（食品科学专业论文）花生蛋白ACE抑制肽的制备和降血压效果的研究.pdf

华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 本文以花生粕为原料，运用二次回归正交旋转组合设计对花生蛋白的提取工艺 进行了优化；以血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 抑制率 为指标，从六种商业蛋白酶中筛选出碱性蛋白酶进行酶解，制备高活性的a c e 抑制 肽；选用凝胶层析法进行纯化分离；用凝胶电泳研究了分子量的分布；使用高效液 相和质谱联用对产物结构进行了初步分析；选用自发性高血压大鼠( s p o n t a n e o u s l y h y p e r t e n s i v er a t ，s h r ) 进行了降血压的体内动物实验。研究结果如下： 1 二次浸提对蛋白的提取率有显著的影响。采用碱提酸沉淀法，结合d p s 软件 分析，研究了温度、p h 和料液比对蛋白质提取率的影响。结果表明：花生蛋白质提 取条件较优的范围为：温度为5 2 5 5 c ，p h 为9 3 9 6 ，料液比为1 ：9 7 1 ：1 0 3 ，在相 同的条件下，进行二次浸提，每次浸提2 h 。 2 采用响应面法筛选出碱性蛋白酶( a l c a l a s e ) 酶解花生蛋白制备a c e 抑制肽， 以a c e 抑制率为响应值，研究了温度、底物浓度和酶与底物浓度比对a c e 活性的 影响。结果表明：生产a c e 抑制肽的最优组合为温度5 3 7 ，底物浓度7 7 2 ，酶 与底物浓度比4 1 8 ，p h 8 0 ，水解时间为1 2 0 m i n 。 3 经凝胶层析的方法对a c e 抑制肽进行了分离和纯化，通过t r i c i n e s d s p a g e 电泳法分析了各组分的分子量的分布，结果表明：分子量小于1 5 0 0 d 的小肽具有较 高的a c e 抑制率。 4 对于高活性的a c e 抑制肽通过高效液相和质谱分析表明：经凝胶柱分离的单 一组分仍然是由分子量不同的许多肽组成的混合物，其分子量主要分布在 3 0 d - 7 0 0 d 。 5 通过自发性高血压大鼠的急性降压实验表明：在给药后1 2 0 m i n 血压开始明显 下降，在给药后1 2 0 m i n 、1 5 0 m i n 、1 8 0 m i n 、2 1 0 m i n 时间段的血压与给药前比较均 有明显的降压效果，平均动脉血压分别下降了9 9 、1 2 2 、1 4 o 和1 3 1 ；慢性 降压实验表明：连续灌服a c e 抑制肽后，高血压大鼠血压呈现下降趋势，其中给药 后2 h 、第2 d 、5 d 、7 d 血压明显低于模型组。 关键词；花生蛋白；酶解：a c e 抑制肽；s h r ；降血压活性 花生蛋白a c e 抑制肚的制备和降血压效果的研究 a b s t r a c t e x t r a c t i o np r o c e s so fp e a n u tp r o t e i nf r o mp e a n u td r e g sw a so p t i m i z e db ym g a n $ o f o r t h o g o n a l l yr o t a t i o n a lc o m b i n a t i o nd e s i g ni nt h i sp a p e r m o n i t o r e db ya n g l o t e n s i nc o n v e r t i n g e n z y m e ( a c e ) i n h i b i t o r yr a t e ，t h ea l k a l ip r o t e i n a s ew a ss e l e c t e df r o ms i xc o m m e r c i a l p r o t e i n a s e sa n du s e df o re n z y m o l y s i st op r o d u c eh i g h l ya c t i v ea c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s ； t h eg e lc h r o m a t o g r a p h ym e t h o dw a su s e df o rt h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n , t h eg e l e l e c t r o p h o r e s i sw a su s e dt oi n v e s t i g a t et h ed i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a rw e i g h t s ，i - i p l c - m s w a su s e dt op r e l i m i n a r i l ya n a l y z et h ep r o d u c ts t r u c t u r e ，a n ds h rw a ss e l e c t e dt ot e s t h y p o t e n s i v ea c t i v i t yi na n i m a li nv i v o t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t w i c ed i g e s t i o na n de x t r a c t i o nh a das i g n i f i c a n te f f e c to np r o t e i ne x t r a c i i o nr a t e t h ea l k a l it r e a t m e n ta n da c i dp r e c i p i t a t i o nm e t h o dw a sa d o p t e da n dt h ee f f e c t so fi t s t e m p e r a t u r e ，p ha n df i q u i da n dm a t e r i a lr a t i oo nt h ee x t r a c t i o nr a t eo fp r o t e i nw e r e i n v e s t i g a t e di nc o m b i n a t i o n 、i t ht h ed p s s o f t w a r ea n a l y s i s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e o p t i m i z e dr a n g eo fp e a n u tp r o t e i ne x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r et e m p e r a t u r e3 2 - 3 5 c ，p h 9 3 - 9 6 ，m a t e r i a la n dl i q u i dr a t i o1 ：9 7 - 1 ：1 0 3 ，t w i c ed i g e s t i o nw a sp e r f o r m e du n d e rt h e 韶t n l ec o n d i t i o n sw i t he x t r a c t i o nt i m eo f 2 he a c ht i m e 2 a l c a l a s ew a ss e l e c t e df o re n z y m o l y s i so fp e a n u tp r o t e i nb yt h em e t h o do fr e s p o n s e s u r f a c et o p r o d u c ea c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s t h ee f f e c t s o ft e m p e r a t u r e ，s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o na n dt h er a t i oo fe n z y m ea n ds u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o no na c e a c t i v i t yw e r e i n v e s t i g a t e db yu s i n gt h ea c ei n h i b i t o r yr a t e sa st h er e s p o n s ev a l u e t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h ep r o p e rc o n d i t i o n sw e r et e m p e r a t u r e5 3 7 c ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n7 7 2 ，t h e r a t i oo fe n z y m ea n ds u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n4 1 8 ，p h 8 0 ，a n dh y d r o l y s i st i m e1 2 0 r a i n 3 a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sw e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e db yt h em e t h o do fg e l c h r o m a t o g r a p h y , a n dt h ed i s t r i b u t i o n so fm o l e c u l a rw e i g h t so fd i f f e r e n tc o m p o n e n t sw e r e a n a l y z e db yt r i c i n e s d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h es h o r tc h a i n p e p t i d e sw i t ht h em o l e c u l a rw e i g h t so fl e s st h a n1 5 0 0 dh a dh i g h e ri n h i b i t o r yr a t eo n a c e 4 t h eh i e , m ya c t i v ea c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sw e r ea n a l y z e db yh p l c - m sa n dt h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h es i n g l ec o m p o n e n ts e p a r a t e df r o mg e lc o l u m nw a st h em i x t u r eo f p e p t i d e s o fd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h t s ，a n di t sm o l e c u l a r w e i g h t sw e r em a i n l y d i s t r i b u t e di nt h er a n g eo f3 0 0 - 7 0 0 d 5 t h er e s u l to fa c u t ea n t i h y p e r t e n s i v ee x p e r i m e n t sw i t hs p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v e r a t s ( s h r ) i n d i c a t e dt h a tb l o o dp r e s s u r e sb e g a nt od e c r e a s es i g n i f i c a n t l y1 2 0 r a i na f t e r o r a la d m i n i s t r a t i o n c o m p a r e dw i t ht h eb l o o dp r e s s u r eb e f o r eo r a la d m i n i s t r a t i o n , t h e b l o o dp r e s s u r e s1 2 0 r a i n , t 5 0 m i n , 1 8 0 r a i n , a n d2 1 0 r a i na f t e ro r a la d m i n i s t r a t i o nw e r e 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 d e c r c 勰c ds i g n i f i c a n t l y , w i t ht h em e a na r t e r i a lp r e s s u r e ( m a p ) r e d u c t i o no f9 9 ，1 2 2 ， 1 4 0 a n d1 3 1 r e s p e c t i v e l y ；a n dc h r o n i ca n t i h y p e r t e n s i v ee x p e r i m e n t sw i t hs h r i n d i c a t e dt h a tt h eb l o o dp r e s s u r eo fs h rt e n d e dt od e c r e a s ea f t e rc o n s e c u t i v eo r a l a d m i n i s t r a t i o n s a n dt h eb l o o dp r e s s u r e s2 ha f t e ro r a la d m i n i s t r a t i o n ，0 1 1d a y2 ，d a y5 ，a n d d a y7w e r es i g n i f i c a n t l yl o w e r t h a nt h a to ft h em o d e lg r o u p k e y w o r d s ：p e a n u tw o t e i n ；e n z y m o l y s i s ；a c ei n h i b i t o r yp c p t i d c ；s h r ； a n t i h y p e r t e n s i v ea c t i v i t y m 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导卿指导下进行的研究_ 3 2 作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究蚴：够中帆弘严占月舯 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存，汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：节 导师签名：勿锄五 签名日期：驴7 年6 月侣日 签名日期：一7 年6 月fg 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第一部分前言 花生臼r a c h i sh y p o g a e al ) 是豆科落花生属的一年生草本植物，俗称香果、地果、 落花生。花生是我国乃至全世界广泛种植的经济作物之一，主要种植区分布于亚洲、 非洲、大洋洲、北美洲和南美洲等气候温暖地区。据2 0 0 5 年1 1 月美国农业部的官 方农业统计数据显示，2 0 0 5 2 0 0 6 年全球花生种植面积为2 2 8 5 x 1 0 6 万公顷，我国的 种植面积为4 9 x 1 0 6 万公顷，仅次于印度，位居世界第二。花生因其香脆味美，营养 丰富。具有补虚、益寿、抗衰老、美容之功能因而被人们誉为。长生果”( 张建成和 宁维光，2 0 0 5 ) 。“本草纲目拾遗”中说，花生有悦脾和胃、润肺化痰、滋养调气之 功效。故民间有“常食花生能养身，吃了花生不想荤”的说法。在国外，花生的营 养保健价值备受人们的青睐，被誉为“植物肉”和“绿色牛乳”。 花生蛋白是一种营养价值较高的油料蛋白，它含有人体所需的八种必需氨基酸， 且易为人体消化吸收，并含有比大豆更少的抗营养因子，对维护人体健康和幼儿发 育具有重要作用( 王瑛瑶等，2 0 0 4 ) 。 多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，多肽和蛋白质都是由 氨基酸构成，从营养的角度来分析，两者是一样的；但是多肽的分子量比蛋白质小 很多，而且有些具有蛋白质所没有的生理调节功能( 励建荣等，2 0 0 4 ) 。科学研究发 现，蛋白质经水解制得的肽有比蛋白质更好的营养性能，实验证实肽的吸收率比氨 基酸高，比氨基酸更易、更快通过小肠黏膜被人体吸收利用。某些小肽不仅能提供 人体生长、发育所需要的营养物质，而且具有独特的生物学功能：可防治血栓、高 血脂和高血压，延缓衰老、抵抗疲劳、提高机体免疫力。2 0 世纪8 0 年代，国际上 如日本、韩国、美国和欧洲等国家和地区都已经有了专业的多肽经营企业进行产业 化运作( 邹远东，2 0 0 4 ) 。 1 国内外花生和花生蛋白的研究进展 花生壳的研究：韩国学者s e u n g - c h e o ll e e 等( 2 0 0 5 年) 的研究发现，花生壳 水提物( 3 0 0 r a g 7 1 0 m l ) 经远红外( f a r - i n f a r e d ，f i r ) 在1 5 0 ( 2 下处理6 0 r a i n ，其总 酚含量从7 2 舡m 升高到1 4 1 即m ，清除自由基能力从2 3 4 上升到4 8 8 3 ，还原 力从o 4 7 3 上升到0 9 1 0 。从而得出经远红外处理的花生壳水提物的抗氧化活性显著 提高。 花生蛋白a c e 抑制肽的制各和降血压效果的研究 花生红衣的研究：台湾学者w e n - j y ey e n 等( 2 0 0 5 年) 的研究表明，花生红衣 的乙醇萃取物具有明显的抗氧化能力，当其浓度达到5 0 5 0 0 m e , l 时，具有良好的保 护蛋白防止氧化变质的作用；当其浓度为1 0 0 m g l 时，清除自由基能力达到9 2 6 。 j i a n m e iy u 等( 2 0 0 4 年) 对花生红衣进行研究，分别采用水、乙醇、甲醇为溶 剂进行提取，经分离纯化后对提取物的总酚和抗氧化能力进行了分析。结果表明， 1 9 干花生红衣含有9 0 1 2 5 r a g 的总酚：经水和乙醇的提取物总抗氧化能力分别为 3 3 9 r a m 和4 1 0 r a m 。 花生蛋白酶解的研究：台湾的j e a n y u h w a n g 等( 2 0 0 1 年) 根据o y a i z u ( 1 9 8 8 年) 和b l o i s ( - 1 9 5 8 年) 的方法，对高温烘烤和去脂肪的花生蛋白进行了研究，经 过酶解后测其还原力、清除自由基的能力、金属离子的螯合力。结果表明，花生蛋 白酶解液的还原力为1 0 m g 蛋白i n l 与0 0 2 m g m l 的b h a 或生育酚具有相同的功 效；0 0 5 m g m l 的花生蛋白酶解液清除自由基d p p h 的能力与0 0 1 m g b h a m l 相当； l m g m l 的花生蛋白酶解液对f c “的螯合力达到6 9 。 李晓刚等( 2 0 0 3 年) 以花生粕为原料，用内肽酶和端解酶制备花生多肽，并且 经过s e p h a d e xg 2 5 凝胶层析和垂直s d s p d g e 凝胶电泳层析进行分析，最后得出 花生多肽中大分子量在1 7 0 0 0 d 左右，中分子量在1 4 2 0 0 d 左右，低分子量在3 5 0 0 d 左右。另外，在1 0 0 0 d 也有少量的多肽。 吴肖等( 2 0 0 4 年) 通过对复合蛋白酶和复合风味酶水解花生粕蛋白，结果发现， 利用复合酶水解花生粕蛋白，可以克服内肽酶氨基态氮生成率低、水解液呈苦味的 特点，最终可得到氨基态氮生成率高、完全澄清透明的水解液。莫琪等( 1 9 9 6 年) 用木瓜蛋白酶对花生粕蛋白进行了研究，结果表明，由于得到较多的花生多肽，提 高了花生蛋白等电点附近的水溶性，扩大了应用范围，是一种优良的食品添加剂。 何东平等( 2 0 0 4 年) 用冷榨花生饼制备花生多肽，对酶制剂筛选和酶解工艺参 数等进行了系统的研究。结果表明，用中性蛋白酶a s l 3 9 8 在p h 7 0 ，温度4 2 c ， 加酶量6 5 0 0 u g 原料，酶解8 h ，底物浓度为1 0 的条件下得到的花生多肽在高浓度 是仍显示低的黏度，扩大了应用范围。仪凯等( 2 0 0 5 年) 也采用中性蛋白酶水解花 生粕，用响应面分析方法进行酶解条件进行优化，得出最佳条件为：底物浓度为6 ， 反应时间3 h ，反应温度4 4 c ，p h 6 7 ，加酶量6 5 0 0 u g 底物，在此条件下理论水解 度为7 6