（发酵工程专业论文）红酵母类胡萝卜素的提取分离及抗氧化性研究.pdf

摘要 进行了红酵母生产p 一 胡萝 卜 素营养因子的选择， 得出最佳碳源为2 % 的葡萄 糖: 最佳氮源为2 % 蛋白 陈o m n 2 * , z n 2 . 和m 矿促进0 一 胡萝卜 素的生成; c a t 抑制 红酵母日 一 胡萝 卜 素的产生，但不影响红酵母细胞的生长。 选用研磨法对红酵母进行破壁， 并同时用冷丙酮提取类胡萝 卜 素， 应用硅胶 薄板将红酵母类胡萝卜 素分为五种组分， 其展层剂为:石油醚/ 丙酮/ 氯仿 ( 5 0 : 1 : 1 , v 八八) : 石油醚/ 丙酮/ 甲醇 ( 2 5 : 2 5 : 1 , v 八/ v ) 。应用化学方法、薄板 层析、紫外/ 可见吸收法及质谱法对红酵母类胡萝 卜 素各组分进行鉴定，鉴定出 红酵母主要含有旦 一 胡萝 卜 素，圆酵母素、红酵母红素，其含量由薄板层析斑块 可以看出，圆酵母素 p 一 胡萝 卜 素) 红酵母红素。 应用化学发光法研究了红酵母类胡萝卜 素清除超氧阴离子和经基自由基的 能力。 其超氧阴离子和轻基自山基产生系统具有较好的重复性， 并在研究中发现， 圆酵母素的清除能力较强。 由结果可知， 类胡萝 卜 素清除自由基的能力和其共扼 双键数及其某些含氧基团相关。 关键词:红酵母、薄板层析、类胡萝 卜 素、电喷雾电离、抗氧化、化学发光 ab s t ract t h e n u t r i t i o n f a c t o r s o f b e t a - c a ro t e n e p r o d u c t i o n b y r h o d o t o r u l a g l u t i n i s w a s s t u d ie d , t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e o p t i m u m c a r b o n s o u r c e w a s 2 % g l u c o s e a n d t h e o p t im u m n it r o g e n s o u r c e w a s 2 % p e p to n e . m n z n z a n d m g z c a n i n c r e a s e t h e c o n te n t o f b e ta - c a r o t e n e w h i le c a t i n h ib it t h e p r o d u c t io n o f b e t a - c a r o te n e , b u t it c a n n o t i n fl u e n c e t h e g r o w t h o f r h o d o t o r u l a g l u t i n is . t h e d r y c e l l o f r h o d o t o r u l a g l u t i n i s w a s g r o u n d e d a n d c o l d a c e t o n e w a s a d d e d t o e x t r a c t t h e c a r o t e n o i d f r o m r h o d o t o r u l a岁a t i n is . t h e e x t r a c t w a s s e p a r a t e d i n t o f i v e p i g m e n t s b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y u s i n g t w o d i ff e r e n c e m o b i l e p h a s e ( p e t r o l e u m e s t e r - a c e t o n e - c h l o r o f o r m , 5 0 : 1 : 1 , p e t r o l e u m e s t e r - a c e t o n e - m e t h a n o l , 2 5 : 2 5 : 1 ) . t h e t h r e e m a i n p i g m e n t s w e r e i d e n t i fi e d a s h a t e - c a r o t e n e , t o r u l e n e , t o r u l a r h o d i n b y c h e m i c a l t e s t s r t v a l u e u v - v i s a n d m a s s s p e c t r u m . f r o m t h e s i z e o f t h e d o tt e d p i g m e n t s , t h e c o n t e n t o f p i g m e n t s : t o r u l e n e b e t a - c a r o t e n e t o ru l a r h o d i n . t h e a n t i o x i d a n t a b i l i t y o f t h e 护 g m e n t e x t r a c t i o n a n d s e p a r a t e d p i g m e n t w e r e d e t e r m i n e d b y c h e m i l u m i n e s c e n c e . t h e s y s t e m o f p r o d u c i n g s u p e r o x i d e a n i o n s a n d h y d r o x y l r a d i c a l s w e r e s t a b l e . t h e r e s u lt s u g g e s t s t h a t t h e a n t i o x i d a n t a b i l i t y o f t o r u l e n e w a s h i g h a n d t h e a n t i o x i d a n t a b i l i t y o f c a r o t e n o id w a s r e l a t e d t o t h e n u m b e r o f c o n j u g a t e d d o u b l e b o n d a n d s o m e s t ru c t u r e s c o n t a i n i n g o x y g e n . k e y w o r d s : r h o d o t o r u l a g l u t i n i s , t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y , c a r o t e n o i d a n t i o x i d a t i o n e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n , c h e m i l u m i n e s c e n c e 天津商学院 硕十学位论文第一章前言 第 一 章 前言 . 1 选题的背景及依据 1 . 1 . 1类胡萝卜 素的特性与功能 1 . 1 . 1 . 1类胡 萝卜 素分子的结构 类胡萝卜 素是由几个异戊二烯单位构成的化合物， 一般可分为两类: 胡萝 卜 素和叶黄素。前者以日 一 胡萝 卜 素为代表，仅含有碳与氢。 后者则是前者的含氧 衍生物， 例如虾青素。 另一种分类系统是将各种类胡萝卜 素分为 链状、 单环和双 环衍生物， 它们的母体代表化合物分别为:丫 一 胡萝 卜 素、番茄红素、0 一 胡萝 卜 素 ( 图1 - 1 ) 1 1 1 . s 一 胡萝 卜 素 虾青素 人 气 、 、 、 气 人 邹” 丫 ， 扮 丫 番茄红素 丫 一 胡萝 卜 素 图 1 - 1几种类胡萝卜 素的结构 天津商学院 硕十学位论文第一章前言 第 一 章 前言 . 1 选题的背景及依据 1 . 1 . 1类胡萝卜 素的特性与功能 1 . 1 . 1 . 1类胡 萝卜 素分子的结构 类胡萝卜 素是由几个异戊二烯单位构成的化合物， 一般可分为两类: 胡萝 卜 素和叶黄素。前者以日 一 胡萝 卜 素为代表，仅含有碳与氢。 后者则是前者的含氧 衍生物， 例如虾青素。 另一种分类系统是将各种类胡萝卜 素分为 链状、 单环和双 环衍生物， 它们的母体代表化合物分别为:丫 一 胡萝 卜 素、番茄红素、0 一 胡萝 卜 素 ( 图1 - 1 ) 1 1 1 . s 一 胡萝 卜 素 虾青素 人 气 、 、 、 气 人 邹” 丫 ， 扮 丫 番茄红素 丫 一 胡萝 卜 素 图 1 - 1几种类胡萝卜 素的结构 天津商学院硕士学位论文第一章前言 1 . 1 . 1 . 2类胡萝卜 素的功能 类胡萝卜 素在自 然界中广泛存在， 并发挥着举足轻重的作用。 它不仅赋予生 物绚丽的色彩， 并且作为光合作用的辅助色素， 类胡萝卜 素参与执行光能传递和 物质转化、 抗光敏化、 淬灭自 由基等重要生物学功能， 保护生物体免受不利环境 因素的伤害。 另一方面的研究表明， 食用类胡萝 卜 素有益于身体健康。 一系列的流行病学 和人体干预实验表明， 饮食中摄入富含类胡萝卜 素的食物， 可减少癌症、 心血管 疾病、眼病的发生。类胡萝卜 素还是单线态氧的淬灭剂及自由基的清除剂。 在 我们人体血液中有多种不同的类胡萝 卜 素，如皮肤中的番茄红素、0一胡萝 卜 素等。 当自 由 基的侵害越大时， 如肥胖、 抽烟或过度日 晒等， 体内消耗的类胡萝 卜 素也就越多。 日 一 胡 萝卜 素是 较为 重要的 类胡萝卜 素， 它具 有以 下功能 12 j : 1 . 维生素a的 前体， 维生素a 是人体必需的维生素。 2 . 具有免疫功能， 提高人体系统抵抗病原 物的能力。3 . 5 一 胡萝 卜 素具有一定的抗氧化作用，能淬灭单线态氧和清除体内 自由 基的不良 影响。 4 . 预防 癌症， 延缓癌症的发展。 1 . 1 . 2类 胡萝卜 素的 生物 合成 通过大量的研究， 人们己 基本上搞清楚了类胡萝卜 素生物合成的主要途径。 它 是一类自乙 酞c o a 开始的次生代谢产物， 其形成过程为: 3 个乙酞c o a 分子通过失 去1 个分子的梭基而缩合成3 一甲 基一 3 , 5一 二甲基戊酸 ( m v a ) ， 在酶的作用下磷酸 化形成焦磷酸酷并经脱梭后形成异戊二烯焦磷酸( i p p ) ， 异戊二烯焦磷酸在异构酶 作 用下异构为二甲 基丙烯基二 磷酸 d m p ) , d m p 与i p p 通过 缩合产生二甲 基辛烯 焦磷酸( g p p ) , f p p ( 法尼基二磷酸) 、二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸( g g p p ) 0 2 个g g p p 在八氢番茄红素合成酶( p s y ) 作用下头对头进行二聚作用形成第1 个无色 的类胡萝卜 素一八氢番茄红素。 八氢番茄红素经过连续的脱氢反应， 共骊双键延长， 直至形成链饱红素、番茄红素。番茄红素在不同环化酶的作用下分别生成a 一胡 萝卜 素、p 一胡萝 卜 素， 在a , 经基以及在p 一环上引入c ( 5 , 3 p 一胡萝 卜 素的c 4位置引入酮基和c3位置引入 6 ) 一环氧基后， 则形成结构更为复杂的叶黄素等 天津商学院硕士学位论文第一章前言 1 . 1 . 1 . 2类胡萝卜 素的功能 类胡萝卜 素在自 然界中广泛存在， 并发挥着举足轻重的作用。 它不仅赋予生 物绚丽的色彩， 并且作为光合作用的辅助色素， 类胡萝卜 素参与执行光能传递和 物质转化、 抗光敏化、 淬灭自 由基等重要生物学功能， 保护生物体免受不利环境 因素的伤害。 另一方面的研究表明， 食用类胡萝 卜 素有益于身体健康。 一系列的流行病学 和人体干预实验表明， 饮食中摄入富含类胡萝卜 素的食物， 可减少癌症、 心血管 疾病、眼病的发生。类胡萝卜 素还是单线态氧的淬灭剂及自由基的清除剂。 在 我们人体血液中有多种不同的类胡萝 卜 素，如皮肤中的番茄红素、0一胡萝 卜 素等。 当自 由 基的侵害越大时， 如肥胖、 抽烟或过度日 晒等， 体内消耗的类胡萝 卜 素也就越多。 日 一 胡 萝卜 素是 较为 重要的 类胡萝卜 素， 它具 有以 下功能 12 j : 1 . 维生素a的 前体， 维生素a 是人体必需的维生素。 2 . 具有免疫功能， 提高人体系统抵抗病原 物的能力。3 . 5 一 胡萝 卜 素具有一定的抗氧化作用，能淬灭单线态氧和清除体内 自由 基的不良 影响。 4 . 预防 癌症， 延缓癌症的发展。 1 . 1 . 2类 胡萝卜 素的 生物 合成 通过大量的研究， 人们己 基本上搞清楚了类胡萝卜 素生物合成的主要途径。 它 是一类自乙 酞c o a 开始的次生代谢产物， 其形成过程为: 3 个乙酞c o a 分子通过失 去1 个分子的梭基而缩合成3 一甲 基一 3 , 5一 二甲基戊酸 ( m v a ) ， 在酶的作用下磷酸 化形成焦磷酸酷并经脱梭后形成异戊二烯焦磷酸( i p p ) ， 异戊二烯焦磷酸在异构酶 作 用下异构为二甲 基丙烯基二 磷酸 d m p ) , d m p 与i p p 通过 缩合产生二甲 基辛烯 焦磷酸( g p p ) , f p p ( 法尼基二磷酸) 、二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸( g g p p ) 0 2 个g g p p 在八氢番茄红素合成酶( p s y ) 作用下头对头进行二聚作用形成第1 个无色 的类胡萝卜 素一八氢番茄红素。 八氢番茄红素经过连续的脱氢反应， 共骊双键延长， 直至形成链饱红素、番茄红素。番茄红素在不同环化酶的作用下分别生成a 一胡 萝卜 素、p 一胡萝 卜 素， 在a , 经基以及在p 一环上引入c ( 5 , 3 p 一胡萝 卜 素的c 4位置引入酮基和c3位置引入 6 ) 一环氧基后， 则形成结构更为复杂的叶黄素等 天津商学院硕十学位论文第一章前言 1 . 1 . 3 夭然类胡萝 卜 素产品的开发与利用 随着类胡萝卜 素的重要性被人们所认识， 天然类胡萝卜 素制品的需求逐渐增 大， 开发利用天然类胡萝 卜 素己成为引人注目的趋势。天然类胡萝 卜 素可通过多 种途径而获得14 1 : 1 . 从富 含类胡萝卜 素的植物中 提取， 如胡萝 卜 、 木瓜、 南瓜等; 2 . 化学合成获得; 3 . 富含类胡萝 卜 素微生物资源或废弃的富含类胡萝卜 素的动物 资源。目前市场上需求较大且开发较好的天然类胡萝卜 素有 0 一 胡萝 卜 素、 番茄 红素、虾青素及叶黄素等。 天然日 一 胡萝 卜 素在食品、化妆品、医药和饲料等工业中具有广泛的应用前 景。另外，0 一 胡萝卜 素作为一种油溶性色素，对热稳定，对光和氧不稳定， 应 用范围较窄的缺点己 可采用微胶囊技术来克服， 这样大大提高日 一 胡萝 卜 素的稳 定性， 扩大了其应用范围， 不仅能获得显著的经济效益， 而且还将促进食品工业、 医药工业和化妆品工业新产品的开发。目前生产的大多数 日 一 胡萝卜 素 ( 9 5 % ) 是化学品。化工合成日 一 胡萝卜 素的相对纯度高， 生产成本低， 但它也存在一些 缺点: 1 .某些类胡萝卜 素的合成技术复杂。 并且在合成的产品中，少量成分具 有毒 性 15 1 0 2 . 化 学合 成品 被 人 体吸 收的比 例也 较少 16 1 。 合 成0 一 胡 萝卜 素与 维 生素 a , c 一样，用量过大有一定副作用。而天然日 一 胡萝卜 素与化学合成的0 一 胡萝 卜 素有顺反异构体上的差异，使得天然0 一 胡萝卜 素在进入人体后可以转变为维 生素a ， 不会有因 过量 摄食而造成维生素a 累积中 毒 现象 闭 。因 此与 化学合 成的 产品相比，天然0 一 胡萝 卜 素拥有更高的附加值。 在天然色素的生产中， 微生物色素具有无可比 拟的优势:植物材料受产地、 季节及场地因素的影响， 而微生物培养时间短， 受季节影响小。 利用发酵法生产 出 的 天 然 0 一 胡 萝卜 素 ， 作 为 食 品 添 加 剂 ， 产 品 己 通 过 法 定 单 位 的 卫 生 检 测 和 安 全性检测。微生物发酵生产目 一 胡萝 卜 素的开发对象主要有短杆菌、分枝杆菌、 杜氏盐藻、 三饱布拉霉、 布拉克须霉及红酵母属的一些菌种。 欧美、 俄罗斯及乌 克 兰 等国 家利 用发 酵法生 产日 一 胡 萝卜 素己 实 现产 业 化 d l 。目 前， 大 面积 养 殖杜 氏盐藻，通过溶剂萃取提取，是国外生产天然0 一胡萝卜 素的主要手段。美国、 澳大利亚等国的数家公司都建有世界级的盐藻养殖厂以 及盐藻提取装置。 但杜氏 盐藻的养殖需要长期的高温和强烈光照， 且需要1 0 %以上的高盐浓度。 全球只有 以 色列死海和西澳大利亚的宾克湖等少数地区比较适合生产。 九十年代初， 内蒙 天津商学院硕士学位论文第一章前言 古吉兰泰盐场生物工程公司、天津兰泰生物工程公司等少数几家公司养殖盐藻， 生产天然p 一胡萝卜 素。 但是盐藻养殖受到外界环境条件的严格限制， 使其规模 均难于壮大， 年生产能力均只有半吨左右， 远远不能满足国内的市场需求。 三袍 布拉霉的发酵水平已 达到中试生产的程度， 国际上实验室水平生产胡萝 卜 素已 达 3 - 3 . 5 / l 。江南大学对三抱布拉霉发酵生产p 一胡萝 卜 素也进行了多年的研 究， 通过菌种选育和优化发酵条件，目 前发醉产量可达1 .5 -2 .0 克/ 升， 并开发 了0 一胡萝 卜 素提取及微胶囊技术， 直接做成水溶性粉剂， 可作为食品、 保健品 和化妆品的添加剂。 、 . 、 . a 利用酵母生产类胡萝卜 素的进展 1 . 1 . 4 . 1含有类胡萝卜 素酵母的分类 能够产生类胡萝卜 素的酵母主要集中于半知菌亚门及担子菌亚门酵母的红 酵母属 ( r h o d o t o r u l a ) 、红色冬抱酵母属 ( r h o d o s p o r i d i n m )及普法夫酵母属 ( p h a f f f i a ) 中。 在 普法夫 酵母 属 ( p h a f f i a ) 中 迄 今为 止仅发现一个 种 d l其 所产色素也较特殊， 以 虾青素为主。 红酵母属 ( r h o d o t o r u a l ) 、 红色冬抱酵母属 ( r h o d o s p o r i d i n m ) 产以 红酵母红素及0 一 胡 萝卜 素为主的类胡萝卜 素， 研究结 果发现除普法夫酵母 ( p h a f f i a r h o d o z y m a ) 外，目 前含有较多类胡萝 卜 素、具 有良 好市 场开 发前 景的酵母菌株都出 现在r h o d o t o r u l a g l u t i n i s . r h o d o t o r u l a m i n u t e . r h o d o t o r u l a m u c i l a g i n o s a 这三 个 种 7 。 红 酵 母r h o d o t o r u l a g l u t i n i s 主 要 产 0 一 胡 萝卜 素 ， s i m p s o n 提出 了 红 酵 母 类 胡 萝卜 素的 生 物合 成 途 径 8 l : 除 产 p 一胡萝 卜 素外， 红酵母还产圆酵母素和红酵母红素.y一胡萝 卜 素是圆酵 母素和 0 一 胡萝 卜 素的重要分支点。由于氧化酶系的氧化以及轻氢化作用，圆酵 母素转化成红酵母红素。 在清除过氧化基团和抑制由纯态氧引发的底物降解作用 时， 红酵母红素比 日 一 胡萝卜 素作用更强9 1 。由于 酵母富含油脂、蛋白 质以 及维 生素，故在提取 5 一 胡萝卜 素后，红酵母菌体可作为饲料添加剂。除了提取色素 外， 还可将全细胞作色素单细胞蛋白， 用于饲料添加剂， 提高蛋、肉、 乳制品的 质量和家禽的 产蛋率。 z a l a s h k o io i 等从红酵母中 将类胡 萝卜 素与油脂的混合物 提取出来， 并注入到鼠体内， 发现其对辐射后的大鼠的油脂转换系统的指标以 及 血清油脂的氧化作用起到调整的作用。 除此之外， 酵母是单细胞微生物， 营养要 求简单， 生长速度较快， 发醉控制容易， 比真菌和藻类更以扩大规模生产。 从红 天津商学院硕士学位论文第一章前言 古吉兰泰盐场生物工程公司、天津兰泰生物工程公司等少数几家公司养殖盐藻， 生产天然p 一胡萝卜 素。 但是盐藻养殖受到外界环境条件的严格限制， 使其规模 均难于壮大， 年生产能力均只有半吨左右， 远远不能满足国内的市场需求。 三袍 布拉霉的发酵水平已 达到中试生产的程度， 国际上实验室水平生产胡萝 卜 素已 达 3 - 3 . 5 / l 。江南大学对三抱布拉霉发酵生产p 一胡萝 卜 素也进行了多年的研 究， 通过菌种选育和优化发酵条件，目 前发醉产量可达1 .5 -2 .0 克/ 升， 并开发 了0 一胡萝 卜 素提取及微胶囊技术， 直接做成水溶性粉剂， 可作为食品、 保健品 和化妆品的添加剂。 、 . 、 . a 利用酵母生产类胡萝卜 素的进展 1 . 1 . 4 . 1含有类胡萝卜 素酵母的分类 能够产生类胡萝卜 素的酵母主要集中于半知菌亚门及担子菌亚门酵母的红 酵母属 ( r h o d o t o r u l a ) 、红色冬抱酵母属 ( r h o d o s p o r i d i n m )及普法夫酵母属 ( p h a f f f i a ) 中。 在 普法夫 酵母 属 ( p h a f f i a ) 中 迄 今为 止仅发现一个 种 d l其 所产色素也较特殊， 以 虾青素为主。 红酵母属 ( r h o d o t o r u a l ) 、 红色冬抱酵母属 ( r h o d o s p o r i d i n m ) 产以 红酵母红素及0 一 胡 萝卜 素为主的类胡萝卜 素， 研究结 果发现除普法夫酵母 ( p h a f f i a r h o d o z y m a ) 外，目 前含有较多类胡萝 卜 素、具 有良 好市 场开 发前 景的酵母菌株都出 现在r h o d o t o r u l a g l u t i n i s . r h o d o t o r u l a m i n u t e . r h o d o t o r u l a m u c i l a g i n o s a 这三 个 种 7 。 红 酵 母r h o d o t o r u l a g l u t i n i s 主 要 产 0 一 胡 萝卜 素 ， s i m p s o n 提出 了 红 酵 母 类 胡 萝卜 素的 生 物合 成 途 径 8 l : 除 产 p 一胡萝 卜 素外， 红酵母还产圆酵母素和红酵母红素.y一胡萝 卜 素是圆酵 母素和 0 一 胡萝 卜 素的重要分支点。由于氧化酶系的氧化以及轻氢化作用，圆酵 母素转化成红酵母红素。 在清除过氧化基团和抑制由纯态氧引发的底物降解作用 时， 红酵母红素比 日 一 胡萝卜 素作用更强9 1 。由于 酵母富含油脂、蛋白 质以 及维 生素，故在提取 5 一 胡萝卜 素后，红酵母菌体可作为饲料添加剂。除了提取色素 外， 还可将全细胞作色素单细胞蛋白， 用于饲料添加剂， 提高蛋、肉、 乳制品的 质量和家禽的 产蛋率。 z a l a s h k o io i 等从红酵母中 将类胡 萝卜 素与油脂的混合物 提取出来， 并注入到鼠体内， 发现其对辐射后的大鼠的油脂转换系统的指标以 及 血清油脂的氧化作用起到调整的作用。 除此之外， 酵母是单细胞微生物， 营养要 求简单， 生长速度较快， 发醉控制容易， 比真菌和藻类更以扩大规模生产。 从红 天津商学院硕士学位论文第一章前言 酵母提取类胡萝 卜 素具有广阔的发展前景。 国内 利用红酵母发酵生产类胡萝卜 素的研究己 进行了一些。 仓一华v ” 等发 现红酵母r h o d o t o r u l a s p .色素积累 起始于对数期末期和稳定期初期。 在2 4 - 9 6 h , 色素 含量 快速增长;在9 6 - 1 2 0 h ， 色素 积累 趋于稳定。 司 菊萍 等 1 2 1对红酵母 ( r h o d o t o r u l a g l u t i n is) 在几 种不同培养基上的生 长及对不同 碳源的 利用 情况作 了研究，结果优化出以玉米浆4 % 和甘蔗汁2 %为最适培养基，在此培养基上于 2 8 培养8 4 h ， 红酵母生物量 和h 一 胡 萝卜 产量分别 可达1 5 . 3 g / l 和1 1 2 6 u g / l ; 在 培 养6 0 h 后如转入蒸馏水继 续培养8 4 h ， 色素量则可 提高 至1 4 7 5 u g / l 。 陈碧娥等 1 1 3 考察直流电 磁场对红酵母r g - 9 8 的生长及代谢的 影响。结果表明， 不同的磁 场强度、 处理时间及处理方式会产生不同的生物效应。 将液体种子和发酵培养基 一起置于mo t电磁场2 h ,能使色素的发酵产量提高2 5 %。比较经磁场处理与 未经处理的发酵过程， 发现磁场处理提高了红酵母对糖的代谢速率， 并且在发酵 后 期 促 进生 物量 和色素含 量 持 续 地 增加。 b h o s a le 14 1用1 0 0 0 1x 的白 炽灯 连续照 射 发酵液， 发现其对菌的生长以 及色素的生成都有抑制作用。而在3 0 对数期照 射发酵液，旦 一 胡萝 卜 素会增长5 8 %，并且红酵母红素的产量也会降低。王岁楼 等 1 5 1研究了 在 培养基中 添 加 番 茄 汁、 花生油、 v b 2 v c 和 植 酸等 添 加 物对红 酵 母细胞生长及其类胡萝卜 素合成的影响。结果表明: 适量添加番茄汁、花生油、 v b z 均可明 显提高 类胡萝卜 素的 产率。 刘月 英、 陈晓强等 【 1 6 1 以 蔗糖为 碳源， 并 添 加桔子皮和盐酸硫胺素发酵优化了一株红酵母，其类胡萝卜 素产量达到 1 1 .5 5 m g / l 。 王 怡 平 、 王 朝 晖 171 发 现 稀 土 元 素 对 红 醉 母 类 胡 萝卜 素 的 合 成 有 促 进 作 用。 张 超 ( 18 1 分 批补料 培养 海 洋红 酵 母， 其生 物量 达到了2 5 .2 叭。 但国内 许多 研究集中 在生物量和产量两项指标上， 对红酵母细胞中0 一 胡萝卜 素含量的报道 不多。0 一 胡萝 卜 素的含量测定多应用h p l c ， 但h p l c 仪器昂贵， 这就限制了0 - 胡萝卜 素含量的测定。 应用柱层析方法将d 一 胡萝卜 素与其他色素分离， 然后测 定其含量，从而能够较准确地考察各种因素对红酵母0 一 胡萝卜 素含量的影响。 在国外更多的研究关注在以 廉价的原料用红酵母发酵生产类胡萝卜 素， 如盐 水 泡 菜 、甘 蔗 汁 19 1 , 葡 萄 汁 2 0 1 、 乳 清 12 11 . g a d r e 2 2 1 等 选 育 的 红 酵 母r h o d o to r u la g l u t in is m u t a n t 在海水中 的0 一 胡 萝卜 素 产量比 亲 株的 产 量高， 同 时0 一 胡 萝卜 素的提取过程不需要机械破壁处理，减少了生产成本。 1 . 1 . 4 . 2生产类胡萝卜 素的酵母选育 天津商学院硕士学位论文第一章前言 仅从自 然界获取优良的生产类胡萝 卜 素的酵母是远远不够的， 可利用遗传育 种及基因工程的手段获得高产类胡萝卜 素的工程菌。 国外较早开展诱变育种的是 红法夫酵母( p h a fa r h o d o z y m a ) ， 在这方面取得了 很大的进展。 p h a f f i a 等人通过 利 用e m s . n t g . a n t i m y c in 等 进行诱 变， 类胡 萝卜 素 产 量己 由 原 来的3 0 0 - 4 0 0 u g / g 干细胞到1 0 0 0 u g / g 干细胞左右。 现在，诱变红酵母获得高 产0 一 胡萝卜 素的菌株 也取得了进步。由于诱变育种带有一定的盲目 性而且工程浩大、 周期长， 国内开 展这方面工作的时间 较晚， 因此国内尚未发现这方面的 报道。 大量的在不同生物 中合成类胡萝 卜 素的基因被发现， 结果表明合成类胡萝 卜 素的反应是由多基因共 同作用完成的。在获得经基因工程改造的高产工程菌方面日本走在了前列， n o r i h k o m i s a m a 领导的科研小组通过将从欧氏杆菌( e r w i n i a ) 分离到的c r t e c rt b c r t l 基因转入假丝酵母c a n d i d a u t i l i s 中， 并通过截断e r g 9 基因的方法使类胡萝 卜 素合成支路另一端合成麦角固醇的合成酶大大削弱， 从而获得了高产番茄红素 的 工 程 菌 ， 其 产 量 可 达7 .8 m g / g 干 重 (a 3 1 。 目 前 这 方 面 工 作 国 内 尚 未 见 开 展 。 1 . 1 . 5类胡萝卜 素的 提取与 分离 1 . 1 . 5 . 1干燥形式与破壁方法的选择 类胡萝卜 素的提取过程中， 样品准备也是至关重要的。 采用高温烘干， 会由 于过高的温度和表面氧化， 造成部分类胡萝卜 素的损失; 同时提取效果与菌体的 干燥度有密切关系， 所用采用真空冷冻干燥有利于类胡 萝卜 素的提取a 4 1 一 般 情况 下， 红 酵母 破壁 有 两种 方法: 酸热 法 和 机 械 法ta l l 。酸热 法: 称取 一定质量的干菌体， 按1 2 m l / g 于菌体加入浓度为3 m o l / l 的盐酸， 浸泡4 0 m i n , 之后于沸水浴中 加热 2 m i n ，迅速冷却，离心， 洗涤沉淀部分，除去上清波，即 得细胞碎片。 研磨法: 称取一定质量的千菌体， 加入石英砂研磨， 同时向菌体加 入丙酮， 研磨时间为1 5 m i n ， 所得混合物直接用于抽提。 有人指出机械法更适合 工业化大生产4 1 1 . 1 . 5 . 2红酵母类胡 萝卜 素的提取 类胡萝 卜 素常与蛋白质等基质结合， 以晶体或者有色小油滴形式存在。 对于 干燥样品， 使用非极性溶剂只能溶解少量类胡萝卜 素， 一般多采用在非极性溶剂 中加入少量低极性溶剂来提取。常见的非极性提取溶剂有苯、氯仿、- 氯甲 烷、 环己 烷、 石油醚、 乙醚、四氢吠喃等， 极性较低的改良 溶剂有乙醉、丙酮、甲 醉 天津商学院硕士学位论文第一章前言 仅从自 然界获取优良的生产类胡萝 卜 素的酵母是远远不够的， 可利用遗传育 种及基因工程的手段获得高产类胡萝卜 素的工程菌。 国外较早开展诱变育种的是 红法夫酵母( p h a fa r h o d o z y m a ) ， 在这方面取得了 很大的进展。 p h a f f i a 等人通过 利 用e m s . n t g . a n t i m y c in 等 进行诱 变， 类胡 萝卜 素 产 量己 由 原 来的3 0 0 - 4 0 0 u g / g 干细胞到1 0 0 0 u g / g 干细胞左右。 现在，诱变红酵母获得高 产0 一 胡萝卜 素的菌株 也取得了进步。由于诱变育种带有一定的盲目 性而且工程浩大、 周期长， 国内开 展这方面工作的时间 较晚， 因此国内尚未发现这方面的 报道。 大量的在不同生物 中合成类胡萝 卜 素的基因被发现， 结果表明合成类胡萝 卜 素的反应是由多基因共 同作用完成的。在获得经基因工程改造的高产工程菌方面日本走在了前列， n o r i h k o m i s a m a 领导的科研小组通过将从欧氏杆菌( e r w i n i a ) 分离到的c r t e c rt b c r t l 基因转入假丝酵母c a n d i d a u t i l i s 中， 并通过截断e r g 9 基因的方法使类胡萝 卜 素合成支路另一端合成麦角固醇的合成酶大大削弱， 从而获得了高产番茄红素 的 工 程 菌 ， 其 产 量 可 达7 .8 m g / g 干 重 (a 3 1 。 目 前 这 方 面 工 作 国 内 尚 未 见 开 展 。 1 . 1 . 5类胡萝卜 素的 提取与 分离 1 . 1 . 5 . 1干燥形式与破壁方法的选择 类胡萝卜 素的提取过程中， 样品准备也是至关重要的。 采用高温烘干， 会由 于过高的温度和表面氧化， 造成部分类胡萝卜 素的损失; 同时提取效果与菌体的 干燥度有密切关系， 所用采用真空冷冻干燥有利于类胡 萝卜 素的提取a 4 1 一 般 情况 下， 红 酵母 破壁 有 两种 方法: 酸热 法 和 机 械 法ta l l 。酸热 法: 称取 一定质量的干菌体， 按1 2 m l / g 于菌体加入浓度为3 m o l / l 的盐酸， 浸泡4 0 m i n , 之后于沸水浴中 加热 2 m i n ，迅速冷却，离心， 洗涤沉淀部分，除去上清波，即 得细胞碎片。 研磨法: 称取一定质量的千菌体， 加入石英砂研磨， 同时向菌体加 入丙酮， 研磨时间为1 5 m i n ， 所得混合物直接用于抽提。 有人指出机械法更适合 工业化大生产4 1 1 . 1 . 5 . 2红酵母类胡 萝卜 素的提取 类胡萝 卜 素常与蛋白质等基质结合， 以晶体或者有色小油滴形式存在。 对于 干燥样品， 使用非极性溶剂只能溶解少量类胡萝卜 素， 一般多采用在非极性溶剂 中加入少量低极性溶剂来提取。常见的非极性提取溶剂有苯、氯仿、- 氯甲 烷、 环己 烷、 石油醚、 乙醚、四氢吠喃等， 极性较低的改良 溶剂有乙醉、丙酮、甲 醉 天津商学院硕士学位论文第一章前言 等。 丙酮有利于p 一 胡萝卜 素的 提取 2 6 1 。 在 提取中， 为了 提高 提取效率， 需要选 择溶解能力较强的溶剂， 尽可能地提取出其中的有效物质; 原料与有机溶剂的混 合比 例要适合， 有机溶剂少， 提取不完全或需要重复的次数多， 反之， 有机溶剂 比例过高， 增加投入，并使后处理工艺增加困难;为避免氧化分解、异构化和分 子重排， 可适量加入抗氧化剂;自 然界中的类胡萝卜 素通常与其他物质结合以 酷 的形式存在，因 此在纯化分离前有必要对其进行皂化处理， 通常采用5 0 % k o h 甲 醇溶液或饱和n a o 1 溶液进行皂化处理，从而类胡萝 卜 素游离出来。经皂化后， 得到的皂化品中仍然存在着部分脂溶性杂质和水溶性杂质， 且含有的类胡萝卜 素 种类往往很多， 因此， 还要进一步将杂质去除后分离所要的类胡萝 卜 素， 最后进 行纯化处理。 皂化处理后， 类胡萝 卜 素以游离单体形式存在， 利用它们分子结构 上的差异进行分离。 超临界c 0 2 萃取技术也是值得探讨的工艺， 利用s c - c o ， 这一食品工业新兴的 萃取分离技术，从农产品原料中提取天然成分，是目 前国内外研究的热点之一 ( 2 7 1 。 超临界 二 氧化碳具有溶剂的 性质。 与 传统的 化学溶剂萃取法相比， 超临界 二氧化碳提取的 优点是: 无化学溶剂消耗和残留、 无污染、 避免萃取物在高温下 的热裂解、 保护生理活性物质的活性， 能耗低， 萃取剂无毒、易回收。 但是该技 术设备复杂， 投入高，提取过程中大量c o : 向 环境中排放。该技术目 前尚停留在 实验室阶段， 尚未进入实用阶段， 作为一种工业化生产工艺超临界提取法在我国 尚需一个发展过程。 1 . 1 . 5 . 3红酵母色素的分离纯化研究 类胡萝 卜 素的分离方法主要有:柱层析法、 薄层层析法、纸层析法、 h p l c 法。 分离类胡萝卜 素的传统方法是采用柱层析法，它也可以为h p l c 为提供标准 品。 其吸附剂较常用的是氧化镁与硅藻土的不同比例的混合物及其氧化铝。 由于 氧化铝可引起类胡萝 卜 素的降解和异构化， 所以较常用的为氧化镁与硅藻土混和 物。 薄板层析可用氧化铝板、 硅胶板、 纤维素板等。 薄板层析与纸层析的 色素斑 可以 被刮出 或剪出， 用丙酮提取并测定光谱特性。 展开剂的选择是达到良 好分离 的 重 要条 件之 一。 根据文 献 报道选用了 石 油 醚 一 丙 酮 一 苯 溶剂系 统 (2 8 1， 对其 配比 和 极性差异进行了 试验， 发现溶剂的极性对色素的比 移值影响很大， 比移值随着溶 剂极性增加而增大， 出 现斑点的数量也有不同。 在层析后， 根据层析图谱或r f 值 天津商学院硕士学位论文 第一章前言 计算， 就可以 初步判断所含色素种类; 另外， 结合薄层扫描还可进一步定性或作定 量分析。 纸层析法可以 将胡萝卜 素和其他色素分开: 以新华滤纸定性、 快速或中 速 1 0 1 号为固定相，以石油醚为展开剂，胡萝 卜 素极性最小， 移动速度最快， 从 而与其他色素分开。 剪下含有胡萝 卜 素的区带， 洗脱胡萝卜 素后于4 5 0 n m 波长下 进行e t 色测定(2 9 ( 由于类胡萝 卜 素的热不稳定性以及低挥发性，不适于用气相色谱分析，而 较适用于高效液相色谱分析。 高效液相色谱 ( p l c ) 是在高压、 快速条件下所进 行的液相层析， 由于层析柱固定相基质粒度很小， 表面积大， 可以偶联各种基团， 选择性好， 流动相可根据不同要求而改变，因此分辨率高，灵敏度也高，能准确 进行微量物质的定性定量分析。 类胡萝卜 素的分离和定性、 定量研究中， 普遍采 用反相高压液相色谱 ( r e v e r s e d - p h a s e h p l c )， 固定相为十八烷基硅烷 ( o c t y i d e c y l s i i a n e c ,0 ， 流动相是 极性溶剂， 层析时， 类胡 萝卜 素在非极 性固 定相和极性流动相之间分配， 含氧的叶黄素首先被洗出， 而胡萝 卜 素后洗出: 正 相高 效液相色谱 ( n o r m a l - p h a s e h p l c )的固定相含有吸附剂 ( 硅、铝) 和极性 结合相 ( 烷基胺、烷基睛、烷基醇) ，流动相为非极性， 类胡萝卜 素分子上的极 性部位与溶剂修饰剂竞争固定相上的吸附部位， 因此， 极性低的胡萝 卜 素首先洗 出，而极性高的叶黄素保留时间长，从而达到分离的目 的。 反相h p l c 流动相使用的主要溶剂是一种低粘度的 有机溶剂， 所以 可以 选择 的修饰剂种类较多。单体 c ， 柱对叶黄素的选择性已 有改善，常用的修饰剂是氯 仿、 二氯甲 烷， 也有用四氢吠喃、乙 酸乙醋和丙酮等， 现在所使用的流动相大都 含有3 - 4 种溶剂。 根据洗脱过程不同， 可分为同 液 洗脱( i s o c r a t i c a l e l u t u i o n ) 和梯度洗脱 ( g r a d i e n t e l u t i o n ) 。同液洗脱和梯度洗脱各有优缺点。同 液洗脱 简单， 所需设备少， 稳定性好， 重复性强， 但选择性和敏感性低一点。 梯度洗脱 分析的成分较多， 其选择性和敏感性好。 无论采用那种洗脱方式， 流动相溶剂的 混合物的混合都必须准确， 前后一致， 且其中不含高挥发性修饰剂， 溶剂应除去 内部溶解的空气以防底线跳动。 目前。 类胡萝 卜 素的分析研究越来越多， 还有很 多有关类胡萝卜 素同分异构体的分析。其中c , 。 柱的应用， 促使类胡萝卜 素h p l c 分析手段进一步加强，因为 c 7 n 柱可以分离出各种类胡萝 卜 素的同分异构体，如 叶黄二醇 、玉米黄素、p一 隐黄质 、q一 胡萝 卜素和 0一 胡萝 卜素等 天津商学院硕士学位论文第一章前言 ( s a n d e r . l c , 1 9 9 4 ) , 一般而言， 经过分离纯化后的制备液， 在低温减压条件下去除其中的溶剂， 然 后进行结晶处理。 胡萝 卜 素产品结晶时， 先去除溶剂的残渣溶于少量甲苯中， 加入 3 - 4倍体积的甲醇， 在一 2 0 条件下静置数小时使之结晶析出; 对叶黄素产品的结 晶则是将残渣溶解于甲醇或乙醇中， 小自 加入少量水并冷却使之结晶 析出 u 1 . 1 . 6红酵母类胡萝 卜 素的鉴定 类胡萝卜 素的分析方法有薄层层析法、紫外/ 可见分光光度法、高效液相色 谱法、 质谱法以及核磁共振法。 薄层层析的优点是:设备简单;时间短， 样品无 需皂化等处理， 直接可拿提取液进行层析。 薄层层析的缺点是精确度不高， 尽管 如此， 在粗略检测中， 作为一种快速简便的方法， 薄层层析还是一种相当 好的方 法。由于类胡萝卜 素分子具有较长的共辘双键系统， 因此它在可见光区有强吸收 峰， 在某些情况下， 在紫外区也有吸收。 u v - v i s 最高峰的位置、 吸收光谱的形状或 精细结构为我们解析类胡萝卜 素的结构提供了重要信息， 并且可以结合一些特征 性的化学反应进行综合判断， 因此，u v - v i s 在类胡萝 卜 素的分离鉴定和定量分析 中， 起着不可替代的作用。 生物质谱目 前己成为有机质谱中最活跃、 最富生命力 的前沿研究领域之一， 现在己 经发展了各种新的软电离技术以及联用技术， 扩展 了质谱可测质量范围，特别是色谱一 质谱联用技术和质谱串联技术。近年来涌现 出 较 成 功地 用于 生 物大 分子 质 谱分 析的 软电 离 技术 主 要 有下列几 种 3 0 1 . 1 .电 喷 雾电离质谱; 2 .基质辅助激光解吸电离质谱; 3 . 快原子轰击质谱; 4 .离子喷雾 电离质谱; 5 . 大气压电离质谱。 在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得 最多 应 用 得也 最 广 泛。 电 喷雾电 离( e l e c t r o s p r a y l o n i z a t i o n , e s i ) 于 1 9 8 9 年 应 用于 有机 质 普。 e s t 的 工 作原 理是 3 t : 样品 溶 液 从毛 细管 流出 时， 在电 场 及 辅 助气流的作用下喷成雾状的带电微液滴;在加热的气体作用下， 液滴中溶剂被蒸 发， 液滴直径逐渐变小， 因而表面电荷密度增加， 当 达到雷利限度时， 即表面电荷 产生的库伦推斥力与液滴表面张力大致相等， 则会发生“ 库伦爆炸” 。 炸碎后， 液 滴产生带电的更小的液滴，