（应用化学专业论文）应用于生物燃料电池的酶催化乙醇阳极的研究.pdf

摘要 乙醇脱氢酶( a d h ) 是以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d ( h ) ) 为辅 酶的一种氧化还原酶，它将乙醇催化转化成乙醛，同时将n a d + 还原成 n a d h ，n a d h 再在电极上氧化而产生电流，但其氧化过电位大且副产 物易污染电极。为设计应用于生物传感器与生物燃料电池的乙醇脱氢 酶阳极，必须探索提高n a d h 催化氧化电流以及电极稳定性的优化条 件。 聚苯胺被用于酶的固定，但它在中性缓冲液中易丧失电化学活 性。实验中掺入1 5 的聚丙烯酸，得到的p a n p 从膜在磷酸氢二钠 一柠檬酸中性缓冲液中具有良好的电化学活性及稳定性。实验中采用 电化学掺杂法即将聚苯胺一聚丙烯酸复合膜先在0 4 v 下还原，然后 在含乙醇脱氢酶的缓冲溶液中于0 4 v 下氧化，利用阴阳离子间的作 用将乙醇脱氢酶固定到复合膜上，用循环伏安、交流阻抗、扫描电镜 和红外光谱对固定乙醇脱氢酶前后膜的性能进行表征，结果表明固定 效果良好。酶修饰电极对乙醇溶液具有一定的电化学响应，从而证实 了聚苯胺膜既可作为酶的固定材料，又可作为以n a d + 为辅酶的酶燃料 电池的媒介体。 为了提高酶修饰电极对乙醇的响应电流，用碳毡作为酶固定的基 质材料。苯胺在碳毡电极上的聚合研究发现，未经掺杂的聚苯胺修饰 碳毡电极，在中性t r i s - h c l 缓冲液中具有良好的电化学活性。研究 了缓冲液、酶浓度以及n a d + 的浓度对催化电流的影响。酶修饰碳毡电 极在o 3 v 左右对乙醇的氧化具有催化作用，且催化电流远大于铂电 极。与铂电极相比，碳毡电极的。、。：都大幅度减小，说明碳毡 电极有利于酶与电极之间的电子转移，从而提高了酶电极的响应电 流。 关键词：生物燃料电池，聚苯胺，乙醇脱氢酶，酶修饰电极 硕十学位论文 a b s t r a ( 叮 a b s t r a c t a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( a d 田i s a n n a d ( h ) - d e p e n d e n t o x i d o r e d u c t a s et h a tc a t a l y s e st h ec o n v e r s i o no fa l c o h o lt oa l d e h y d e s ，w i t h c o n c o m i t a n tr e d u c t i o no f t h ec o f a c t o rn a d + t on a d h t h e nn a d hw a s o x i d e do nt h ee l e c t r o d ea n dc u r r e n tp r o d u c e d b u tt h eo v e r p o t e n t i a lo f n a d ho x i d a t i o ni sl a r g ea n dt h es u b p r o d u c tp o l l u t e dt h ee l e c t o d ee a s i l y i no r d e rt od e s i g nd e h y d r o g e n a s eb a s e db i o a n o d e sf o rb i o s e n s o ra n d b i o r u e lc e l la p p l i c a t i o n s i ti sn e c e s s a r yt of i n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n st o m a x i m i z et h ec a t a l y t i cc u r r e n t sf o rn a d ho x i d a t i o na n dt oa c h i e v eh i 【g h s t a b i l i t yf o rt h eo p e r a t i o no f t h ee l e c t r o d e p o l y a n i l i n ew a su s e df o ri m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e b u ti t l o s t e l e c t r o a c t i v i t yi nb u f f e rs o l u t i o n ( p h 7 、a f t e r1 5 w t p o l ya c r y l i ca c i d w a sa d d e dt ot h ee l e c t r o l y t eb e f o r ep o l y m e r i z a t i o n , t h ep a n i p a a p t m o d i f i e de l e c t r o d es t i l lr e t a i n e dg o o de l e c t r o a c t i v i t ya n ds t a b i l i t yi n d i s o d i u mh y d r o g e np h o s p h a t e c i t r i ca c i da t p h = 7 e l e c t r o c h e m i c a l a d u l t e r a t i o nw a su s e dt oi m m o b i l i z ea l c o h o ld e h y d r o g e n a s eo n p o l y ( a n i l i n e ) p o l y ( a n i o n ) c o m p o s i t ef i l mb ye l e c t r o v a l e n tb o n d d u r i n g t l l i s p r o c e s sc o m p o s i t ef i l mw a sf i r s tr e d u c e da t 一0 4 v , t h e ni t w a s o x i d i z e da t0 。4 v t h ee l e c t r o d ew i t ha n dw i t h o u ti m m o b i l i n ga d hw a s c h a r a c t e r i z e d b y i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y ( i r ) ， s c a n n i n g e l e c t r o n i c m i c r o s c o p y ( s e m ) ，c y c l i cv o l t a m m e t r ya n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c e s p e c t r o s c o p y ( e i s ) ，i n d i c a t i n g t h a tt h ei m m o b i l i z a t i o nr e s u l tw a s f a v o r a b l e r e s p o n s et oa l c o h o lo fe 咀z y m em o d i f i e de l e c t r o d em e n t i o n e d a b o v ew a so b t a i n e d ，s op o l y a n i l i n ec a l lb eu s e da sc a r r i e rf o re n z y m e i m m o b i l i z a t i o na n dm e d i a t o rf o re n z y m a t i c a l l yc a t a l y z e dr e a c t i o n s t oi n c r e a s ec a t a l y t i cc u r r e n to ft h ea d h - m o d i f i e de l e c t r o d et o e n t h a n 0 1 c a r b o nf e i tw a su s e da ss u b s t r a t ef o ra d hi m m o b i l i z a t i o n p a n m o d i f i e d c a r b o nf e i te l e c t r o d ew i t h o u ta d u l t e r a t i o nh a d g o o d e l e c t r o a c t i v i t yi nt r i s h c lb u 髓rs o l u t i o n0 h 7 ) t h ee f f e c t so fb u f f e r s o l u t i o n , e n z y m ec o n c e n t r a t i o na n dn a d + c o n c e n t r a t i o no nt h ec a t a l y t i c c u r r e n tw e r ea l li n v e s t i g a t e d p a n p aa a d h ce l e c t r o d eh a dc a t a l y s i st o e t h a n o lo x i d a t i o na to 3 v ，a n dt h ec a t a l y t i cc u r r e n tw a sb i g g e rt h a n p a n pk 沁强铂孰e l e c t r o d e i nc o m p a r e dw i t h ￥蛐k 黼呲 硕士学位论文a b s t r a c t e l e c t r o d e ，p a f l pa 俏d h e l e c t r o d e s 艮i 、kd e c r e a s e d i ti n d i c a t e s t l l a tc a r b o nf e i te l e c t r o d ef a v o r e df o re l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e ne n z y m e a n de l e c t r o d e s ot h er e s p o n c ec u r r e n to ft h ea d i - i - m o d i f i e de l e c t r o d et o a l c o h o li n c r e a s e d k e yw o r d s ：b i o f u e l c e l l ，p o l y a n i l i n e ，a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ， e n z y m em o d i f i e de l e c t r o d e m 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说 明。 作者签名： 日期： 年一月一日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名： 导师签名：鄹堕日期：丝年旦月坐日 硕十学位论文绪论 绪论 近年来，微生物燃料电池发展的新方向主要是无介体微生物燃料电池的研究 和高活性微生物的选用；而酶生物燃料电池的研究，集中在寻找固定酶的新方法， 发展体积更小的无介体酶生物燃料电池，以及与太阳电池相结合等方面虽然由 于功率密度低等原因，短期内生物燃料电池还无法进入实用阶段，但在为植入体 内的器官提供动力和生物传感器等方面已显示出良好的前景。美国宾夕法尼亚州 立大学科学家宣称，他们开发了一种高效能的微生物燃料电池，使细菌能从有机 废水中产生大量的氢，其氢产率是传统发酵过程的4 倍。研究人员说，这种微生 物燃料电池不仅可产生氢作为清洁能源，也可净化有机废水，适用于生活污水、 农业废水和工业废水等行业。专家强调，这种燃料电池第一次证明。从有机废弃 物中获得清洁能源有很大的潜力，可望为“循环社会”做出贡献。美国圣路易斯 大学的科研人员开发出一种新型的生物燃料电池依靠醇和酶产生电流的电 池，只要加入几毫升的醇便能充电，而不需要固定的电源插口。如果经过适当的 优化，这种电池的电力能够保持一个月而无须重新充电。这种电池的另一个特点 是使用乙醇而不是其它电池所用的甲醇作为燃料，选择乙醇的原因是它能延长酶 的活性，来源丰富且廉价。 由于生物燃料电池中的阴极与其它燃料电池相似，也可以使用空气中的氧气 作为氧化剂，所以相关的研究大多集中于阳极。本实验室致力于研究以乙醇为燃 料( 阳极) 的生物燃料电池。本论文工作的要求是制各能固定乙醇脱氢酶的聚合 物修饰电极并将乙醇脱氢酶固定到修饰电极上。制备固定化酶电极用于催化乙醇 脱氢反应，能大大提高酶的使用效率，改善电极的稳定性，提高电极的使用寿命， 对于生物燃料电池阳极的制备有十分重要的意义。本论文在这方面进行了一些积 极的探索。 实验中选择聚苯胺作为固定酶的载体和作为酶与电极之间的电子传递的媒 介。研究了苯胺在电极上的电化学聚合，目标是制备适用于固定酶的生理条件的 中性介质并且具有电活性的修饰电极。具体研究内容如下： ( 1 ) 在含苯胺的酸性、中性溶液制备聚苯胺修饰电极，用循环伏安法测试 电极电化学性能，发现酸性条件下得到的聚苯胺膜在酸性条件下具有良好的电活 性，但随着p h 值的增加，聚苯胺膜逐渐失去电活性。 ( 2 ) 用聚丙烯酸对聚苯胺进行掺杂改性在铂电极通过循环伏安法制备了 聚苯胺聚丙烯酸复合膜，该复合膜在中性磷酸缓冲液中仍具有良好的电化学活 性。并将乙醇脱氢酶固定于复合膜中，采用一系列循环伏安法、交流阻抗法、扫 硕士学位论文 绪论 描电镜、红外光谱等方法对酶修饰电极进行表征，并测试了酶电极在n a d + 存在的 情况下对乙醇的电化学响应。 ( 3 ) 在碳毡电极上研究了浓度、扫描电位、聚丙烯酸聚阴离子对苯胺电聚 合的影响，并研究了聚苯胺修饰碳毡电极对还原态辅酶i ( n a d h ) 氧化的催化作 用。将乙醇脱氢酶固定于聚苯胺聚丙烯酸修饰碳毡电极上，讨论了乙醇脱氢酶、 n a d + 的浓度对酶电极响应电流的影响，并对反应机理进行了初步的探讨。 本论文工作的创新点 ( 1 ) 采用循环伏安法将乙醇脱氢酶固定于聚苯胺聚丙烯酸复合膜内，此 电极对乙醇具有响应。 ( 2 ) 聚苯胺修饰碳毡电极未经掺杂聚阴离子，在中性缓冲液中仍具有良好 的电化学活性，说明碳纤维的存在改善了聚苯胺的性能，扩大了聚苯胺的p h 活 性窗口，减少了对聚苯胺掺杂的步骤。同时，固定了a d h 的聚苯胺修饰碳毡电极 大大提高了对乙醇的响应电流。 本文工作的研究意义： 乙醇生物燃料电池具有绿色、来源广泛的优点，国外一些研究小组正致力于 这方面的研究，通过优化酶固定条件、有效媒介体的采用，提高了电极的电流密 度以及酶修饰电极的稳定性。但因其能量密度低，离实际应用还有很长的距离， 本论文工作在导电聚合物对酶的固定、固定基质材料的选择，进行了一些基础性 探索研究，为乙醇生物燃料电池的研究提供了一定的实验数据及理论依据。 2 硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 生物燃料电池 第一章文献综述 生物燃料电池是燃料电池中特殊的一类。它利用生物催化剂将化学能转变为 电能，所以除了在理论上具有很高的能量转化效率之外，还有其它燃料电池不具 备的若干特点： 原料来源广泛：可以利用一般燃料电池所不能利用的多种有机、无机物以 及微生物呼吸的代谢产物、发酵产物作为燃料，甚至可利用光合作用或直接利用 污水等作为燃料； 操作条件温和：由于使用酶或微生物作为催化剂，一股只要求在常温、常 压、接近中性的环境中工作。这使得电池维护成本低、安全性强； 生物相容性好：由于可以利用人体血液中的葡萄糖和氧作为原料，一旦开 发成功，便能方便地为植入人体的一些人造器官提供电能，例如作为心脏起搏器 等人造器官的电源n 2 ，。 1 9 1 1 年植物学家p o t t e r 用酵母和大肠杆菌进行试验，发现微生物也可以产 生电流，从此，开创了生物燃料电池的研究。4 0 多年之后，美国空间科学研究促 进了生物燃料电池的发展，当时研究的目标是开发一种用于空间飞行器中、以宇 航员生活废物为原料的生物燃料电池。在这一时期，生物燃料电池的研究得以全 面展开，出现了多种类型的电池。但占主导地位的是间接微生物电池，即先利用微， 生物发酵产生氢气或其它能作为燃料的物质，然后再将这些物质通入燃料电池发 电。从6 0 年代后期到7 0 年代，直接生物燃料电池逐渐成为研究的热点。热点之 一是开发可植入人体、作为心脏起搏器或人工心脏等人造器官电源的生物燃料电 池。这种电池多是以葡萄糖为燃料，氧气为氧化剂的酶燃料电池。正当研究取得 进展的时候，另一种可植入人体的锂碘电池的研究取得了突破，并很快应用于医 学临床，生物燃料电池研究因此受到较大冲击嘲。8 0 年代后，由于氧化还原媒介 体( m e d i a t o r ) 的广泛应用，生物燃料电池的输出功率密度有了较大的提高，使其 作为小功率电源而使用的可行性增大，并因此推动了它的研究和开发嘲。另一方 面，由于生物燃料电池中的阴极与其它燃料电池相似，也可以使用空气中的氧作 为氧化剂，所以相关的研究大多集中于阳极，但同时，也出现了具有生物电催化 功能的修饰电极代替常规的氧阴极。有趣的是，以天然食物为燃料，能够自给自足 的机器入( g a s t r o b o t s ) 研究也于近年来取得了某些进展嘲。 硕十学位论文 第一章文献综述 1 1 1生物燃料电池的工作原理及分类 以a d h ( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，醇脱氢酶) 的甲醇燃料电池为例，简要说 明这类生物燃料电池的工作原理( 如图i - i 所示) 嘲。 极 m e d r e d ，m e d o x 分别为还原型和氧化型介体 a d h r e d ，a d h o x 分别为醇脱氢酶还原型和氧化型辅基 图1 - 1甲醇生物燃料电池工作原理示意图 s c h e m e1 - lt h ew o r k i n gp r i n c i p l eo f m e t h a n o lb i o f u e lc e l l 在阳极区进行酶催化反应，原料甲醇脱氢氧化后产生的电子，先转移至i j a d h 的活性中心。然后在介体( m e d ) 的帮助下传递到阳极，再通过外电路负载l 到达阴 极。反应中产生的质子( 穿过质子交换膜进入阴极区，与氧一起在阴极上反应， 接受来自外电路的电子，生成水。 微生物燃料电池的工作原理与上面的有类似之处，只是生物催化反应过程要 复杂得多。 按照使用催化剂形式的不同，生物燃料电池可以分为微生物燃料电池和酶燃 料电池。前者利用整体微生物中的酶，而后者对酶直接利用。尽管已经有在阴、 阳两极同时使用生物催化剂的例子，但大多数生物燃料电池只在阳极使用生物催 化剂，阴极部分与一般的燃料电池没有什么区别。因为生物燃料电池同样以空气 中的氧气作为氧化剂。因此，在生物燃料电池领域的研究工作也多是针对电池阳 极区的。 生物燃料电池根据电子转移方式的不同可分类为直接生物燃料电池和间接 生物燃料电池。直接生物燃料电池的燃料在电极上氧化，电子从燃料分子直接转 移到电极上，生物催化剂的作用是催化在电极表面上的反应；而在间接生物燃料 电池中，燃料并不在电极上反应。而是在电解液中或其它地方反应，电子则由具有 氧化还原活性的介体运载到电极上去。另外，也有人用生物化学方法生产燃料( 如 发酵法生产氢、乙醇等) ，再用此燃料供应给普通的燃料电池。这种系统有时也 4 硕士学位论文第一章文献综述 被称为间接生物燃料电池“】 目前，直接型生物燃料电池非常少见，使用介体的间接型电池占据主导地位。 氧化态的小分子介体可以穿过细胞膜或酶的蛋白质外壳到达反应部位，接受电子 之后的成为还原态，然后扩散到阳极上发生氧化反应，从而加速生物催化剂与电 极之间的电子传递，达到提高工作电流密度的目的。理想的介体应具有下列特性： 能够被生物催化剂快速还原，并在电极上被快速氧化； 在催化荆和电极间能快速扩散； 其氧化还原电势一方面要足以与生物催化剂相偶合，另一方面又要尽量低 以保证电池两极间的电压最大； 在水溶液系统中有一定的可溶性和稳定性。 1 1 2 微生物燃料电池 理论上，各种微生物都有可能作为生物燃料电池的催化剂，经常使用的有大 肠杆菌、p r o t e u sv u l g a r i s 等。传统的微生物电池以葡萄糖或蔗糖为燃料，利用 介体从细胞代谢过程中接受电子，并传递到阳极“。 与酶电池相比，微生物电池对燃料的利用效率比较低，其原因是副反应较多。 t h u r s t o n 等人用同位素标记的方法对燃料使用情况进行了研究。他们以c 。标记 葡萄塘，研究了细菌p r o t e u sv u l g a r i s 催化的微生物电池过程。结果表明实验条 件下有4 0 5 0 9 6 的葡萄糖被完全氧化为c 晚，而3 0 的葡萄糖经副反应生成了乙酸 盐嘲。 选择适当的菌种一介体组合，对微生物燃料电池的设计至关重要。d e l a n e y ” 等发现介体的使用明显改善了电池的电流输出曲线，其中t r ( 硫 堇) 一p l v u l g a r i s 一葡萄糖组合的性能最佳，库仑产率( 实际电流量与燃料消耗所算 得的理论电流量之比) 最高达到了6 2 。l i t h g o w 嘲等人则更侧重于不同介体的 比较，他们发现在介体分子亲水性基团越多，生物电池的输出功率越大。其原因可 能是在介体分子中引入亲水性基团，能够增加介体的水溶性，从而减小介体分子 穿过细胞膜时的阻力。 也出现了一些形式新颖的微生物燃料电池，其中具有代表性的是利用光合作 用和含酸废水产生电能。 t a n a k a 嗍等将能够发生光合作用的藻类用于生物燃料电池，展示了光燃料 电池新种类的可行性k a r u b e 和s u z u k i “”用可以进行光合作用的微生物 p , h o d o s p i r i l l u mr u b r u m 发酵产生氢，再提供给燃料电池。他们用含有乙酸、丁酸 等有机酸的污水作培养液，发酵产生氢气的速率为1 9 3 1 m i m i n 。燃料电池输 硕士学位论文第一章文献综述 出电压为0 2 0 3 5 v ，并可以在0 5 0 6 a 的电流强度下连续工作6 h 。 h a b e r m a n n 和p o m e r “”使用了一种可还原硫酸根离子的微生物d e s u l f o v i b r i o d e s u l f u r i c a n s ，并制成了管状微生物燃料电池，直接以含酸废水为原料进行研 究，发现在对两种污水的实验中，降解率达到3 5 7 5 。这说明生物燃料电池的 具有双重功能，一方面可以处理污水，另一个方面还可以利用污水中的有害废物 作为原料发电。 1 1 3 酶燃料电池 能够在酶燃料电池中作为催化剂的酶主要是脱氢酶和氧化酶。甲醇和葡萄糖 足最常见的两种原料。 甲醇氧化主要使用a d h 或甲醇脱氢酶( m e t h a n o ld e h y d r o g e n a s e ，m d h ) 作催 化剂，氧化的产物是甲酸。p l o t k i n 等人肋h 为催化剂的甲醇燃料电池中，比较了 介体p e s 和p m s 的性能，结果发现在p h 值9 5 时，p e s 工作的稳定性比p m s 要好。 这种电池的主要缺陷是产物甲酸的积累导致电解液p h 值不断减小，所以难以实 现长期连续工作。为了解决这个问题，p l y u e 和k l o w t h e r “2 1 在m d h 的基础上 又引入了f d h ( f o r 咐t ed e h y d r o g e n a s e ，甲酸脱氢酶) ，使甲醇氧化为c 0 2 。电池中 使用的介体仍为p e s 和p m s 。另外，他们以碳布为阳极，比较了酶固定化和酶游离 时电池性能的差别，发现将酶固定化可使电流增大1 3 8 。 2 0 0 3 年3 月2 7 日，美国s a i n tl o u i s 大学m i n t e e r 博士在美国化学协会2 2 5 次会议上展示了她和她的同事研究酶生物燃料电池的最新进展。m i n t e e r 的电池 的特点是用乙醇( 酒精) 取代别人在研究中常用的甲醇作燃料，在用伏特加、松子 酒、白葡萄酒和啤酒作燃料时都能成功地运行。在技术上采用改性的n a f i o n 膜 来固定酶使酶在电极上的生存环境得到改善，电池可以连续工作3 0 到5 0 天不失 效( 其他的生物燃料电池一般为几天) 。电池开路电压达到0 6 0 _ _ o 8 2 v 最大功率 1 1 6m w c m 2 。m i n t e e r 的小组正在致力于生物燃料电池的小型应用如移动电话电 源并声称为他们的成果申请专利。m i n t e e r 小组的进展马上引起关注，美国媒体 纷纷予以报导。 同时也出现了两极都采用酶作为催化剂的生物燃料电池。k a n ok e n j i 与 i k e d at o k u j i 研究了生理条件下运行的葡萄糖0 2 燃料电池，将交联胆红素氧化 酶的0 s 氧化还原聚合物修饰的玻碳电极作为阴极，交联p q q - g d h 或p 0 0 一g o d 的0 s 氧化还原聚合物修饰的玻碳电极作为阳极，最大的能量密度为0 0 5 8m w c m 2 。 6 硕士学位论文第一章文献综述 1 2 酶修饰电极 1 2 1 酶与电极之间的电子传递 生物燃料电池自身潜在的优点使人们对它的发展前景看好，但要作为电源应 用于实际生产与生活还比较遥远。主要原因是其输出功率密度远远不能满足实际 要求。生物燃料电池的功率密度远远小于目前质予交换膜燃料电池的功率密度， 目前报道最高的生物燃料电池的功率密度为1 1 6 1 m w c m 2 “”。 制约生物燃料电池输出功率密度的最大因素是电子传递过程。按照m a r c u s 和s u t i n “7 1 提出的理论，电子转移速率由电势差，重组能和电子供体与受体之间 的距离决定。理论和实验均表明，随传递距离的增加，电子转移速率呈指数下降 的趋势。在这种情况下，即使将这些酶固定在电极的表面上，仅仅是酶分子蛋白 质外壳的厚度就足以对电子由活性中心到电极的直接传递过程产生屏蔽作用。微 生物细胞的体积要比酶分子大得多，所以在微生物燃料电池中，屏蔽作用就更加 明显。 为打破屏蔽，人们提出了使用氧化还原介体的方法并已进行了大量的研究。 尽管介体有效地提供了电子迁移的途径，但也增加了所需要的环节，而其综合结 果还远不能令人满意。而在生物电极领域关于直接电子传递研究的许多方法和结 果有可能为生物燃料电池借鉴，其中或许已经暗示了提高电池功率密度的途径。 以酶电极为例，实现直接电子传递的方法主要有以下几种。 ( 1 ) 酶分子的蛋白质外壳进行修饰，使它能够允许电子通过，然后再把修饰 后的酶固定到电极上。 ( 2 ) 聚合物固定酶。导电聚合物就象是导线一样，穿过蛋白质外壳，将电极 延伸至酶分子活性中心附近，大大缩短电子传递的距离，从而实现电子的直接 传递”。 ( 3 ) 通过在电极表面进行贵金属纳米粒子、以及碳纳米管等物质的修饰，利 用纳米粒子的尺寸效应、表面效应等奇妙的特性来实现直接的、快速的电子传递。 1 2 2 酶在电极上的固定 固定过程是通过化学或物理方法将生物活性分子束缚在载体材料上，使之 只能在载体中发生催化反应。生物分子在电极表面的固定方法通常主要有吸附、 交联、共价键合和聚合物凝胶包埋。这些方法均存在一些不足，吸附和包埋法固 定的生物分子稳定性差，交联和共价键合过程中会引起生物活性分子的失活。因 7 硕士学位论文 第一章文献综述 此，探索新的生物活性分子固定方法和固定材料是生物修饰电极领域中有重要意 义的工作。 1 3 聚合物酶修饰电极 1 3 1 导电聚合物固定生物分子的原理”1 1 用于固定生物活性分子的导电聚合物。2 1 主要有聚吡咯”、聚苯胺删、聚 噻吩。它们处于导电状态时的电子结构如图1 - 2 所示。 优a - 。o i 。+ 赢， l 即 o n o 蒹。o 。“， h q b q 式中r ：p o l y a n i l i n ec h r i n w i t hnu n i to f a n i l i n e ( 2 1 ) 1 6 硕士学位论文 第二章聚苯胺l 醇脱氢酶修饰铂电极的研究 图2 - 1 在0 i m o l l 苯胺一1 o m o l lh c l 溶液中苯胺在p t 电极土电化学聚合首次循环伏安 图。扫描速率5 0 m v s 。1 f i g 2 it h ef i r s tc y c l i cv o l t a m m o g r a mo f a n i l i n ep o l y m e r i z a t i o no nb a r ep te l e c t r o d ei na q t m o u s s o l u t i o nc o n t a i n i n g0 i m o l la n i l i n ea n d1 o m o l lh c ia t5 0 m v s 1 图2 - 2 在0 1 m o l l 苯胺一1 o m o l lh c i 溶液中苯胺在p t 电极上电化学聚合过程循环伏安 图，扫描速率5 0 m v s 1 f i g 2 - 2c y c l i cv o l 切m m o g r a m so f a n i l i n ep o l y m e r i z a t i o no nb a r ep te l e c t n x l ei na q u e o u ss o l u t i o n c o n t a i n i n 9 0 i m o l la n i l i n e a n di o m o i l h c ia t 5 0 m v s - l 当把循环扫描电位上限扩大到1 1 v 时，发现聚苯胺的聚合速度非常快。考 虑到高电位会引起聚苯胺的过氧化及降解，从而影响聚苯胺的导电性。在o 8 1 0 v 范围内改变扫描电位上限，实验发现，当电位在o 8 v 以下时，首次循环伏 安曲线上没有出现正向滞环，且聚合电流非常小，苯胺很难聚合，并且电极上得 到的是粉色覆盖物。当首次扫描电位范围为- 0 2 o 9 v ，后续扫描电位范围为 - 0 2 o 7 8 v 时，循环伏安图中只出现两对氧化还原峰( 如图2 3 ) ，对应于聚苯 胺自身的氧化还原，而1 8 0 7 5 0 m v 电位区间的氧化还原峰不明显，说明这对峰 的出现与扫描电位有关。证明了可以通过选择适当的电位来抑制聚苯胺膜的降 解，这对保持电极的稳定性是非常有效的。在每一次循环过程中，电极的颜色只 b t 墨 l 8 j 墨 硕士学位论文第二章聚苯胺，乙醇脱氢酶修饰铂电极的研究 在绿色与蓝色之间变化，可逆性好。 i 日n s 图2 3 在0 1m o l l 苯胺一1 0m o l lh c i 溶液中笨胺在p t 电极上电化学 聚合过程循环伏安图，扫描速率5 0m v s 1 f i g 2 - 3c y c l i c v o l t a m m o g r a m so f a n i l i n ep o l y m e r i z a t i o no i lb a r ep te l e c t r o d ei n a q u e o u ss o l u t i o n c o n t a i n i n 9 0 1 m o l la n i l i n ea n d1 0 m o l l h c ia t 5 0 m v s 1 2 3 2 苯胺浓度对聚合的影响 实验过程中考察了苯胺浓度对聚合的影响，当苯胺浓度小于0 0 2 m o l l 时， 很难在电极上聚合；而当苯胺浓度大于0 5 m o l l 时，制备的聚苯胺膜很不均匀， 考虑到两方面的影响，选取苯胺的浓度为0 2 m o l l 。 2 3 3 电解质对苯胺聚合的影响 采用循环伏安法制备p a n p t 电极，聚合液为0 2m o l l 苯胺一1 0m o l lk c l 溶液，扫描电位一0 2 1 o v ，描速率为5 0m y s 一，循环1 0 次。实验发现，苯胺 在中性介质中较酸性介质中较难聚合，经过1 0 个循环后，在电极表面得到一层 很薄的浅棕色膜。图2 - 4 显示，用循环伏安法在中性介质中制备p a n p t 电极的 过程中，第1 个循环在0 8 2 v 出现一个氧化峰，随着聚合的进行，氧化峰逐渐向 正电位方向移动，并且峰电流密度显著降低，第4 个循环以后，伏安曲线基本稳 定，第4 个循环和第1 0 个循环得到的曲线基本重合。在整个聚合过程中，伏安 曲线上没有观察到还原峰。可能是因为在第1 个循环中，苯胺单体在电极表面氧 化成胺基阳离子，导致电流增大。随着聚合的进行，胺基阳离子与苯胺单体形成 长链聚合物覆盖在铂电极上，而中性条件下制备的聚苯胺的导电性较差，随着膜 厚度增加，膜电阻增大，苯胺的电化学聚合变得困难，到第4 个循环以后，聚合 十分缓慢。在整个聚合过程没有观察到还原峰，说明此种条件下苯胺的电化学氧 化为不可逆过程，所制得的聚苯胺膜不具有氧化还原活性，因而不能用作酶催化 硕士学位论文 第二章聚苯胺，乙醇脱氢酶修饰铂电极的研究 反应的媒介体。 踟ns c d 图2 - 4 在o 2 m o l l 苯胺一1 o m o l lk c i 溶液中苯胺在p t 电极上电化学聚合过程循环伏安 图，扫描速率5 0 m v s - 1 f i g 2 - 4c y c l i cv o l t a m m o g r a m so f a n i l i n ep o l y m e r i z a t i o no nb a r ep te l e c t r o d ei n a q u e o u ss o l u t i o n c o n t a i n i n 9 0 2 m o l la n i l i n e a n d ! o m o l l k c ia t 5 0 m v s 1 2 3 4 聚苯胺膜在不同酸性溶液中的循环伏安曲线 图2 - 5p a n p t 电极在三个不同溶液体系中循环伏安图，扫描速率1 0 m y s 4 f i g 2 - 5c y c l i cv o l t a m m o g r a mo f p a n p te l e c t r o d ei nd i f f e r e n ts o l u t i o n sa t1 0 m v s 1 在0 2m o l l 苯胺、1 0m o l l h c i 的溶液中，首次扫描电位为- o 2 o 9 v ， 后续扫描电位为一0 2 0 7 8 v ，扫描十五个循环得到性能良好的聚苯胺膜，用 1 o m o l kh c l 溶液冲洗p a n 修饰电极表面残留的苯胺单体，测试其在不同酸度 溶液中的循环伏安曲线，如图2 - 5 所示。可以看出，溶液的酸度对p a n 膜的电化 学性能有很大的影响，在1 o m o l l8 c l 溶液中出现三对氧化还原峰，三对峰的 1 9 ，e !、自暑 硕士学位论文第二章聚苯胺，乙醇脱氢酶修饰铂电极的研究 位置与聚合过程中的大致一致，说明了第二对峰的存在与溶液中是否含苯胺单体 无关；p h = 2 4 时只出现两对氧化还原峰；当p h = 7 时氧化还原峰消失，电流不明 显，只有当电压超过1 0 v 时电流才有显著增加，可能对应于聚苯胺膜的进一步 氧化。随着p h 值的增加，第一对氧化还原峰的峰电流下降，第二对氧化还原峰 向负方向移动。 上面的实验表明，经盐酸质子化掺杂得到的聚苯胺膜在酸性溶液中具有良好 的电化学活性，但随着溶液p h 值的增大，聚苯胺膜的电化学活性变差，当p h 值为7 时，聚苯胺膜完全失去了电化学活性。为使聚苯胺膜在中性缓冲液中仍具 有电化学活性，从而应用于酶的固定材料，实验用聚阴离子对聚苯胺膜进行改性。 2 4 聚丙烯酸对聚苯胺膜的改性研究 由于n a d h 在p h 7 0 时迅速水解，而翠绿亚胺型的聚苯胺( 部分氧化态聚 苯胺，质子导体) 在中性条件下通常发生去质子化而变得不导电，因此，必须使 用苯胺和高分子对阴离子一起聚合得到聚苯胺膜，使得膜在p h - - - - 7 0 0 时仍然具 有电活性。聚合物对阴离子被包覆在聚苯胺膜中，这样翠绿亚胺型聚苯胺的去质 子化只有在膜中质子的脱出和外界阴离子的进入相平衡的条件下才会发生“”。此 外，a d h 为生物活性物质，等电点为5 4 ，只能在接近中性条件下才具有生物活 性。所以，采用聚丙稀酸作为掺杂聚合物，改变聚苯胺膜的结构，维持其在中性 条件下的电活性。并且聚丙稀酸中存在羧基，能够与生物分子发生羧氨酸耦合反 应“”，形成较强的相互作用，从而有利于活性物质a d h 在聚合物中的固定。此外， 聚丙烯酸不仅具有分子载体的功能，而且会使聚合物膜产生多孔的结构，而这种 结构对改善生物修饰电极的性能是有利的嗍除p 从( p o l y a c r y l a t e ，聚丙稀酸) 外，也可以采用p v s ( p o l y v i n y l s u l f o n a t e ，聚乙烯基磺酸) 作为掺杂聚合物对 阴离子，它和聚丙稀酸具有相同的分子骨架啪1 。 2 4 1 聚苯胺聚丙烯酸复合膜的制备 图2 - 6 是苯胺在p a a 酸性溶液中聚合时的循环伏安曲线，当电压大于o 8v 时聚合电流急剧上升，此现象与苯胺在未含聚丙烯酸溶液中电聚合一致，说明聚 丙烯酸的存在不改变苯胺在铂电极上的聚合机理。循环伏安曲线表明，当加入 p a a 后只于o 0 3 v 之间出现一对氧化还原峰，在0 4 o 7 5 v 之间没有出现聚 苯胺降解产物b q h q 的可逆峰，聚苯胺本身的第二对氧化还原峰在扫描电压范 围内没有出现，只是随着扫描次数的增加，o 7 8 v 时的聚合电流增加，说明 p a n - p a a 膜逐步在铂电极上生成，这一点也可以从依次增加的峰电流得到证明。 硕士学位论文第二章聚苯胺，乙醇脱氢酶修饰铂电极的研究 勺 图2 - 6 在0 5m o l l 苯胺一2 5m o l lh c i 一1 5 w t 聚丙稀酸溶液中苯胺 在p t 电极上电化学聚合过程循环伏安图，扫描速率5 0 m y s “ f i g 2 - 6c y c l i cv o l t a n u n o g r m n so f a n i l i n ep o l y m er i z a t i o no nb a r ep te l e c t r o d ei na q u e o u s s o l u t i o nc o n t a i n i n g0 5m o l la n i l i n e 2 5m o l l h c ia n d1 5 w t a n i l i n e s c a nr a t e ：5 0 m v s - 1 2 4 2 聚苯胺聚丙烯酸复合膜在磷酸缓冲溶液中的c v 曲线 图2 - 7p a n - p a a p t 电板在p h - 7 0 0 缓冲液 中循环伏安图，扫描速率1 0 m v - s “ f i g 2 - 7c y c l i cv o l t a m m o g r a m so f p a n - p a a p te l e c t r o d ei nb u f f e rs o l u t i o nw i t h p h - - 7 0 0 。s c a nr a t e ：1 0 m v s i l 图2 - 8p n p 从p t 电极在p h - 7 0 0 缓冲溶 液中在不同扫描速率下的循环伏安图， f i g 2 - 8c y c l i cv o l t a m m o g r a m so f p a n - p a a p t e l e c t r o d ei nb u f f e rw i t hp h - - - 7 0 0a td i f f e r e n t s c a nr a t e s 聚苯胺膜的电化学活性受溶液的p h 值的影响比较大，在磷酸盐中性缓冲溶 液中电化学活性变差。实验考察了p a n - p a a 修饰电极在中性介质中的电化学活 性，图2 7 所示为p a n - p a a 膜在中性缓冲溶液第l 、4 、8 、1 6 、2 0 次的c v 曲 线，在_ o 2 o 4 v 之间出现一对稳定明显的氧化还原峰，它对应于聚苯胺完全还 2 l l i 硕七学位论文 第二章聚苯胺，乙醇脱氢酶修饰铂电极的研究 原态与半氧化态半还原态的电化学反应。当聚苯胺膜中掺入聚丙烯酸聚阴离子 后，由于聚丙烯酸的分子量比较大，难以从聚苯胺膜中脱出。为了保持导电聚合 物的电中性，聚苯胺的去质子化比较