 0 1 等； 2 酸性咕吨染料，如溴邻苯三酚红【1 2 1 】、邻苯三酚红【1 2 2 1 等； 3 酸性偶氮类，如变色酸但偶氮染料【1 2 3 1 ，酸性铬蓝k i l l 、偶氮胂1 2 5 1 、偶氮磺 i i i 【1 2 6 1 、曲利苯蓝【1 2 7 1 、4 偶氮变色酸苯基荧光酮【1 2 8 1 、金橙g 【1 2 9 1 等； 4 其他，如卟啉类试剂3 0 l 、纳米粒子【1 3 1 1 ”1 、表面活性剂1 3 1 3 5 】等。 1 4 光谱分析在药物测定中的应用 药物分析是一门研究药物及其制剂的质量控制以及相关问题的综合性应用学 科，是药物科学的一个重要组成部分。其中，光谱分析法，因为其独有的优点， 两南大学硕+ 学位论文 第一章绪论 在药物的定量测定中得到了广泛应用。由于含巯基的药物具有的重要生理和化学 性质，近年来，该类药物的分析研究也异常活跃。下面就以它为例，简单介绍一 下其相关的检测方法： 目| j 可用于测定巯基化合物的分析方法有很多，包括紫外可见分光光度法、 荧光分光光度法、电化学法 1 3 6 - 1 4 0 1 、质谱法1 4 1 1 4 5 1 、化学发光法【1 摊15 0 1 ，以及高效 液相色谱【1 5 5 5 j 和毛细管电泳1 5 6 ，1 5 7 1 等。这些方法中，除了电化学方法和质谱法， 其他方法一般都是建立在待测物中含有发色团或荧光衍生团的基础上检测的。 1 4 1 荧光分光光度法在巯基药物测定中的应用 在含巯基药物的分析测定中，高效液相色谱法发挥了重要的作用，不过，在 通常情况下，该法还需借助一些光谱分析，如紫外或吸收光谱等手段。如：m a r t i n 等人利用丹磺酰氯将细胞组织中的氧化和还原型谷胱甘肽衍生后，将h p l c 荧光 光谱联用对其作了分析【”卅；人尿中的2 巯基丙酸也可以通过h p l c 分离，同时 采用流动注射荧光检测的方法进行定量测纠1 5 9 1 。 1 4 2 紫外可见分光光度法在药物测定中的应用 有些含巯基药物也可以采用分光光度法进行测定。t a n e j a 等人用d m s o 溶解 片剂中的巯嘌呤，然后用差示分光光度法对其直接测定，方法简便【1 椰】。r a g g i 等 人用( n h 4 ) 2 p d c l 4 作为显色剂，采用分光光度法对人淋巴细胞中的硫醇进行了测定 1 6 1 。e i d l l 6 2 1 报道了分光光度法测定药物制剂中的半胱氨酸和n 乙酰半胱氨酸； 用二硫苏糖醇为显色剂，在2 8 0 0n n l 处可以测定头发中的半胱氨酸 1 6 3 1 。紫外可 见分光光度法测定含巯基的药物虽然相对简单些，但是对于大多数硫醇来说，很 难找到有特异性的显色剂，因此在测定中会有很大的干扰，不容易分别测定各种 硫醇的单独含量。但是，当紫外可见分光光度法与其他方法联用时，这些问题就 可以得到解决了。如采用紫外h p l c 法可以成功测定尿液中的半胱氨酸和高半胱 氨酸含量【1 6 4 1 ，并且有效地排除了共存物质的干扰。 1 4 3 散射光谱法在巯基药物中的应用 该类研究中，用得最多的探针是金属纳米粒子，这是由于它们有较大的体积， 很高的摩尔吸光系数，因而非常适合为共振光散射光谱法提供探针。事实上，金 属纳米粒子在单分散的状态下就可能呈现出较强的共振光散射，这一点和分子的 共振光散射有很大不同。在金纳米粒子聚集后，由于粒子之间的相互作用，可以 导致强烈的共振光散射。根据文献报道，一些金属纳米粒子( 棒) ，如金胶和银胶， 能在巯基化合物的引导下自组装，导致其颜色及共振光散射信号发生变化，这一 6 西南大学硕七学位论文第一章绪论 现象可用于巯基化合物的测定【1 6 5 ，1 6 6 】。这种检测方法快速简便，对设备的要求低， 并且灵敏度很高。 1 5 本文研究的主要内容及拟达到的目的 综上所述，光谱分析法充分地体现了它在生化药物检测中的优越性，为进一 步拓展其应用范围，拟开展如下的一些研究： ( 1 ) 对共振光散射与荧光光谱法进行理论和实验的探索，为研究这两种分析 方法提供一些新的依据； ( 2 ) 寻找新的测定生化药物( 如葡萄糖、氨基酸和蛋白质) 的共振光散射探针， 拓展共振光散射光谱法的应用领域； ( 3 ) 以紫外吸收、荧光等光谱表征方法对药物分子( 如卡托普利) 进行定性和定 量的分析和表征，为它们在临床、生化、环境等应用领域中提供重要的理论和实 验依据。 7 两南大学硕+ 学位论文第二苹共振光散射在蛋白质以及药物中的分析麻用 第二章共振光散射在蛋白质以及药物中的分析应用 2 1 共振光散射法测定糖尿病患者血液中的葡萄糖 2 1 1 引言 多年以来，糖尿病一直困扰着人们，血糖含量的测定在糖尿病诊断和治疗过 程中具有重要的作用和意义。目前为止，已有多篇文献报道利用葡萄糖氧化酶电 化学法来检测葡萄糖含量【卜4 1 ，但是由于这种方法所使用的电极的稳定性较差，常 常给测定带来很多不便瞪1 。随后，人们又发现了其他一些方法，例如：利用葡糖糖 与右旋糖苷或者伴刀豆球蛋f l a 之间的竞争反应【6 一，利用金属纳米粒子及碳纳米 管对葡萄糖的吸附作用孵，以及流动注射法【1 0 l 等来对其进行测定，这些方法都能有 效地克服上述缺点。 近年来，金纳米粒子由于其优越的光学性质叫忉，在d n a 杂交【l s l 、免疫分析 1 9 l 、蛋白质分析1 2 0 1 ，以及纳米粒子的制备口1 1 等领域都得n t 广泛的应用。本文所 用到的方法就是先让葡萄糖和氯金酸反应生成能使r l s 信号大大增强的金纳米粒 子，然后利用普通荧光仪来测量这些r l s 信号，以达到定量检测葡萄糖的目的。 2 1 2 实验部分 1 仪器 f 4 5 0 0 型荧光分光光度计( 日本日立公司) ：用于测定荧光发光光谱和散射 光谱；u v - 3 0 1 0 型紫外可见分光光度计( 日本日立公司) ：用于测定吸收光谱； 上海仪器厂生产的恒温仪用于保持体系反应温度的恒定；7 0 6 0 型自动分析仪( 日 本日立公司) ：用于测定葡萄糖的浓度( 对照方法) ；t e c n a i1 0 型透射电镜( f e a ，美 国) ：用于测定金纳米粒子的半径；p h s 一3 c p h 数字式酸度计( 大中分析仪器厂， 上海) ；m v s 1 旋涡混合器( 北德科学仪表厂，北京) 。 2 试剂 h a u c l 4 3 h 2 0 ( 9 9 9 ) ：购于北京恒业中远有限公司；葡萄糖：北碚化学试剂 厂生产；1 0 0n ma un p s ：购于s i n o a m e r i c a n 生物技术有限公司；氯金酸 ( h a u c h 3 h 2 0 ) ：购于s i g m a 公司；试验所用试剂均为分析纯，溶液均用二次水配 制。 3 实验方法 在1 0 0m l 比色管中依次加入1 0m lb r 缓冲溶液( p h1 1 2 0 ) ，1 0m l2 0 8 西南大学硕七学f ) = 论文第二章共振光散射在蛋白质以及药物中的分析麻用 m m o l l h a u c l 4 ，1 0 0 “l1 0 0n i n a u n p s ( 1 1 0 0 0 0 ) ，一定量的葡萄糖溶液，用二次 水稀释至刻度，旋涡混合均匀，置入沸水浴加热5 分钟，用荧光分光光度计( 厶。= 五。) 进行同步扫描获得散射光谱。 4 结果与讨论 ( 1 ) 葡萄糖和氯金酸反应前后的光谱特征 从图l 中不难发现，单独的氯金酸和葡萄糖在4 2 0 0 - 7 0 0 0 a m 之间的吸收强度 都非常微弱，而反应后，在5 2 2 0 h i l l 左右出现一个明显的吸收峰，与金纳米粒子 的特征吸收峰在同一位置，为了证实溶液中金纳米粒子的存在，对其作了透射电 镜实验，如图2 所示。通过测量，可以得到当葡萄糖的浓度为4 0 u n o l l 和4 0 0 i - l m o l l 时，所生成的金纳米粒子的粒径分别为1 7 6 姗和5 9 3i l r n 。 由于反应生成的金纳米粒子在可见光区只有一个特征峰，根据文献报道2 2 1 ， 它们应该是球形的。另外，还观察到随着葡萄糖浓度的增加，其相应金纳米粒子 的的紫外吸收也随之红移，颜色也有从酒红色变到紫色的趋势【图1 ( 内嵌) 】这可 能是由于金纳米粒子粒径的增大所致1 2 3 1 。同时，从图2 中也可以得到这两个信息。 w a v e l e n g t h r m f f l 图l 体系反应前后的紫外光谱图 浓度：葡萄糖( 1 8 ，p m o v l ) , 0 0 ，2 0 ，4 0 ，6 o 8 0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，4 0 0 ；b r 缓冲溶液( p hl i 2 0 x 1 0m l ；h a u c i - 。0 2 0r e t o o l l ；a u 纳米粒子 ( 1 0r i m , 1 1 0 0 0 ) ，1 0 0 儿 图3 体系的共振光散射图 浓度：h a u c 4 ，0 2 0n m l l ；b r 缓冲溶液( p h i i 2 0 ) 1 0m l ；葡萄糖( i - 9 , 岫x0 0 ，4 0 0 ( 不 舍h a u c l 4 ) ，2 0 ，4 o 6 0 ，8 0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，4 0 0 ；a u 纳 米粒子，( 1 0r i m , 1 1 0 0 0 ) ，1 0 0 - ll ， 图3 为体系反应前后的散射光谱图，该图表明单独的葡萄糖和氯金酸的散射 信号都很微弱，但是二者反应之后，由于生成了金纳米粒子，在5 6 0 0 蛐附近出 现了一个显著增强的散射峰，而这些散射峰恰好位于其相应的吸收峰附近，有文 献报道，球形的金纳米粒子在可见光区只有一个特征吸收峰，如果这个吸收峰的 9 西南大学硕士学位论文第二章共振光散射在蛋白质以及药物中的分析应用 位置在其散射峰的附近，那么这种散射就可被称之为表面等离子共振( s p r ) 1 2 2 j ， 这表明所得的这些散射信号也被称为表面等离子共振( s p r ) 信号。 图2 金纳米粒子的t e m 图 浓度：h a u c i 0 2 0 m m o l l ；葡萄糖，4 0 “m o l l ( 左x4 0 o p m o l & ( 右) ：b r 缓冲溶液( p h i l 2 0 ) ，1 0 m l a u 纳米粒子0 0 on m , 1 1 0 0 0 ) , 1 0 0t t l ( 2 ) 反应条件的优化 p h 图4 酸度对散射强度的影响 浓度：h a u c i b0 2 0m m o l l ；b r 缓冲溶液( p h 1 1 2 0 xi o m l ；葡萄糖2 0 o x l o 5 m o l l ；a u 纳米 粒子( 1 0r i m , 1 1 0 0 0 ) , 1 0 0 l 虹僦 图5 温度对反应速度的影响 浓度：h a u c h 。o 2 0m m o l l ；葡萄糖，0 3 0m f i l ； b r 缓冲溶液( p h1 1 2 0 ) ：1 0m l ；a u 纳米粒子( 1 0 r i m , 1 1 0 0 0 ) ：1 0 0 止；温度( 1 - 3 ) ，3 6 0k3 6 6k 和 3 7 3 k 实验表明，在酸性及中性条件下这个反应是不能发生的，图4 是酸度对葡萄糖 氯盒酸体系的散射强度影响图。由图可知，h a u c h 的散射强度几乎不受酸度影响， 而当溶液的p h 高于l o 3 8 后，生成物的散射信号开始升高，最大值出现在p h1 1 2 0 ， 然后，又开始下降。因此，实验选用的酸度为p h1 1 2 0 。 同时，在不加入表面活性剂的条件下，这些金纳米粒子至少能保持1 个月稳定。 所以，实验选择不加入表面活性剂。此外，体系的反应速度和反应物的初始浓度 1 0 西南大学硕十学位论文第二章共振光散射在蛋向质以及药物中的分析应用 及反应温度密切相关，比如，当葡萄糖的初始浓度低于1 0 0 ) - l m o l l 时，如果不加 入催化剂，这个反应在常温下是很难发生的，即使用沸水浴，也很难在2 0 分钟内 反应完全。有文献报道，制备金纳米粒子时如果事先加入痕量的晶种，那么反应 速度会明显加快1 2 3 。实验证明，在反应液中加入1 0 0u l a u n p s ( 1 0 0n i n ，1 1 0 0 0 0 ) 后，即使当葡萄糖的浓度仅为2 0 m o l l 时，反应也能在五分钟之内完成，同时， 这也不会影响到反应物的散射强度。所以，最终选择加入痕量的金纳米粒子作为 晶种来催化反应。 ( 3 ) 活化能的计算 根据a r r h e n i u s 经验公式，如果一个体系的其他条件固定，只是温度在一定范 围内改变，那么它的活化能应该是一个常数。为了计算出体系的活化能，选择了 三个反应温度：3 7 3 、3 6 6 与3 6 0k 。根据文献【2 4 l 可得： 瓤争= 争百i 一去， ( 式中r 表示热力学常数，t i 和t 2 表示反应温度，t l 表示t 2 反应所需时问，e a 表示活化能) 这即是说，可以通过在不同温度下完成反应所需的时间计算出体系的活化能。 如图5 所示，在这三个温度下，若葡萄糖浓度为o 3 0m m o l l ，反应到终点时，体 系的r l s 值都大致相同，同时所需时间分别为6 0 、7 5 和9 0s 。将这三个温度两两组 合，求得体系的活化能为3 6 2 、3 3 3 和3 4 8k j m o l ，平均值3 4 8k j t o o l ，这说明该 反应需要在较高温度才能完成。 ( 4 ) 反应比例的探讨 4 咖 洲 j2 0 0 0 1 0 o j。h ： ； 01 23 41 弘们驼骗2 ，1 舛 c 女一c m m 图0 最佳反应比的探讨 浓度：h a u c t i ，0 2 0r e t o o l l ；b r 缓冲溶液( p h1 12 0 x1 0m l ；a u 纳米粒子0 0a m ，1 1 0 0 0 ) ，i o o 止 由于酸度对体系的影响较大，所以选择固定氯金酸的浓度，改变葡萄糖的浓 西南大学硕十学位论文第一章共振光散射在蛋白质以及药物中的分析商用 度来研究葡萄糖和氯金酸的最佳反应比。如图6 所示，当c - q - ：c h a u c l 4 = 3 ：2 时， 所得产物的散射强度最大，而超过此比值之后，散射强度基本不变。所以，c _ 自蕾： c h a u c l 4 = 3 ：2 为体系的最佳反应比。基于此，可以推导出葡萄糖在反应之后转化成 葡萄糖酸，这与文献1 2 5 1 所得结论一致。另一方面，正是由于葡萄糖酸上的羧基吸 附在金纳米粒子周围，使这些金纳米粒子之间相互排斥而不聚集，因而具备了良 好的稳定性。 ( 5 ) 共存物质对体系的影响 表l 共存物质的影响 a 代表m g m l ；b 代表p c r c c n t ；s d b s 表示1 2 烷基苯磺酸钠 浓度：h a u c l t0 2 0r n m o l l ；e i ) t a , 5 00 t n o l l ；b r 缓冲溶液( p h l l2 0 x 1 0 m l ；a u 纳米粒子( 1 00 l m - 1 1 0 0 0 ) , 1 0 0 止 在生化分析领域中，常见的共存物质主要是一些金属离子、氨基酸、糖类等， 为此对它们的干扰情况进行了测定。实验选择5 0 m o l l 的葡萄糖作为参照，结 果如表1 所示。 从表中可以看出，c a z + 、m g + 、b a 2 + 、n h 4 + 、k 十、e d t a 及表面活性剂的允 许量较大，而f e ”、舢3 + 、p b 2 + 和c u 2 + 的允许量相对较低，加入一定量的e d t a 后，这些离子的干扰程度就得到了大大降低。另一方面，氨基酸基本没有表现出 干扰，蔗糖和果糖有干扰，但是在人血液里一般是不存在蔗糖和果糖的，所以它 西南大学硕七学位论文第二章共振光散射在蛋白质以及药物中的分析应用 们不会影响到对血糖的检测。总的来说，以血清作为实际样品分析，上述共存物 质不会产生太大的影响，不干扰测定。 ( 6 ) 体系的线性范围及实际样品的测定 在最佳条件下，测得葡萄糖的浓度为2 0 2 5 0 0p , m o l l 时，金纳米粒子的s p r 强度与其相应的葡萄糖的浓度成正比，线性方程为：a = 2 6 + 7 5 cp ，t o o l l ) ，相关 系数r 值为0 9 9 8 4 ，检出限为0 2 1i t m o l l 。 为了考察这个方法的实用性，检测了三份糖尿病患者( 血清样品取自重庆第九 人民医院1 的血糖含量。根据文献1 2 6 l ，先用适量浓度为2 0m o f l 的三氯乙酸除去血 清中的蛋白，离心后取上层清夜，稀释1 0 0 0 倍待测。考虑到样品中可能含有一定 量的金属离子，因此加入少许e d t a 将其掩蔽。最后，使用标准加入法测定了样品 中的葡萄糖含量，并将其结果与医院的检测结果( 葡萄糖自动测定仪所得结果) 进行 了比较，如表2 所示。 表2 实际样品的