（发酵工程专业论文）γ癸内酯产生菌选育、发酵条件优化及其细胞固定化的研究.pdf

摘要 摘要 y 癸内酯( g d l ) 是一种内酯类香味物质，主要用于配制奶油、桃子、柑橘和椰子 型等香精。本文对耶罗维亚酵母( y a r r o w i al i p o l y t i c a ) a s 2 1 4 0 5 以蓖麻油为底物发酵生产 丫癸内酯的可行性、诱变选育高产菌、发酵条件及细胞固定化进行了研究。 本实验以购买的一株y a r r o w i al i p o l y t i c aa s 2 1 4 0 5 为出发菌，g d l 的发酵产量为 1 4 3 m g l 。经紫外线和硫酸二乙酯诱变后，其突变株y 1 6 的发酵能力提高到3 1 8 m g l 。 论文对突变株y - 1 6 发酵产生g d l 的条件进行单因素和正交优化。优化后的发酵 培养基( l ) 如下：蓖麻油6 0 ，蛋白胨3 0 ，酵母浸出汁2 5 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 01 2 ，吐温8 0 4 ，k h 2 p 0 41 5 ，p h 6 5 ，温度2 5 ，接种量8 ，装液量5 0 m l 5 0 0 m l 三角瓶。在该条 件下，培养4 8 h ，g d l 产量达4 0 2 m g l 。 为了降低产物对细胞的毒性，进一步提高g d l 的产量，本研究还采用了细胞固定 化技术。利用聚乙烯醇和卡拉胶固定化耶罗维亚酵母，制备出机械强度高、传质效果好 的凝胶颗粒发酵生产g d l 。以小球强度和g d l 产量为主要指标，确定发酵生产g d l 的最佳条件。在聚乙烯醇8 0 9 l ，卡拉胶5 9 l ，菌体添加量0 1 m l ，固定化时间2 4h ， g d l 产量达4 8 2 m g l 。酵母经固定化后，g d l 产量比未固定化细胞发酵生产的4 0 2 m g l 提高了2 0 。 关键词：y a r r o w i al i p o l y t i c aa s 2 1 4 0 5 ， r 癸内酯，蓖麻油 一 a b s t r a c t a b st r a c t 1 , - d e c a l a c t o n e ( g d l ) i sal a c t o n e ，u s e dt of o r m u l a t ec r e a m ，p e a c h ，o r a n g ea n dc o c o n u t f l a v o r s i t sf e a s i b i l i t y , i n d u c e m e n t ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o na n di m m o b i l i z e dy e a s tc e l l sw e r e i n v e s t i g a t e db yu s i n gy a r r o w i al i p o l y t i c aa s 2 14 0 5a n dc a s t o ro i la ss u b s t r a t e y a r r o w i al i p o l y t i c aa s 2 14 0 5w a st a k e na st h eo r i g i n a lf u n g u si nt h i ss t u d y ，p r o d u c i n g 14 3 m g lg d l a f t e ru va n dn t g m u t a g e n e s i s ，t h eg d lp r o d u c t i o no ft h em u t a n ty - 1 6 r e a c h e dt o318 m g l o p t i m i z a t i o no fg d lp r o d u c t i o nb yt h em u t a n ty - 1 6w a sc a r r i e do u tt h r o u g hs i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u mw a s ：c a s t o ro i l6 c g l p e p t o n e3 0 9 l ，y e a s te x t r a c t2 5 9 l ，n a 2 h p 0 4 12 h 2 01 2 9 l ，t w e e n 一8 04 9 l ，k h 2 p 0 41 5 9 l ， p h 6 5 ，t e m p e r a t u r e2 5 ，i n o c u l u m ss i z e8 ，v o l u m ei nf l a s k5 0 m l 5 0 0 m l a f t e r f e r m e n t a t i o nf o r4 8h o u r s ，t h ep r o d u c t i o no fg d lr e a c h e dt o4 0 2 m g lu n d e ra b o v e m e n t i o n e d c o n d i t i o n s i no r d e rt ol o w e rt h et o x i c i t yo fo u t c o m et oc e l l sa n di n c r e a s eg d l p r o d u c t i o n y a r r o w i a l i p o l y t i c aa s 2 1 4 0 5w a ss t u d i e dt oi m m o b i l i z e t h ei m m o b i l i z e dy e a s tc e l l so fb e t t e r m e c h a n i c a ls t r u c t u r ea n dm a s st r a n s f e rc o u l db em a d eb yt h em i x t u r eo fp v aa n d c a r r a g e e n i n t of e r m e n ta n dp r o d u c eg d l n l eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ed e c i d e dt h r o u g hm a i ni n d e x e s ： b e a di n t e n s i t ya n dg d l y i e l d t h eo p t i m a lc o m p o s i t i o no fe n t r a p p i n ga g e n t s ：8 0 9 lp v a 5 9 lc a r r a g e e n i n ，m i c r o b i a lc e l l so 1g m l ，i m m o b i l i z a t i o nt i m e2 4h o u r s t h ep r o d u c to f g d lc o u l dr e a c ht o4 8 2m g l t h eo u t p u to fg d lw a s2 0p e r c e n ti n c r e a s ew i t hi m m o b i l i z e d y e a s tt h a nb e f o r e k e y w o r d s ：y a r r o w i al i p o l y t i c aa s 2 1 4 0 5 ，y - d e c a l a c t o n e ，c a s t o ro i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：益墨 e l 期：堋秒哔 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 叠亟 导师签名： 一 第一章绪论 第一章绪论 1 1p 癸内酯的概况 1 1 1p 癸内酯的简介 y 一癸内酯( y d e c a l a c t o n e ，g d l ) 是一种内酯类香味物质，它是一个含有五元内 酯环的十碳化合物，分子式为c l o h l 8 0 2 ，分子量为1 7 0 2 5 1 1 。g d l 的结构式见图 1 1 。 厂 v o 冬o 图1 一lg d l 分子结构式 f i g 1 - 1m o l e c u l a r s t r u c t u r eo f y d e c a l a c t o n e g d l 为无色液体，呈椰子和桃子香气，沸点1 5 3 。c 2 0 0 0 p a 或1 1 4 1 1 6 c 6 6 7 p a ，折射率( r i d 2 1 5 ) 1 4 6 1 0 ，微溶于水，易溶于有机溶剂，在其它溶液中的溶 解度随该溶剂介电常数的增大而递减【2 】。 1 1 2 哥癸内酯的用途 g d l 存在于桃、杏和草莓等水果中，也存在于乳制品的风味物质中。1 9 6 9 年，g d l 被美国食品药品管理局认为是安全的食品添加剂和药物添加剂【3 】。我国 g b 2 7 6 0 ，8 6 规定为允许使用的食用香料。它以其诱人的桃香和低香气阈值( 水中为 o 0 8 8 m g l ) 的特性而得到香料工业的普遍应用。g d l 广泛用于各类花香、果香、 东方香型、檀香型日化香精，有良好定香作用；也可用于食品、烟用、饲料、酒 用香精中。 1 2 国内外生产技术发展概况 内酯是羟基脂肪酸分子经过分子内酯化形成的化合物，根据羟基位置的不同 可分为p 内酯，6 内酯和国内酯等。内酯是广泛存在于自然界中具有生物活性的 一类化合物。丫内酯和6 内酯通常具有水果香味，而某些大环c o 内酯具有麝香香 味。它们在食品和化妆品工业中有重要的应用价值，某些昆虫性激素和植物生长 调节剂也是内酯化合物。大多数内酯化合物具有手性，它们的生理活性经常取决 于分子的绝对构型。 内酯化合物具有浓郁的香气，在各种水果昧、可可味、奶酪味、甜昧、及坚 果味的食品体系中都曾分离到内酯。目前，内酯化合物主要由化学方法合成。但 是，用微生物可以产生具有最适活性的相对较纯的产物；同时，微生物可以完成 需要许多步骤的化学合成的生产过程。其中，g d l 是香料工业由生物技术得到的 主要产品。 g d l 广泛存在于水果、肉制品和日常食品中，它以诱人的桃香和低香气阈值 江南大学硕士学位论文 的特性而得到香料工业的普遍应用。早期，g d l 直接来源于水果和化学合成，但 随着消费者对天然香料需求量的上升促使食品研究人员通过微生物技术生产天 然g d l 。1 9 3 0 年，研究者对真菌属s p o r i d i o b o l u s 的 l 种菌能生产g d l 已有所了解。 风味和芳香物质对于食品、饲料、化妆品和制药工业是极其重要的。风味是 最后评判食品质量的决定因素，是“食品化学的皇后”1 4 】。目前，在所生产的风味 化合物中，8 4 的产品由化学合成法生产。化学合成法生产的产品缺陷在于：产 品为同分异构体的混合物，造成了一些有毒物质的混入和香味的改变。某些患“化 学恐怖症”的人对任何化学合成的化合物都有反应，尽管事实证明此举多半是没 有道理的，但通常还是避免食用添加合成香味成分的食品，因为消费者怀疑这些 化合物有毒或对人体有害。这正是生产风味物质的企业对以生物法生产风味物质 感兴趣的原因。 目前，世界上风味和芳香物质的年产值约为7 0 亿美元，逐年增长，这意味着 它占食品添加剂2 5 的市场。从广义上讲，风味物质是一群具有感官特性的化合 物，本文所讲的风味物质为“狭义的风味化合物 ，即主要为具有芳香特性的挥 发性化合物。 长期以来，植物是风味物质的唯一来源，然而，具有感官特性的有效成分通 常含量甚微或以结合态存在，给分离带来了困难。为提高风味化合物的产量而去 调节植物的代谢目前还不可能，因为我们对于其生物合成机理尚待解析中。再者， 随着人们对天然风味物质的需求不断增加，一些植物资源( 如：薄荷) 严重短缺。许 多植物油和香味化合物的价格高达5 0 0 0 美元k g ，例如：桃的主体风味化合物g d l 的化学合成成本为1 5 0 美元k g ，而由天然植物萃取法制得的产品成本为6 0 0 0 美元 1 ( g 。植物作为风味物质来源的另一缺陷在于在很大程度上受诸多难以控制因素 的影响，例如受气候和植物病害侵袭的影响。 进入2 0 世纪以来，生产风味化合物的可能选择是利用生物技术，即通过植物 组织培养，微生物和酶来完成生物合成过程。目前，微生物法是生产较安全的、 高生物活性的风味化合物和其复合物最有前途的方法。 1 2 1y - 癸内酯的化学合成法 1 2 1 1 分子内反应直接合成 利用分子内反应可将羟基酸、羟基酯和羟基酸衍生物直接转化为内酯。催化 剂一般采用无机酸( 如盐酸、硫酸等) 、有机酸( 如对甲苯磺酸、对甲苯磺酰氯以 及2 ，4 ，6 三甲基苯磺酰氯等) 。 由于原料4 羟基癸酸、4 羟基癸酸酯和4 羟基癸酸衍生物不易得到，由此方 法直接转化为内酯的运用具有一定的局限性。可用其它易得原料先合成4 羟基癸 酸，再用此法合成。 1 2 1 2 不饱和酸异构化、内酯化 第一章绪论 由癸烯酸在硫酸中异构化形成p 、丫不饱和癸烯酸，在硫酸等酸催化剂存在 下加热制得。 有日本专利公开了3 ，癸烯酸在聚磷酸、酸性离子交换树脂和固体磷酸等酸性 催化剂的存在下，经环化反应制备g d l 【5 】。 此法合成路线短，反应条件简单，但原料癸烯酸很难得到，不易于工业化。 b 、丫不饱和癸酸生成后，再内酯化，许多合成路线要经过这一步。 1 2 1 3q 烯烃作原料 由醇为原料，脱水生成烯烃，进一步合成y 内酯。随着石油化工的发展，用0 l 烯烃为原料合成丫内酯类香料是很有前途的。0 【烯烃在高于其最低价态的锰、铯 和铈等离子存在下，由烯烃氧化合成，用过量醋酸锰( i i i ) 氧化烯烃可制得丫内酯， 产率颇高。 1 2 1 4 利用醇类与不饱和酸的游离基加成反应合成y 内酯 醇类在游离基引发剂存在下形成游离基，然后与不饱和羧酸酯进行加成。日 本信越公司的专利【6 j 中公开了g d l 锘u 备方法。除二叔丁基过氧化物外，还加入了 h 3 8 0 4 、h 3 p 0 4 和对甲苯磺酸等。g d l 得率为8 0 左右。 此类方法，原料易得，产品得率高，工艺条件温和，成本较低，是比较理想 的一种工业生产方法。 1 2 2 丫癸内酯的生物技术法 由于天然香料不断增长的市场需求，促进了香精香料生产技术的迅速发展。 尽管传统的化学合成和天然提取方法还在起重要的作用，但是利用生物技术生产 香料化合物正受到人们越来越多的重视。利用微生物发酵来模拟植物次级代谢过 程可生产出香料化合物，而且这些香料化合物已被欧洲和美国食品法规界定为 “天然的”。g d l 是手性分子，从水果中提取的g d l 具有特定的立体结构，而化学 法生产的却是消旋体。因此，用生物法生产光活性的g d l 的工作吸引了许多研究 人员的关注，并开展了大量的工作，对这方面的工作有大量文献进行了报道【7 9 1 。 采用生物技术可以通过3 种途径得到g d l ：生物合成、生物转化和生物催化。 1 2 2 1 生物合成法制取g d l 某些丝状真菌和酵母在静止期能合成和积累对于细胞生长非必需的作为次 生代谢物的内酯。在果酒、啤酒和米酒中氨基酸可能是形成内酯的起始物，但通 常的合成途径是通过脂类代谢的中间体合成内酯；所以，内酯的形成与脂类代谢 有关。 b e r g e r 从长有担子菌的含有麦芽酵母提取液的培养基中发现t g d l ，还有文 献报道通过真菌生物合成g d l f l 0 , 1 1 】。l e e 等用发酵法生产g d ld 2 ，在罐式发酵器 中，微生物s p o r o b o l o m y c e so d o r t l s 生长迅速，大约培养7 2 h 后，可进行生产。 j o u r d a i n 0 3 采用固定s p o r b o l o m y c e so d o r l g $ 的方法发酵，但g d l 积累的速率仍很低 江南大学硕士学位论文 ( 1m l h 或0 3 m g l ) 。g e r v a i s 1 4 针对水活度( a w ) 对g d l 产量的潜在影响进行了研 究，他选用的菌种也是so d o r u s ，但产量很低。在此研究的基础上，研究者开始 探讨利用微生物将脂肪酸生物转化成内酯的可行性。 1 2 2 2 生物转化法制取g d l 。 羟基脂肪酸，非羟基脂肪酸和脂肪酸酯可作为底物。g d l 的直接前体是y 羟基脂肪酸，不同的脂肪酸底物先要经过微生物体内酶的转化生成直接前体，才 能转化成内酯。 ( 1 ) 以羟基脂肪酸为底物制取g d l 以不同链长的4 或5 羟基脂肪酸为底物，经过细菌、酵母或真菌的转化形成 相应的羟基脂肪酸，再经过简单的加热即可形成内酯。7 羟基十二烷酸在生物转 化中先经过1 3 氧化缩短碳链，再还原成6 癸内酯。 天然的羟基脂肪酸，比如存在于蓖麻油中的蓖麻油酸( 1 2 羟基9 十八碳烯 酸) ，在微生物转化过程中，先经过1 3 氧化，使碳链缩短，再转化成g d l 。 ( 2 ) 以非羟基脂肪酸为底物制取g d l 一些微生物能直接利用非羟基脂肪酸( 包括癸酸、油酸、亚油酸) 和羟基不 饱和脂肪酸等为底物产生内酯。在非羟基脂肪酸的转化中，需要引进羟基，对于 长链脂肪酸还包括缩短碳链。 虽然微生物转化脂肪酸形成内酯的代谢途径及调节机制尚未完全阐明，但通 过某些代谢调节可以提高内酯产量。长碳链脂肪酸转化形成内酯涉及b 氧化，因 此需要诱导激活此类酶系。人们发现蓖麻油酸是很好的激活剂，在用c 切胛诫砌 l i p o l y t i , a 和r h o d o t o r u l a “，加括转化油酸、亚麻酸和蓖麻酸自氧化而形成羟基酸 时，加入蓖麻油酸或醋酯可以提高内酯的产量，有些内酯产量提高了二倍，逐步 接近工业化生产的需要。 ( 3 ) 以脂肪酸酯为底物制取g d l b a s f 公司注册了一个关于使用多种m u c e r 菌，以脂肪酸酯为底物生产g d l 的专利【】。专利中列举的实验中，癸酸乙酯经微生物氧化作用后，再经酸化、提 取和蒸馏后得n g d l 。以其它脂肪酸酯为起始物还可获得相应的内酯。 1 2 2 3 生物催化法制取g d l 酶在非水相中具有催化活性，它被广泛地应用于有机合成中。其中应用最多 的是脂肪酶( e c 3 1 1 3 ) ，其价格便宜，不需辅酶，底物适应性强。脂肪酶不仅能 催化脂的水解反应，而且在有机相中能催化酯化反应和酯交换反应，包括催化羟 基脂肪酸形成内酯。 脂肪酶催化的内酯反应受多种因素的影响，如脂肪酶的来源、底物的链长、 底物上取代基的位置和底物浓度、有机溶剂的极性、p i q 值、反应系统的水含量 和温度等。 第一章绪论 生物催化反应一般使用悬浮体系，即将底物溶于有机溶剂中，加入固体酶粉， 搅拌反应。 脂肪酶在有机溶剂中的反应提供了一种方便高产率和高对映选择性的合成 内酯的方法。由于脂肪酶种类繁多和底物的特异性，通过酶技术可以制取比微生 物转化更多种类的内酯。 而利用常规方法环化这些羟基酸则非常困难，产率很低，利用酶法在有机介 质中完成环化过程则要容易得多，这无疑为这类香味内酯的大规模市场化提供了 良好的途径。有时在条件许可的情况下，也可以利用其他的一些生物技术酶催化 方法。也许在不久的将来也会成为解决内酯类生物活性物质市场化这一问题的重 要手段之一。 1 2 3g d l 的微生物发酵法 近几年，国外申请的g d l 生产专利几乎全是生物法【1 6 。1 引。目前，利用生物技 术生产g d l 普遍采用生物转化的方法，即利用酵母菌以蓖麻油中的主要组分蓖麻 油酸( 1 2 羟基9 十八碳烯酸，含量在8 0 以上) 为底物，先经过p 氧化使碳链缩短， 再内酯化生成g d l ，代谢途径【1 9 j 如图1 2 。 1 3 分离提取工艺的研究 1 3 1 风味物质的提取 常用的风味物质提取方法有：溶剂提取法、蒸馏提取法、吸附与解吸法、顶 空搜集法、液体c 0 2 提取法和超临界c 0 2 萃取法。 溶剂萃取法是分析化学领域中最经典的提取技术，利用有机溶剂对大部分食 品风味物质所具有的良好溶解性来提取。设备简单，操作方便，具有比较理想的 分离效果。其关键是溶剂的选择及溶剂的提纯。 蒸馏提取法是食品风味分析中最普遍应用的提取方法。这是一种在相同温度 下利用液体混合物中各组分具有不同的蒸汽压来气提宽沸程挥发性化合物的最 有效的方法之一。主要包括常压与减压蒸馏法、高真空蒸馏法、分子蒸馏法、水 蒸汽薄膜吹扫蒸馏法、同时蒸馏提取法。 吸附与解吸法是利用某种固体吸附剂对食品中的风味组分进行选择性的吸 附，从而达到排除其它组分的目的【2 0 ，2 1 1 ，这也是食品风味分析中最常用的方法。 被捕集到吸附剂上的风味物质，通过加热解吸出来，直接进入分析系统，特别适 合于富集痕量的风味分离物，且具有良好的效果。 顶空捕集法是根据食品加热以后，挥发性化合物逸出食品表面，可使人们嗅 到强烈的食品香气的原理设计的。据挥发性组分的提取方式分成静态法( s t a t i c ) 和 动态法( d y n a m i c ) 两类，由于动态法经历了吹扫与捕集两个阶段，又称吹扫捕集 法( p u r g ea n du a p ) 。这是食品风味研究中最现代化的分析手段之一。这种方法的 特点是简便、快速，被分析的风味化合物十分接近人体嗅觉所能感觉到的气味， 江南大学硕士学位论文 动态法的灵敏度优于静态法【2 2 ，2 3 1 。 液体c 0 2 是种良好的提取剂，其沸点为7 8 5 ，在提取低沸点、易挥发的 风味物质时显示出较高的选择性。特别适合于提取低分子量的酯类、醛类、酮类 及醇类物质。 超临界流体c 0 2 的临界温度3 1 0 6 ，临界压力7 2 4 m p a ，具有较高的溶解性和 选择性，特别适合于低沸点、易氧化物质的提取。 经过溶剂法提取出的风味物质，由于风味物质在组成中含量甚微，必须经过 浓缩富集才能满足各种分析方法的灵敏度要求。常用的方法有蒸发浓缩、冷冻浓 缩、吸附浓缩等。 c h 厂( c 叭f ；，c h 2 ) 广c o o h o h 0 卜钒化 c h 厂化5 p c o o h 1 酬t c h 厂( c 峨八c o o h o h l1 3 一氧化 c h 3 一c 吣y h o h 环化 一一毋。 图l 2 生物转化蓖麻油生产g d l f i g 1 2b i o t r a n s f o r m a t i o nc a s t o ro i li n t o1 , - d e c a l a c t o n e 1 3 2 风味物质的分析 风味物质的分析方法是随着现代分析仪器的发展而发展起来的，目前应用最 多的是气相色谱和高压液相色谱。对于有机化合物的鉴定还主要依靠定性分析仪 器：质谱、红外光谱、紫外光谱和核磁共振，从四大谱联合定性信息的综合分析 中获得准确的鉴定结果。随着色谱、质谱联用仪在风味分析中的应用，风味化学 的研究进入了飞跃发展的阶段，各种食品中有数百种挥发性化合物得到分析【2 4 1 。 第一章绪论 1 4 本课题的研究意义 在美国、英国、德国、日本、法国等国家利用生物技术生产风味物质的研究 开始于本世纪三十年代，最初是通过对香味的描述来对其进行分类。随着分析化 学领域中一些仪器分析手段的应用和改进，如：气相色谱法和质谱分析法，越来 越多的微生物风味挥发物质得以鉴定。1 9 6 9 年，g d l 被美国食品药品管理局确定 为安全的食品添加剂和药物添加剂。 随着消费者对天然食品添加剂的不断认识，激发了风味物质的采用生物法制 取的进程。目前，g d l 是香料工业最主要的由生物技术得到的产品，国内对此 研究方向的文献还不多。面对巨大的食品添加剂市场和日趋激烈的市场竞争，必 须及早、及时着手风味物质的生物技术研究，这不仅对我国食品添加剂工业的发 展有着重大的意义，同时对节省国家外汇开支，出口创汇等均具有深远的意义。 1 5 本课题的主要研究内容 ( 1 ) 复合诱变选育g d l 高产菌株； ( 2 ) 发酵工艺条件的优化； ( 3 ) 固定化耶罗维亚酵母发酵生产g d l 。 江南大学硕士学位论文 第二章复合诱变选育g d l 高产菌株 2 1 引言。 菌种是影响产酶的重要因素，不同菌种产酶能力相差很大，因此选育出优良 的菌种对本研究具有决定性意义。本章y a r r o w i al i p o l y t i c a 酵母作为出发菌株， 利用紫外线和硫酸二乙酯进行复合诱变，筛选出产g d l 高的菌株，为高产菌株的 培养基配方、发酵培养条件的进一步优化提供实验基础。 2 2 材料和方法 2 2 1 材料 2 2 1 1 主要试剂与材料 丙位癸内酯标样实验试剂 玉米浆 生化试剂 吐温8 0生化试剂 酵母膏生化试剂 琼脂 生化试剂 葡萄糖分析纯 蓖麻油化学纯 三丁酸甘油酯分析纯 m g s 0 4 7 h 2 0 分析纯 n a a s 2 0 3 分析纯 k 2 h p 0 4 分析纯 n a o h分析纯 z n s 0 4 7 h 2 0分析纯 n a c l分析纯 n a 2 h p 0 4 12 h 2 0 分析纯 2 2 1 2 仪器设备 s w c j i f 单人双面净化工作台 往复式摇床 h z s h 水浴振荡器 恒温培养箱 立式圆形压力蒸汽灭菌器 电热鼓风干燥箱 昆山绿洲香料有限公司 无锡酶制剂厂 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 苏净集团安泰公司 无锡查桥轻机厂 常州国华有限公司 上海跃进医疗集团 上海医用核子仪器厂 上海跃进医疗器械厂 第二章复合诱变选育丫癸内酯高产菌株 t g l 1 6 g 高速台式离心机 电热恒温培养箱 g s p 7 7 0 3 磁力搅拌器 电子天平 x s s 2 光学显微镜 紫外线杀菌灯 7 2 2 分光光度计 气相色谱仪 2 2 1 3 微生物菌种 上海医用仪器分析厂 上海跃进医疗器械厂 江苏泰县姜埝无线电厂 m e t t l e 公司 上海第三分析仪器厂 自制 上海第三分析仪器厂 日本岛津g c 1 4 a 耶罗维亚酵母( y a r r o w i al i p o l y t i c aa s 2 1 4 0 5 ) ，购自中国普通微生物菌种保 藏中心，4 c 保存于试管斜面上。 2 2 1 4 培养基( g m ) ( 1 ) 斜面培养基：葡萄糖1 0 ，蛋白胨1 0 ，酵母膏5 ，n a c l5 ，琼脂2 0 ，用6 m o l l n a o h 调p h 7 0 - - 7 2 。 ( 2 ) 种子培养基：葡萄糖2 0 ，蛋白胨1 5 ，酵母浸出汁1 0 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 ，吐 温8 03 ，k h 2 p 0 4 2 ，p h 6 5 ，5 0 0 m l 一= 角瓶装液量5 0 m l 。 ( 3 ) 起初发酵培养基：蓖麻油5 0 ，蛋白胨1 5 ，酵母浸出汁1 0 ，n a 2 h p 0 4 - 1 2 h 2 02 ， 吐温一8 03 ，k h 2 p 0 4 2 ，p h 6 5 ，装液量5 0 m l 5 0 0 m l 。 ( 4 ) 脂肪酶筛选培养基：酵母膏1 0 ，三丁酸甘油酯2 ，葡萄糖3 ，琼脂2 0 ，用6 m o l l n a o h 调p h 7 1 。 2 2 2 培养方法 斜面培养：将保存的斜面菌种，接一环到新鲜的斜面培养基上，3 0 c 恒温培 养2 7 h 。 种子培养：接斜面菌体一环到种子培养基中，3 0 ，1 0 0 r m i n 培养3 0 h ，装 液量5 0 m l 5 0 0 m l 三角瓶。 发酵培养：在发酵培养基中接入8 种子液，3 0 。c ，1 0 0 r m i n 培养4 8 h ，装 液量5 0 m l 5 0 0 m l 三角瓶。 2 2 3 分析方法 2 2 3 1 生长曲线 接种一环菌体至种子培养基，不同时间取样稀释，于6 2 0 n m 处测定o d 值作 曲线。 2 2 3 2g d l 的提取 终止发酵，调p h 至4 0 ，10 m l 发酵液 h io m l 正己烷，振荡，离心10 ，0 0 0 r m i n ， 4 c 冷冻离心后取上清液。 2 2 3 3 对照样品 江南大学硕士学位论文 取0 1 m l 用化学方法制取得g d l ，溶于9 9 m l 正己烷中，混匀。从中取0 1 m l 溶于9 9 m l 正己烷中，得到o 0 1 浓度的标样。 2 2 3 4g d l 的测定方法 采用气相色谱( g c ) 外标法定量。 仪器：日本岛津g c 1 4 a 色谱柱：p e g 2 0 m3 0 mi d 0 3 2 m m xli t m 检测器：f i d ( 氢火焰离子化检测器) 汽化室温度：2 6 0 检测器温度：2 6 0 程序升温：8 0 ( 3 ) - - - - 2 2 0 ( 2 0 ) 1 0 载气压力( n 2 ) ：o 8 0 k g c m 2 燃气压力( h 2 ) ：0 6 5 k g c m 2 助燃气压力( 空气) ：0 5 0 k g c m 2 分流比：3 0 ：1 进样量：1 l 2 2 4 紫外线诱变和致死率 紫外线诱变【2 5 1 采用以下路线。 菌体活化 上 菌体种子培养基 j ， 紫外线诱变 上 稀释 、l 涂布平板 l 分离 将菌种用斜面活化至对数期，用血球计数板计数，移取适量菌液于装有无菌 水和适量玻璃珠的三角瓶中，振荡三角瓶以打散细胞，调整菌悬液的细胞浓度分 别约为1 0 4 、1 0 6 、1 0 8 个m l ，取5 m l 以上各浓度菌液加入到直径9 c m 的无菌平皿 中，置距离1 5 w 紫外灯3 0 c m 处进行照射，每隔l m i n 取样，然后分别取0 1 m l 涂平 板。对照组涂1 0 一、1 0 4 、1 0 5 三个稀释度，诱变组涂诱变原液和1 0 、1 0 五、1 0 3 四个稀释度，每个稀释度涂三个平板。从紫外线照射以后的操作都在红灯下进行。 将涂匀的平板装在不透明的盒子里，置于3 0 c 恒温培养箱中培养7 2 h ，将培养好 第二章复合诱变选育7 - 癸内酯高产菌株 的平板取出进行菌落记数，计算致死率。 致死率( ) = 1 0 0 一( 处理后0 1 m l 菌落数对照0 1 m l 菌落数) x1 0 0 2 2 5 化学诱变 化学诱变采用以下路线： 菌种活化 上 液体种子培养基 j ， 化学诱变 l 稀释 j ， 涂布平板 j ， 分离 化学诱变采用硫酸二乙酯为诱变剂。硫酸二乙酯易分解而引起环境p h 改变， 因此采用缓冲液配制。本实验将生长到对数生长期菌液4 m l ( 浓度约为1 0 8 个 m l ) ，加入到1 6 m l 磷酸缓冲溶液中，加入0 2 m l 硫酸- - 7 , 酯，振荡处理3 0 、5 0 、 7 0 m i n ，最后加入0 5 m l 的2 5 硫代硫酸钠中止反应。稀释到1 0 4 、1 0 、1 0 - 6 三个 稀释度，每个稀释度平行涂布三个平板。3 0 c 恒温培养箱中培养7 2 h ，将培养好 的平板取出进行菌落记数，计算致死率。 致死率( ) = 1 0 0 一( 处理后0 1 m l 菌落数对照0 1 m l 菌落数) 1 0 0 2 2 6 初筛与复筛 y a r r o w i at f p o t y t i c a 身会分泌出脂肪酶和乙酰c o a 氧化酶，其中脂肪酶分解 底物为其生长提供养料，乙酰c o a 氧化酶是该菌种产生g d l 的关键酶。作为产生 g d l 的筛选方法，本应该以乙酰c o a 氧化酶的活性为标准，但由于乙酰c o a 氧化 酶的测定非常麻烦，所以在初筛时采用相对容易的脂肪酶检测培养基进行筛选。 将菌液直接涂布于脂肪酶筛选培养基上，挑选透明圈大且菌斑直径大的菌落，转 接至斜面培养基。在复筛中采取单瓶发酵，最后测定发酵液中g d l 的含量，作为 复筛标准。 2 3 结果与讨论 2 3 1 出发茵生长曲线 耶罗威亚酵母在种子培养基中的生长曲线如图2 1 所示，1 2 h 之前菌体生长 处于延迟期，菌体生长缓慢，1 2 h 后开始进入指数生长期，菌体质量浓度快速增 长，伴随着葡萄糖消耗完全，3 0 h 后菌体生长进入稳定期。 江南大学硕士学位论文 05 1 01 52 02 53 03 5 t ( h ) 图2 - 1 耶罗维亚酵母在种子液中的生长曲线 f i g 2 一lg r o w i n gc u r v eo fy a r r o w i at i p o l y t i c ai ns e e dm e d i u m 2 3 2 紫外线诱变结果及致死率 紫外线诱变中，1 0 8 个n 山浓度的出发菌株的菌液经诱变后，即使是在稀释倍 数最高的平板上，菌落数还是很多。1 0 4 个m l 浓度的出发菌株的菌液经诱变后， 在2 m i n 时己达到了很高的致死率，所以选取1 0 6 个m l 浓度的出发菌株的一组采集 数据图2 2 。 盆 、- ， 槲 献 毹 012 3 456 7 处理时间( m i n ) 图2 - 2y a r r o w i al i p o l y t i c a 酵母紫外线诱变致死曲线 f i g 2 - 2l e t h a l i t yc u r v eo f y a r r o w i al i p o l y t i c as u b j e c t e dt ou vm u t a g e n e s i s 由图2 2 中的数据可看出，该酵母在2 r a i n 之内对紫外线是比较敏感的，照射 至l j 2 m i n 时致死率可达至t j 5 9 1 0 ，此后随处理时间的延长，致死率逐渐上升。处 2 0 8 6 4 2 o 1 1 0 0 0 0 0 o n d o 加们趵加0 第二章复合诱变选育丫- 癸内酯高产菌株 理到5 m 血时，致死率已经接近1 0 0 。故该菌株的紫外线最长耐受时间为5 r a i n 。 许多学者认为，当致死率达到7 0 8 0 时弘6 ，诱变效果最好，正突变率最高， 故本实验选取致死率为8 4 8 0 时的3 m i n 为最佳紫外诱变时间。 2 3 3 紫外线诱变筛选结果 3 6 株诱变菌株进行筛选，数据如图2 3 所示，其中o 号菌株为出发菌株，其发 酵液中g d l 的含量为1 4 3 m g l ，共3 6 株待筛选菌株，其中正突变菌株有2 9 株。其 中产量最高的一株菌为1 8 号菌株，产量为3 0 4 m g l ，是出发菌株的2 1 倍。 3 0 0 2 5 0 051 0152 02 53 03 5 菌种名称 图2 - 3 紫外线诱变菌株g d l 产量图 f i g 2 - 3y i e l do fg d lb yi n d u c e du v - m u t a n t s 将产量最高的1 8 号菌株进一步紫外诱变，筛选出g d l 产量最高的菌株，再进 行紫外诱变，但是发现g d l 产量并没有得到进一步提高。其中第二轮和第三轮紫 外诱变的最高产量均保持在3 0 4 m g l 左右的水平。推测其原因是紫外诱变虽然对 该菌株产生一定的作用，但是这种突变是很容易得到恢复的，在进行下一轮诱变 前的传代过程中，这种突变即被修复。将最后一轮采用紫外诱变得到的高产菌株 命名为y 1 ，进而采用化学诱变的方法稳定y 1 的产量。 2 3 4 化学诱变结果及致死率 化学诱变处理3 0 m i n 的菌液在稀释倍数最大的平板上菌落数也很大，该组数 据不进行处理。处理5 0 m i n 和7 0 m i n 的菌液致死率见表2 1 。可见处理5 0 m i n 时的数 据比较符合筛选的标准，进行进一步初筛和复筛。 0 0 o 0 0 加 佰 伯 5 1，西e一一oo 江南大学硕士学位论文 表2 1 酵母，勿即w 妇l i p o l y t i c a 化学诱变后平板菌落数与致死率 t a b l e2 1r e l a t i o n s h i pb e t w e e nc h e m i c a l t r e a t e dy e a s tn u m b e ra n dl e t h a l i t y 注：平板1 2 3 是诱变前的菌落数，4 5 6 诱变后的菌落数。 2 3 5 化学诱变筛选结果 对2 0 株菌进行发酵所得的结果如图2 2 所示。0 号菌是y 1 ，其中产量最高 的菌株产g d l 为318 m g l ，较紫外诱变没有什么增长，推测该菌株可能对于紫 外和化学诱变的敏感度较低，需尝试用其他诱变方法增加其产量；也可能是由于 化学诱变的剂量不够导致。将化学诱变得到的高产菌株命名为y 1 6 。 3 0 0 2 5 0 32 0 0 口 e 了1 5 0 o c 1 0 0 5 0 0 051 01 5 菌种名称 图2 4 化学诱变菌株g d l 产量图 f i g 2 - 4y i e l do fg d lb yc h e m i c a l i n d u c e dm u t a n t s 2 3 6 稳定性实验 将y 1 6 传三代，分别进行发酵，g d l 含量分别为3 1 5 、3 0 8 和3 0 1 m g l ，产量 有所下降，但是基本可以保持在较稳定的水平。 2 4 本章小结 针对y a r r o w i al i p o l y t i c a 酵母产y 癸内酯含量不高的特点，采用紫外诱变和化 学诱变相结合的复合诱变方法，对产生菌株进行诱变。经过一次紫外诱变后， g d l 产量为过去的2 1 倍，但多次诱变后其产量并没有进一步提高，且稳定性不 好。其后采用硫酸二乙酯进行化学诱变稳定其产量，g d l 含量分别为3 1 5 、3 0 8 第二章复合诱变选育1 ，癸内酯高产菌株 和3 1 0 m g l ，产量有所下降，但是基本可以保持在较稳定的水平，最终突变株1 ，- 癸内酯产量为出发菌株的2 2 倍。 江南大学硕士学位论文 3 1 引言 第三章发酵工艺条件的优化 微生物需要从环境吸取营养物质，以提供能量，调节新陈代谢并合成细胞物 质，从而使得菌体总量增加，并使细胞数目逐步增多。营养物质的组成以及微生 物所处环境条件的变化，不仅会影响微生物的生长及其生存状态，而且将在很大 程度上影响代谢产物以及各代谢途径中酶系的生成与活性。 其中，培养基的组成和摇瓶培养条件是实验室研究的主要内容。培养基是人 工配制的供微生物生长、繁殖、代谢和合成人们所需产物的营养物质原料，同时 培养基也为微生物等提供除营养以外的其它生长所需的环境条件。培养基的组成 和配比是否恰当对微生物的生长、产物的合成、提取工艺的选择、产品的产量和 质量都有很大的影响，培养基组成要符合一些基本需要：必须含有作为合成细胞 组成的原料；满足一般生化反应的基本条件，如碳源、氮源、无机盐及生长因素； 一定的p h 条件2 7 渤】。摇瓶发酵培养条件的优化是发酵产品从实验室研究到工业 化生产过程中必须进行的工作。本章结合前人实验结果【3 1 , 3 2 】，主要就发酵培养基 组成作了详细的研究，并确立了较好的培养基组成和摇瓶发酵条件。 3 2 材料与方法 3 2 1 材料 3 2 1 1 主要试剂 丙位癸内酯标样 葡萄糖 玉米浆 吐温8 0 酵母膏 琼脂 蓖麻油 m g s 0 4 。7 h 2 0 n h 4 c i n h 4 n 0 3 k c l f e s 0 4 7 h 2 0 k h 2 p 0 4 n a o h 实验试剂 分析纯 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 昆山绿洲香料有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 无锡酶制剂厂 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集