（发酵工程专业论文）l异亮氨酸产生菌的发酵控制研究.pdf

摘要 本文以代谢控制发酵理论为指导，重点对l 一异亮氨酸高产菌t c - 2 1 的发 酵控制进行了研究。主要研究内容和结果如下： ( 1 ) 建立了发酵液中l 一异亮氨酸定量测定的“氧化比色法”，并对该方法 的应用条件进行了研究。 ( 2 ) 研究了菌株t c 2 1 的摇瓶分批发酵条件。应用正交设计和响应面法分 别优化出种子培养基和发酵培养基的配比，并对种子培养条件和发酵条件进 行了研究。在优化条件下，t c 一2 1 菌株摇瓶分批发酵9 6 h ，产l 异亮氨酸 2 1 1 8 9 l 。 ( 3 ) 对t c 2 1 菌株进行了5l 发酵罐发酵研究，分析了分批发酵过程，研 究了发酵过程动力学以及发酵过程中菌体形态；重点研究并提出了分阶段发 酵控制方式，优化后的l 异亮氨酸发酵产酸达2 3 5 8 9 l 。 ( 4 ) 基于5 l 发酵罐发酵数据对后期发酵过程中的代谢流迁移变化进行了 研究。分别对不同补料方式和控制方式下代谢流迁移变化进行了初步研究， 为进一步发酵研究提供有利的理论指导。 本文l 异亮氨酸高产菌t c 2 1 菌株在5l 罐上发酵可产l - 异亮氨酸2 3 5 8 g l ，发酵过程其性状稳定。利用代谢流迁移变化分析了l 异亮氨酸5 l 罐发 酵过程中的变化，有助于进一步对该菌株开发和研究、优化其l 一异亮氨酸生 物合成代谢流。 关键词：l 异亮氨酸，黄色短杆菌，发酵，分阶段控制，代谢流迁移变 化分析 a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h et h e o r yo fm e t a b o l i cc o n t r o lf e r m e n t a t i o n ，t h ed i s s e r t a t i o n f o c u s e so nf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fl i s o l e u c i n ep r o d u c i n gs t r a i n t c - 2 1a n dh o w t oc o n t r o lt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s n l em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea s f o u o w s ： ( 1 ) t h e m e t h o do fo x i d a t i o nc o l o r i m e t r i cw a sd e f i n e dt od e t e r m i n a t e l i s o l e u c i n ec o n t e n t q u a n t i t a t i v e l y i nt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h t h e a p p l i c a t i o n c o n d i t i o n so f t h i sm e t h o dw a ss t u d i e d ( 2 ) t h eb a t c hf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fs t r a i n t c - 21i ns h a k ef l a s kv c a s s t u d i e di n t h i sd i s s e r t a t i o n t h ep r o p o r t i o n so fs e e dm e d i u ma n df e r m e n t a t i o n m e d i u mw e r eo p t i m i z e db yo r t h o g o n a ld e s i g ne x p e r i m e n ta n dr e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i so f s a ss o f t w a r e t h es e e dc u l t u r ec o n d i t i o n sa n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s w e r ea l s os t u d i e d u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n ，s t r a i nt c - 2 1c o u l dp r o d u c e l i s o l e u c i n e 2 1 1 8 9 l a f t e rf e r m e n t a t i o nf o r9 6h o u r sb yf l a s k s h a k i n gb a t c h f e r m e n t a t i o n ( 3 ) t h el i s o l e u c i n ef e r m e n t a t i o np r o c e s so f s t r a i nt c 2 1i n5 - l i t e rf e r m e n t o r w a ss t u d i e d t h eb a t c hf e r m e n t a t i o nw a sa n a l y z e d ，t h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s d y n a m i c sa n dt h es t r a i nm o r p h o l o g yo f s t r a i nt c 一21 i nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s w e r es t u d i e d t h ed i s s e r t a t i o nf o c u s e so ng r a d i n g f e r m e n t a t i o nc o n t r o lm o d e la n d f e df e r m e n t a t i o no fl - i s o l e u c i n ep r o d u c i n gs t r a i nt c 一21 u n d e rt h eo p t i m u m c o n d i t i o n ，s t r a i nt c 一2 lc o u l dp r o d u c e l i s o l e u c i n e2 3 5 8 9 几 ( 4 ) b a s e do nt h ee x p e r i m e n t a l d a t af r o mt h e a n a p h a s e f e r m e n t a t i o no f l - i s o l e u c i n ep r o d u c i n gs t r a i nt c - 21 s t u d y i n g t h em e t a b o l i cf l u xt r a n s f e rv a r i a n c e a n a l y s i s t h ee f f e c to fg r a d i n g f e r m e n t a t i o nc o n t r o lm o d e la n df e d f e r m e n t a t i o n o nt h et h em e t a b o l i cf l u xt r a n s f e rv a r i a n c ew a ss t u d i e d a l lt h e s ew o u l d p r o m o t e t h ef u r t h e r m o r ed e v e l o p m e n to f t h es t r a i ni nt h ef e r m e n t o t t h el - - i s o l e u c i n e p r o d u c i n g s t r a i nt c - 2 1c o u l d p r o d u c e l - i s o l e u c i n e 2 3 ，5 8 9 li n5l i t e rf e r m e n t o ra n dw h o s eg e n e t i cc h a r a c t e rw a sv e r ys t a b l ei nt h e f e r m e n t p r o c e s s n l ea p p l i c a t i o n o fm e t a b o l i cf l u xt r a n s f e r a n a l y s i s o n l i s o l e u c i n ef e r m e n t a t i o ni n5 lf e r m e n t o r , w i l i c hc o u l df u r t h e rh e l pt os t u d ya n d d e v e l o p ，a n d t oo p t i m i z et h em e t a b o l i cf l u xo fl - i s o l e u c i n eb i o s y n t h e s i s k c y w o r d s ：l i s o l e u c i n e ， b r e v i b a c t e r i u m f l a v u m ，f e r m e n t a t i o n ， g r a d i n g - c o n t r o l ，m e t a b o l i cf l u xt r a n s f e rv a r i a n c ea n a l y s i s i i 天津科技大学硕士学位论文 1 1 概述 1 前言 1 9 0 1 年，f i s c h e r 在由蛋白水解液分离的亮氨酸组分中发现了旋光度较亮氨酸 更大的物质，此为有关l 异亮氨酸的最早报道。l 异亮氨酸( l i s o l e u c i n e ) 化学名 为b 甲基a 一氨基戊酸。由于在a 位和b 位具有两个不对称碳原子，因而存在d 、 l 、d 别、l 别四种旋光异构体，自然界中主要是l 一异亮氨酸，研究表明 1 8 l ，其余 三种均无营养价值。由于存在四种旋光异构体，很难采用化学合成法或化学合成和 酶法相结合的方法廉价地制造高纯度的l 异亮氨酸，目前只有采用发酵法。但是， 自然界中只有分泌l 亮氨酸和l 缬氨酸的菌株。直到2 0 世纪6 0 年代后半期，随 着氨基酸生物合成体系中反馈调节机制的全部搞清，才逐步人工选育出l 异亮氨酸 产生菌。由于提取法和化学合成法生产的l 异亮氨酸与其它异构体分离困难，因而 均未能实现工业化生产。发酵法就是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累 l 异亮氨酸，包括添加前体物发酵法和直接发酵法两类。添加前体物发酵法：又称 微生物转化法。这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加特异的前体物质 即在氨基酸生物合成途径中的一些合适中间代谢产物，以避免氨基酸生物合成途径 中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸 9 - 1 1 1 。由于其前体物 质稀少或价格昂贵，目前已很少采用此法生产l 异亮氨酸；直接发酵法；直接发酵 法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱交处 理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈 抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。目前，l 异亮氨酸产生菌 大多由黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌诱变选育而来。 1 i il 异亮氨酸的结构 l 异亮氨酸的立体结构和结构式如图1 - 1 所示。 e h 3 _ ：2 c h 一 h c o o h 。n 飓 图卜ll 异亮氨酸立体结构和结构式 f i g u r e1 - 1s p a t i a ls t r u c t u r e a n ds t r u c t u r a lf o r m u l ao f l i s o l e u c i n e 1 1 2 l 异亮氨酸的理化性质2 。3 i 1 箭言 相对分子质量 分子式 呈味性 结晶形状 比旋光度 熔点 溶解性 1 3 1 1 7 c 6 h 1 3 n 0 2 苦昧 从乙醇中结晶，白色菱形叶片或片状晶 【a 】2 0 d = + 4 1 1 ( 6 m o l l h c i ，c = 4 ) ，温度系数：0 0 9 2 8 4 ：1 6 8 1 7 0 ( 升华) 溶于水，难溶于乙醇、乙醚，几乎不溶于其它有机 溶剂在水中溶解度随着温度升高而增大。 1 2l - 异亮氨酸发酵生产的研究意义 l 异亮氨酸为八种必须氨基酸之一，广泛应用于医药和食品领域，近年来在运 动食品行业得到广泛的运用。如果人体缺乏l 异亮氨酸，将导致食欲不振、体质下 降、贫血及其它功能障碍。并且l 异亮氨酸作为运动食品的添加剂，有助于增进肌 肉的生长发育。 l 一异亮氨酸作为特殊的支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在生命代谢 中具有特别重要的地位。主要用于一般营养型复合氨基酸输液、要素膳，大量用于 配制治疗型特种氨基酸输液如肝安、肾安氮基酸输液，特别是以l 异亮氨酸为主要 原料生产的高支链氨基酸输液、肝安糖浆、肝灵口服液，对治疗各种肝脏疾病具有 显著疗效。因此，其用量逐年增长 5 - 8 1 。l 异亮氨酸对维持成人、婴儿、儿童的生长 发育有重要作用。异亮氨酸的缺乏，可导致骨骼肌萎缩和变形。 1 ，3l 一异亮氨酸的生物合成途径及调节机制 1 3 1l 异亮氨酸蠢q 生物合成途径 葡萄糖经酵解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸经二氧化碳固定 反应生成四碳二羧酸，经氨基化反应生成天冬氨酸；天冬氨酸在天冬氨酸激酶催化 作用下，生成天冬氨酸半醛；天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶的催化下生成高丝氨 酸；高丝氨酸在高丝氨酸激酶的催化下生成苏氨酸，苏氨酸经苏氨酸脱水酶、乙酰 羧基酸合成酶和支链氨基酸谷氨酸转氨酶的催化作用，生成l - 异亮氨酸。l 一异亮氨 酸生物合成途径及调节机n t 3 ，j ，如图1 2 所示。 天滓科技大学硕士学位论文 i 一一一一一一一j 嚣：翟馨嵩譬翼雾鼍g 鐾譬l 淼蟊 彝瀚酶。高魑氟酸脱羞壤 7 。苏氟酗脱槽。a 8 己酰 + 反馈揶制一+ 庶i 畦遢| 溃传骞 始 够擘昧反馈阻遏基辞除屣_ 瞌抑制 图1 - 2l 异亮氨酸生物合成途径及其代谢调节机制 f i g u r e1 - 2t h e b i o s i n t h e s i sp a t h w a ya n dm e t a b o l i cr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo f l - i s o l e u c i n e 1 3 2l 异亮氨酸生物合成的代谢调节机$ j 1 3 , 9 1 l 异亮氨酸合成的第一个限速酶，即l t h r 脱水酶( t d ) ，几乎在所有的微生 物中，都是受l - 异亮氨酸的强烈反馈抑制的。这种抑制是与l t 1 1 r 相拮抗的。其抑 制率依赖于t h r 的浓度。这种抑制可由y a l 或l e u 特异性地回复。但是对于某种细 菌来说，l 异亮氨酸的反馈抑制则非常弱。 缬氨酸合成的限速酶乙酰羟基酸合成酶( a s ) 也是异亮氨酸合成的第二个限速 酶。大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌( s a l m o n e l ia i y p h m u r i u m ) 的a s 有三种同功酶存 在。同功酶i 和i i i ，受缬氨酸的强烈抑制，也受异亮氨酸的抑制，但比缬氨酸弱， 不受亮氨酸的抑制。同功酶i 受v a l + l e u 的阻遏。同功酶i 受亮氨酸的阻遏。这种 调节方式不同的同功酶的存在，与a k 、h d 以及芳香族氨基酸的合成酶系的3 脱 氧d 阿拉伯庚酮糖酸7 磷酸合成酶相似。看来，a s 的各个同功酶系调节，与微生 物机体生理的内在联系尚待细查。有人发现大肠杆菌的k 1 2 菌株，没有a s 同功酶 i i 。通过对该酶结构基因i l v g 区段核酸序列的研究，发现该基因中部有移码( f r a m e s h i f t ) 的位点，因此不能合成有活性的酶。而大肠杆菌的b 菌株和w 菌株，以及 鼠伤寒沙门氏菌的该基因没有移码，故能表达同功酶i i 。 1 前言 己知乙酰羟酸合成酶是催化活性乙醛与n 酮基丁酸，或与丙酮酸相缩合的反应 的酶。该酶度对c 1 - 酮基丁酸的亲和性比对丙酮酸更高。所以通过调节q 一酮基丁酸 的生成，可以间接的调节缬氨酸和亮氨酸的合成。n 酮基异戊酸在转氨酶b 的催 化之下，转化为亮氨酸的中间体。后者反应对酶的亲和性比前者约高1 0 倍。所以， n 一酮基异戊酸转换为缬氨酸的量，依赖于c 1 异丙基苹果酸合成酶的调节。由此可 以说，分支链氨基酸合成的有限顺序，可以排列为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。 限速酶的活性不仅受最终生成物浓度的调节，也受基质浓度的调节。异亮氨 酸的前体苏氨酸的合成，受苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸的反馈调节。肠道细菌的异亮 氨酸，参与a k 和h d 的反馈阻遏，从而调节l 苏氨酸的合成。还有，亮氨酸参与 乙酰羟酸合成酶的调节，从而调节了前体a 一酮基异戊酸的浓度。 微生物合成l 异亮氨酸由于有正常的反馈调节机制【l 。3 】，故不能过量合成，正 常的反馈调节 8 - 9 1 包括；( 1 ) 磷酸烯酵式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制；f 2 ) 天 冬氨酸激酶受苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制；( 3 ) 高丝氨酸脱氢酶受苏氨酸的反 馈抑制和蛋氨酸的反馈阻遏；( 4 ) 苏氨酸脱水酶受l 一异亮氨酸的反馈抑制；( 5 ) 乙 酰羟基酸合成酶受缬氨酸的反馈抑制：( 6 ) 分支链氨基酸合成酶受三种支链氨基酸 ( l 异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸) 的多价阻遏：( 7 ) 细胞内苏氨酸水平的调节作用 等。 所以l - 异亮氨酸产生菌应具备的生化特征为2 】：( 1 ) c 0 2 固定反应能力强；( 2 ) 天冬氨酸合成酶能力强；( 3 ) 天冬氨酸激酶活力强；( 4 ) 高丝氨酸脱氢酶活力强：( 5 ) 苏氨酸脱氢酶活力强；( 6 ) 乙酰羟基酸合成酶活力强；( 7 ) 二氢吡啶2 ，6 二羧酸合 成酶活力微弱或丧失；( 8 ) 琥珀酰高丝氮酸转琥珀酰酶活力微弱或丧失；( 9 ) 谷氨酸 脱氢酶活力弱。 1 4l 一异亮氨酸的研究和生产现状 国际上，l 异亮氨酸目前合计年产量4 0 0 5 0 0 吨。主要以日本为主，占垄断 地位。厂家有味之素、协和发酵和田边制药三家，均以发酵法生产，产酸率达 3 0 3 5 9 l ，提取率6 0 7 0 。鉴于l - 异亮氨酸生产的高难度，l 异亮氨酸一直是 高价氨基酸，国际市场医药级价格高达6 0 8 0 美元k g 。国内售价由于日本向中国倾 销而逐年下降，目前医药级价格约4 0 0 元k g 。 我国的l 异亮氨酸发酵研究始于2 0 世纪7 0 年代，2 0 世纪9 0 年代初正式工业 化生产。目前，传统一次投糖分批发酵大罐产酸率为2 0 2 2 9 l ，总得率为4 0 5 0 。 国内l 异亮氨酸产量约为1 0 0 吨。与日本相比，我国的l - 异亮氨酸生产水平还很 低下。 1 4 1l 异亮氨酸产生菌代谢控制育种实例 i k e d a l l3 - 1 4 等以产l 苏氨酸1 1g l 的l 苏氨酸产生菌f a b 3 1 ( a h v 和a e c 天津科技大学硕士学位论文 双重抗性) 为亲株选育乙硫氨酸( e t h ) 抗性突变株，获得几乎不积累l 苏氨酸面 积累l 异亮氨酸的变异株n o 1 4 0 8 3 。由1 0 葡萄糖可产n # l 的l 异亮氨酸， 流加醋酸发酵，可产l 异亮氨酸3 3 5 9 l 。 吉永文弘【”i 由黄色短杆菌选育a h v 、e t h 、a e c 多重抗性突变株，在培养期间流 加l ：0 2 比率的醋酸与醋酸铵混合液( 7 0 1 0 0 m l ，以醋酸计) ，维持培养液p h 7 7 。 经9 6 h 发酵后，可生成l 一异亮氨酸3 7 4 9 l 。 天滓氨基酸公司张磊“”等利用i a b s 模型以l 异亮氨酸产生菌a s l l l 为出发菌 株，有目的地活化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( p c ) 、高丝氨酸脱氢酶( h d ) 和乙酰羟 基酸合成酶( a s ) 等酶，筛选获得a 氨基丁酸抗性( a - a b ) 、以琥珀酸为唯一碳源平 板生长( s u c g ) 和乙硫氨酸高抗( e t h ”) ，在优化的培养条件下可产l 一异亮氨酸2 0 9 l 。 无锡轻工业学院张炳荣1 等以乳糖发酵短杆菌为出发菌株，经d e s 和u v 诱 变处理，在a h v 、a e c 、e t h 、异亮氨酸氧肟酸盐( i l e h x ) 等氨基酸结构类似物及 琥珀酸( s u c ) 为唯一碳源的平板上定向筛选，获得一株l 异亮氨酸高产菌z t - 2 ( a h v a e c s u c e t h r + l l e h x r ) ，在合适的条件下可产l 异亮氮酸2 4 9 ，l 。 1 5 代谢工程在l 一异亮氨酸发酵生产中的运用 代谢工程1 1 s - 2 6 是指应用重组d n a 技术和应用分子生物学相关的遗传学手段进 行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能和输送体系的功能，甚至产能体系的功能， 以改进微生物细胞某些方面的代谢活性的整套工作，目标是修饰初级代谢，将碳架 物质流导入目的产物的载流途径以获得产物的最大转化率。 随着代谢工程与各种学科知识的融合，越来越多的研究方法和策略被应用于代 谢工程的研究中。 1 5 1 代谢流分析理论 在细胞代谢过程中，底物被运输到细胞中后，经过多种细胞内反应，被转化成 代谢产物或细胞组分。在底物形成大分子的过程中，底物首先转化为结构单元 ( b u i l d i n gb l o c k ) ，如氨基酸和核苷酸，然后再聚合为大分子。 代谢流分析理论( m e t a b o l i cf l u xa n a y s i s ) 在微生物培养中应用比较广泛【2 7 3 9 】， 有助于加深理解细胞各代谢途径特点，并提供代谢调控或优化的信息。其较直接准 确的方法是通过同位素标记及核磁共振( n m r ) 等分析方法来测定，但这种方法测 定费用昂贵；基于物流平衡的代谢流分析( m f a ) ，即代谢通量分析是另种方法。 这种方法是基于数学计算上，相对较简单。它是根据代谢途径中各生化反应的计量 关系，通过测定细胞外代谢物及菌体组成来计算整个代谢网络的代谢流分布。但其 前提是拟稳态假设：即假设细胞内的中间代谢物均处于拟稳态，其浓度变化速率为 0 。采用j o s e p hj v a l l i n o 的方法f 4 0 1 ，根据物流平衡计算代谢物的积累速率，有： ( ，) = d ，x ) 一a h ( r ) ( 1 1 ) 前言 式中，x ，彤：生成r ，似的第歹步反应反应速率( m o l l h ) x k ( t ) ：消耗，似的第k 步反应的反应速率( m o l l h ) a 。：第，步反应的反应计量系数 a ：第k 步反应的反应计量系数 r ，：中间代谢物i 的积累速率( m o ll h ) 式( 1 1 ) 用矩阵表示为： a x = r 纠( 1 2 ) 式中，a ；m x n 维矩阵：x ( o ：盯x 1 维矩阵：n ：选定的速率总数目；，俐：m x l 维矩阵，中间代谢物f 的积累速率向量。 其中，r ( o = r e m + 儿 坩：代谢物的胞外代谢速率向量；e l ：代谢物的胞内积累速率向量。 ，中的每一个速率可由两个连续的胞外代谢物浓度数据点间的斜率得出，或 者直接测出。 细胞内的代谢物为保持生理响应的敏感性，其胞内浓度一般在2 0 1 0 0 饱和 度之间浮动。而一般的代谢物饱和度小于l m m o l l ，最高也不超过1 0 m m o l l 。这 样，即使胞内代谢物有l m m o l l m i n 的积累速率，和一般情况下的x 。和 代谢流相比也很小，几乎可以忽略，且胞内代谢物一旦达到饱和度即可发生调整， 则：a x = r e ( t )( 1 3 ) 在测出一定时间的旭的前提下，由n 个中间代谢物即可得到删个关于速率 的约束条件，待解问题的自由度为：f = n 一肌，通过实验测出，个不相关速率即可 确定胞内整体流量分布，从而对其生理行为进行定量描述。 1 5 2 代谢控制分析理论 代谢控制分析【4 1 侧( m e t a b o l i cc o n t r o la n a l y s i s ) 是以系统观点对细胞内代谢调 控进行定量分析，认为代谢控制是细胞内代谢的系统属性，可以用酶动力学性质定 量表示，代谢途径中酶促反应步骤对代谢的控制作用随系统内外调节的改变而改 变，用理论计算或试验确定的控制系数能够加深对代谢的控制结构的理解，是由 k a c s e r 6 6 等首先提出，严格地说，代谢控制分析仅能应用于稳态条件( 或拟稳态条 件) 。它的一个基本前体条件是：一个稳定可靠的稳态仅被一条代谢途径中催化某 一步骤的酶的活力所确定。 代谢控制分析理论中的流量控制系数、浓度控制系数和弹性系数三个概念以及 总和原理、连通原理非常重要，以上的概念和原理构成代谢控制分析理论的基本形 式，下面简要介绍m c a 中的重要参数h 1 4 8 1 。 1 5 2 1 流量控制系数 流量控制系数( f l u xc o n t r o lc o e 珩c i e n t ) ，其定义是： 。，d j je 。d i n ， ( 1 - 4 ) l j 2 = 一 d e ，x ，d l n e ， 天津科技大学硕士学位论文 式中：j ，一在酶e ，催化下的稳态代谢流；e 。一酶巨的浓度。 流量控制系数c j 实际上是对酶e ，浓度变化影响稳态代谢流的测量，即在该稳态 代谢流下酶e 对代谢流控制的贡献程度。 1 5 2 2 浓度控制系数 浓度控制系数( c o n c e n t r a t i o nc o n t r o lc o e f f i c i e n t ) 的定义是 c = 警= 筹( 1 - ，) 式中：x 代谢物的稳定浓度。 浓度控制系数c 夕的作用在于测定酶巨浓度对代谢物稳态浓度工，的影响。 1 5 2 3 弹性系数 弹性系数( e l a s c i t yc o e f t & c i e m s ) ，其定义表示如下： 占一：坐立：坐( 1 - 6 ) i a x i 、。a l n x 式中：v ，一表示e i 催化的反应速率； 可以说弹性系数6 ，实际上是在其他代谢物浓度保持恒定的前体条件下对反应 速率如何响应代谢物浓度，变化的一直度量。 两个控制系数表征的是整个代谢途径的特性，途径中任何一个参数的变化均会 引起控制系数的变化；而弹性系数则表征的是代谢途径的区域特性，仅反映单一酶 或其他影响因子的状态。根据这些概念，结合直线式代谢途径( 稳定态代谢途径中 任何两个反应步骤式是通过唯一的共同中间代谢物连接的) 的结构约束，即系统内 代谢物式均匀分布的，可以导出总和理论和连通理论。 1 s 2 4 总和原理 总和原理是代谢系统中对指定代谢通量，和代谢物卫所以反应步骤j 对，的 流量控制系数得到总和为1 ，即 c ? = l ( 1 - 7 ) 相应地，对的浓度控制系数的总和可以用下式表示： q 州= 1 ( 1 8 ) l 总和原理表示出了，代谢控制式一个系统特性，控制系数的大小表示每一步反 应步骤对代谢控制作用的强弱。代谓 系统中的全部反应步骤共同承担了对代谢通量 前言 的控制，某一通量控制系数的增加意味着其他通量控制系数的减少。也就是说所以 反应步骤的控制系数总和是恒定不变的。 1 5 2 5 连通原理 连通原理是指：在代谢系统中，若以中间代谢物为弹性系数的微扰参数，则 由j 联结的全部反应的流量控制系数和浓度控制系数与这些反应对j 的弹性系数乘 积之和是一个定值，即 q = 0 ( 1 - 9 ) c j 】= 0 g 】= 0 。j 2 。 ( 1 1 0 ) 0 - 1 1 ) 连通原理在m c a 理论中意义重大。连通原理提出了用酶的动力学性质( 以弹 性系数表示) 确定控制系数的方法，是经典的酶促动力学与代谢控制分析联系的纽 带。在代谢系统中，中间代谢物联结的两个反应都对其浓度变化非常敏感。连通原 理表明，通过这种方式联结的反应，控制系数和弹性系数之间存在羞确定的关系。 1 s 3 代谢工程理论指导下的l - 异亮氨酸工程菌构建的具体思路 代谢工程的具体思路和常规诱变育种技术有所不同。 ( 1 ) 改变代谢流：改变分支代谢途径的流量，阻断有害产物。可采取如下措施： a 加速限速反应。通过克隆对生物合成起限速作用的关键酶基因，加速代谢流 的流动。借助于基因克隆与表达技术，将氨基酸生物合成途径中的限速酶编码基因 导入生产菌中，通过增加基因剂量和( 或) 更换表达调控条件，扩增其表达。导入 的限速酶基因既可以是生产菌自身的内源基因，也可以是来自非生产菌( 如大肠杆 菌) 的外源基因。 b 构建代谢旁路。用代谢工程的方法可以阻断或降低副产物的合成，特别是有 毒产物的产生。采取类似的方法，扩增表达氨基酸输出系统的关键基因，或者降低 某些基因产物的表达速率，最大限度地解除氨基酸及其生物全合成中间产物对某生 物合成途径可能造成的反馈抑制。 实施上述战略的第一步是有关基因的克隆。谷氨酸棒杆菌中i l v 操纵子如图1 3 所示。氨基酸生物合成基因的克隆大都采用突变株互补的方法，在大肠杆菌的营养 缺陷型突变株中构建谷氨酸棒杆菌的基因文库，然后通过遗传互补正向筛选，即可 克隆相关基因。 8 - 天津科技大学硕士学位论文 乙酰乳酸合成酶i a 一异丙基苹果酸异构酶 图1 3 谷氨酸棒杆菌中i l v 操纵子基因图 f i g u r e1 - 3t h eg e n e t i cd i a g r a m o f i l vo p e r o ni nc g l u t a m i c u m l 异亮氨酸是从l 苏氨酸转化丽来的，整个合成过程包括五步反应，分别由苏 氨酸脱水酶( i l v a ) 、乙酰羟基酸合成酶( i l v b n ) 、异构还原酶( i l v c ) 、二羟酸脱 水酶( i l v d ) 以及转氨酶b ( i l v e ) 催化，这些酶中只有苏酸氨酸脱水酶是l 异亮氨酸 生物合成特异性的，其它4 种酶也参与l 一缬氨酸和l 亮氨酸的生物合成。肠道内 至少存在5 中乙酰羟基酸合成酶的同功酶，与之相比，谷氨酸棒杆菌只有一种，碳 源从l 苏氨酸到l 异亮氨酸的流向实际上是由苏氨酸脱水酶和乙酰羟基酸合成酶 控制的，最后3 种酶无论是在酶活水平还是在基因水平上均不参与l 异亮氨酸生物 合成的调控。对于谷氢酸棒杆菌的l 苏氨酸脱水酶而言，l 异亮氨酸是一个变构抑 制因子，而缬氨酸则是变构激活因子。乙酰羟基酸合成酶的活性可被三种支链氨基 酸反馈抑制5 0 左右，谷氨酸棒杆菌的乙酰羟基酸合成酶在细胞中受到严格控制， 而且调控水平存在于基因的转录阶段。 由于在大量的突变工作中从未分离到含有这两个关键酶抗调节的突变株，因此 l 异亮氨酸工程菌的构建策略主要是解除l 苏氨酸脱水酶或( 和) 乙酰羟基酸合成 酶的反馈抑制。谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶基因的克隆及测序为这项工作提供了 有利条件，借助于定点突变技术，可将该酶的变构功能域转变成抗反馈抑制的序列。 例如将该酶的第3 2 3 位氨基酸残基由v a l 转变为a l a ，l - 异亮氨酸对突变酶的反馈 抑制全部解除，使其始终处于活化状态。若将这个基因导入l 苏氨酸生产菌中，并 使之过量表达抗反馈抑制的苏氨酸脱水酶，则工程菌的l 苏氨酸合成系统可转换成 l 异亮氨酸的生成系统，培养液中的l 异亮氨酸浓度可达2 0 9 l 。 k o m a t s u b a r a 等 5 5 】采用l 一异亮氨酸产生菌f 8 0 3 的染色体d n a ，通过鸟枪法克 隆，分离得到重组质粒p t k l 2 0 。此重组质粒在p l g 3 3 9 上含有7 5 k b 插入子，并 携带包括i l v a 2 突变的4 种i l v 基因。将质粒p t k l 2 0 导入野生型菌株m u - 9 1 0 和 菌株t 一8 0 3 的细胞中。导入p t k l 2 0 后显著的提高了苏氨酸脱水酶和乙酰羟基酸合 1 前言 成酶的活性。采用具有t h r 重组质粒的工程菌株也可以提高l 异亮氨酸的产酸率。 得到携带p s k 3 0 1 的菌株t 8 0 3 ，在4 8 h 或7 2 h 添加蔗糖，其重组菌株 t 一8 0 3 ( p s k 3 0 1 ) 司1 产l 异亮氨酸3 2 9 凡。 s a h m 【6 7 】等人为获得谷氨酸棒杆菌的l 异亮氨酸高产菌株，对l 异亮氨酸的生 物合成途径中相应的酶进行了基因扩增，即通过基因克隆增加基因剂量。以赖氨酸 高产菌株为出发菌株，扩增已经对反馈调节不敏感的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激 酶的相应基因，打通从天冬氨酸半醛到高丝氨酸的通道，结果大量积累苏氨酸。然 后将失去反馈调节作用的苏氨酸脱水酶进行基因扩增，使苏氨酸被转化成l 异亮氨 酸，产量可达3 0 9 l 。 s g u i l l o u e t 【6 8 1 等人从大肠杆菌中分离到了对l 异亮氨酸反馈抑制不敏感的苏氨 酸脱水酶基因。不同于由基因i l v a 编码的基因，该酶基因为t d c b ，并能被a m p 激 活。大肠杆菌在厌氧条件下在只含有高浓度氨基酸而不含有葡萄糖的培养基中良好 生长时能产生这种酶。当这种异源基因被引入野生型异亮氨产生菌谷氨酸棒杆菌并 获得表达时，发现该菌在2 0 0 m m o l l 的l 异亮氨酸的存在下仍能保持6 0 的苏氨 酸脱水酶活性，而野生型菌株在1 5 m m o l l 的l 异亮氨酸存在下酶活性就已被抑制。 将此谷氨酸棒杆菌的异源基因扩增，即增加基因剂量，则工程菌的l 异亮氨酸产量 能比野生型菌株提高5 0 倍；而如果将谷氨酸捧杆菌本身的苏氨酸脱水酶基因扩增， 则l - 异亮氨酸产量只比野生型菌株提高4 倍。碳平衡数据表明，上述异源酶基因的 扩增使得7 0 的碳源从赖氨酸途径改向l 异亮氨酸途经，因而大大提高了l 异亮 氨酸产量。 c 改变能量代谢途径。 d 改变分支代谢途径的流量。通过提高代谢分叉点的某个分支代谢途径酶系 的活力，以得到高产的末端代谢产物。 ( 2 ) 扩展代谢途径和构建新的代谢途径：通过引入外源基因，可以延伸原来 的代谢途径，产生新的末端代谢产物，或者利用新的底物作为生物合成的原料，也 可构建新的代谢途径来合成具有新化学结构的代谢产物。 a 延伸代谢途径。 b 构建新的生物合成途径。 将多种完整的氨基酸生物合成操纵子导入另一种氨基酸生产菌中，构建能同时 生成两种甚至多种氨基酸的工程菌。 1 6l - 异亮氨酸发酵条件对其代谢流的影响 提高异亮氨酸生产菌株的l 异亮氨酸产量，不仅取决于调节控制机制被解除和 解除的程度，发酵的外界环境对产量也有重要影响。l 异亮氨酸生物合成的代谢调 节的解除，只是说明所选突变株具备大量积累l 异亮氨酸的潜在能力，而不能说这 天津科技大学顾士学位论文 些突变株在任何条件就一定能在发酵生产上取得高产。实际结果证明发酵的环境条 件 3 7 - 4 1 】，如：培养基组成、p h 、温度、溶氧水平等邦呗显的影响巽亮氨酸的产量。 对l 一异亮氨酸生物合成分析发现，环境因子对代谢流的迁移都有很大影响。 1 6 1 营养因子对代谢流的影响 1 6 1 1 碳源和氨源的影响 碳源是构成菌体和合成异亮氨酸的碳架及能量的来源。氮源不仅是构成菌体蛋 白质、核酸等含氮物质的来源，而且是合成l 异亮氨酸中氨基的来源。在发酵中， 培养基浓度太大，增大了培养基的渗透压。进而影响微生物的生理代谢，不利于l 异亮氨酸的代谢合成，不利于发酵生产。因此，选择合适的碳氮源以及其浓度对发 酵生产有重大的影响。张伟国1 6 9 j 等研究了发酵培养基对l 异亮氨酸发酵的影响，得 到选用玉米浆和葡萄糖对发酵产酸的影响浓度玉米浆为2 0 m l l 、葡萄糖为1 4 0 9 l 较好。 1 6 1 2 无机盐的影响 无机盐是微生物生命活动不可缺少的物质。其主要功能是作为酶的组成部分、 酶的激活剂或抑制剂、调节培养基的渗透压、构成菌体成分和氧化还原电位等。虽 然生物细胞对无机盐的需要量很少，但它通过参加细胞代谢对代谢过程中的代谢流 量分配产生影响，进而影响l 异亮氨酸的生物合成。杨革等口0 】研究了金属离子对地 衣芽孢杆菌合成多聚y 一谷氨酸的影响。 1 6 1 3 生长因子的影响 在l 异亮氨酸发酵生产中，生长因子主要是生物素和硫胺素，是一类对微生物 细胞正常代谢必不可少却不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。是生长途径 和产酸途径的主要因子。其添加量的多少往往会直接影响到发酵产酸，也就是说直 接对代谢流的流量分配产生影响。 1 6 2 环境因子对代谢流的影响 1 6 2 1 温度、p h 韵影响 不同菌种的发酵控制温度不同，l 异亮氨酸产生菌也不例外，就本论文研究的 黄色短杆菌的生长环境而言，生长温度一般控制在3 l 左右：p h 值控制在7 0 7 3 右较好。许正宏等提出了黄色短杆菌的分阶段变温发酵的模型结果使得l 异 亮氨酸发酵产酸有明显的提高。 1 6 2 2 溶氧的影响 l 一异亮氨酸是由a 酮基b 甲基戊酸在支链氨基酸转氨酶作用下合成的，l 异 亮氨酸的合成中全部碳元素都来源于丙酮酸，而丙酮酸的前体物是糖酵解途径的磷 酸烯醇式丙酮酸。因此，在l 异亮氨酸发酵中氧对发酵产酸的影响是至关重要的， 1 前言 参考大量的研究报告发现，高或低的溶氧对l 一异亮氨酸的发酵产酸都不有利。并且 微生物细胞在发酵过程中，存在着不同的时期由于不同时期发酵的目的不同，所以 其对氧的需求也就随着发酵代谢过程进行变化，即在不同的时期代谢流发生不同的 迁移，相应的需氧量不同，所以发酵过程中氧对代谢流的迁移有着重要的影响，直 接影响着产量和副产杂酸量。张伟国1 7 2 j 等对黄色短杆菌x q 一4 分析，得到当体积传 氧系数伟3 8 5 h 1 左右时，对菌株x q 一4 的供氧较适宜。 1 7 菌种保藏 l 异亮氨酸生产菌与其它菌株一样，经诱变获得，很可能由于回复突变( 突变 率lo - 7 1 0 8 ) 丧失其优良性状，造成生产损失。根据l 异亮氨酸生产菌的生理生化 特征，参考经典试验方法，采取如下措施：筛选遗传稳定性强的菌种，定期进行分 纯、复壮，保藏培养基中加入必须营养物质以及抗性物质。 1 8 论文立题背景及主要研究内容 1 8 1 论文立题背景 l 异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，能治疗神经障碍、食欲减退和贫血， 在人类生命代谢中占有特别重要的地位。由于l 异亮氨酸生产的高难度，作为高价 氨基酸，国际市场医药级价格高达6 0 8 0 美x z k g 。国内由于菌种产酸差、工艺落 后，l 一异亮氨酸产量低，总量约为1 0 0 吨，因此绝大部分依靠进口，尤其是医药级 l 异亮氨酸，每年消耗大量外汇。因此，开展l 异亮氨酸发酵生产的研究，对促进 我国氨基酸发酵工业的发展具有重大意义。 1 8 2 本课题主要研究内容 本文主要对l 异亮氨酸的测定方法、摇瓶发酵条件以及5 l 罐的发酵控制进行 了研究，并结合5 l 罐发酵实验对l 异亮氨酸发酵后期代谢流迁移进行了初步分析， 以期通过宏观手段控制微生物细胞的微观代谢，进而提高发酵产酸。具体研究了氧 化比色法测定发酵液中l 异亮氨酸的方法，并对比了氧化法、纸层析法和氨基酸分 析仪法的l 异亮氨酸测定方法：通过对黄色短杆菌t c 2 1 进行摇瓶分批发酵试验， 结合正交设计和响应面法分别对种子和发酵培养基进行优化，获得最佳种子培养基 和发酵培养基；研究了5 l 罐分批和补料分批发酵进行最优控制试验，建立了5 l 罐 分阶段控制发酵模式；得到5 l 发酵罐最佳控制条件；基于代谢通量分析和代谢控 制分析的基础上，对黄色短杆菌t c 2 1 菌株的生物合成途径进行分析，结合流量平 衡模型，初步分析了不同控制方式下代谢流的变迁，为l 异亮氨酸产生菌的发酵控 制和补料的操作提供理论指导。 天津科技大学硕士学位论文 2 1 实验材料 2 材料与方法 2 1 1 菌种 所采用菌株为黄色短杆菌b r e v i b a c t e r i u m k v 搿搬t c 2 1 ( m e t 一+ e t h r + a a b r + a e c 7 ) ，本研究室保藏菌种。 2 1 2 主要仪器 7 5 2 型分光光度计上海精密科学仪器有限公司 电子天平f a 2 0 0 4上海精密科学仪器有限公司 日立8 3 5 5 0 高速氨基酸分析仪日本日立公司 t g l 。1 6 g 高速台式离心机上海医用分析仪器厂 l d 5 1 0 型低速离心机北京医用离一t l , 机厂 p h s j 4 a 型实验室p h 计 上海精密科学仪器有限公司 l r h 2 5 0 a 型生化培养箱广东省医疗器械厂 1 0 0 0 微升微量可调移液器北京青云航空仪器有限公司 5 0 微升微量进样器上海分析仪器厂 层析缸