（环境科学专业论文）环境污染体系对dna氧化损伤的表征、机理及标志物研究.pdf

t h y m u s d n a in v i t r o in d u c e d b y e n v i r o n m e n t a l t o b a c c o s m o k e ( e t s ) , u r b a n m i x e d a ir p o l l u t a n t s a n d d i e s e l e x h a u s t p a rt i c l e s ( d e p ) . t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t b o t h p a rt i c l e s a n d v o l a t i l e o r g a n i c c o m p o u n d s ( v o c s ) o f t h e s e t h r e e p o l l u t i o n s o u r c e s c a n c a u s e d n a d a m a g e a t d i ff e r e n t e x t e n t . o r g a n i c a n d i n o r g a n i c c o m p o n e n t s h a v e b e e n a n a l y z e d b y g c - ms a n d a a s r e s p e c t i v e l y a n d t h e m o l e c u l a r me c h a n i s m o f d n a d a m a g e d h a s b e e n p r o b e d a n d p r o v e d o n t h e b a s i s o f c h e m i c a l c o m p o s i t i o n a n d c o m p o n e n t s o f p o l l u t a n t s . a l s o , t h e d n a o x i d a t i v e d a m a g e b y e t s , p a h s a n d l o w m o l e c u la r w e ig h t a l d e h y d e in v i v o h a v e b e e n s tu d ie d p r e li m in a r il y . t h e r e s u lt s o f o u r w o r k m a y b e o n e o f t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s o f p o t e n t i a l c a r c i n o g e n i c it y o f e n v i r o n me n t a l p o l l u t a n t s a n d a l s o e s t a b l i s h e d a b a s i s o n t h e s t u d y o f h a r m t o h u m a n b o d y , r i s k a s s e s s m e n t , m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f t o x i c e ff e c t a n d p o t e n t i a l c a r c i n o g e n i c i t y . k e y wo r d s : b i o m a r k e r , 8 - h y d r o x y d e o x y g u a n o s in e , e n v i r o n m e n t a l t o b a c c o s m o k e , a i r , d i e s e l e x h a u s t p a r t i c l e s i v 侧._ 第一章绪论 第一章绪论 1化学致癌与d n a氧化损伤生物学标志物 1 .发展癌现象 2 0世纪以来，在各个发达国家的发展过程中，随着工业的发展和人民生活 水平的提高，癌症的发病率反而都有逐年升高的趋势。除极个别例外，大多数 发达国家都是癌症高发的国家，而经济相对落后的发展中国家，几乎都是癌症 相对低发的国家。例如，根据 1 9 7 8年世界卫生组织 ( wh o)所公布的死亡统 计资料，在发达国家如原西德、威尔士、月麦和美国每十万人中癌症死亡率分 别为 1 5 3 . 1 , 1 5 2 . 5 , 1 5 2 .4不 1 1 1 3 1 . 5 0而发展中国家如埃及和泰国分别为 2 9 . 2和 2 4 . 2 。在我国，解放前每十力人日癌症死亡率在 3 0以下， 经济的发展，1 9 7 3 - 1 9 7 7 年 上 升个7 3 . 9 9 , ，随着 我国癌 症的死亡率迅速 初的癌症死亡率 f l一 达 9 9 . 5 , a 1 9 9 1 1 1 而1 9 7 8 年根据 这个数字己达到 1 9 5 1 年为4 c wh o的统计 1 6 0 与美国 1 7 4已经相当接近。1 9 9 1 年我国城市人c a 的死亡 率构成， 年代 癌症 已经上升为第一位，而心脑血管疾病退居第二位，我国死亡率构成已与各发达 国家类似。 随着工业的发展和人民生活水平的提高，癌症的发病率和死亡率表现较大 幅度地上升，这种现象被称为发展癌现象川 。发展癌现象是普遍的，几乎没有 例外的情况。工业的发展和人民生活水平的提高，也伴随着人口在城市的集中， 这是发展癌现象的可能盛要原因，首先是随着工业的发展和城市人 ! 的集中， 各种燃料用量，特别是煤用量均有相当幅度的增加，城市飘 c 和其携带的强劲 致 癌的多 环 芳 烃 均 有较 大 幅 度的 增 加 生 活 水 平 的 提高 使肉 类 、 鱼 虾 油 料 等 食品的消耗量增加，肉类等高蛋白食品在烹调的褐化过程中，产生具有强力致 癌能力的杂环芳胺;被人们喜爱的油炸、烧烤比蒸煮炖等烹调方法产生更多的 杂环芳胺。脂肪性食品消费的增加，促进胆酸的更多分泌，近来证明胆酸具有 促癌作用。氮肥使用的片面增加和蛋白质类食品消费的增加，促使粮食、蔬菜、 水果和地下水中硝酸盐或亚硝酸盐含量的增加，从而有增加在体内产生 n - 亚硝 第一章绪论 室内污染源室外污染源 柴汕 尾气 户颗粒物 挥发 性有 机物 挥发 性有 机物 抨发 性有 机物 颗粒物! 颗粒物 采集颗粒物五相分离消化载体 青石棉 s i 02 采集 v o c s a a s法测 余属 复合 污染物 呼 贵 仪 i 倪 体外与d n a 试管反应 休外与d n a 试管反应 链断裂 g c - ms分析 其它 醒 酚 醛 多 ( 了 机 类 类 类 环 物 试管 反应 动物 实验 试管 反 应 动物 实验 h p l c - e c测定 8 - o hd g生成 h p l c - e c钡 叮 定 8 - o h d g生成 可能的致癌途径之一 图1 - 1 1本研究主要内容框架图 第二章 8 - ) f 基脱氧鸟普分析方法及特性研究 第二章c4 - 轻基脱氧鸟昔分析方法及特性研究 以f e n t o n 型产轻自 由 基系统如鳌合剂一 f e - h 2 0 : 系统作为氧化源，与 脱 氧鸟昔和小牛胸腺 d n a反应生成大量的 8 - o h - d g ，并以此为氧化模型对 d n a 氧化损伤生物学标志物 8 - o h - d g的一些特性进行研究，对于稳定、灵敏、准确 地定量 8 - o h - d g ，进而研究有毒化学物质对生物体内的氧化损伤是很重要的。 用高压液相色谱一电 化学检测( h p l c - e c ) 的方法定量，并对 8 - o h - d g的分析条 件进行优化，对酶水解 d n a的条件，储存酸度、介质环境及其稳定性等进行 了探讨，并用苯酚捕捉释自山基的方法独立地对轻自由基进行定量评价(8 6 1 ，从 而探讨不同介质环境影响 8 - o h - d g形成的机理，并采用添加抗氧化剂等干预措 施使d n a中8 - o h - d g的测定既灵 敏又稳定。 1 .实验部分 l . 1试剂 8 - o h - d g ( s i g m a ) , j兑 氧鸟i1 - d g ( s i g m a ) ， 小牛)ml泉d n a ( t y p e l , s i g m a ) , 核酸酶 p 1 ( s i g m a , 8 0 u n i t s / m g d n a ) , e .c o l i 碱性磷酸酶 ( t y p e i i i - s , s i g m a , 2 0 u n i t s / m g d n a ) , h p l c级甲 醇 ( 天津四 友) ， 冰醋酸，氢氧化钠，柠檬酸， 醋酸钠，双氧水， 维生素 c ( v c ) ，还原型谷肤肝肤 g s h , e d t a ， 硫酸业铁， 乙醇， t r i s ,磷酸二氢钠均为国产分析纯试剂。 1 .2实验方法 1 .2 . 1双氧水染毒d g和小牛胸腺 d n a 将小 牛 胸 腺d n a 或d g 溶i 几 缓 冲 溶 液n a h zp o , ( 阳6 .8 , 1 0 m m o l/ l ) 中 ， 9 5 加热 1 0 分钟，后在冰上骤冷，热饱和的小牛胸腺 d n a浓度为 1 0 0 u g / m l , d g浓度为2 .5 m m o l/ l ， 在f e s 0 4 ( 1 . 3 m m o l / l ) , e d t a ( 6 . 5 m m o l/ l ) 存在下 加入h 2 0 2 ( 1 0 0 m m o l/ l ) 3 7 0c 反应2 小时。 1 . 2 . 2酶水解 d n a 0 .2 5 m l 染毒后的d n a置于 l o m l 聚四氟乙 烯离心管中 ( 预先分别用洗液， 无水乙醇浸泡过夜，风干)加入2单位的核酸酶 p i 和 0 .2 5 m 1 醋酸钠缓冲溶液 ( 2 0 m m o l/ l , p h 4 .8 ) 3 7 下温育3 0 分钟， 再加入0 . 5 单位e . c o l i 碱性磷酸酶3 7 第二章 8 - 轻基脱氧鸟昔分析方法及特性研究 下温育6 0分钟，将d n a逐步水解为相应的核普，水解产物离心两次，每次 l 0 0 0 0 r p m , 1 5 分钟， 除去多余的酶和大分子， 上清液冷冻保存， 待h p l c - e c分 析。 1 . 2 . 3 h p l c - e c分析 使用美国wa t e r s 公司高压液相色谱， 配4 6 4 电 化学检测器， 柱子u b o n d a p a k c 1 8柱，4 .6 x 3 0 0 m m ( w a t e r s ) ，流动相为缓冲溶液:甲 醇= 3 : 1 ，其中缓冲溶 液为3 0 m mo l / l柠檬酸一2 0 m m o l / l冰醋酸一5 0 m m o l / l醋酸钠一5 0 m m o l / l氢 氧化纳，流速 0 . 6 m l / mi n ，电化学检测器工作电极为玻璃碳电极，参比电极为饱 和甘汞电极，工作电压为8 0 0 m v o 2实验结果 2 . 1 h p l c - e c条件优化 8 - o h - d g 的标准色谱图见图 2 - 1 ，它的出峰f月间较长，我们试图通过调整 流动相中缓冲溶液与甲醇的比例来缩短分析时间，但同时造成柱头压的上升( 图 2 - 2 ) ，兼顾两方面的利益，我们选择缓冲溶液与r l 1 f y 的比 例为 3 : 1 ， 此时 8 - o h - d g的出峰时lfi j 为3 2 分钊 ， ，村头压为5 0 0 0 p s i o -。一se卜比日日日日川川川”州1 川川川翻倒尸 丫一 图2 - 1 a为 8 - o h - d g 8 - oh- d g 标准b 的标准色谱图 为氧化损伤后的d n a 第_章 8 - h ! 基脱氧鸟普分析方法及特性研究 .保留时间.柱头压 6 0 0 0 5 5 0 0 薛半阳psi 5 0 0 0 4 5 0 0 4 0 0 0 (u万e厘盆翩麒 4: 1 3 : 1 2 : 1 缓冲溶液:甲醇 图2 - 2 流动相组成与保留时间和柱头压关系图 电化学检测器工作电极的最佳氧化电位通过绘制8 - o h - d g的伏安曲 线( 图 2 - 3 )来选择，玻璃碳工作电极相对于饱和甘汞电极的氧化电位在 6 0 0 - 8 0 0 m v 之间变化较为平坦，将工作电压选择在此区间，可以达到最大电流响应和最小 背景噪音。 5 6 2 0 0 4 0 0 6 0 0一动 才 、 1 0 0 0 1 2 0 0 叱写钾 电压 m v j 图2 - 3 8 - o h - d g的伏安曲线 h p l c - e c 法测定8 - o h - d g的线性范围 相当宽， 可达4 个数量级从0 . 3 2 p m o l 到3 .2 n m o l ,相关系数可达 0 .9 9 9 6( 图2 - 4 ) ，最低检出限可达 3 2 f m o l ( 基线 噪音的2 倍) ，既可满足生物体在环境有毒物质低剂量长期暴露条件下或内源性 氧化损伤所造成的8 - o h - d g变化测定，又可满足如辐射等高水平损伤所造成氧 第二章 8 一 径基脱氧鸟营分析方法及特性研究 化应激测定的要求。 撅友9影旧雪 1 a一“-一一 0 1 2 3 4 浓度的对数 ( p m o l ) 图2 - 4 h p l c - e c法测定8 - o h - d g的标准曲线 2 .2 酶水解 d n a条件选择 通过一系列的酶可以将核酸大分子降解为小分子量的片段，甚至单核营 酸，染毒后的d n a需经水解酶水解为相应的核朴刁可用h p l c - e c分析， 水解 的方 法很多， 我们选用核酸酶p i 和e .c o l i 碱性磷酸酶的方法对d n a进行水解， 通过考察水解酶的反应时间 ( 图2 - 5 ) ， 反应温度及光照条件 ( 图2 - 6 ) 等对d n a 水解程度的影响，选择最佳水解条件。 2 0 0 1 8 0 1 6 0 。 1 4 0 飞 1 2 0 压1 0 0 翼 8 00 由 6 0 4 0 2 0 0 一闷 卜 -! x 防的p i c o u胶竹.欣位 5 0 时间 1 0 0 ( m i n ) 1 5 0 图2 - 5 时间对酶水解的影响 第二章 8 - 轻基脱氧鸟普分析方法及特性研究 一叫 今， - -峨)- . 核酸酶p 1 e . c o i i 喊性磷酸酶 八川门日门曰门门户八曰 usnlll匀门尸3 伪刁qq11 笔飞/。勺二0由 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 f t 度. c 图2 - 6 温度及光照对酶水解的影响 核酸酶 p 1 在 3 7 条件下对 d n a的水解随时间变化不明显，而 e .c o l i 碱 性磷酸酶随时间延长，对 d n a 的水解更加彻底，本实验选择在模拟室温条件 f ，核酸酶 p i 反应时问为3 0分钟，e . c o l i 碱性磷酸酶反应时间为 6 0分钟。随 着水解温度的升.佰，两种酶对 d n a 水解更加完全，黑暗和自然光照下对核酸 酶p i 水解 d n a没有明显区别， 为了接近生物体的环境条件， 我们选择3 7 为 两种酶的水解温度。对于生物体内低水平的氧化损伤，可以考虑提高水解酶的 水解温度，以达到定量测定的目的。 2 .3介质酸度和介质类型的影响 在一 2 0 c 储存 一 星期条件 卜 ，考察了不同酸度 卜8 - o h - d g存在的稳定性。 染毒后的d n a用冷乙 醉沉淀，风干 后分别储存在p h 4 .0 , 5 .0 , 8 .0 , 1 1 . 0的缓 冲溶液中，- 2 0 c 储存一星期后经酶解，进行 h p l c - e c分析，结果列于表 2 - 1 0 d n a 中 8 - o h - d g 的稳定性在酸、中性缓冲溶液中比在碱性中好，偏酸性比中 性环境中损失更少，所以d n a中的8 - o h - d g应保存在偏酸性的介质中。 表 2 - 1储存酸度对 8 - o h - d g的影响 储存酸度 p h 4 . 0 p h 5 . 0 8 o hd g / 1 0 d g p h 8 . 0 p hl 1 .0 2 5 1 3 1 7 2 7 6 21 9 3 0 第_章 8 一 径基脱氧鸟昔分析方法及特性研究 我们还发现d n a中的8 - o h - d g的稳定性与存在的介质类型有关，在五种不 同介质中的实验结果列于表2 - 2 0 表2 - 2不同介质对 8 - o h - d g及 o h的影响 介质8 - o h - d g / 1 0 d g 间苯二酚( “ m o l/ l ) t r i s i o m m o l / l / e d t a i m m o l / l p h 7 .0 n a c l 1 . 5 m m o l/ l / 柠檬酸钠0 . 1 5 m m o l / l / e d a0 . 1 m m o l / l p h 7 . 0 n a h 2 p 0 4 i o m m o l / l p h 6 .8 n a h : p q 1 0 0 m m o l / l p h 6 . 8 n a h , p o , 5 0 0 m co o l / l p h 6 . 8 1 0 81 . 3 6 1 2 . 3 1 2 . 3 1 0. 9 未检出 1 0 . 9 当d n a在1 0 m co o l/ l n a h 2 p 0 4 缓冲溶液中8 - o h - d g的含量最高，当 磷酸盐的 浓度升高 1 0 倍时，8 - o h - d g的量 卜 降二十倍，而再提高磷酸盐的浓度至 5 0倍 时，就检测小$1l 8 - o h - d g了。 我们川苯酚作为轻自山基的捕捉剂，表2 - 2中间 苯 _ 酚是苯m的) r 化产物，用它的吊可独立地定量评价n自山基在不同介质体 系中的含量，从 (u - ; 察 d n a 1 小同浓度的磷酸盐介质中 8 - o h - d g量不同的机 理是否由于羚自山基产生量不同所致。从表 2 - 2中可以发现，在三种不同浓度 磷酸盐介质 羚自山基浓度变化很小，因此，随着磷酸盐浓度的升高 8 - o h - d g 含量降低并不是i n pn自山基的减少所致，其主要原因是过量的磷酸盐抑制了 部分水解酶的活性，从而造成8 - o h - d g含量下降。而另一种介质t r i s / e d t a体 系，8 - o h - d g星较低，轻自山基量也较低，这是因为t r i s 缓冲液是很好的轻自 山基的消除剂，它会与d n a竞争 o h，影响8 - o h - d g的生成量。 2 .4 稳定性实验 8 - o h - d g的水溶液暴露在空气中很不稳定，特别是在染毒后的d n a 中 更不稳定，给8 - o h - d g的定量带来困难。我们在实验中发现，一个样品染毒后 水解d n a测得8 - o h - d g值，该 样品在空气中暴露8 小时后再测，升高到原来 的2 .5 倍，为此我们对8 - o h - d g测定不稳定的原因作了 进一步的探讨，并采取 一些干预措施。 我们观察了染毒后的d n a立即用酶水解为相应的核昔，及未水解d n a 第_章 $ - 1 基脱氧鸟昔分析方法及特性研究 t d n a在2 e - 刊 卜 - d n a在- 2 0 一 叫 . 一 d g在弓 -x - - d n a在 4 0 r 尸01/口，二01的 时间 ( 天) 图2 - 7 8 - o h - d g在不同温度 f 随时间变化曲线 8 - o h - d g的变化? i 1 u,图2 - 7 为四种不同温度下储存7 天，每天连续测定的 实验结果。图中四条曲线的变化趋势是一致的，先上升，达到一峰值后下降 们随着温度的降低，峰尚 卜 月，时间后移。这种现象说明无论是 解产物 d g与氧化琳或空气中的氧继续反应，图中出现 8 - o h - d g 温度的降低而后移，说明这种反应是随着温度的降低而减速的， d n a 还是水 峰值的时间随 当 8 - o h - d g在 溶液中达到定浓) x i比 碱基之间存在相互作用，这种鸟m吟的衍生物强烈地 趋向于缔合，先缔合形成平函 1 四聚体，后两个这样的四聚体形成一个八聚体， 籽 ! 滞性增加，甚至形成假聚物，如同核酸的紫外吸收性质中的减光效应一样， 8 - o h - d g的聚合也使其电化学性质有 一 定程度的降低，导致图 2 - 7中峰值后曲 线下降，但聚合要消耗能l随着温度的降低，聚合程度减小，峰高上升。 为了能使 8 - o h - d g在溶液 ， 稳定存在便于测定，我们模拟体内还原系统加 入 定量的抗氧化剂v c 和还原型谷肮肝肤g s h ， 或在体系中 冲入n : 以 消除 有 氧 环 境， 观 察8 - o h - d g 随 时 间 变 化 情 况( 图2 - 8 ) ， 与 对 照 相 比 ， 加 入 抗 氧 化 剂 的样品，经过抗氧化剂与体系中的氧化源及空气中的氧化学反应，一定时间后 8 - o h - d g的量趋 几 不变，证实了山于d g的继续氧化使图2 - 7 中开始阶段8 - o h - d g不断上升。冲入n , 消除环境中的0 2 8 - o h - d g的量基本不变。 第二章 8 - 轻基脱氧鸟昔分析方法及特性研究 x j 照 勺 语加v c 和g s h 宕们01。勺ho由 冲入n 2 nu八目八unununllnunll八钊 nun介0n00nu0八曰 ods内1卜bsdn人n乙1 0 1 0 0 2 0 0 时间 ( m i n ) 3 0 0 4 0 0 图2 - 8添加抗氧化剂和n , 后8 - o h - d g随时间变化曲线 综合_ 脱离氧化源， 述实验，为了稳定雕确地定量 8 - o h - d g ，染毒后的 d n a 应尽快 冲入n ， 或 a r 等保护气，在低温下保存。 3 讨论 众所周知，氧化损伤的途径是损伤 d n a的碱基，因为碱基是核酸分子中 最敏感部分，8 - o h - d g是氧化损伤一个很好的通用的生物学标志物，因此它的 一些特性研究对于稳定、灵敏、准确地定量 8 - o h - d g，进而研究体内氧化损伤 显得尤为重要。本文包括氧化损伤后 d n a中8 - o h - d g的分析，水解，储存， 稳定性等方而的研究。从本研究中可以发现用h p l c - e c法测定8 - o h - d g灵 敏 度很高 ( 最低检出限为 3 2 f in o l )比光学吸收法高 2 - 3个数量级，线性范围可达 4 个数量级，克服了 过去g c - ms 法或免疫化学法等仅能检测辐射等引起的高水 平损伤，面对检测低水平内源性损伤无效的弱点，另外本法有高的选择性，已 知四个原形脱氧核营在 。 .6 - 0 . 8 v 的电压下不易起反应，其多数己知氧化产物对 e c 也不敏感，而8 - o h - d g由于在c - 8 位上有一个轻基，故具有电 化学活性， 即使色谱峰未完全分开，也可通过调节电位将痕量8 - o h - d g从复杂的生物样品 或酶促消化物中检测出来。 d n a中8 - o h - d g储存在中性偏酸的缓冲溶液中损失较碱性缓冲溶液少， 这主要是由于脱嚓吟作用所致。d n a 中8 - o h - d g的形成与所处介质环境有关， 第二章 8 - 轻基脱氧鸟昔分析方法及特性研究 我们用苯酚作自由基的捕捉剂定量评价轻自由基的形成，从而解释不同介质中 8 - o h - d g 形成的差异，克服了传统的电子顺磁共振 ( e s r )法无法测定生物体 系中轻自由基的弱点，为探索8 - o h - d g形成机理提供了一个方法。 8 - o h - d g在氧化损伤 d n a 中储存、测定的稳定性是其作为氧化损伤生物 学标志物的关键，d n a 中 8 - o h - d g在氧化源存在下或有氧环境中一定时间内 有累积作用，生物体在有毒化学物质低剂量长时间暴露条件下，8 - o h - d g在体 内有累积作用，提示我们急性氧化应激实验中，动物的给药方式可采用连续多 次的方式，使8 - o h - d g在体内累加到一定浓度，便于低水平损伤检测。在体外 实验中，染毒后的 d n a应迅速脱离氧化源，在惰性气体保护下，低温冰冻储 存，防止d n a继续氧化， 使8 - o h - d g升高而出现假阳性结果。 4结论 4 . 1 d n a加合物 8 - o h - d g是氧化损伤一个很好的通用的生物学标志物，用 h p l c - e c法可对其 进行稳定灵 敏地测定，灵 敏度很高 ( 最低检出限为 3 2 f m o l ) 比光 学吸收法高2 - 3 个数量级， 线性范围 相当 宽可达4个数量级，从0 . 3 2 p m o l 到 3 .2 n m o l ,相关系数可达 0 .9 9 9 5 ，可满足生物体内低水平氧化损伤定量测定 的要求。 4 . 2作为生物学标志物，8 - o h - d g应及时，灵敏，准确地反应出生物内氧化 损伤变化，通过本研究可知，d n a 中 8 - o h - d g 在氧化源存在下或有氧环境中 一 定时间内有累积作用，生物体在有毒化学物质低剂量长时间暴露条件下，8 - o h - d g在体内有累积作用。 体内实验， 动物的给药方式可采用连续多次的方式， 便于低水平损伤检测，体外实验要避免出现假阳性结果。 第四章 标准石英粉尘及青石棉直接诱导8 - 轻基脱氧鸟普加合物形成的研究 第四章标准石英粉尘及青石棉直接诱导 g p 基脱氧鸟昔加合物形成的研究 标准石英粉尘的主要成分为游离二氧化硅 ( s i o z ) ，本身即为一种典型污 染物，同时是多种气态污染物和有毒重金属的载体，被国际癌症研究中心 ( i a r c)认定为致癌物，其诱发肺癌的机制尚不明确。 青石棉 (na2o - f e 2 0 , - 3 f e o . 8 s i o z - h 2 o ) 的 致 癌性也有文 献 报导。 两 者的 潜在 致癌 性有别于大多数的化合物，不经细胞氧化酶代谢活化后与 d n a分子直接作用 造成损伤，而可能与自由基2 日戊密切相关。然而到目前为止，很少涉及污染物 本身的作用，其表面和水介质中能否产生活性氧及其对d n a分子的损伤情况， 以及作为颗粒物载体在氧化剂存在下的反应特性。本文将标准石英粉尘 ( 主要 成分为粒径 5 p m的游离 s i 0 2 )和青石棉 ( 主要成分为纤维状 n a , o - f e , 0 3 . 3 f e o . 8 s io , - 11 2 0 ) 在生 理 条 件下 ，1i 小 牛 胸 腺d n a进行 试 管 反应，应用高效液相色谱 ( h p l c )结合电化学检测器 ( e c d) ，测定反应体系 所产生的8 -轻基脱氧鸟葺 ( 8 - o h - d g ) ，首次发现标准石英粉尘和青石棉可直 接诱导d n a分子的氧化损伤，进而形成有强烈致突变作用的 8 - 0 h - d g ,说明 在其表面和水介质能产生l y 基自山基，探索了潜在致癌效应的一种可能机制。 1 实验部分 1 . 1 试剂 小牛胸腺 d n a 、核酸酶 p 1 , e . c o l i 碱性磷酸酶、8 - o h - d g标准品均购自 于 s i g m a公司; 标准石英粉尘 ( 5 p m游离 s i 0 2 ) 和青石棉纤维 ( 分子式为 n a , o - f e 2 0 3 . 3 f e o . 8 s 0 2 - h 2 0 ) 均 购于中 国 预防 医 学 科学院 劳 动 卫生 与 职 业 病研究所;甲醇为国产色谱纯，其他试剂为国产分析纯。 1 . 2仪器 美国w a t e r s公司液相色谱仪，配 4 6 4电化学检测器，p b o n d a p a k c l 8柱， 4 . 6 m m x 3 0 0 m m 。电化学检测器工作电极为玻璃碳电极，参比电极为饱和甘汞电 极。中国香港天美公司全扫描紫外一可见分光光度计。上海安亭公司台式高速 第四章 标准石英粉尘及青石棉直接诱导8 一 轻基脱氧鸟昔加合物形成的研究 离心机。 1 . 2 方法 1 . 3 . 1反应体系不同剂量的标准粉尘和青石棉与 d n a溶液在 3 7 下反应 1 5 h ，设 d n a溶液为对照;考虑颗粒物在环境介质中共存大量氧化物质，以 h 2 o : 为 氧化 源掺入 反应1 5 h ， 设立h 2 o : 与d n a反 应溶液为 对照。 1 . 3 . 2 d n a沉淀、 定量与 酶解 反应溶液置于离心管以1 2 0 0 0 g 转速离心2 0 m i n 后， 取上清液加入醋酸钠溶液使之终浓度为0 .3 m o l / l ， 加入二倍溶液体积的一 2 0 无水乙 醇， 放置2 h以 上，取出 后再次离心， 倾去上清液， 用4 c 7 0 % 乙 醇洗 涤、离心两次，使离心管内乙醇挥发干净。用 1 m l n a h 2 p 0 , ( 1 0 m m o l / l )缓冲 液溶解 d n a沉淀，充分冲洗管壁:取其中 0 . 5 m l溶液溶于 2 m l去离子水， 在2 6 0 n m波长下对d n a分子进行定量; 另取0 .2 m l 溶液， 加入浓度为3 6 u / m l 的核酸酶p , 4 5 1v l , 在3 7 0c 下酶解3 0 m i n ， 再加入e .c o l i 碱性磷酸酶1 0 u l , 3 7 下 酶解 l h a 酶切反应后溶液在8 0 0 0 g 转速下离 心两次，每次2 0 m in ，取上 清液 1 0 0 u l 进行h p l c - e c d 分析，平行测定两次取均值。 1 . 3 . 3色谱条件色谱流动相为缓冲溶液:甲醇= 3 : 1 ,其中缓冲液为: 0 . 0 3 m m o l / l 柠檬酸、0 . 0 2 m m o l / l 冰醋酸、0 . 0 5 m m o l / l 醋酸钠、0 . 0 5 m m o 1 / l 氢 氧化钠。电化学检测器工作电压为8 0 0 m v o 2结果与讨论 2 . 1 污染物单一剂量下诱导d n a 分子生成8 - o h - d g 量的比较 为初步探讨两者直接产生的氧化作用以及在氧化剂存在下的协同作用，将 单一剂量 ( l m g )的% i 染物与 d n a ( 1 0 0 v g )进行反应，同时加入各对照组， 结果见图4 - 1 。同d n a空白相比，标准石英粉尘和青石棉均诱导 8 - o h d g的生 成，同一剂量下青 石棉诱导能力要强于标准石英粉尘;同时，在氧化剂h z o : 存 在下，标准石英颗粒诱导的 8 - o h d g并未见显著增高，而青石棉染毒的样品产 生大量的 8 - o h d g ，达到 7 2 3个 8 -t 基鸟昔/ 1 0 5 d g ,高出其他样品近一个半 数量级 第四章 标推石英粉尘及青石棉直接诱导8 4 t 基脱氧鸟 普加合物形成的研究 2 0 . nunn目 只6j任 笔飞二口pho击 1 2 3 4 5 6 图4 - 1 单一剂量( 100u g d n a / l m g 污染物) 污染物诱导8 - 轻基鸟 普 的生成i t 较， h z o z 浓 度为5 0 m m o l / l , n = 3 l d n a 溶液作为空白 对照 2 11 2 0 : 作为 氧化剂存在的对照 3标准石英 粉尘 4 标准石英粉尘+比 。 : 5青石棉 6 青石棉十h 2 0 2 ( 显 示值为实际值1 / 1 0 ) 2 . 2 标准石英粉尘诱导8 - o h d g 不同剂量的标准石英粉尘 形成的剂量一反应关系 i d n a反应，其剂量一反应关系如图 4 - 2 所示 结果表明， 剂量的增加 在石英粉尘量在 1 . 5 m g / m l时产生了最人量的 8 - o h - d g ，而后随着 8 - o h - d g呈现了下降趋势。 1 2 1 0 0们hj件n乙 宅。01/。勺=0出 1 2 树o kw, a 岁 v r ( m g / m l ) 图4 - 2 标准石英粉尘诱导8 - o h - d g的剂量一 反应关系 ( n = 3 ) 2 . 3 青石棉诱导8 - o h - d g 形成的剂量 一反应关系 不同剂量的青石棉与d n a反应，其剂量一反应关系如图4 - 3 所示。结果表 第四章 标准石英粉尘及青石棉直接诱导8 - 轻基脱氧鸟 普加合物形成的 研究 明，在青石棉达到 l m g / m l时，诱导 d n a分子产生了 最大量的 8 - o h - d g ，而后 随着剂量的增加8 - o h - d g呈现了下降趋势，表现了与标准石英粉尘相类似的反 应特性，但8 - o h - d g 数量要显著高于标准石英粉尘。 3 0 2 5 2 0 1 5 1 0 5 0 名价01/。二0由 青 石棉的 浓度 ( m g / m l ) 图4 - 3 青石棉诱导8 - o h - d g的剂量一 反应关系 ( n = 3 ) 2 . 4 h , o ， 存在条件 卜 行石棉诱导8 - o h d g 形成的剂量一反应关系 在同一剂量 氧化刹 h z q( 5 0 m m o l/ l ) 存在条件下， 不同剂量的青石棉与 d n a ( 1 0 0 p g ) 反应，其剂量 一反应关系如图 4 - 4所示。结果表明， 在青石棉达 到 l m g / m l时，诱导d n a分子产生了最大量的8 - o h - d g ，而后随着剂量的增加， 8 - o h - d g的量有所下降，但未呈现明确的反应趋势。同时，在 h , o : 存在条件 下，反应体系产生的8 - o h - d g 数量，较之 2 . 3 与2 . 4 节中相对应的反应明显增 启 : ，达到 1 -2 个数量级以上。 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 0 弓飞1/。勺工。由 青石棉的浓度 2 ( m g / m l ) 图4 - 4 h z 0 2青石棉诱导8 - o h - d g 的剂量反应关系 第四章 标准石英 粉尘 及青石棉直接诱导8 - 经基脱氧鸟 昔加合物形成的研究 2 . 5 f e -h z o , d n a 反应体系8 - o h - d g 形成的剂量 一反应关系 为探讨标准石英粉尘和青石棉诱导 8 - o h - d g形成能力差异的机制，以及 h z o z ( 5 0 m m o l / l ) 掺 入 反 应 后8 - o h - d g 量明 显 增 加的 原 因， 设 计了 可 产生 t s 基自 由 基的f e n t o n 反应，即f e *-h , 0 。 反应体系，与d n a 分子( 1 0 0 4 , g ) 共同作用。 不同剂量的f e z 与8 - o h - d g 形成的剂量一反应关系如图4 - 5 所示。 。尸。洲/。习若co f e z , ( m n o l / l ) 图4 - 5 h z o , -f e z 诱导8 - o h - d g 的剂量反应关系 结果表明，在 f e 浓度达到 0 . 5 m m o l / l之前，8 - o h - d g随 f e e 浓度增加而 增加，之后随 f e z + 浓度增加呈现下降的趋势。其主要原因是体系中 f e z 达到一 定浓度后，被体系内产生的经基中和形成沉淀，弱化了其催化 f e n t o n反应的 能力，因而8 - 0 1 1 - d g 生成量明显下降。 2 . 6 讨论 8 - o h - d g 是主要由氧自由基引起的氧化d n a 产物， 是d n a 损伤的一种形式， 可以引起d n a 碱基的g向t 转变， 这些突变与一些肿瘤的发生有关。有文献报 道，可由8 - o h - d g来观察人类肿瘤中氧自由基引起的突变作用。本文研究结果 表明:以 游离s i 0 : 为主 要 成分的 标准石英 粉尘与d n a 分子作用， 生 成了8 - o h - d g 。由于 o h生成是 8 - o h - d g形成的必要条件，所以在其表面或水溶液中能 够产生 轻基自 由 基。分 子式为n a 2 0 f e . 0 3 . 3 f e o . 8 s 0 2 h z o的青石 棉诱导 能力要强于标准石英粉尘，而加入氧化剂h z o : 显著增强了青石棉的诱导能力。 结构上分析， 游离 s i 0 ， 是化学性质稳定的原子晶体化合物，较难水解或电离 第四章 标准石英粉尘及青石棉直接诱导8 - 径基脱氧鸟普加合物形成的 研究 产生各种自由基;而青石棉纤维较短，且僵直易碎，据报道碎裂溶解过程中可 产生 s i 0 和 h i 、与二氧化碳、 氧基、 水经复杂反应产生h 2 o : 和 o h ， 这是 两者诱导8 - o h - d g形成能力差异的重要原因之一。另外，青石棉含 f e 近4 0 % , 在水介质中形成二价离子，而标准石英粉尘是经过严格处理的标准物质，载带 的金属离子较少。金属离子，特别是 f e 离子存在下，反应溶液构成了典型的 f e n t o n反应体系，在少量自由基产生的条件下，金属离子可进一步催化产生 各种 自由基， f e 构成循环反应: +o 2 4 = f e 一o z 井 兰 f e 一o z - 于 二亡 f e +o z 过氧阴离子在溶液中经过质子化反应形成h z o 2 : o z + h - h o o z 十h 0 2 、0 : + h o , +h o , 、 h z o z +o z h o , ，h o ,十h -h , o , 经过各种途径产生轻基自由 基: h 2 0 2 - 2 0 h 在氧化剂h 2 0 2 存在条件下，由 于青石棉载带f e 较多， 在其催化下， 产生 了大量的轻基自 由基， 氧化d n a 分子产生高 达1 5 0 0 -2 5 0 0 个8 - o h - d g / 1 0 d g . 在各个污染物剂量一反应关系中，均体现了随污染物 i) 量升高，8 - 0 h - d g先增 高后降低的反应趋势， 这 一 现象与2 . 5 节中f e -h 2 0 2 d n a 反应体系 的剂量 一 反应关系是一致的，原因是该体系 f e 达到一定浓度后，被体系内产生的轻基 中和，减弱了其催化 f e n t o n反应的能力。因此，可以判断在标准石英粉尘和 青石棉的反应体系中，氧化 d n a 分子形成 8 - o h - d g 均有金属离子的参与，其诱 导能力的强弱也与载带金属离子的浓度有关。 3结论 3 . 1标准石英粉尘和青石棉，可直接诱导d n a 分子氧化形成8 - o h - d g . 3 . 2青石棉诱导能力强于标准石英粉尘， 氧化剂 h 2 0 1 增强青石棉诱导能力 但不增强标准石英粉尘的诱导能力，以及各污染物的特定剂量一反应关系曲 线，均可能与青石棉和石英粉尘载带的金属离子种类及含量密切相关。 3 . 3标准石英粉尘和青石棉直接诱导 d n a氧化生成少量的 8 - o h - d g ，以及在 其载带的氧化剂和金属离子共同作用下产生大量的 8 - o h - d g ，是其产生致癌效 应的一条可能途径。 第五章 室内外环境污染物诱导核酸分子氧化损伤与机理研究 第五章 室内外环境污染物诱导核酸 分子氧化损伤及机理研究 夸 1香烟主、侧流烟雾对d n a生物氧化能力的比较 h u舌 全世界约有 1 1 亿人吸烟 ( 约占全世界人口的2 2 %) ,侮年吸掉 6万亿支香 烟 ( 年度报告，烟毒的严酷现实，1 9 9 5 ) 。而我国的吸烟人数比例还要远远高于 这个数字，且近年来有低龄化的趋势。吸烟是室内空气重要污染源之一，它不 仅影响吸烟者的健康，同时还影响暴露于烟雾中的不吸烟者的健康，污染整个 大气环境。环境烟草烟雾 ( e n v i r o n m e n t a l t o b a c c o s m o k e , e t s )分为香烟主流 烟雾 ( 吸烟者吸入的烟雾， ma i n s t r e a m , ms )和香烟侧流烟雾 ( 烟头冒出的烟 雾， s i d e s t r e a m , s s ) ，分别对吸烟者及其周围的人的健康造成严重危害。香 烟烟 雾成分复杂，主要是刺激性气体和致癌的焦油颗粒物的混合物，目前已鉴定出 的化学物质有3 0 0 0 余种，其中很多化合物是致癌、致畸、致突的。流行病学调 查发现，吸烟能导致肺癌和呼吸系统疾病，还与心脏病有关，但尚不能把吸烟 与癌症的发生形成指纹关系。目前已有研究表明被动吸烟的危害要大于主动吸 烟。本研究从分一 1- 生物学水平 卜 探讨环境香烟主流烟雾和侧流烟雾对 d n a的 遗传毒性效应，即吸烟对主动吸烟者和被动吸烟者造成的危害，并加以比较研 究。以d n a加合物 8 - 轻基脱氧鸟营 ( 8 - o h d g)作为 d n a氧化损伤的生物学 标志物，通过气质联用法