（食品科学专业论文）高压CO2杀灭芽孢机理和协同措施研究.pdf

高压c 0 2 杀灭芽孢机理和协同措施研究 摘要 芽孢是自然界中抗逆性最强的生物体，由于其自身的特殊结构，给人们的生活生产 都带来了不小的麻烦。高压c 0 2 杀菌技术作为一种新型非热力杀菌技术，不但能够有 效杀死食品中细菌的营养体，而且对于细菌芽胞也有一定的杀灭作用，且处理温度温和， 对食品中的热敏物质破坏作用小，有利于保持食品原有品质。本文通过超l 临界达到高压 c 0 2 的状态，主要对超临界c 0 2 ( s c c 0 2 ) 杀灭芽孢工艺、协同剂及萌发剂对杀灭效果的 影响进行研究，并初步探讨了超临界c 0 2 杀灭芽孢的机理。主要结论如下： 1 ) 通过单因素实验，确定了影响杀菌工艺的主要因素为压力、温度和时间，通过 正交试验，杀灭芽孢的最佳工艺参数为：压力2 0 m p a ，温度3 5 ，处理时间3 0 m i n ， 处理两次，芽孢杀灭对数值为3 4 8 。 2 ) 作为协同剂的乙醇和h 2 0 2 对杀灭芽孢都有较好的协同作用，其中添加0 6 h 2 0 2 的芽孢杀灭对数值为4 8 5 ，而异丙醇对杀灭芽孢的协同作用不大；而作为芽孢萌发剂的 l 丙氨酸和葡萄糖，常温常压下对芽孢的萌发都有一定的促进作用，但经s c c 0 2 处理 时添加l 丙氨酸的实验组比添加葡萄糖的实验组的致死率要高，添加浓度为1 0 0 m m o l l 的l 丙氨酸，经s c c 0 2 处理后，芽孢杀灭对数值为4 0 5 。 3 ) 通过扫描电镜( s e m ) 对处理和未处理的芽孢观察后发现，经过s c c 0 2 处理过的 芽孢，形态部分发生了变化，压力造成的机械损伤导致了部分芽孢死亡，但同时s c c 0 2 处理会形成菌悬团，从而增加杀灭的难度，致使杀菌不够彻底。 4 ) 通过对芽孢内蛋白、核酸泄漏物的检测发现，虽然经过s c c 0 2 处理后，芽孢内 含物有所泄露，但在较低压力和温度的作用下，内含物的泄漏量也较少，由超临界引起 机械作用而直接杀灭的芽孢能力较弱。因此提高芽孢的萌发率是杀灭芽孢的关键。 关键词：芽孢超临界c 0 2协同剂萌发剂杀灭对数值 t h em e c h a n i s ma n ds y n e r g i s t i cm e a s u r eo fs t e r i l i z i n gs p o r e sb y h i g hp r e s s u r ec a r b o nd i o x i d e a b s t r a c t s p o r ei sc o n s i d e r e dt h es t r o n g e s tr e s i s t a n c ei nn a t u r eb e c a u s e o ft h e i r ss p e c i a ls t r u c t u r e ， a n d t h e yb r i n gm a n yt r o u b l e si np e o p l e sl i v e sa n dp r o d u c t i o n h i g hp r e s s u r ec a r b o md i o x i d e a san e ws t e r i l i z a t i o nt e c h n o l o g y ，i tn o to n l yc a nk i l ln u t r i t i o nc e l l s ，b u ta l s os p o r e si nf o o d t h em i l dt e m p e r a t u r ea n dt h ew e a kd e s t o r yt os e n s i t i v em a t e r i a l s ，w h i c hi sp r o p i t i o u st ok e e p o r i g i n a lc h a r a c t e r s t h i st h e s i sf o c u s e do nt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n so fs t e r i l i z i n gs p o r e sb y s u p e r c r i t i c a lc a r b o md i o x i d et r e a t m e n t , t h ee f f e c to fs y n e r g i s t i ca n db o u r g e o n i n gr e a g e n t st o k i l ls p o r e s ，a n dt h em e c h a n i s mo fs t e r i l i z i n gs p o r e sb ys u p e r c r i t i c a lc a r b o md i o x i d et r e a t m e n t t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 ) i tw a sc e r t a i nt h a tt h ep r e s s u r e ，t e m p e r a t u r ea n dt i m ew e r et h em a i np a r a m e t e r sb y s i g n a le x p e r i m e n t b yo r t h o g o n a lt e s tt h eo p t i m a ld e c i s i o n t os t e r i l i z eb a c i l l u ss u b t i l i ss p o r e s w a st h a tp r e s s u r eo f2 0 m p a , t e m p e r a t u r eo f3 5 * ( 3 ，3 0 m i n sa n dt w i c ec o u r s e s ，a n dt h el o g r e d u c t i o no fs p o r e sw a s3 4 8 2 ) t h ee t h a n o la n dh y d r o g e np e r o x i d eh a v eb e t t e rs y n e r g i s t i cr e a c t i o nt ok i l ls p o r e s t h e l o gr e d u c t i o nc a nu pt o 4 8 5b ya d d i n go 6 h y d r o g e np e r o x i d e b u tt h ef u n c t i o no f i s o p r o p a n o li sr a r e l y l - a l a n i n ea n dg l u c o s ec a l l a l s oa c c e l e r a t es p o r e sb o u r g e o n i n go r d i n a r y c o n d i t i o n ，b u te x p e r i m e n t a lg r o u pa d d i n gl a l a n i n eh a sh i g h e rd e a dr a t et h a na d d i n gg l u c o s e b ys u p e r c r i t i c a lc a r b o md i o x i d et r e e a t m e n t t h el o gr e d u c t i o ni s 4 0 5w h i c ha d d i n g 1o o m m o l ll a l a n i n e 3 ) c o m p a r e dw i t hu n t r e a t i n gs a m p l e s ，t h es p o r e st r e a t i n gb ys u p e r c r i t i c a lc a r b o r n d i o x i d e ，t h e i r ss h a p e sw e r ec h a n g e dp a r t l yo b s e r v e db ys c a ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ，a n d m e c h a n i c a li n j u r ec a s u e db yp r e s s u r el e a dt od e a d b u tt h em e a n t i m ef o r m e db a c t e r i a h a n g i n gm i s s i o ni n c r e a s e dd i f f i c u l t yo fs t e r i l i z i n g f o rt h i sr e a s o n , t h ed e g r e eo fs t e r i l i z i n gi s n o tt h o r o u g h 4 ) t e s t e dt h el e a k a g eo fp r o t e i na n d n u c l e i ca c i dw i t h i ns p o r e s ，w h i c hl e a kb y s u p e r c r i t i c a lc a r b o md i o x i d et r e a t m e n t b u tu n d e rt h el o w e rp r e s s u r ea n dt e m p e r a u r e ，t h e l e v e lo fl e a k a g ew a sa l s ol e s s ，a n dt h ea b i l i 够o fk i l l i n gs p o r e sc a u s e db ym e c h a n i c a lf o r c e w a sf e e b l e s oi tw a si m p o r t a n tt oi m p r o v eb o u r g e o n i n gr a t et os t e r i l i z i n gs p o r e s k e y w o r d s ：s p o r e s ；s u p e r c r i t i c a lc a r b o md i o x i d e ；s y n e r g i s t i cr e a g e n t s ；b o u r g e o n i n gr e a g e n t s ； l o gr e d u c t i o n 插图清单 图1 1 芽孢结构示意图1 图1 2 芽孢的类型2 图1 3 芽孢的萌发3 图l - 4 芽孢萌发过程示意图3 图2 1 超临界c 0 2 灭菌设备示意图一9 图2 2d p a 标准曲线1 4 图2 3 压力对d p a 释放量的影响1 4 图2 - 4 温度对d p a 释放量的影响1 5 图2 5 时间对d p a 释放量的影响1 5 图3 1 乙醇对d p a 释放量的影响2 1 图3 2h 2 0 2 对d p a 释放量的影响2 1 图3 3 异丙醇对d p a 释放量的影响2 1 图3 - 4 乙醇对芽孢杀灭效果的影响一2 2 图3 5 异丙醇对芽孢杀灭效果的影响2 2 图3 - 6h 2 0 2 对芽孢杀灭效果的影响2 2 图3 7 不同萌发剂的杀灭效果2 5 图4 1 未处理的芽孢扫描电镜图。2 8 图4 2s c c 0 2 处理一次芽孢扫描电镜图。2 8 图4 3s c c 0 2 处理两次芽孢扫描电镜图2 8 图4 4 芽孢凝结扫描电镜图2 8 图4 5d p a 标准液的电泳图2 9 图4 6s c c 0 2 处理后的电泳图2 9 图4 7 超临界处理对芽孢萌发率的影响一2 9 图4 8 温度对芽孢萌发率的影响。3 0 图4 9 酸度对芽孢萌发率的影响3 0 图4 1 0 时间对芽孢萌发率的影响3 l 图4 1 1 处理和未处理对芽孢内蛋白、核酸泄露的影响3 1 图4 1 2 时间对芽孢内蛋白、核酸泄露的影响3 2 v i 表格清单 表2 1 超临界设备无菌清洗处理条件平板计数1 3 表2 2 正交试验结果1 6 表2 3d p a 释放量方差分析16 表2 - 4 芽孢杀灭对数值级方差分析17 表2 5 处理次数对d p a 释放量及芽孢杀灭对数值的影响1 7 表3 1 添加乙醇的样液配制1 9 表3 2 添加h 2 0 2 的样液的配制1 9 表3 3 添加异丙醇的样液配制1 9 表3 4 常压处理和超临界处理的对照试验2 3 表3 5h 2 0 2 残留的测定2 3 表3 - 6l 丙氨酸对芽孢萌发的影响2 4 表3 75 葡萄糖对芽孢萌发的影响2 4 v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知， 除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得金壁王些盔堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签字苓鼓旁签字日期： 和年j 月乒日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金壁工些盔堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权 金壁王些太堂 可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名：夕投 签字日期：纠p 年上月 r 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期：扫，。年厂月够e t 电话： 邮编： 、毋归 致谢 本论文是在导师周先汉副教授的悉心指导下完成的。从论文的选题、试验方案的制 定、具体问题的解决到论文的成稿直至日常生活中的细节，都得到了导师的大力帮助和 支持。正是老师广博的学识、严谨的科学思想、诲人不倦的教育情怀和求实的科研作风， 让我充实愉快的度过我的研究生阶段。在我的人生中有了这么一位好老师，必将使我终 身受益，在此向周老师表示深深的敬意和衷心的感谢! 本实验特别得到了曾庆梅教授的悉心指导，使得实验得以顺利的完成，在此表示感 谢! 此外，陈从贵老师、王泽南老师、王武老师、陆剑锋老师、孙汉巨老师等给了我许 多亲切的指导和关怀；同时宋俊骅，程丽梅，郑钰，焦道龙，张伟伟，范婷婷，易守连， 唐晓明，李洪波，高媛，李琪玲等同学以及实验室的老师在试验实施的过程中给予了大 力的支持，借此机会，向他们表示最诚挚的谢意! 本实验还要特别感谢国家自然科学基金面上项目，热敏性果汁超高压杀菌灭酶机 理及降压协同措施研究，批准号：3 0 5 7 1 3 0 4 ，以及国家自然科学基金面上项目，热 敏性果汁高密度c 0 2 杀菌机制和协同措施研究，批准号：3 0 8 7 1 7 3 9 。 最后，还要特别感谢我的父母，他们给了我精神上的的鼓舞和生活上的关心，使我 能够安心学习和顺利毕业! 再次感谢所有与我共度这段岁月的老师、同学、朋友和家人! i i i 作者：张安 2 0 1 0 年4 月 第一章绪论 1 1 芽孢简介 1 l1 芽孢 芽孢( s p o r e ) 又称内生孢于，是产芽孢细菌细胞的特殊结构。大多数产芽孢的细菌园 生长环境缺乏营养或有害代谢产物积累过多时，繁殖速度下降，菌体的细胞原生质浓缩， 在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的特殊休眠体叽芽孢是整个生物界抗逆性最 强的生命体，在抗热、抗化学药物、抗辐射、抗高压等方面更是首屈一指8 l 。 1 12 芽孢的构造 细菌芽胞的结构与其营养体有 很大差别。芽胞的某些结构和组成成 分是生长细胞所不具有的。这正是细 菌的芽胞对物理或化学处理具有很 高的抗性而其营养体却相对容易被 杀灭的原因所在。芽孢的结构从外到 内分别为孢外壁、芽孢衣、皮层、芽 孢壁、芽孢膜、芽孢质、芽孢核区， 其中芽孢壁、芽孢质膜、芽孢质、芽 孢核区组成了芽孢的核心口】。 图l _ 1 芽孢结构示意图 f i gl - 1 s k h c b m a p o f s p o r e ss 仉】a m 卜 孢外壁( e x o s p o r i t u n ) ，主要由碳水化合物和高分子蛋白质组成，但其具体功能尚不 清楚，也没有证据表明该结构在维持芽胞的高抗性中有任何作用 i 。 芽孢衣( s p o r ec o a t ) ，厚度约3 r i m ，由多达2 5 种常有高度横向联系的多肽组成口】，主 要含有疏水性的角蛋白( 占芽孢总蛋白的5 0 8 0 ，其中水溶性差的胱氨酸、半胱氨 酸和赖氨酸含量很高) 。芽孢农对溶菌酶、蛋白酶和表面活性剂具有很强的抗性，可以 确保芽胞免受溶菌酶等大分子的攻击，而对多价阳离子的透性也很差。该层对于维持芽 胞对有毒试剂的抗性是非常重要的，原因可能是它可以作用于有毒试剂进而消除有毒试 剂对芽胞的毒害作用t 4 j ：研究表明芽胞衣对维持芽胞的高抗压性作用不大，但是对维持 其耐热性很重要1 5 , q 。 皮层( c o r t e x ) ，在芽孢中占有很大的体积0 6 6 0 蛳，内含有大量为芽孢皮层所特有的 芽孢肚聚糖，其特点是纤维束装、交联度小、负电荷强及可被溶菌酶水解。还含有占芽孢 干重7 6 o - , , 1 0 “o 的d p a - c 缸吡啶二羧酸钙盐) ，这是芽孢所特有的( 一般的营养细胞没有) ，不 含磷壁酸。皮层的渗透压可以达到2 0 个大气压左右，含水量约为7 0 ，略低于营养细胞( 约 8 0 蛳，而比芽孢的平均含水量高出许多( 约4 0 h p o p h a t n 等提出芽孢渗透阻隔性的减弱( 如 可以通过一些小分子溶物) 与皮层的溶解很有可能是两个独立的过程。芽孢皮层溶解与芽孢 发芽、核心水合和膨胀有一定的关联。芽胞皮层在保持芽胞核心区域或内核的低水分含量 具有重要作用，影响芽胞的休眠n 因此皮层的降解是芽胞萌发的必经之路。 核心f c o r c l ，又称为芽孢的原生质体，由芽孢壁、芽孢膜、芽孢质和核区4 个部分 构成，含水量极低。除芽孢膜中不含有磷壁酸和芽孢质中含有d p a - c a 外，核中心的其 他成分与一般细胞相似。 芽孢壁( g 锄c e l lw 甜1 ) ，同芽胞皮层一样主要由肽聚糖组成，但是两者的肽聚糖的 结构有所不同，该层在芽胞萌发后转化成生长细胞的细胞壁。芽胞的内膜层( i n n e r m e m b r a n e ) ，是一层完整的、具有特殊性质的膜层，对小分子物质具有极低的渗透性， 对于保护芽胞d n a 免受外来有毒试剂破坏具有重要作用田。尽管芽胞的内膜层对于芽 胞有着及其重要的作用，但是其具体结构却尚不清楚。 n 已有研究表明核心内的2 , 6 吡啶二羧酸恻7wx c o o h 与多种二价阳离子螯合使芽 胞对湿热和过氧化氢具有高抗性，但是对芽胞的抗紫外线能力影响不大。芽胞的核心具 有两个重要特性：一是水分含量低，芽胞的水分含量依不同种类介于2 5 5 5 。低水 分含量对于芽胞保持休眠状态和高抗湿热性有重要作用，有研究者认为这是因为核心区 的低水分含量使酶类被禁锢在特定区域，核心呈玻璃体状态 9 1 0 i ；二是芽胞核心的p h 值较生长细胞的低1 0 i5 单位。在芽胞形成的后期形成，这对于此时调节几种关键酶 的活性非常重要。低p h 值在芽胞萌发后的最初几分钟里通过向外排出质子而消失。此 外，在核心内含量很少( 约占5 ) 的低分子量的邮型酸溶性芽胞蛋白( 邮t y p es m a l l a c i d s o l u b l e p r o t e i n s a s p s ) 与d n a 相结合，改变d n a 的结构，在保护d n a 免受湿热 或者干热、氧化剂和紫外线等的破坏中起重要作用，l2 _ ”j 。 1 13 芽孢的类型 a 日9o ? o 目十榭 n 利 拉n镕十一 种珲雁 * i i n 图1 之芽孢的类型 f i g 1 2 1 帅o f s p o r 自s 各种细菌芽孢形成的位置、彤状和大小是一定的，但也受环境条件的影响。多数好 氧性的芽孢杆菌形成的芽孢位于细胞中央或近中央的部位，其直径小于细胞的宽度，如 枯草芽孢杆菌s u b t i l i s ) 、巨大芽孢杆菌 m e g a t e r i u m ) 、蜡状芽孢杆菌皿c e r e u s ) 等。大 多数厌氧芽孢杆菌的芽孢也位于细胞的中央，但直径大于细胞的宽度，因此细胞呈两头 小、中间大的梭状。但有些厌氧苗如克氏梭状芽孢杆菌( c l d u y v e r i l ) 的一些细胞形成的 芽孢位于细胞的一端，其直径大于细胞的宽度，细胞呈鼓槌状。 1 14 芽孢的萌发 囝辆酶”鹫 图1 3 芽孢的萌发 f i b 1 - 3b o u r g e o n i n g o f s p o r e s 7 幡。堪多, t - a * 上i # 竹饨性 图1 4 芽孢萌发过程示意图 f i 9 1 - 4s k e k h m a p o f s p o r e s b o u r g c o n i n g 芽孢萌发机制分为营养机制和非营养机制。营养萌发机制需要营养萌发因子，依靠 受体蛋白对其识别；非营养萌发机制则依靠化学发芽因子d p a - c a 的释放( 泄漏) ，水的 移动方向与其相反，进入核心发生水合，降低了芽孢对湿热的部分抗性，皮层溶解，核 心进一步水舍膨胀，细胞壁膨胀，蛋白质活性的恢复也使得酶开始活动，但这一切的发 生没有伴随明显的能量上的新陈代谢。接着存在于休眠芽孢中的低能量前体物会转化为 可利用的能量源( 比如a t p ) ，并进一步发生新陈代谢，s a s p 降解，大分子物质合成， 脱去芽孢外衣，出芽。 在图1 4 中，阶段l ：矿( 可能从核心释放出来，因为发现核心p h 从65 变至77 ) 、 z n 2 + 释放，芽孢新陈代新是一个必要的步骤，使得核心水合到一定程度足以使酶激活， 水是d p a 的替代者，降低了芽孢对湿热的部分抗性，但此时核心的水台程度还不能对 留 核心中的蛋白质活性或酶作用产生影响；阶段i i ：这个过程导致蛋白质活性的恢复，也 使得酶开始活动。但这一切的发生没有伴随明显的能量上的新陈代谢【1 4 1 。 1 1 5 芽孢对人类生活的影响 芽孢对人体是有害的。最常见的情况之一，就是用加热法保存食品时，芽孢往往会 造成保存的失败。这是因为芽孢极耐热，一般加热方法不能把它杀死，它萌发成营养细 胞后大量繁殖，会导致食品腐败变质。因此需要用高压蒸汽灭菌法( 1 2 1 ，3 0 m i n ) 将其 杀死，才能使食品长期保存【1 5 1 。 1 2 高压c 0 2 灭菌技术 c 0 2 是一种特殊的气体，呈化学惰性，常温常压下无色、无味、无毒。在临界温度( 3 1 1 ) 和i 临界压力( 7 3 6 m p a ) 以上，c 0 2 只能以流体形式存在，而且具有气体的低黏度、高扩散系 数和液体的高密度，能溶解很多物质【1 6 1 。c 0 2 是一种天然的抗微生物剂，与它的特殊性质 有很大关系。但是c 0 2 单独作用，只能抑制微生物生长，不能杀死微生物【r 7 1 。 高压c 0 2 ( 1 1 i g hp r e s s u r ec a r b o nd i o x i d e ，h p c d ) 杀菌技术作为一种新型非热力杀菌技 术，不但能够有效杀死食品中细菌的营养体，而且对于细菌芽胞也有一定的杀灭作用； 同时，h p c d 杀菌技术处理温度温和，对食品中的热敏物质破坏作用小，有利于保持食 品原有品质：与超高压杀菌技术( 3 0 0 6 0 0 m p a ) 相比，h p c d 杀菌技术处理压力低( 一般 2 0 m p a ) ，实现成本低并易于控制，日渐成为食品非热力杀菌技术研究的焦点之一。 1 2 1 高密度c 0 2 灭菌技术 c 0 2 水溶液呈弱酸性，在水中的溶解度遵循亨利定律。随着压力和温度的变化其存 在形态和物理性质发生变化。c 0 2 的临界压力和温度分别为7 3 6 m p a 和3 1 1 。在临界 点以上的c 0 2 以流体状态存在，称为超临界c 0 2 ( s u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d e ) 。有的研究 者把该临界点以下的c 0 2 称为亚临界c 0 2 ( s u b c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d e ) t 1 8 1 。高密度 c 0 2 ( d e n s e p h a s ec a r b o nd i o x i d e ，d p c d ) 贝l j 是指5 0 m p a 以下包括上述两种状态的c 0 2 【1 9 1 。 d p c d 技术是通过c 0 2 的分子效应来影响和杀灭微生物和酶，避免了热加工对食品 所带来的不良效应，可很好地保持食品品质。d p c d 技术对杀菌的效果受多方面因素的 影响，比如温度、压力、时间、水分活度、p h 、微生物种类等，其中以温度和压力的 影响最大。一般而言，增大压力可使超临界技术的杀菌效果更好，大多数采用的压力在 1 0 - 2 0 m p a 之间。d p c d 技术对微生物营养细胞的钝化效果良好，但对芽孢的钝化效果 则不如营养细胞，这与芽孢的性质有关【2 0 】。 1 2 2 超临界c 0 2 灭菌技术 超临界流体萃取技术是一种新型的化工分离技术。经过多年的研究和实践，基础理 论和应用领域都有了进一步的深化和发展。超临界流体技术的应用己从简单萃取发展到 有机合成，材料加工，环境保护和生物技术等多种领域。对某些热敏性的生物药物、制 剂或食品，用超临界c 0 2 处理，可在比较温和的条件下作用，抑制酶活和灭菌，避免因 高温消毒引起的不良影响。例如，用超临界c 0 2 处理骨骼和人造血浆可以脱脂和杀灭其 4 中的病毒，保证异源骨骼移植和输血的安全性【lo 】；利用超临界c 0 2 处理，在1 3 7 m p a 、 6 0 、7 5 m i n 条件下，可使桔汁中的果胶酶全部失活；超临界c 0 2 还可以作为一种微生 物灭菌方法，在2 5 m p a 、3 5 、3 0 m i n 条件下使乳酸短杆菌，啤酒酵母完全灭菌；5 m p a 、 3 5 、3 0 m i n 条件下用超临界c 0 2 处理，大肠杆菌l o g c f u 后c f u 前= 1 0 由1 2 。 超临界流体具有液体对溶质有较大溶解度，气体易于扩散和运动，传质速率大大高 于液体过程的优点。最近二三十年来，由于环保法规的颁布，超i 瞄界流体技术得到迅速 发展，成为国际上公认的绿色技术。超临界流体的密度对温度和压强的变化很敏感，而 其溶解能力在一定压强范围内与其密度成比例关系，通过对温度和压强的调控而改变物 质的溶解度；特别是在临界状态附近，超临界流体具有高度可压缩性，温度和压强的微 小变化往往会导致溶质的溶解度发生几个数量级的突变【2 2 1 。而c 0 2 在超临界状态下对 细胞具有很好的渗透性。本文研究的高压c 0 2 都是指超临界c 0 2 的情况。 到目前为止，有关超临界技术杀菌的机理还不是十分清楚，主要假说有： 1 ) 细胞的物理破坏 f r a s e r 于1 9 5 1 年首次认为超临界二氧化碳对微生物的钝化作用是由于细胞的物理 性破坏【2 3 1 。该过程包括细胞壁或者细胞膜的破坏，有可能是细胞完全被破坏或者只是 其表面具有皱纹或破洞。还有假设认为微生物被钝化或死亡是由于升压或处理过程c 0 2 分子已渗透细胞膜进入细胞，而在卸压过程中由于细胞内外的压力差导致细胞爆炸，从 而达到杀菌目的。n a k a m u r a 等人认为当用超临界二氧化碳处理微生物时，细胞c 0 2 的 吸收有可能导致微生物细胞膨胀从而导致机械性破坏【2 4 1 。许多研究者运用扫描电子显 微镜( s e m ) 观察处理后的微生物( 包括酵母、细菌等) ，发现细胞的外形都有不同程度破 裂和皱缩。总之，在超临界二氧化碳处理过程中造成的细胞形态学的变化可能与处理条 件、卸压速率、以及微生物的种类有关。值得注意的是细胞具有完整的细胞壁即无任何 破坏仍有内部微结构的改变或破坏。 2 ) 细胞膜的流动性改变使得细胞内溶物渗漏 h o n g 和p y u n 等用s e m 检测经过超临界二氧化碳处理的植物乳杆菌其细胞壁完整， 而用t e m 检测微观结构却证实了其细胞膜的改变，并推测可能伴随着细胞质的渗漏。 他们也证明了微生物经过超临界处理( 7 m p a 、3 0 、1 0 m i n ) 会造成一些不可逆破坏，包 括耐盐性丧失、紫外吸收物质泄露、离子释放以及质子渗透性削弱。通过用荧光桃红 ( p h l o x i n eb ) 对植物乳杆菌细胞染色，结果表明，一经超临界处理就使得细胞变得不完 整。i s e n c h m i d 等人推测分子态c 0 2 有可能渗入细胞膜并在膜内部聚集，打乱了磷脂链 的规则性，也称为“麻醉效应”，从而提高了膜的渗透性【2 5 1 。l i l l 等则认为渗入细胞的c 0 2 能溶解细胞内物质如磷脂等，而在卸压过程中将这些物质从细胞中提取出来。细胞及细 胞膜中脂肪或其他物质的渗漏是微生物致死的原因【2 副。 3 ) p h 值降低 在超临界二氧化碳处理过程c 0 2 溶解并渗透入食品的含水部分或者溶液中并形成碳 酸，而碳酸进一步分解成h c o 孓、c 0 3 玉、矿从而降低了细胞外部的p h ；另一方面，当环 境中有足量的高密度c 0 2 时，c 0 2 就会通过细胞膜渗透入细胞并超过细胞的缓冲能力而降 5 低细胞内部p h 。而细胞内部p h 值的降低比细胞外部p h 值降低更能导致微生物的死亡， 这可能是由于细胞内部p h 降低能钝化细胞内部一些与新陈代谢相关的关键酶，这些酶与 糖酵解、氨基酸和小分子肽的运输、离子交换以及蛋白转换等有关。l i n 等发现在p h 3 左 右，与新陈代谢有关的，如与糖酵解有关的一些关键性酶会发生不可逆性失活阑。 4 ) 碳酸盐的作用 c 0 2 分子渗透入细胞与水结合形成碳酸或分离成c 0 3 2 。并与细胞内的钙镁离子结合 生成碳酸钙镁盐，在细胞内部可能造成钝化作用。l i l l 等人认为可能是由于有一组对钙 镁敏感的蛋白对分子内部平衡十分重要，而它们容易因为碳酸盐而形成沉淀【2 6 】。这个 现象与带电离子的位点及蛋白的化学结构有关。总之由于蛋白的沉淀引起了对微生物的 钝化作用。 1 3 国内外研究进展 早在1 9 5 1 年，f r a s e r 就在自然上发表了有关高压c 0 2 具有杀菌作用的文章 2 3 1 。 直到近十几年来，压力c 0 2 的这一功能才逐渐被广泛重视，并在此基础上提出了新型 非热力杀菌技术超临界杀菌技术。1 9 8 7 年k a m i h i r a 等用超临界二氧化碳萃取装置 对细菌和酵母细胞经2 小时，3 5 和2 0 3 m p a 处理后使其减少1 0 6 + g t z n 。1 9 9 5 年石川 等运用亚临界和超临界c 0 2 系统有效减少食物中的微生物种群【2 引。 2 0 0 0 年在日本东京举办了日本2 0 0 0 国际食品工业展上，早川功等人开发出连续处 理装置，利用超临界二氧化碳法进行杀菌试验，实现了常温下的杀菌。该试验装置的工 作程序包括向物料供给加压c 0 2 、保持压力、c 0 2 减压3 个过程。实验方法是先用c 0 2 进行细胞膜、蛋白质疏水区域的渗透，经过一段时间后，快速减压，通过c 0 2 的急剧 膨胀，破坏疏水区域，达到杀菌目的。试验证明大肠菌、酵母、乳酸菌在6 0 a t m 压力下、 滞留1 3 r a i n 后完全失活。 由于孢子对热的耐受力很强，在一定的温度下结合高压c 0 2 能达到比单独热杀菌 更好的杀灭效果。研究表明，真菌的孢子比细菌的芽孢对高压c 0 2 的处理更敏感一些。 p b a l l e s t r a 等实验发现，对于枯草芽孢杆菌，高压c 0 2 在5 m p a ，8 0 条件下处理1 h 可 降低3 5 个对数值；而在同温同压无c 0 2 的处理下菌数没有明显变化。在8 0 时，高 压c 0 2 在5 m p a 条件下处理l h 能使其孢子的数量下降8 0 2 9 j 。 2 0 0 2 年s p i l i m b e r g o 等对铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 、枯草芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss u b t i l e ) 和枯草芽孢杆菌芽孢( s p o r e so f 丑s u b t i l e ) 进行了超临界c 0 2 流体的杀 菌试验，说明温度和保压时间是杀灭芽孢关键影响因子f 3 0 j 。 2 0 0 3 年，美国p r a x a i r ，i n c 公司在佛罗里达州的s u n o r c h a r d ，i n c 公司安装了国际上 第一条用于鲜橙汁杀菌的高密度c 0 2 杀菌装置，处理能力达1 5 0 l m i n ，产品质量达到 了f d a 关于强制执行的果汁h a c c p 规定的要求，将致病菌减少了5 个对数。 2 0 0 6 年，j i a n z h a n g 等阐明了运用超临界c 0 2 激发枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的机 理【3 l j 。同年，他们运用超临界c 0 2 技术杀灭短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) ，证明了在 6 0 ，2 7 5 m p a ，2 0 0 p p m 过氧化氢的添加量下能将芽孢完全杀灭【3 2 , 3 3 j 。 6 1 4 研究背景与实验方案 近年来，许多研究者提出了“冷杀菌”( 相对于高温杀菌而言) 的概念。高压c 0 2 灭菌 技术作为一种新型的食品杀菌技术，凭借其有效保留食品中原有营养价值、色泽和天然 风味的独特作用，使之得以广泛的应用畔l 。与湿热灭菌( 温度和时间组合) 相比，三维灭 菌模型( 压力、温度和时间的组合) 杀菌效果更佳1 3 引。 目前，我国对于高压c 0 2 杀菌技术研究得还不是很多。1 9 9 9 年，尹卓容等进行超 临界c 0 2 抑制脂肪氧化酶及灭菌作用的研究f 2 1 1 。此后也有许多关于运用超临界c 0 2 技 术杀菌灭酶的研究，但对于杀灭芽孢的研究很少。从目前国内外的研究现状来看，在应 用超临界c 0 2 杀灭芽孢时采用的温度过高，压力也偏大，还大量使用在食品中限制添 加的携带剂过氧化氢等，使得超临界c 0 2 杀菌技术的低温、低压、无毒、无残留等优 势不能得到很好的体现。 本课题将以枯草芽孢杆菌为主要研究对象，通过正交试验，探索出最佳灭菌工艺； 通过对最佳工艺的结果的电镜观察和分析，探寻杀灭芽孢的机理；依据试验结果，选取 适当的协同剂，优化结果。 7 第二章高压c 0 2 杀灭芽孢最佳工艺条件研究 本章以枯草芽孢杆菌为试验对象，通过单因素试验，选出较好的水平再进行正交试 验，探索超临界c 0 2 杀灭芽孢的最佳工艺条件。 2 1 试验材料和仪器 2 1 1 试验材料 菌种：枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，编号2 0 11 ，购于中国工业微生物菌种保藏 中，l , ( c i c c ) 。实验药品如下。 药品名称 乙酸钠 硫酸亚铁铵 抗坏血酸 磷酸二氢钠 氯化锰 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 冰醋酸 柠檬酸 磷酸氢二钠 藏红t 孔雀绿 7 5 乙醇消毒液 过氧化氢 9 5 乙醇 碘化钾 碘 结晶紫 草酸铵 2 , 6 - f l 啶二羧酸( e 帆q 2 1 2 仪器和设备 仪器设备型号及名称 电热恒温培养箱 t d l 5 0 b 台式离心机 s w c j c o 超净工作台 h h - 2 数显恒温水浴锅 药品分类 分析纯( a r ) 分析纯( 分析纯( a r ) 分析纯o 埘 分析纯( a r ) 生化试剂( b r ) 生化试剂( b r ) 分析纯( 分析纯( 分析纯( a r ) 分析纯( a r ) 生物染色剂 生物染色剂 分析纯( a r ) 分析纯( a r ) 分析纯( a r ) 分析纯o 姣) 生物染色剂 分析纯( a r ) 分析纯( a r ) 8 生产厂家 汕头市西陇化工厂有限公司 天津市博迪化工有限公司 上海展云化工有限公司 汕头市西陇化工有限公司 天津市博迪化工有限公司 北京奥博星生物技术有限责任公司 北京奥博星生物技术有限责任公司 广东汕头市西陇化工厂 广西汕头市西陇化工厂 合肥工业大学化学试剂厂 汕头市西陇化工有限公司 天津市光复精细化工研究所 天津市光复精细化工研究所 宿州市畅达消毒用品厂 无锡市展望化工试剂有限公司 宿州化学试剂有限公司 无锡市展望化工试剂有限公司 无锡市展望化工试剂有限公司 天津市光复精细化工研究所 无锡市展望化工试剂有限公司 上海晶纯试剂有限公司 生产厂家 上海跃进医疗器械厂 上海安亭科学仪器厂 苏州净化设备有限公司 金坛市杰瑞尔电器有限公司 h a l 2 1 5 0 0 1 c 型超临界萃取装置 p h s 2 5 b 型数字酸度剂 y x q s g 4 1 2 8 0 手提式压力蒸汽灭菌器 7 2 1 分光光度计 双层铁皮电炉 冰箱 x s z 3 g 双目生物显微镜 江苏南通华安超临界萃取有限公司 上海大普仪器有限公司 上海华线医用核子仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 上海鹿牌日用电炉厂 合肥荣事达电冰箱有限公司 c o i cc h o n g o i n gc h i n a 图2 1 超临界c 0 2 灭菌设备示意图 1 c 0 2 钢瓶；2 净化器；3 - 冷箱；4 泵；5 反应釜；6 压力计；7 流量计 f i g 2 - 1s c h e m a t i cd i a g r a mo fs c c 0 2s t e r i l i z i n ga p p a r a t u s 1 - c o ：f e e dt a n k ；2 - f i l t e r ；3 - c h i l l e r ；4 一p u m p ；5 - r e a c t o r ；6 m a n o m e t e r ，7 一f l o wm e t e r 2 2 试验方法 2 2 1 菌种的活化 将枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于3 0 c 恒温培养箱中培养2 4 h 。 2 2 2 芽孢菌悬液的制备 2 2 2 1 芽孢的制备 移取0 5 m l 活化的菌液至含o o i m n c l 2 牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上，涂布， 于3 0 c 恒温培养箱中培养5 天，置室温中培养1 3 天，在这期间对其进行革兰氏染色 和芽孢染色。 2 2 2 2 革兰氏染色 1 ) 原理革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此法染色， 9 可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌( 和革兰氏阴性菌( 0 3 两大类。 革兰氏染色过程所用四种不同溶液的作用： 碱性染料草酸铵结晶紫液，使菌体染上颜色。 媒染液碘液，其作用是增强染料与菌体的亲和力，加强染料与细胞的结合。 脱色剂乙醇将染料溶解，使被染色的细胞脱色。利用不同细菌对染料脱色的 难易程度不同，而加以区分。 复染液蕃红溶液，目的是使经脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱 色菌进行比较。 革兰氏染色有着重要的理论与实践意义，其染色原理是利用细菌的细胞壁组成成分 和结构的不同。革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交