（环境科学专业论文）umu试验方法优化及在环境中应用研究.pdf

水以及沿途污染较重的污水的注入，致使出新乡市前卫删水的遗传毒性升高。 通过尚庄污水处理厂进水、出水水样分析和卫河新乡市区段的水样分析，验证了经 过优化保存条件的s a l m o n e l l at y p h i m u r i u mt a l 5 3 5 p s k l 0 0 2 菌种和经过优化的u m u 试 验方法。 关键词：u m u 试验，遗传毒性，s a l m o n e l l at y p h i m u r i u mt a l 5 3 5 p s k l 0 0 2 ，菌种活化， 4 - n q o 标准曲线，最佳测试区间 i j ab s t r a c t u m ut e s t ，w h i c ha l s o c a l l e ds o s u m ut e s t ，h a sb e e nw i d e l ya p p l i e di ng e n o t o x i c i t yd e t e c t i n go f c h e m i c a lm a t e r i a l sa n de n v i r o n m e n t a ls a m p l e s i th a sb e e nr e s e a r c h e do ft h ep r e s e r v a t i o nc o n d i t i o no ft h e u m ut e s ts t r a i ns a l m o n e l l at y p h i m u r i u mt ai5 3 5 p s k l0 0 2 ，a sw e l la st h ee x p e r i m e n tc o n d i t i o n so ft h e u m ut e s t i no r d e rt ov a l i d a t et h er e s e a r c ho ft h eo p t i m i z e dp r e s e r v a t i o nc o n d i t i o na n dt h eo p t i m i z e d e x p e r i m e n tc o n d i t i o n s ，t h eg e n o t o x i c i t yo fe n v i r o n m e n t a lw a s t ew a t e rs a m p l e s ，w h i c ha l s os h o w e dt h e g e n o t o x i c i t yo f t h es a m p l e s ，h a sb e e nd e t e c t e d t h eu l t r ac o l ds t o r a g ef r e e z e r ( 一8 0 c ) w a ss u b s t i t u t e df o rt h er e f r i g e r a t o r ( 一2 0 。c ) i nt h eo p t i m i z a t i o n o fs t r a i np r e s e r v a t i o nc o n d i t i o n t h ec o m p l i c a t e do p e r m i o n sw e r er e d u c e d ，a n dt h es t r a i na c t i v i t yw a sk e p t w i t hs t r a i na c t i v a t i o n t h eg r o w t hc u r v e sa n ds t a n d a r dc u r v e so ft h es t r a i n s - a c t i v a t e ds t r a i n sa n d u n a c t i v a t e ds t r a i n sp r e s e r v e di nr e f r i g e r a t o r , a n ds t r a i n sp r e s e r v e di nu l t r ac o l ds t o r a g ef r e e z e r - w e r e c o m p a r e d i tw a sv a l i d a t e dt h a tt h et r a d i t i o n a ls t r a i np r e s e r v a t i o nc o u l db es u b s t i t u t e df o rt h ea c t i v a t e d s t r a i np r e s e r v e di nt h er e f r i g e r a t o r a tf i r s tt h ea c t i v a t i o ni n t e r v a lo ft h es t r a i nw a sr e s e a r c h e di nt h e c o n d i t i o no p t i m i z a t i o no ft h eu m ut e s t s t a b l ea c t i v a t e dg r o w t hc u r v ew a sr e c e i v e dw h e nt h es t r a i nw a s a c t i v a t e di nt h ep e r i o df r o mt h el o g a r i t h m i ca n a p h a s et ot h es t a t i o n a r ym e t a p h a s e ( a p p r o x i m a t e l y6h o u r s ) o ft h eg r o w t hc u r v e a n dt h i sp e r i o dc a l l e dt h eo p t i m a la c t i v a t i o np e r i o do ft h es t r a i n w h e nt h ec u l t i v a t e d s t r a i nw a sd i l u t e dw i t ht g ac u l t u r em e d i u mi nd i f f e r e n td i l u t e dm u l t i p l e sa n di nd i f f e r e n tp h a s eo ft h e a c t i v a t e dg r o w t hc u r v e ，t h et g ah a dar e l a t i v e l ys t a b i l eg r o w t hs p e e di nt h ep e r i o d ，w h i c hc a l l e dt h e o p t i m a lt g ac u l t i v a t i o np e r i o d , f r o mt h el o g a r i t h m i ca n a p h a s et ot h es t a t i o n a r ym e t a p h a s e ( a p p r o x i m a t e l y 7h o u r s ) o ft h ea c t i v a t e dg r o w t hc u r v e i nt h eo p t i m a lt g ac u l t i v a t i o np e r i o d , t h ea c t i v i t yo ft h es t r a i nw a s p e r f e c tw h e nt h et g a d i l u t e dm u l t i p l ew i t h i n0 3t o0 4 ，a n dt h i sd i l u t e dm u l t i p l ew a st h eo p t i m a lt g a d i l u t e dm u l t i p l e o fa c t i v a t e dg r o w t hc u r v e ，i nt h ep e r i o df r o mt h el o g a r i t h m i ca n a p h a s et ot h es t a t i o n a r y m e t a p h a s e ( a p p r o x i m a t e l y7h o u r s ) ，t h ea c t i v i t yo ft h es t r a i nw a sp e r f e c ta n ds t a b l e i nt h i sp e r i o dt h e c u l t i v a t e ds t r a i nd i l u t e db yt h et g ac u l t u r em e d i u mg r o w ns t e a d y , t h ee x p e r i m e n tc o u l db ed o n ei nal o n g p e r i o da n dt h eo p e r a t i o n sw e r ee a s i e r s ot h i sp e r i o d ( f r o mt h el o g a r i t h m i ca n a p h a s et o t h es t a t i o n a r y m e t a p h a s e ) c a l l e dt h eo p t i m a lu m ut e s t i n gp e r i o d b e f o r et h ed e t e c t i n go fe n v i r o n m e n t a lw a t e rs a m p l e s ，t h ew a t e rs a m p l ep r e t r e a t m e n tm e t h o dw a s i i i e s t i m a t e dw i t ht h er e s p o n d i n gc h iv eo fm a s c u l i n ec o n t r a s t4 一n q o a n dt h er e s u l ts h o w st h a tt h ew a t e r s a m p l ep r e t r e a t m e n tm e t h o dw a sf e a s i b l ei nt h eu m ut e s t t h eg e n o t o x i c i t yo ft h ei n f l u e n ta n dt h ed r a i n a g e s a m p l i n gf r o ms h a n g z h u a n gs e w a g et r e a t m e n tp l a n tw e r ed e t e c t e dw i t ht h eu m ut e s t a n dt h e4 - n q o t o x i ce q u i v a l e n tv a l u e ( t e f ) w e r et e f ( i n f l u e n t ) = 1 2 9 7 3p 酽l a n dt e f ( d r a i n a g e ) = 7 2 9 1l a g l 一i tw a s s h o w nt h a tt h eg e n o t o x i c i t yo ft h ei n f l u e n tw a sv e r yn o t a b l e ，t h ee x i s t i n gs e w a g et r e a t m e n tp r o c e s sh a da c e r t a i nr e m o v a lo nt h eg e n o t o x i c i t yo ft h es e w a g e ，a n dt h eg e n o t o x i c i t yo ft h ed r a i n a g ew a ss t i l lv e r yh i 曲 t h r o u g ht h ei n v e s t i g a t i o no ft h er i v e rw a t e ra n dt h ew a s t ew a t e r so ft h ew e ir i v e rw i t h i nx i n x i n ga n dt h e a n a l y s i so ft h ew a t e rs a m p l e sw i t ht h eu m ut e s t ，w ef o u n dt h a tt h eu p p e rr e a c h e so ft h er i v e rh a dn o tb e e n s e r i o u s l yp o l l u t e d t h ei n f l u xo fw a s t ew a t e r sf r o mt h eu p p e rr e a c h e sa n df r o mt h eu r b a nw a sc o l l e c t e di n t h ec a m e lb a ys e w a g et r e a t m e n tp l a n tt h r o u g ht h ec u l v e r t t h ed r a i n a g el e ti n t ot h ew e ir i v e ra f t e r t r e a t e d t h ed r a i n a g el e dt h eg e n o t o x i c i t yi n c r e a s eo ft h el o w e rr e a c h e s t h ed r a i n a g eo ft h ec a m e lb a y s e w a g et r e a t m e n tp l a n ta n dt h ed r a i n a g eo ft h es h a n g z h u a n gs e w a g et r e a t m e n tp l a n ta n dt h ei n j e c t i o no f t h eh e a v yp o l l u t e ds e w a g ea l o n gt h el o w e rr i v e rw e r et h ei m p u t a t i o n so ft h eg e n o t o x i c i t yi n c r e a s eo ft h e w e ir i v e ro u t f l o wo fx i n x i n g w i t ht h ea n a l y s i so ft h es e w a g es a m p l e so ft h ei n f l u e n ta n dt h ed r a i n a g es a m p l i n gf r o ms h a n g z h u a n g s e w a g et r e a t m e n tp l a n ta n dt h ew a t e rs a m p l e sf r o mt h ew e ir i v e rw i t h i nx i n x i n g ，i th a sb e e nv a l i d a t e d t h a tt h eu m ut e s ts t r a i ns a l m o n e l l at y p h i m u r i u mt a i s 3 5 p s k l 0 0 2p r e s e r v e di no p t i m i z e dp r e s e r v a t i o n c o n d i t i o na n dt h eo p t i m i z e de x p e r i m e n tc o n d i t i o n so f t h eu m ut e s tw e r ef e a s i b l e k e yw o r d s ：u m ut e s t ，g e n o t o x i c i t y , s a l m o n e l l at y p h i m u r i m ut a l 5 3 5 p s k l 0 0 2 ，s t r a i na c t i v a t i o n ， 4 - n q os t a n d a r dc u r v e ，o p t i m a lt e s t i n gi n t e r v a l i v 图2 一l 图2 2 图2 3 图2 4 图2 5 图2 - 6 图2 7 图3 1 图3 2 图3 3 图3 4 图3 5 图3 - 6 图3 7 图3 8 图3 - 9 图3 1 0 图3 11 图3 1 2 图3 1 3 图3 1 4 图3 1 5 图3 1 6 图3 1 7 图3 1 8 图3 1 9 图3 2 0 图3 2 1 图3 2 2 图3 2 3 图3 2 4 图3 2 5 图3 - 2 6 图3 2 7 图3 2 8 图4 1 图4 - 2 图4 3 图4 - 4 图4 5 图4 - 6 图4 7 图4 8 插图清单 s o s 修复反应的调节机理1 1 u m u 试验原理12 样品的u m u 响应曲线。1 5 样品u m u 响应曲线指数段的i r 值拟合1 5 阳性对照物4 n q o 的u m u 标准曲线1 6 4 - n q o 标准曲线指数段的l r 值拟合1 6 4 n q o 的代谢通路17 优化保存菌种不同保存时间的生长曲线2 4 优化保存菌种生长曲线及活化生长曲线活化点2 5 优化保存菌种不同生长时期的活化生长曲线2 5 优化保存菌种不同保存时间最佳活化区间的活化生长曲线2 6 不同保存条件及活化条件菌种生长曲线2 7 2 0 保存菌种活化标准曲线2 7 8 0 保存菌种未活化标准曲线2 8 2 0 保存菌种未活化标准曲线2 8 不同稀释倍数t g a1 5h 吸光值a 5 9 5 n m 2 9 不同稀释倍数t g a1 5h 生长速度3 0 活化生长曲线不同生长时期t g a 稀释点3 0 不同生长时期不同稀释倍数t g a1 5h 吸光值a 5 9 5 n m 3 1 不同生长时期t g a1 5h 稀释生长速度3 1 不同t g a 稀释倍数( t o 1 ，t o 2 ) 标准曲线3 2 不同t g a 稀释倍数( t o 3 ，t o 4 ) 标准曲线3 3 不同t g a 稀释倍数( t o 5 ，t o 6 ) 标准曲线3 3 不同t g a 稀释倍数标准曲线3 4 不同t g a 稀释倍数标准曲线a 5 9 5 n m ，a 4 1 5 n m ，a 5 7 0 n m 吸光值3 5 不同稀释倍数t g a1 5 h 吸光值a 5 9 5 n m 3 6 不同稀释倍数t g a1 5 h 生长速度3 6 活化生长曲线不同生长时期标准曲线点3 8 不同生长时期( t 1 ，t 2 ) 标准曲线3 8 不同生长时期( t 3 t 6 ) 标准曲线3 9 不同生长时期( t 7 t 1 0 ) 标准曲线4 0 不同生长时期标准曲线4 1 不同生长时期标准曲线a 5 9 5 n m ，a 4 1 5 r i m ，a 5 7 0 n m 吸光值4 1 不同生长时期标准曲线t g a1 5 h 吸光值a 5 9 5 n m 4 2 不同生长时期标准曲线t g a1 5 h 生长速度4 3 阳性对照物4 n q o 经水样预处理方法处理的u m u 标准曲线4 6 尚庄污水处理厂处理工艺流程及进水出水取样点4 7 尚庄污水处理厂进水和出水u m u 效应曲线4 8 新乡市卫河水样取样点5 0 卫河建设桥水样u m u 响应曲线5 1 下河曲里水样u m u 响戍曲线5 2 卫河新乡市区段及其支流的暗渠工程示意图5 5 污水处理厂排水注入与卫河水样的遗传毒性5 6 i x 错误! 未找到引用源。 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 关于论文使用授权的说明 渺8 、6 8 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师 范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 日期：幽墨6 墨 第一章绪论 第一章绪论 环境毒理学是研究环境污染物对生物体的毒性和作用机制的- - i - j 学科，它不仅以环 境污染物作为研究对象，而且还将环境污染物作为工具，阐明环境污染物与生物体之间 的交互作用及造成的不良效应的性质和剂量结构反应( 效应) 关系，为指导化学物质 的安全使用和防止中毒提供依据。现代毒理学的研究方法已经广泛用于有毒化学品的管 理，工业化学物质的控制，以及对它们造成的不良效应进行定性定量评价【l 】。而化学物 质“三致”作用，特别是化学物质致癌作用则是环境毒理学研究的主要内容之一。 1 1 化学致癌物质 在中国各城市的癌症发病率都呈明显上升趋势，恶性肿瘤在1 9 9 7 1 9 9 9 三年中已上 升至全国大城市居民死因顺位的第1 位【2 】。全球每年有一千万人口被确诊为癌症、畸形 人，预计到2 0 2 0 年全球癌症的年发病率将达到一千五百万。每年癌症的死亡人口为六 百万，占全球死亡人口的1 2 。 现己确定9 0 的人类癌症可归因于环境因素，其中主要是一些环境化学物 质，另外还有病毒( 如某些致癌病毒) 和物理因素( 如x 一射线、放射性核素氡) 1 3 】。据估计，约有3 4 的人类癌症是由于环境化学物质引起的【4 1 。 1 1 1化学致癌物质的环境行为 两百多年前有人以临床观察和流行病学调查为依据发现烟筒清理工人多发 阴囊癌1 5 j ，证实了环境化学因素可以引起癌症。之后，又有人发现苯胺染料生产 工人易得膀胱癌。1 9 2 5 年，有人用乙醚提取烟煤中的物质，将它涂抹在小鼠皮肤 上，结果诱发了皮肤癌进一步证实了炯煤中存在着致癌性化学物质。之后又陆续 发现吸烟与肺癌5 1 ，对二氨基苯及芳香胺类与膀胱癌1 6 】，石棉与间皮组织恶性肿 瘤【”，苯与白血病8 1 以及黄曲霉素与肝癌1 9 1 之间都存在着因果关系。 在过去的两个多世纪里，尽管人类对化学物质与癌症的认识有了很多进展，但 近年来，在全球范围内区域性污染导致的癌症发病率上升( 如美国马萨诸塞州的 儿童白血病等) 现象仍然十分普遍。究其原因是由于近几十年来，随着科学技术 的进步和工业时代的到来，在生产环境中发现的致癌性化学物质越来越多；而在 u m u 试验方法优化及在环境中应用研究 生活环境中，人们通过饮用被污染的水，吸入被污染的空气，食入含有残留农药 的农副产品等，比以前更有机会接触到更多的化学致癌物。 作为全球性的公众健康问题，如何对癌症进行有效的预防和控制已经成为全 人类共同关注的重要课题。尽量避免与致癌物的接触，是人类目前防癌斗争最有 效的方法。世界卫生组织( w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ，w h o ) 在2 0 0 4 年的第五 十八届世界卫生大会上通过了预防和控制癌症的决议，该决议指出有1 3 的 癌症可以通过戒烟、合理饮食和避免致癌物暴露来避免的【10 1 。 就化学物质致癌而言，大部分的化学物质暴露致癌都是长期的低剂量暴露造 成的，因而许多化学物质导致的癌症病例和死亡都是可以预防的。而对环境中化 学致癌物质的检测及其致癌风险评价是避免与其接触的前提条件，是癌症预防和 控制的基础。 1 1 2 化学致癌物质的种类 目前世界上已经合成的或已鉴定的化学物质有1 3 0 0 多万种，常见的或在使 用中的有8 万种之多，化合物、混合物和消费产品的数量达数百万种。常见的“三 致”化学物质主要涉及表1 1 中的1 1 类物质【1 1 1 。 1 1 3 化学致癌物质的作用机理 从机体暴露于化学致癌物质至机体出现致癌作用的过程可分为启动阶段、促癌阶 段和进展阶段【1 2 - 1 4 1 。 ( 1 ) 启动阶段：致癌物直接作用于d n a ，引起基因突变，使多个或少量细胞发生 永久性的、不可逆的遗传性改变。 ( 2 ) 促癌阶段：细胞在致癌作用的第一阶段变成启动细胞后，在某些因素的促进 下克隆扩增，形成细胞群，即良性肿瘤，这是致癌作用的第二阶段。 ( 3 ) 进展阶段：启动和促癌两个阶段所引起的良性损伤并不是致死性的。良性肿 瘤需要经过进展阶段才能转变为恶性肿瘤。 2 第一章绪论 表1 1 “三致”化学物质的分类 类别 典型化学物质典型物化学结构式 芥子气、氯甲甲醚、环氧乙烷、硫 直接烷化剂( h ，( 卜。一( h ) c 1 酸二乙酯 间接烷化剂氯乙烯、苯、丁二烯抗癌烷化药物 0 陋一( 删 苯并芘、二甲基本葸、二苯葸、三甲 国 多环芳烃 基胆葸、煤焦油、沥青、 联苯胺、乙萘胺、 h ：文) 一g z 芳香胺类 4 一氨基联苯、4 硝基联苯 金属和类金属镍、铬、镉、铍、砷 n i 、c r 、c d 、b e 、a s 亚硝胺及亚硝二甲基亚硝胺、二乙基亚硝胺、亚硝 n o i 酰胺酰胺 h 3 c 一“n c h 3 霉菌和植物毒 黄曲霉素、铁霉素、黄樟素 舻 素 u 叮l 。上又懈， 结晶硅及石棉 结晶硅及石棉 吸烟、嚼烟、槟榔、鼻烟、过量的酒 嗜好品 精饮料 食物的热裂解 苔乏 杂环胺类、2 一氨3 甲基咪唑喹啉、 产品 药物( 含某些激 鼍p 5 2 还磷酰氨、噻替派、乙烯雌酚 素) u m u 试验方法优化及在环境中应用研究 三个阶段中，启动和进展都涉及突变。细胞突变学说( s o m a t i cm u t a t i o nt h e o r y ) 指 出致癌因素包括化学因素、物理因素、生物因素，这些因素使机体细胞的遗传物质d n a 发生突变，结果使细胞的功能发生异常改变而致癌，即癌变形成的基础是机体细胞发生 突变【3 , 1 5 】。 研究证明，不论是用动物、植物还是微生物作为检测材料，“三致”效应( 致癌、 致畸、致突变) 之间具有很高的相关性。至少有9 0 9 5 的致癌物质也是致突变物质 1 6 , 1 7 】。但由于致癌和致畸试验需要较长的时间才能得出结果( 一般动物致癌试验需要三 年的时间，而且花费较大) ，而测定致突变效应可以短时问内得到结果，因此，依据化 学物质的致突变性可以预测其是否具有潜在的致癌或致畸危险。 1 2 致突变试验的分类 致突变试验主要是研究外源性化学物质引起人类基因突变并通过生殖细胞传递给 后代的可能性。若致突变化学物质作用于人或哺乳动物的胚胎细胞就会造成畸胎，若作 用于体细胞便可能产生肿瘤【1 8 - 2 0 。不论是用动物还是植物作为检测材料，诱变剂引起的 “三致”效应( 致癌、致畸、致突变) 具有很高的相关性。因此依据某种化学物质的致突 变性可以预测它是否具有潜在致癌或致畸危斛2 1 】。 哺乳动物致癌试验是鉴定化学物质致癌性的标准活体试验，但哺乳动物致癌试验评 价化学物的致癌性花费较大、时间较长，整个试验过程一般需两年以上的时间。而且新 化学品不断涌现，对每一种新化学品都进行动物致癌试验的话，要消耗非常多的人力、 物力和财力。另外，由于致癌试验所用的动物品系和试验动物数量有限，对一些致癌性 较弱的化学物有可能无法检出。基于突变与癌变之间的关系，致突变试验被广泛应用于 外源性化学物质对哺乳动物及人体的致癌性预测。近年来，发展了大量的快速、简便、 经济而又敏感的遗传毒理学短期检测方法，用以评价化学品的致癌、致突变活性。合理 应用组合的成套短期测试方法可部分克服哺乳动物试验费钱、费时，或因长时间、大剂 量给药可能产生较多的假阳性的缺点。 致突变试验的检测终点包括基因突变，染色体损伤以及一些直接检测d n a 损伤( 如 d n a 加合物测定、d n a 链断裂测定等) 或间接反映d n a 损伤的试验( 如对d n a 损伤 修复的检测) 。致突变试验旨在评定外源化学物质对生殖细胞及体细胞的致突变性，对 遗传危害性作出初步评价并预测其致癌的可能性，同时致突变试验还可用于环境诱变剂 第一章绪论 污染的检测及评价。过去的二十多年里，对各种环境因子致突变性效应的生物检测在环 境毒理学研究中已占有十分重要的地位，它们在环境污染监测和环境保护中发挥了积极 的作用。大量的致突变分析方法被用于识别生殖细胞诱变剂、体细胞诱变剂、潜在致癌 剂，所涉及的方法已经超过2 0 0 种。所用的指示生物涉及病毒、细菌、霉菌、昆虫、植 物、培养的哺乳动物细胞和哺乳动物等。根据这些指标所检测的遗传学终点，可将致突 变试验分为三类，即基因突变试验( a s s a y sf o rg e n em u t a t i o n ) 、染色体损伤试验( a s s a y sf o r c h r o m o s o m ed a m a g e ) 及反映d n a 损伤的试验( a s s a y sf o rd n a d a m a g e ) 。 虽然已建立的致突变试验有2 0 0 多种，但大部分实验方法的有效性尚待进一步证实， 目前常用的、具有一定可靠性的致突变试验方法仅几十种，如表1 2 所示【2 2 】。 1 3 常用的致突变试验方法 目前常用的短期致突变试验包括a m e s 试验，s o s 显色试验，微核试验，哺乳类细 胞突变检测法，染色体畸变检测法和程序外d n a 合成检测法等2 3 。2 5 1 。 1 3 1a m e s 试验( 细菌回复突变试验，b a c t e r i a lr e v e r s em u t a t i o nt e s t ) 1 9 7 5 年艾姆斯( a m e sb n ) 教授创建了细菌回复突变试验【1 引，人们称为a m e s 试 验，是当前世界各国都熟知的快速检测方法之一。该试验的基本原理是利用鼠伤寒沙门 氏菌一系列组氨酸营养缺陷型( h i s ) 菌株，在加入哺乳动物肝微粒体酶( s 9 ) 活化的 条件下，测定化学物质诱导组氨酸操纵子回复突变成为组氨酸营养型回复子( 向括+ ) 的 能力，故属于回复突变检测体系。当组氨酸营养缺陷细菌回复突变为原营养型时，细菌 从不能合成组氨酸到能合成组氨酸，因此能在不加组氨酸的培养基上生长，极易被鉴定 选出。根据在不含组氨酸的培养基上生长的细菌菌落数目，与对照组比较，来测定化学 物质诱导微生物基因突变的能力【2 6 。2 9 1 。 由于a m e s 法简便、易行，不需要特殊器材，因此容易推广。但微生物d n a 修复 系统不如哺乳动物复杂，基因也不如哺乳动物多，所得结果不能完全代表哺乳动物的实 际情况。尽管如此，因存在着上述优势，此法目前在致突变检测试验中仍占有重要的位 置，广泛应用于环境样品的致突变检测【3 m 3 6 j 。 u m u 试验方法优化及在环境中应用研究 表1 2 致突变试验的基本类型 检测 检测 遗传终端指标 分析系统 终点材料 微生物鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验( a m e s 试验) 营养缺陷突变的回复 试验 大肠杆菌w p 2 色氨酸回复突变试验 哺乳动物 小鼠淋巴瘤或人体细胞t k 位点基因突变试验 正向突变分析 基因细胞试验 中国仓鼠或人体细胞h g p r t 位点基因突变试验 突变果蝇试验生殖细胞基因突变性连锁隐性致死突变( d l r l ) 试验 生殖细胞基囚突变和缺失 小鼠生化特异基因座试验 哺乳动物分析引起小鼠骨骼或晶体缺陷的显性突变 试验 转基因小鼠中细菌靶基因小鼠、大鼠中l a c i 突变 突变小鼠肠吃突变 染色体结构畸变中国仓鼠或人类淋巴细胞中期相分析 哺乳动物人类淋巴细胞染色体断裂 细胞质裂阻断微核分析 细胞试验异常细胞分裂着丝粒、染色体有丝分裂器异常 有丝分裂非整倍体 染色体计数检测超倍体 染色果蝇试验性染色体非整倍体性染色体丢失试验 体损 体细胞染色体损伤分析嗜多染红细胞微核分析 伤试生殖细胞染色体损伤卵母细胞、精原细胞或精母细胞染色体畸变试验 验 生殖细胞染色体损伤间接 哺乳动物小鼠精子细胞微核试验 证据 试验 生殖细胞可遗传的染色体 小鼠可遗传易位试验 畸变 有丝分裂非整倍体小鼠骨髓细胞超倍体检测 d n a 损伤修复 枯草芽孢杆菌修复缺陷与野生型差别杀死分析 微生物 s o s 显色试验 试验s o s 诱导 大肠杆菌s o s u m u 试验 d n a d n a 损伤修复。非程序d n a 修复合成( u d s ) 试验 损伤 哺乳动物 s c e 诱发人或中国仓鼠细胞s c e 试验 细胞分析 d n a 加合物 诱变剂d n a 加合物检测 哺乳动物s c e 诱发 啮齿类骨髓细胞s c e 试验d n a 损伤修复啮齿类肝细胞u d s 6 第一章绪论 1 3 2s o s 显色试验( s o sc h r o m o t e s t ) q u i l a r d e t 等人于1 9 8 5 年首创了该方法，并已进行了大量改进1 37 。3 9 】。该试验使用大 肠杆菌e c o l i4 4 3 6 构建含有s f i a ：l a c z 融合基因的菌株p q 3 7 ，用于s o s 反应的检测。 当d n a 受损后，s o s 反应启动s f i a ：l a c z 融合基因表达，产生d 半乳糖甘酶，根据该 酶的产生量从而估算受试物的遗传毒性。 该试验目前已用于环境样品的遗传毒性检测，其检测范围包括空气、食品及水污染 物的监测、藻类对工业废水的影响、重要药用植物研究等许多方面【4 0 。4 3 1 。 1 3 3 微核试验( t h em i c r o n u c l e u st e s t ，m n t ) 微核是由染色体或染色体的无着丝点片断或因纺锤体受伤而失去的整个染色体，在 分裂后期，仍留在细胞质中，或因核膜受损后核物质向外突出延伸形成，成为一个或几 个规则的圆形或椭圆形小体，其嗜染性与细胞核相似，比主核小，故称微核。进行分裂 的细胞，在染色体断裂剂作用下，均能产生微核，因此可用微核率的变化来检测诱变物。 由于测定方法比较快速可靠，近年来，该法己作为化学致突变试验的一种常用筛检方法 1 2 5 ，4 4 - 4 6 o 目前常用的微核测定方法由小鼠骨髓多染性红细胞微核测定( p c e m n t ) ，蚕豆细 胞微核测定，胞质分裂阻滞微核测定( c b m n t ) 及紫露草花粉母细胞四分体微核测定法。 1 3 4 染色体畸变检测法( c h r o m o s o m ea b e r r a t i o nt e s t ) 染色体畸变测试法用来检测致突变物引起细胞染色体结构和数目的改变。染色体畸 变检测的材料有离体培养的细胞株和动、植物体外细胞。核型己确定的任何一种细胞株， 几乎都能用于体外细胞遗传学分析。尤其是高等植物细胞染色体畸变检测法，由于其染 色体结构与哺乳动物( 包括人) 相似；同一个体分生的植株可作多项检测，能降低个体 异质的影响；植物生活周期短，显示致突变效应所需的时间也短；可在广泛控制的条件 ( 如p h 、温度等) 下研究环境致突变物的效应；易观察检测；花费低，因此，近几十 年来，该检测法在国内外发展很快【4 7 4 9 1 。 1 3 5 哺乳类细胞突变检测法( m a m m a l i a nc e l lg e n em u t a t i o na s s a y ) 待测物诱导哺乳类细胞突变与诱导细菌突变在原理上没有根本的区别，但理论上用 哺乳类细胞进行检测，更能反映被测物在人体内的作用情况。目前这一检测系统发展较 7 u m u 试验方法优化及在环境中应片j 研究 快，已有多个相对完善的检测方法。 虽然哺乳类细胞突变检测法与细菌突变检测法的原理相同，但由于细菌与哺乳类细 胞在生理、结构和生化代谢上的不同，因此二者的检测结果相互独立。巴奇( b a r t s c hh ) 等曾测试过1 8 0 种化合物，沙门氏菌微粒体酶法单独使用时敏感性为7 6 ，在与哺乳 类细胞突变法联测其中2 6 种致癌物时，敏感性提高至9 6 5 0 , 5 1 】。 1 3 6 程序外d n a 合成检测法( u n s c h e d u l e dd n a s y n t h e s i st e s t ，u d s ) u d s 试验是通过测定受损d n a 的切除修复合成水平来评价受试物能否对原代哺乳 动物细胞d n a 和哺乳动物细胞系d n a 造成损伤，以及损伤程度。目前u d s 检测法己 成为化学物质致癌性、诱变性快速预筛的方法之一【5 2 彤】。 8 第二章u m u 试验方法及应用 第二章u m u 试验方法及应用 自7 0 年代以来，环境毒理学研究得到迅猛发展，开发t a m e s 实验、d n a 展开分析 法、s o s 显色反应、c o m e t 分析法、程序p d n a 合成实验、v 7 9 h g p r t 基因突变分析法 等一系列化学物质致突变和遗传毒性检测方法。其中a m e s 实验得到非常广泛的应用， 但是所需菌株多、操作复杂、检测时间长等缺点。o d a 及其同事建立的u m u 澳o 试法，克 服了上述a m e s 法的缺点，近年开始应用于环境科学领域【5 4 】。 2 1u m u 试验的原理 2 1 1u m u 试验 u m u 是u vm u t a b l e 的缩写形式，其原始含义是经紫外线照射引起的突变。 u m u 试验( 又称s o s u m u 试验) 是19 8 5 年o d a 等【5 4 】根据d n a 损伤时诱导s o s 反应 而表达u m u c 基因这一基本原理建立并发展起来的检测环境诱变质的短期筛选试验。 z i m r 基因来源于大肠杆菌，其主要的两种存在形式是：u m u c 和u m u d 。u m u c 基因的 大小为4 5k d a ，属于d n a 聚合酶v ，其跨越无碱基位点的合成能力比聚合酶i i i 高1 0 0 1 5 0 倍；u m u d 基因的大小为1 5k d a ，也属于聚合酶v ，它能促进d n a 损伤的修复。 u m u c 和u m u d 是s o s 调节子的重要成员，诱导后表达r e c a 。凭借它的蛋白酶活性， 把u m u d 在c y s 2 4 和g l y 2 5 之间切开，得至) j 1 2k d a 的u m u d 才是活性形式，u m u d 非但无 益，反而有损s o s 诱导反应，在s o s 诱变中起作用的是u m u d 2 c - - 元化合物。 由于u m u 试验具有快速、敏感、廉价等优点，因而被广泛应用于遗传毒理学研究、 环境监测与质量评估以及药效评价和新药筛选等方面【5 4 , 5 5 】。 2 1 2 d n a 损伤修复 遗传信息之所以能长期保持高度保真( f i d e l i t y ) 即重现精度，是由于细胞能够通过 对d n a 损伤的修复以保护亲代d n a 链，使之避免由于外来因素作用而发生改变。大 部分的修复都通过高保真度的修复来完成，修复无误，突变不会发生。但是也有一些是 易错( e r r o r - p r o n e ) 修复系统，由于修复错误或没有修复，损伤就得以固定下来，于是 发生突变。因此，诱变是一个受控过程，而修复的失控才真正能由d n a 损伤导致突