（测试计量技术及仪器专业论文）集成毛细管电泳芯片电动进样数值模拟.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 集成毛细管电泳芯片是生物分析领域出现的一种新兴的分析装置，它具有快速、高 效、节约样品和能用计算机处理存储分析结果等优点，在d n a 序列分析、d n a 片段分 离、p c r 产物分离分析及细胞分离等生物及医药领域得到越来越广泛的应用。 在集成毛细管电泳芯片的电泳分离中，首先要解决的问题就是驱动样品进入芯片内 的分离沟道，目前解决这个问题的方法是采用电动进样技术来控制样品在微沟道内的流 动模式。在样品、缓冲液以及电泳芯片的物理参数已经确定下来之后，施加在电极上的 驱动电压组合将是决定流体流动模式的主要因素。因此，通过计算机数值模拟获得不同 进样条件下的电势、速度场以及流场的分布情况，从而得知流体在微沟道内的流动情 况，既可以避免盲目的实验尝试，提高实验效率；同时也可以为集成毛细管电泳芯片的 版图设计提供有价值的参考依据。 本文首先在理论上分析了集成毛细管电泳电动迸样系统的微观模型，研究了电场力 驱动流体在微沟道内流动模式的规律；运用有限差分法建立了系统的计算机数值模型， 并用涡量一流函数法得到了模型的结果；运用有限容积法建立了系统的另一个计算机数 值模型，并用改进的压力耦合方程的半隐式法对模型进行了计算，得到了不同驱动电压 组合时微沟道内的电势、速度场和流场的分布，其中流场分布直观的给出了沟道内流体 的流动模式。利用第二种模型，模拟了进样和分离过程，从理论上总结了外加电压控制 微沟道内流体运动的一般规律，得到了适用于电动进样过程的较好的电压组合。利用理 论模拟的结果，设计了电动进样实验，获得了与理论计算结果吻合非常好的实验结果， 从而验证了本文建立的集成毛细管电泳芯片电动进样数值模型的正确性。 关键词：芯片毛细管电泳：电动进样；数值模拟：改进的压力耦合方程的半隐式法 集成毛细管电泳芯片电动进样数馕模拟 i n t e g r a t e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i ps a m p l ei n j e c t i o n n u m e r i c a ls i m u l a t i o n a b s t r a c t i n t e 掣 a t e d c a p i l l a r ye l e c t r o p h o m s i sa n a l y s i s s y s t e m w i t hi t s a d v a n t a g e o f f a s t , m u i f i f u n c t i o n a l h i g h - e f f i c i e n c y a n dc a nb ed e a lw i t h c o m p u t e r i san e wm i c m a n a l y s i s i n s t r u m e n ti nm i c r o a n a l y s i sa r e a i th a s g o te x t e n s i v ea p p l i c a t i o ni nd n aa r r a ya n a l y s i s ，d n a s e p a r a t i o n , p c rs e p a r a t i o n a n d a n a l y s i s 、c e l ls e p m a t i o n a n do t h e r b i o l o g i c a la n d m e d i c a lf k 地 1 1 1 em a i n p r o b l e m i ne l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o ni sh o wt 0p u s ht h e s a m p l el i q u i di n t ot h e s e p a r a t i o nc h a n n e l n o w d a y s ，t h em e t h o dt os o l v et h i sp r o b l e mi st ou s et h ee l e c t r o k e n t i c s a m p l ei n j e c t i o n t oc o n t r o lt h ef l o wm o d eo f t h e l i q u i di nt h em i c r oc h a n n e l w h e n t h es o l u t i o n a n dt h ec h i ph a sb e e nf i x e d , t h ee x t e r n a lp o t e n t i a lw i l lb et h em a i nf a c t o rt od e t e r m i n et h ef l o w m o d e i ft h ec o m p u t e rn u m e r i c a ls i m u l a t i o nc s n g e tt h ep o t e n t i a l ，v e l o c i t yv e c t o ra n ds t r e a m d i s t r i b u f i o i l t h ec o m p u t e rt h e nc a ns i m u l a t et h el i q u i d sf l o wm o d ei nt h em i c r o - c h a n n e l i tw i l l i m p r o v e t h e t h e e x p e r i m e n te f f i c i e n c y a n do f f e rs o m ev a l u a b l ec l e w st o d e s i g n t h e e l e c t r o p h o r e s i sc h i p 1 1 1 ee l e c t r o k e n t i cs a m p l e 画e e t i o ns y s t e mm o d e lh a sb e e nf o u n d e di nt h e o r y ，a n dt h er u l e o f h o wt h ep o t e n t i a lt oc o n t r o lt h el i q u i dh a sb e e ns t u d i e d an u m e r i c a lm o d e lh a sb e e nf o u n d e d w i t hf i n i t ed i f f e r e n c em e t h o d , a n di th a sb e e ns o l v e dw i t hv o r t i c i t y - f l o wf u n c t i o nm e t h o d a n o t h e rm o d e lh a sb e e nf o u n d e dw i t hc o n l r 0 1 v o l u m em e t h o d , a n dj th a sb e e ns o l v e dw i t ht h e s e m i - i m p l i c i tm e t h o d f o rp r e s s u r e - l i n k e de q u a t i o nr e v i s e d n 圯p o t e n t i a l v e l o c i t yv e c t o ra n d t h es l r e a md i s t r i b u t i o ni nt h em i c r oc h a n n e lh a v eb e e ng o t , a n dt h es t r e a md i s w i b u l i o nw i l l r e f l e c to b v i o u s l yt h e l i q u i d s f l o wm o d ei nt h em i c r oc h a n n e l ，1 1 1 e s a m p l ei n j e c f i o na n d s e p a r a t i o np r o c e s sh a v eb e e ns i m u l a t e dw i t h t h es e c o n dn u m e r i c a lm o d e l ，a n dt h en o r m a lr u l e s o fh o wt h ee x t e r n a lp o t e n t i a lt oc o n t r o lt h el i q u i di nt h em i c r oc h a n n e lh a sb e e nc o n c l u d e di n t h e o r y , w h i c hh e l p st og e tt h eb e t t e rp o t e n t i a lt ob eu s e di nt h ee l e c t r o k e n t i cs a m p l ei n j e c t i o n p r o c e s s t h e s es i m u l a t i o nr e l u l t sh e l pt od e s i g nt h ep i n c h e di n j e e t i o ne x p e r i m e n t ，a n dt h e e x p e r i m e n tr e s u l ti n o s e u l a t e sw e l lw i t hs i m u l a t i o nr e s u l t , t h e r e f o ri tv a l i d a t e st h ec o m p u t e r n u m e r i c a lm o d e li nt h i sp a p e r k e yw o r d s ：m i e r o c h i pc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；e l e c t r o k e n t i cs a m p l ei n j e c t i o n ； n u m e r i c a ls i m u l a t i o n ；s i m p l e r - 一 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得 大连理工大学或其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢 意。 作者签名：日期： 大连理工大学硕士学位论文 引言 近些年，随着微机电系统啡i c r o 髓e c ”o n i c c h a n i c a l 曲s t e m ，j 曰 s ) 技术的不 断完善，微全分析系统( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ，- t a s ) 也得到了长足的发展。 pt a s 足以分析化学为基础，微加工技术为依托的跨多种学科领域的一门新技术。利用 这个技术，以往需要在一个实验室中用大量样品、试剂和时间才能完成的实验，现在可 以在一个几平方厘米大小的芯片上完成，实现样品的进样、反应、分离、检测等多个步 骤连续进行，它具有体积小、便于携带、样品消耗少、成本低、分析速度快、分析过程 自动化等优点。另外，它将化学分析所需要的器件集成到一起，更有利于现场分析，可 显著降低分析过程中出现的误差。 毛细管电泳芯片的概念来自计算机芯片。计算机芯片采用的是集成电路技术，在硅 片上集成晶体管电路，而毛细管电泳芯片利用m e m s 技术，在几平方厘米的硅片或有机 玻璃上加工出很多不同尺寸、不同形状的微沟道。与常规毛细管电泳相比，芯片毛细管 电泳有更大的散热面积，可以在无须冷却的情况下施加很高的电压。另外，传统毛细管 电泳的分离沟道长度一般为几十厘米，两芯片的分离沟道长度仅为几厘米，因此，芯片 毛细管电泳的分析速度快，样品的消耗量少，并且为了提高分离效率还可以在芯片上制 作多个通道，能够在在同一时间内对多种样品进行分离。 用毛细管电泳芯片进行生物分析，需要采用电动进样技术使样品进入分离沟道内进 行分离，在芯片上施加变化的电压组合是实现电动进样的关键步骤。通常需要大量的实 验来摸索不同电压所产生的电动进样效果，要花费大量的时间和资金。如果能够在理论 上建立合适的计算机数值模型来模拟集成毛细管电泳芯片电动进样过程，就可以在理论 指导下有针对性的开展实验，节省大量的时间和经费。 本课题属于生物芯片研究领域，是国家自然科学基金项目中的部分研究内容f 基金 号是：6 0 1 7 4 0 3 4 ) 。本文的主要工作是建立集成毛细管电泳芯片电动进样的计算机数值 模型，并运用此模型描述不同电压组合所产生的电动进样的变化，最后通过实验来验证 这一结果。 集成毛细管电泳芯片电动进样数值模拟 1 绪论 1 1 前言 进入2 1 世纪，越来越多的有识之士认识到科学仪器在人类科技发展过程中发挥的 极其重要的作用，并开始给予科学仪器更多的重视和关注。与此同时，生命科学与信息 科学的发展不断为分析科学及科学仪器提供新的机遇与挑战，要求分析科学仪器在低消 耗的情况下快速地提供准确的有关物质成分的信息，表现为分析设备的微型化、集成化 和便携化。微全分析系统( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，“t a s ) 正是在这一趋势下，于 2 0 世纪9 0 年代初由瑞士的m a n z 和w i d m e r 以微机电加工技术( m i c r o e l e c t r o m e e h a n i c a l s y s t e m s ，m e m s ) 为基础提出来的f 1 1 。 ut a s 是通过将化学分析设备微型化与集成化，最大限度地把分析实验室的功能转 移到便携的分析设备中，甚至集成到方寸大小的芯片上，最终目的是实现分析实验室的 “家用化”，从而使分析科学及分析仪器进入千家万户。 1 2 u t a s 的分类 当前的ut a s 可分为芯片式与非芯片式两大类，其中芯片式是发展的重点。芯片式 “t a s 根据芯片结构及工作机理又分为微流控芯片和微阵列( 生物) 芯片，它们都以 m e m s 技术为基础，但是前者以微通道网络为结构特征，后者以微探针阵列为结构特 征。微流控芯片主要用于化学分析和生物化学分析，是当前ut a s 研究的热点，也是本 文研究的方向。微流控芯片的目标是把整个分析实验室的功能，包括采样、稀释、加试 剂、反应、分离、检测等集成在可多次使用的微芯片上。微探针阵列芯片主要以生物技 术为基础，以亲和结合技术为核心，以在芯片表面固定系列可寻址的识别分子阵列为 结构特征，将大量( 通常每平方厘米点阵密度高于4 0 0 ) 探针分子的杂交信号强度获取 样品分子的数量和序列信息。这类芯片使用方便，测定t , z n ，一般是一次性使用。 1 3i it a s 及微流控分析芯片的发展过程 微流控分析芯片的出现是现代分析科学与分析仪器向微型化、集成化方向发展的必 然，早在2 0 世纪5 0 年代后期，s k e g g s 创始的间隔式连续流动分析( s e g m e n t e d c o n t i n u o u sf l o wa n a l y s i s ，s c f a ) 就已经体现了这一趋势【2 。1 9 7 5 年r u z i c k a 与h a n s e n 在s k e g g s 的基础上提出了流动注射分析( f l o wi n j e c f i o na n a l y s i s ，f i a ) 的概念 3 】，在提 高分析速度的同时促进了分析系统的微型化。事实上早在m a n z 与w i d m e r 提出ut a s 的概念之前，r u z i c k a 和h a n s e n 于1 9 8 4 年在f i a 的基础上就提出了集成化微管道系统 2 大连理工大学硕士学位论文 ( i n t e g r a t e dm i c r o c o n d u i ts y s t e m s ，i m c s ) 的概念，并取得了一些突破4 j 。1 9 9 1 年m a n z 和w i d m e r 提出了ut a s 的概念，并且毛细管电泳分离技术的迅速发展为ut a s 提供了 重要的契机。1 9 9 2 年m a n z 与h a r r i s o n 合作发袁了首篇在微加工芯片上完成毛细管电泳 分离的论文f 5 ，6 】。此后，研究中的重点转向基于m e m s 技术的电渗驱动的毛细管电泳 分离微流控系统，故微流控芯片也称之为毛细管电泳芯片( c a p m a r ye l e c t r o p h o r e s i s c h i p ，c e c h i p ) 。 1 9 9 4 年以后，由于美国的一些著名大学研究组的介入，使该领域的发展迅速出现 高潮。1 9 9 4 年，美国橡树岭国家实验室以r a r n s e y 为首的研究组【7 在m a n z 的工作基础 上发表了一系列论文，改进了芯片毛细管电泳的进样方法，提高了其性能与实用性，引 起了更广泛的关注。在此形势下，该年首届斗t a s 会议在荷兰恩舍得( e n c h e d e ) 举行，起 到了推广ut a s 的作用。1 9 9 5 年，美国加州大学b e r k e l e y 分校的m a t h i e s 研究组在微流 控芯片上实现了高速d n a 测序【8 】，微流控芯片的商业价值开始显现，而此时微阵列型 的生物芯片已进入实质性的商品开发阶段。同年9 月，首家微流控芯片企业，c a l i p e r t e c h n o l o g i e s 公司在美国成立，年就集资近于万美元。1 9 9 5 年开始，美国哈佛大学的 w h i t e s i d e s 研究组报道了一系列与微流控芯片加工有关的新技术，大大促进了这一领域 的发展【9 】。1 9 9 6 年m a t h i e s 等又将基因分析中有重要意义的聚合酶链反应( p c r 扩 增) 与毛细管电泳集成在起【1 0 ，展示了微流控芯片在试样处理方面的潜力。次年， 他们又实现了微流控芯片上的多通道毛细管电泳d n a 测序，从而为微流控芯片在基因 分析中的实际应用提供了重要基础【1 l 】。 1 9 9 9 年之后，很多企业也加入了微流控芯片的研究开发工作中。一些微流控芯片 丌发企业纷纷与世界著名分析仪器生产厂家( 包括h p 、p e 、导津、日立等) 合作，利 用各自的优势技术平台抢先开发微流控分析仪器，1 9 9 9 年9 月 坤与c a l i p e r 联合研制 的首台微流控芯片商品化仪器开始在欧美市场销售，2 0 0 0 年8 月，已提供用于核酸及 蛋白质分析的5 - 6 种芯片，其他几家厂商的产品也开始推向市场。2 0 0 0 年5 月和次年9 月，相继召开的第四、五届ut a s 会议是对微全分析系统发展的全面检阅，预示着微全 分析系统的一个更大的发展高潮已经到来。由著名的英国皂家化学会主编的，以“l a b - o n a - c h i p ”为名称的新学术季刊已于2 0 0 1 年创刊，它将作为一个专门的学术论坛促进 u t a s 领域的发展。 近些年来我国科研工作者在这个领域也开展了一系列的研究工作 1 2 1 5 。1 9 9 9 年， 印燕【1 6 】等人探讨了玻璃基片上毛细管区带电泳集成系统的迸样及其对分离效率的影 响，提出了交叉点进样方法，实现了微量进样，提高了分离效率。2 0 0 1 年汤扬华 1 7 】等 人利用微细加工技术研究在玻璃上制作电泳芯片的方法，进行电泳分离实验，得到了样 3 集成毛细管电泳芯片电动进样数值模拟 品分离谱图。2 0 0 2 年中国科学院大连化学物理研究所成功研制出一套芯片毛细管电泳 激光诱导荧光检测装置【1 8 】，并用此装置研究了芯片毛细管电泳与传统毛细管电泳的差 别，考察了微沟道内组分迁移的特征。 1 4 芯片毛细管电泳进样技术 1 4 1 毛细管电泳芯片结构 毛细管电泳芯片是在常规毛细管电泳理论和技术 1 9 2 2 1 的基础上利用微机械加工 ( m e m s ) 技术，在硅、玻璃、塑料、橡胶等为材料的基片上形成微细沟道，然后用盖 片将管道封接，在外加电场的作用下，通过不同的管道、反应器、检测单元等的设计和 布局，实现样品的进样、反应、分离和检测。整个过程可以在一块几平方厘米的基片上 得以实现。 毛细管电泳芯片与传统毛细管相比具有以下优点： 1 减少了样品、缓冲液用量，可节约试剂用量，减少废液产生量，降低环境污染。 2 比传统的毛细管散热能力强，可进一步提高电场强度达到高速高效分离。 3 可制得高性能、连通的管道网络。 4 采用m e m s 技术可以将反应器、过滤器甚至检测器等集成在一个芯片上，使得 进样、反应、分离、检测等过程能在一个芯片中进行，即所谓的芯片实验室 ( l a b o n - a - c h i p ) ，达到小型化、系统化、集成化的目的。 5 利用m e m s 技术可以在一个基片上制作微管道阵列，可同时对一系列样品进行 分离和分析，具有并行处理的能力。 6 利于低成本大规模生产。 最简单的毛细管电泳芯片原理图如图1 1 所示通常设计有进样沟道和分离沟道， 图中竖向的沟道为进样沟道，横向的沟道为分离沟道，进样沟道与分离沟道交叉成 “十”字型，交叉处为样品进样口。在沟道的顶端设计了四个储液池，分别是样品池、 缓冲液池、样品费液池和废液池，微沟道长度一般为3 - 2 0 c m ，宽为1 0 一1 0 0um ，深为 1 0 1 0 0 u m 左右，检测口设在距离废液池卜2 c r a 处 2 3 - 2 5 1 。 毛细管电泳芯片的材料有单晶硅、无定型硅、玻璃、石英、金属和有机聚合物，如 环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲脂( p m m a ) 等 2 6 ，3 0 。单晶硅具有强度好、耐腐蚀等优 点，但硅是半导体，试验表明，硅在外加电压不到1 0 0 0 v 时便会被击穿 3 1 ，此外，深 度刻蚀困难。玻璃和石英则是应用最多的基片材料，因为玻璃和石英的微加工技术较为 成熟，它们的光学、电学和化学性能较好，有较多的表面键合技术，封装较容易，并且 4 一 大连理工大学硕士学位论文 具有较好的散热性能，电泳分离时产生的焦尔热能得到有效的散发，可以在通道中施加 较高的驱动电压。 兰 图1 1 毛细管电泳芯片示意图 f i g 1 1s c h e m a t i cd i a g r a m o f t h ec a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s 微流动通道不仅提供流体流动和进行微流控操作的场所，而且经过特殊设计的微通 道网络本身可以作为微流体控制的一种重要手段。毛细管电泳芯片的基本通道模式有两 种，如图1 2 所示。其中图( a ) 是十字型沟道【3 2 】，图( b ) 是双梯形沟道 3 3 。在一定 驱动力的作用下，控制样品在微沟道罩流动，完成样品的迸样、反应、分离和检测。 ( a ) 十字型 ( b ) 双梯形 图1 2 毛细管电泳芯片模式 f i g 1 2m o d e o f t h e c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p 十字型电泳芯片与双梯形电泳芯片在本质上是相同的，观察图1 2 ( a ) 和图1 2 ( b ) 可以发现，十字型电泳芯片竖向两个沟道与横向分离沟道相交于同一点，而双梯形电泳 芯片竖向两个沟道与分离沟道相交于不同的点。设计双梯形沟道的目的是保证在交叉口 处有足够的样品量，降低对检测器灵敏度的要求。 5 集成毛细管电泳芯片电动进样数值模拟 1 4 2 芯片毛细管电泳进样系统 通过微沟道设计来控制微流体的方法有三类，分别是采用改变微通道构型、表面性 质、通道内外附加装置的方法实现微流控操作。根据微流体驱动系统有无活动的机械部 件，可以分为机械驱动系统和非机械驱动系统。机械式驱动系统主要分为活塞式、隔膜 式和齿轮式微泵三种。迄今为止，在非机械驱动系统方面人们已经采取了很多方法来控 制液流，如压电泵 3 4 】、离心力驱动微泵 3 5 】、热气动微泵 3 6 】、电渗泵 3 7 】。其中电渗 泵是目前微流控系统中应用最为普遍的驱动方式，电渗流是电渗泵的驱动力，也是毛细 管电泳的中的主要驱动力。有关电渗作为驱动力的原理、优缺点将在下一章中作具体的 讨论。 芯片毛细管电泳进样方法是生物芯片分析中的关键环节，不同的进样方法会建立不 同的初始区带分布，而不同的初始分布不仅对应着不同的初始效率，而且可能产生不同 的区带收缩和扩展水平。理想的进样方法应具有以下特点： 1 对样品各组分视同仁，没有歧视现象； 2 具有通用性，能适应不同的形式和分离介质； 3 能够得到窄的初始区带分布； 4 进样操作简单、方便、重现性好； 5 易于自动化控制。 目前，完全符合进样要求的进样方法尚不存在，不合适的进样方法很容易导致区带 扩张和样品过载，因此，有效地控制进样样品的长度，减小进样对分离效率的影响是非 常重要的问题。根据文献报道1 3 8 ，采用交叉形式的进样沟道，可较好地控制芯片式毛 细管电泳的进样过程，减小进样造成的样品过载等影响。为了较好地控制进样区带的长 度，提高柱效和分离度，在电泳芯片中广泛采用十字交叉进样结构，如图1 2 ( a ) 所示， 使进样管道和分离管道交叉形成一个进样区域。目前，毛细管电泳芯片主要有两类进样 方法：基于时间的进样方法和基于体积的进样方法，其中门进样法属于前一种，夹流进 样法属于后一种。 门进样过程如图1 3 所示。进样前，在u 2 和u 3 之间加一定的电压，为了遏制样品溶 液向两旁扩散，在u 1 和u 4 上也加一定的电压，使样品溶液主要从u 2 流向u 3 。进样时在 u 2 和u 4 之间加电压，同时u l 和u 3 仍保持一定的电压，于是一段样品就从交叉口进入分 离槽，如图1 3 ( b ) 所示，可通过保持此过程时间的长短来改变所进样品的体积。分离 时，在u l 和u 4 之间加一定的电压，使样品进入分离沟道进行分离。在进样前，微沟道 内壁需要经过修饰，以减少内壁对样品的吸附，同时也降低对电渗流的影响。另外，还 需要将缓冲液注入缓冲液槽，待缓冲液充满整个沟道时，在样品槽中注入样品，然后加 6 大连理工大学硕士学位论文 入驱动电压完成电动进样过程。门进样可以实现连续进样，这对于需要不断进行样品载 入和分离的模式，如柱后反应是十分有用的。 山 ：；中液 _ _分离淘 山 山 ：冲液 _ 一 _ 挣黼日弛 士 ( a ) 进榉前 b ) 避榉时( c ) 分离时 图1 3 门进样示意图 f i 晷1 3s c h e m a t i cd i a g r a mo f g a t e di n i e c t i o n ( s h a d o wm e a n so f s a m p l es o l u t i o n ) 夹流进样过程如图1 4 所示。这种进样方式比较简单，即进样的时候直接将十字交 叉口处的样品推入分离沟道进行分离。从表面上看，这种进样法所进样品的多少是由沟 道交叉口处的体积大小决定的，但实际情况并非如此。由于分子扩散作用以及电力线在 十字交叉口处受到微扰而发生弯曲等原因，样品在进样沟道中流经十字交叉口时，不可 避免地向十字交叉口横向的分离沟道扩张 3 9 1 。若不对这种谱带扩展现象加以抑制的 话，分离效率就会受到影响。而在分离阶段，若仅在u 1 和u 4 之间施加分离电压而保 持u 2 和u 3 悬空，那么留存于十字交叉口上下两边的样品会受到分离沟道中流动着的 缓冲液的拖动而被携入分离沟道，形成很高的背景噪声，影响检测效果。同时夹流进样 的样品体积不依赖于场强和时间，引起的空间展宽最小、基本没有“歧视”效应。综 上，夹流进样的过程是：注入缓冲液充满整个沟道后再注入样品，除u 3 接地外，u 1 、 u 2 、u 4 均施加正电压，电势分配为u l 、u 2 、u 4 的电势高于交叉口处，而u 3 低于交 叉口处电势。进入分离阶段时，四个槽的电压同时切换，使u 1 处电势高于交叉口处电 势，而u 2 、u 3 低于交叉口处电势，u 4 接地，将一段三角形形状的样品推入了分离沟 道如图】4 ( b ) 所示。夹流进样可以在“十”字型槽中实现，也可以在双t 型的槽中实 现 4 0 。夹流进样的优点是可控制样品带宽度，获得比其它进样方法更高的分离效率， 可准确重现地控制进样体积；且进样体积与进样时问无关，容易获得重现的分析结果； 可控制分析时的泄漏。 7 集成毛细管电泳芯片电动进样数值模拟 ( a ) 进样时 ( b ) 分离e t 图1 4 夹流进样示意图 f i g 1 4s c h e m a t i cd i a g r a mo f p i n c h e di n j e e t i o n ( s h a d o wm e a u so f s a m p l es o l u t i o n ) 1 5 集成毛细管电泳芯片电动进样系统计算机模拟研究现状 到目前为止，对集成毛细管电泳芯片电动进样的研究大多数都是通过实验来进行的 【4 l - 4 5 】，对于c ec h i p 的进样和分离还缺乏理论指导，而理论的研究有助于解释和优化 现有的进样系统设计。目前国际上微流控分析领域正处于起步时期，技术的发展大大领 先于理论，文献报道了大量实验系统，而在理论方面还没有形成可用来指导微流控系统 设计的统一的、完善的理论。目前，这一问题已逐渐被人们所认识，理论研究己成为微 流控分析重要的研究方向之一。 由于c ec h i p 的原理和常规c e 的原理有相似之处，所以对c ec h i p 的研究可以借 鉴些c e 的理论。早在1 9 6 5 年r i c e 和w h i t e h e a d 4 6 就建立了毛细管电泳电渗流的有 关方程。1 9 8 1 年j o r g e n s o n 和l u k a c s 建立了一维的毛细管电泳模型 4 7 1 。1 9 9 3 年 a n d r e e v 和l i s i n 发表了一篇论文 4 8 ，在论文中他们建立了一维毛细管电泳的数学模 型，并且研究了电渗流模式对分离效率的影响。这些关于利用常规c e 进行物质分离的 计算机数值模拟，虽然提出了描绘电泳分离过程的差分方程，但是直到e r m a k o v 等人的 一系列文献发表 4 9 5 1 ，才出现了较好的数值解法来解这些方程。e r m a k o v 的解法表 明，人为增加对流方程的离散量，可以大大改进仿真的结果，消除了数值抖动和分散。 e r m a k o v 的研究发现，出现抖动的原因与以下因素有关：所用的数值方法、方法中的参 数、时间与空间的网络尺寸等等。为了加速计算的过程，在不产生抖动和溶液负浓度的 条件下，网络的尺寸要尽量大，这些参数的最优值取决于电泳状态的选择( 主要是离子 8 大连理工大学硕士学位论文 强度和电流密度) 。当增加电场强度时，在分离的不同阶段最优离散网格尺寸是不同 的。虽然有许多可以利用的数值方法，但是由于实际情况的需要以及计算速度的要求在 一定程度上限制这些方法的使用。国内目前在芯片毛细管电泳领域的研究主要集中于集 成毛细管电泳芯片的研究 5 2 5 3 】，而关于集成毛细管电泳电动进样系统的研究很少见。 我校在这个问题上作了比较深入地研究。2 0 0 3 年范博源等人对十字沟道内的电场分布 作了一定研究 5 4 1 ，但是他的研究偏重于电场分析，不能够反应出沟道内流体在不同驱 动电压组合下的流动模式。仲武 5 5 等人对电渗流机理进行了分析，用于研究提高微流 体流动速度的方法。 1 6 本文的主要任务 综上所述，由于样品分离过程涉及到生物化学反应和粘性流体动力学问题，因此 对于具体粒子分离过程的理论研究是相当复杂的。并且随着电泳芯片沟道几何结构的目 益复杂，进样控制也变得非常复杂。通过大量的实验来总结控制芯片毛细管电泳电动进 样方法显然是不可取的。由于电场力是驱动流体流动的动力，所以，如果可以精确地控 制沟道内部的电场分布，就可以控n i n o n 道内部流体的流动模式，也就可以精确控制进 样和分离过程。因此在沟道几何尺寸、形状、采用的样品及缓冲溶液确定的条件下，芯 片上四个液体槽内电极上施加的驱动电压组合是决定流体在沟道内流动模式的主要因 素。 本文将主要研究芯片毛细管电泳电动进样系统的数值计算模型，研究计算此数值 模型的方法，编写出求解此模型算法的计算机程序，利用计算机求得施加各种驱动电压 组合时沟道内的电场、流场以及速度场的分布情况，获得相应驱动电压组合下微沟道内 流体相对应的流动模式，从而利用计算机模拟的方法来获取驱动电压组合控制集成毛细 管电泳芯片电动进样模式的规律，并通过实验验证计算机数值模型的正确性。 9 - 集成毛细管电泳芯片电动进样数值模拟 2 芯片毛细管电泳理论 芯片毛细管电泳分离分析的基本原理与常规毛细管电泳相似，但是在平面芯片的微 细通道中进行高效、快速的电泳分离分析有其特殊性。本章将首先介绍双电层和z e t a 电 势的理论以及电泳的理论，然后介绍电渗流的理论以及淌度的概念，最后根据这些理论 结合流体运动的基本方程，建立了集成毛细管电泳芯片电动进样系统的理论模型。 2 1 双电层和z e t a 电势 由于高效毛细管电泳中所用的毛细管绝大多数是石英材料，由界面化学可知，当沟 道内电解质溶液的p h 值大于或等于3 的时候，管壁的- - s i o h ( 硅羟基) 开始部分解离 为- - s i o + ，使管壁带负电荷，当管壁和溶液相接触时，为了与管壁表面固定化的负电 荷达到电平衡，在管壁表面会形成稍微过量的反电荷薄层叫做双电层( e l e c t r i cd o u b l e l a y e r ，e d l ) ，双电层分为两部分，与固体表面非常接近的过量电荷和在表面有效的 固定化的离子被称之为紧密层或s t e m 层，s t e m 层的厚度约为1 2 个离子的厚度；另 一部分过量电荷可以与溶液中的离子自由交换，这一部分过量电荷形成双电层中的扩散 层。与平衡离子相关的过量电荷密度随着与固体表面的距离增加而迅速降低，降低到 s e 时的距离称之为双电层的厚度，通常以l k 表示，其中s 是缓冲液的介电常数， 占= 4 ；r 6 0 s ，是真空介电常数( 8 8 5 1 0 “2 c 2 n - m 2 ) ，s ，为相对介电常数，如水在2 5 摄氏度时g ，为7 8 ，k 是d e b y e 长度。剪切面位于s t e m 面外侧很近的地方，紧贴固相 表面粘度迅速变化的区域，剪切面上的电位称为f ( z e t a ) 电势。 2 2 电泳 在半导电流体中，荷电粒子在外电场作用下的泳动现象叫电泳( e l e c t r o p h o r e s i s ) 。 带电粒子在场强为e 的电场中受电场力为： 吒= q e ( 2 1 ) 式中最为电场力，q 为溶质粒子所带的有效电荷，e 为电场强度。同时当带电粒子以速 度v 在电场中移动时，又会受到一个与其速度成正比的粘滞阻力的作用，即摩擦力，表 达式为： f = f - v 1 0 ( 2 2 ) 大连理工大学硕士学位论文 式中f 为靡擦力，v 为溶质粒子在电场中的迁移速度，f 为摩擦系数，f 的大小和荷电粒 子的大小、形状以及介质粘度有关。对于球形粒子，f = 6 ，r r r ，对于棒型粒子， f = 4 z r r r ( 其中r 是溶质粒子表观液态动力学半径；r 为电泳介质的粘度) 。 当平衡时，电场力和摩擦力大小相等方向相反。所以 批一一等= 赤f ( 2 3 ) 从式2 3 可知，荷电粒子的电泳速度除了与电场强度成正比外，还与其有效电荷成 丁f 比，与其表观液态动力学半径r 及介质粘度，7 成反比。不同物质在同电场中，由于 它们的有效电荷、形状、大小的差异，它们的电泳迁移速度不同，所以能够分离。也就 是说，物质粒子在电场中迁移速度的不同是电泳分离的基础。 2 3 淌度 因为电泳速度与外加电场强度有关，所以，在电泳中常用淌度( m o b i l i t y ，口) 而 不用速度来描述荷电粒子的电泳行为与特征。电泳淌度( e l e c t r o p h o r e f i cm o b i l i t y ) 定义为单 位场强下粒子的平均电泳速度，简称淌度，用表示，即：t = v i e 。物质粒子在电场 中的迁移速度决定于粒子淌度和电场强度的乘积，所以淌度不同是电泳分离的内因。物 质所处的环境不同，其形状、大小及所带电荷多少都可能有差别，则淌度也可能不同。 淌度的分类： 1 绝对淌度绝对淌度是指无限稀释溶液中荷电粒子在单位电场强度下的平均迁移速 度，绝对淌度表示一种离子在没有其它离子影响下的电泳能力，是该离子在无限稀 释溶液中的特征物理量。各种离子的绝对淌度可以在化学手册中查到。 2 有效淌度在实际工作中，不可能在无限稀释的溶液中进行电泳，某种离子在溶液 中不是孤立存在的，必然要受到其它离子的影响，其形状、大小及所带电荷多少都 可能发生变化。把物质在实际溶液中的淌度叫做有效淌度。所以有效淌度是指在实 验中测得的离子淌度，用以，表示。有效淌度和离子形状、离子半径、介质的介电 常数、溶剂的粘度、离子的电荷数、离子的解离度以及溶液酸度。温度等因素有 关。 3 表观淌度，在毛细管电泳中，离子在电场中的迁移速度不仅取决于离子的有效淌 度和电场强度，而且还与电渗流速度有关。把离子在实际电泳中的迁移速度q 做表 1 1 集成毛细管电泳芯片电动进样数值模拟 观迁移速度，这旱用v ，表示，则：v 。= 。r e ，其中，= ( 矿。) ，不同物 质在电泳中的表观淌度不同，使它们的表观迁移速度不同，因而得以分离。 2 。4 电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w ，e o f ) 原理 电渗流是毛细管区带电泳中最重要和最有趣的性质之一。广义地讲，电渗是一种液 体相对于带电的管壁移动的现象。处在扩散层中的阳离子，在负电荷表面形成一个圆筒 形的阳离子鞘，在外加电场作用下，以剪切面为分界面，朝向阴极与s t e r n 层做相对运 动。由于这些阳离子是溶剂化的，当它们沿剪切面做相对运动时，携带着溶剂一齐向阴 极迁移，便形成e o e 2 0 。 2 4 1b o f 速度和流型 电渗流的速度k 与管壁的z e t a 电势厶有关，g q v o ns m o l u c h o w s k i 方程给出： v 。：一盟占 7 其中为真空介电常数。 类似于电泳，常用电渗淌度。表示e o f 的大小 心= ”么 ( 2 4 ) ( 2 5 ) 在通常的毛细管区带电泳条件下，电渗流从阳极流向阴极，且很多条件下，电渗流 的速度是电泳速度的5 至7 倍。既然同时存在着电泳和电渗现象，那么，如果不考虑相互 作用，粒予在毛细管内电介质中的运动速度应当是两种速度的矢量和。 毛细管区带电泳中，多数情况下，正离子的运动方向与电渗一致，因此最先流出， 中性粒子的电泳速度为“零”，将随电渗而行。负离子因其运动方向和电渗相反，在 电渗速度大于电泳速度时，将在中性粒子之后流出。也就是说，混合物中的所有组分将 朝一个方向迁移。电渗流的流型也很特别，如图2 1 所示，e w 的流型属扁平流型，或称 “塞式流”，扁平流型不会引起样品区带的增宽，这是芯片毛细管电泳获得高分离度的 重要原因之一。 1 2 大连理工大学硕士学位论文 一 ( a ) 电渗流速度轮廓( b ) 剐蜀区带示意图 图2 1 电渗流流型及其区带示意图 n 蛋2 1e i e c t r o o m o s t i c m o d ea n dt h es c h e m a t i cd i a g r a mo f z o n e 2 4 2 电渗流的影响因素和控带0 方法 1 ，p h 值对电渗流速度的影响 在电泳介质中，溶液的p h 值对电渗流速度有很大的影响，电渗流正比于毛细管内 壁的z e t a 电势。对于相同材料毛细管，管中溶液的p h 值不同时，它们的表面电荷特性 不同，毛细管壁的z e t a 电势不同，其电渗流的大小也不同。以常用的石英毛细管为例： 当内充液的p h 值增高时，避表面的硅羟基电离带负电荷的- - s i o 一数增多，使壁表面的 负电荷密度增大，管壁z e t a 电势增大，电渗流增大；当溶液的p h 值达到7 时，壁表面 的硅羟基完全电离，使壁表面的负电荷密度达到最大，电渗流达到最大。随着溶液的 n h 值减少，壁表面的硅羟基电离受到抑制，使壁表面的负电荷密度减少，管壁z e t a 电 势减小，电渗流减小；当p h 值减少至3 以下时，壁表面带负电荷的- - s i o 一完全被氢离 子中和，使壁表面呈电中性，z e t a 电势趋于零。因此溶液p h 值的稳定，对于保持电渗 流稳定、保证电泳分离分析结果的重现性极为重要。所以，电泳操作一定要在适当的缓 冲液中进行。 2 介质成份和浓度对电渗流的影响 电泳介质的成份和浓度对电渗流有明显的影响，由于各种离子的形状、大小、带电 荷多少不同，它们的电导率也不同。由不同离子构成的相同浓度