（农产品加工及贮藏工程专业论文）黄酮类活性成分配位色谱分离技术研究.pdf

摘要 天然产物活性成分常具有不同的药理作用，实用中多需分离纯化和分析检测。天然产物 中的黄酮类化合物有数千种，其结构类似，分离难度大。本文紧紧围绕黄酮类化合物色谱分 离过程的关键技术难题，以黄酮类化合物中的3 类典型成分为对象，进行配位色谱高效分离 纯化新技术研究。 作者通过分析计算配位剂和目标组分的相互作用，构建色谱分离模型、开展配位色谱分 离试验，考察了配位剡对不同结构黄酮苷元和黄酮苷的协同分离效果，初步解析了配位色谱 分离原理。研究结果如下： 1 建立了以黄酮醇和异黄酮为目标化合物的过渡金属离子( z n 2 + 、n i 2 + 等) 配位色谱 精制纯化方法。分子力场、量子力场计算和配位色谱分离试验结果显示：过渡金属 离子与黄酮苷元不同部位的配位结合强度分别为：对于单独的羟基 3 - o h , 5 - o h 3 o h 4 。- o h , 5 - o h 7 o h ：对于邻位基团c = o , c 4 ) h c - - o h , c - o h c o h , c - o c h 3 ：对于不同区域a 环 b 环、a 环下部 a 环上部，- o c h ，抑制邻近基 团的配位 2 建立了以黄酮、黄酮醇和异黄酮为目标化合物的争环糊精配位色谱分析检测方法。 分子力场计算和配位色谱分离试验结果显示：争环糊精与黄酮苷元不同部位的配位 结合强度依次是：- o c h 3 一h - o h ，b 环 a 环、a 环上部 a 环下部，- o c h 3 促进 邻近基团的配位。 3 发现葛根黄酮在不同的流动相中保留行为各异。葛根素与3 一甲氧基葛根素在四氢呋 喃一水和甲醇水流动相中的出峰顺序相反；流动相为四氢呋哺水时分离度随着流动 相极性的降低而增加，流动相为甲酵水时分离度随着流动相极性的降低而降低。化 学计算分析表明，氢键在配位色谱分离中起关键性作用。在配位色谱中根据不同配 位荆的性质选择相应的漉动相。 4 b - 环糊精可以调节葛根黄酮中葛根素与37 甲氧基葛根素在配位色谱中的分离度。使 用四氢呋喃水流动相时，较低浓度争环糊精协同能提高葛根素与3 甲氧基葛根素 的分离度，但过高浓度则会降低分离度。 5 优化葛根黄酮的配位色谱分离试验参数，同时满足色谱分离结果即分离度、保留时 间和拖尾因子的要求。采用b o x - b e h n k e n 模型进行色谱分离响应曲面试验方案设计， b p 人工神经网络建立非线性色谱分离模型，差分进化法计算色谱分离的多目标同时 优化问题，得到最优化的分离条件经试验验证：p 环糊精、冰醋酸和三乙胺的浓度 是3 7m m o l - l 、0 0 2 和0 8 。 关键词：黄酮类化合物，分离纯化，配位色谱，光谱，化学计算 a b s t r a c t a c t i v ec o m p o n e n t si nn a t u r a lp r o d u c t sp o s s e s sv a r i o u sp h a r m a c o l o g i ce f f e c t sa n dr e c e i v e c o n s i d e r a b l ea t t e n t i o ni nt h el i t e r a t u r e i s o l a t i o n , p u r f i c a t i o na n da n a l y s i sw e r ee s s e n t i a li nt h e i r r o u t i n ea p p l i c a t i o n o v e r4 0 0 0s p e c i e so f f l a v o n o i d sw a sd i s c o v e r e du pt on o w , w h i c ha r es l r u e t u l - e r e l a t e dc o m p o u n d sa n dg r e a te f f o r t sa r cn e e d e dt oc o n q u e rt h ec o m p l e x a t i o no fs e p a r a t i o n t h i s a s s a yw 8 5f o c u so nt h eb o t t l e n e c ko fr & dp r o c e d u r eo ff l a v o n o i d s e p a r a t i o nm e t h o do f t h r e e d i v e r s em o d e lc o m p o m e n t sw a sa c h i e v e db yc o o r d i n a t i o nc h r o m a t o g r a p h yt e c h n o l o g y i n t e r a c t i o no ft a r g e tc o m p o u n da n dc o o r d i n a t i o na g e n t sw a ss t u d i e db yc h e m i c a lc a l c u l a t i o n c o o r d i n a t i o nc h r o m a t o g r a p h ye x p e r i m e n t a lr e s e a r c hw a sc a r r i e do u ta c c o r d i n g l ya n dm a t h m a t i e a i m o d e lo fc o o r d i n a t i o nc h r o m a t o g r a p h yw a se s t a b l i s h e d d i f f e r e n t f i a v o n o i da g i y c o n ea n d f l a v o n o i dg l y c o s i d ew a st e s t e dt oi n v e s t i g a t ec o o r p e r a t i v ee f f e c t i v e n e s so fc o o r d i n a t i o na g e n t st o c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n s e p a r a t i o nm e c h a n i s mo f c o o r d i n a t i o nc h r o m a t o g r a p h yw a s r e s o l v e d p r e l i m i n a r i l y m a i nr e s e a r c hf i n d i n gw a sf o l l o w i n g ： 1 i s o l a t i o na n dp u r i f c a t i o nm e t h o do f f l a v o n o la n di s o f l a v o n ew a sa c c o m p l i s h e db yc o o r d i n a t i o n c h r o m a t o g r a p h yu s i n gt r a n s i t i o n a lm e t a li o n ( z n 2 + ，n i 2 + ) c o o r d i n a t i o na g e n t s d e d u c e db y h er u s u l t so fi v l v la n dq mc o m p u t a t i o na n de x p e r i m e n t a li n v e s t i g a t i o n , t h ec o m p l e x a t i o n s t r e n g t h o ft r a n s i t i o n a lm e t a li o nw i t hf l a v o n o i dw a s ；s o l i t o r yh y d r o x y lg r o u p 3 - o h 。5 一o h t - o h ，4 - o h ，5 - o h 7 - o h ，o r t h o - g r o u p c = o , c - o h c - o h ，c - o h c - o h ， c - o c h 3 ，d i f f e r e n td o m a i no ft a r g e tc o m p o u n d sr i n ga r i n gb ，i n f e r i o rp a r to fr i n ga s u p e r i o r p a r t o f n n g a ，- o c h 3a t t e n u a t e t h ec o o r d i n a t i o n a f f i n i t y o f i t sn e i g h b o r i n g g r o u p 2 i s o l a t i o na n dp u r i f c a t i o nm g t h ( x io ff l a v o n e ，f l a v o n o la n di s o f l a v o n ew a sa c c o m p l i s h e db y c o o r d i n a t i o nc h r o m a t o g r a p h yu s i n gc y c l o d e x t r i na sc o o r d i n a t i o na g e n t s d e d u c e db yh e r u s u l t so fm mc o m p u t a t i o na n de x p e r i m e n t a li n v e s t i g a t i o n ，t h ec o m p l e x a t i o ns t r e n g t ho f c y c l o d e x t f i nw i t hf l a v o n o i dw a s ：s o l i t o r yg r o u p - o c h 3 - h - o h , d i f f e r e n td o m a i no ft a r g e t c o m p o u n d sr i n gb r i n ga s u p e r i o rp a r to f f i n ga i n f e r i o rp a r to f f i n ga ，- o c h 3f a c i l i t a t e t h ec o o r d i n a t i o na f f i n i t yo f i t sn e i g h b o r i n gg r o u p 3 r e t e n t i o nb e h a v i o ro fi s o f l a v o n o i di nr a d & p u e r a r i a ew a sd i f f e r e n ti nv a r i o u sm o b i l ep h a s e o fh p l c r e v e r s e de l u t i o no r d e rw a so b s e r v e di nt e t r a h y d r o f u r a na n dm e t h a n o lm o d i f i e d m o b i l ep h a s e r e s o l u t i o nw a sd e c r e a s e da sp o l o r i t yo f t e t r a h y d r o f u r a nm o d i f i e dm o b i l ep h a s e i n c r e a s e i n g , w h i l er e s o l u t i o nw a sd e c r e a s e da sp o l o r i t yo fm e t h a n o lm o d i f i e dm o b i l ep h a s e d e c r e a s e i n g h y d r o g e nb o n d i n gp l a y e d as i g n i f i c i e n tr o l ei n t h i sp h e n o m e n o nb yt h e c o m p u t a t i o nr e s u l t s m o b i l ep h a s es h o u l dh ec h o o s i n gc a r e f u l l ya c c o r d i n gt ot h en a t u r eo f c o o r d i n a t i o na g e n t s 4 1 3 - c y c l o d e x t r i ne d j o s t e dc h r o m a t o g r a p h i cr e s o l u t i o no fp u e r a r i na n d3 - m e t h o x yp u e r a r i ni n c o o r d i n a t i o nc h r o m a t o g r a p h y w h e nt h em i x t u r eo ft e t r a h y d r o f u r a na n dw a t e rw a su s e da s m o b i l ep h a s e ，l o wc o n c e n t r a t i o no fp - - c y c l o d e x t r i ne l e v a t e dt h er e s o l u t i o no fp u e r a r i na n d 3 - m e t h o x yp u e r a r i n ，y e th i g hc o n c e n t r a t i o no f c y c l o d e x t r i nd e p r e s s e dt h er e s o l u t i o n 5 e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o nf o ri s o f l a v o n o i di nr a d xp u e r t 口 a eo fc o o r d i n a t i o nc h r o m a t o g r a p h y w a so p t i m i z e dt o s a t i f yt h er e s o l u t i o n , a n a l y s i st i m ea n dt a i l i n g f a c t o r ss i m u l t a n e o u s b o x - b e h n k e nm e t h o dw a su s e dt od e s i g no fe x p e r i m e n tf o rs i m u l a t i o nt h ec h r o m a t o g r a p h i c r e s p o n s e ，b a c k - p r o p a g a t i o na r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k sw a se m p l o y e dt om o d e li s o c r a t i ch p l c s e p a r a t i o no fp u e r a r i na n d3 - m e t h o x y p o e r a r i n ，m u r id e c i s i o nm u l t i c r i t e r i ao p t i m i s a t i o no f s e p a r a t i o no f p u e r a r i na n dy - m e t h o x y p u e r a r i nw a so b t a i n e db yd i f f e r e n t i a le v o l u t i o n , ag l o b a l o p t i m i z a t i o n m e t h o d t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o nf o r s e p a r a t i o n w a sc o n c e n t r a t i o n so f 1 3 - c y c l o d e x t r i n , t r i e t h y l a m i n ea n d a c e t i ca c i dw a s3 7m m o l l - 1 、o 0 2 a n d0 8 r e s p e c t i v e l y , w h i c hw a st e s t i f i e db ye x p e r i m e n t a lt e s tt oq u a l i f yt h er e s e a r c ho b j e c t i v e k e y w o r d ：f l a v o n o i d ，i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n , c o o r d i n a t i o nc h r o m a t o g r a p h y , s p e c t r o s c o p y , c h e m i c a lc a l c u l a t i o n 表格清单 表1 1 各种分子问作用力的结合能量表 表2 i 黄酮类化合物的 表2 2 黄酮类化合物中 表2 3 银杏黄酮及其配 表2 4 银杏黄酮配体与 表2 5 葛根黄酮及其配 表2 6 葛根黄酮配体与 表2 - 7 黄酮醇化合物的 表2 8 黄酮醇化合物的 表3 - 1 银杏黄酮配位色 表3 - 2 银杏黄酮配位色 4 表3 3 不同黄酮苷元与金属离子配合物分子量 表3 - 4 槲皮素、木犀草素、山柰酚和异鼠李素的工作曲线 表3 5 黄酮苷元配合物稳定常数比较 表3 6 槲皮素廿环糊精配合物分子量解析 表3 7 木犀草素一b 环糊精配合物分子量解析 表3 - 8e s i m s m s 多级质谱对 f i + c d + n a l + 分析。 2 7 3 2 3 3 3 4 表3 9 不同黄酮苷元p 环糊精配合物的稳定性比较分析 表4 1 葛根黄酮色谱制备分离结果的比较 3 4 表4 2 葛根黄酮配位色谱的色谱柱选择币 流动相组成 表4 3 流动相有关溶剂性质参数的比较 表4 - 4 流动相有关溶剂性质相对参数的比较 表5 1 响应曲面法试验自变量因素编码及水平 3 5 3 9 4 0 4 7 表5 2 响应曲面法试验设计与结果 表5 3 分离度尼响应曲面回归模型方差分析。 表5 4 分离度足响应曲面回归方程系数显著性分析 表5 5 分离时间l 。回归方程系数显著性分析 5 0 5 l 表5 6 拖尾因子瓦，回归方程系数显著性分析 5 2 5 2 5 3 表5 - 7 拖尾因子7 0 回归方程系数显著性分析5 4 表5 8 响应曲面分析汇总表5 6 插图清单 图1 1 黄酮类化合物的基本结构图 图l ，2 配位色谱分离介质原理示意囤3 图1 3 配位色谱研究的技术路线7 图2 - l 槲皮素的a 环和c 环共平面，与b 环平面的夹角c ( 9 ) - c ( 1 0 ) - c ( 2 0 ) - c ( 2 1 ) 为3 6 。 图2 2 槲皮素z n 2 + 配合物的结构图 图2 3 黄酮醇类化合物一山奈酚及异鼠李素的计算结果 图2 4 异黄酮化合物3 l 甲氧基基葛根素和葛根素的计算结果 图2 5 流动相中有机溶剂的影响 图2 - 6 山奈酚b 环糊精配合物的分子模拟 。9 1 6 1 7 1 7 2 0 图3 1 三种黄酮配位色谱分离后的检测图谱。2 5 图3 2 槲皮素与n 1 2 十的配位比实验 图3 3 槲皮素- n i 2 + ( 2 ：1 ) 配合物对应的分子离子峰为6 6 1 5 。2 6 图3 4 槲皮素：z n 2 + ( 2 ：1 ) 配合物对应的分子离子峰为6 6 7 5 图3 5 异鼠李索- n ：+ ( 2 ：1 ) 配合物对应的分子离子峰为6 8 9 5 2 6 2 6 图3 6 异鼠李素z n 2 + ( 2 ：1 ) 配合物对应的分子离子峰为6 9 5 5 2 7 图3 7 黄酮类化合物的结构 图3 8 银杏黄酮中槲皮素、木犀草素、山柰酚和异鼠李素分离的色谱图。3 0 图3 - 9 槲皮素争环糊精包合物紫外光谱。 图3 一1 0 黄酮苷元- b 环糊精的溶解度相图 3 2 3 2 图3 一il 槲皮素廿环糊耩配合物质谱图3 3 图4 1 葛根素( a ) 和染料木素、大豆营元( b ) 的分子结构。3 6 图4 _ 2 葛根素配位前( a ) 和配位后( b ) 质谱比较。3 7 图4 3 染料木素配位前( a ) 和配位后( b ) 质谱比较 图4 4 葛根黄酮配位色谱分离所得样品的色谱图3 8 图4 5 两种异黄酮苷即葛根素、3 甲氧基葛根素的分子结构。4 l 图4 - 6 反相高效液相色谱法用于葛根黄酮提取物的分离与主要活性成分的测定。4 l 图4 7h p l c 法检验文献报道对葛根素与3 l 甲氧基葛根素的分离4 l 图4 8 乙腈作为流动相改性剂的色谱图 图4 - 9 空白对比试验色谱图 图4 一1 0 葛根黄酮配位色谱试验色谱图4 3 图4 - i i3 ：甲氧基葛根索( 下) 和葛根素( 上) 的紫外光谱4 3 图4 1 2 葛根素的质谱图4 4 图4 1 33 - 甲氧基葛根素的质谱图 图4 1 4 冰醋酸对葛根黄酮配位色谱分离的影响 图4 1 5 葛根黄酮的保留值随溶质和溶剂极性变化的规律 4 5 4 6 图4 1 6 色谱溶质保留值( 保留时间和分离度) 随溶剂极性变化的规律4 7 图5 1 色谱分离中1 3 环糊精与三乙胺的交互作用5 4 图5 2 色谱分离中b - 环糊精与冰醋酸的交互作用 图5 3 色谱分离中三乙胺与冰醋酸的交互作用。 图5 - 4 拖尾因子z b 与各个分离参数响应关系 图5 5b p 人工神经网络模型模拟的试验结果 图5 6 优化条件下的葛根黄酮分离的液相色谱图 5 5 5 5 符号清单 反相液相色谱( r e v e r s e d - p h a s eh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 电喷雾质谱( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o ns p e c t r o m e t r y ) 紫外光谱 红外光谱( i n f r a r e ds p e c t r o m e u y ) 稳定常数( s t a b i l 时c o n t r a s t ) 质核比( m a s s t o c h a r g er a t i o ) 分子模拟( m o l e c u l a rm o d e l l i n g ) 量子力学( q u a n t u mm e c h a n i c s ) 环糊精( c y e l o d e x t r i n ) 三乙胺 冰醋酸 多重相关系数( t h e c o e f f i c i e n t o f m u l t i p l e d e t e r m i n a t i o n ) 响应曲面法( r e s p o n s es u r f a c em e t h o d ) 人工神经网络( a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k s ) 差分进化算法( d i f f e r e n t i a le v o l u t i o na l g o r i t h m ) 分离度( r e s o l u t i o n ) 最大分析时间( a n a l y t i c a lt i m e ) 拖尾因子( t a i l i n gf a c t o r ) 保留时同( r e t e n t i o nt i m e ) 偶极矩 氢键酸性 氢键碱性 分子体积 孔 腮 一 一 吖 服 疋毗 m 默 眦一 州 删 瞅 k l r 。 a b v 独创性声明 本人声明所节交的学位论文是本人在导师指导f 进行的研究j ：作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外。论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得 盒蟹! ：些厶堂 或其他教育机构的学位或证节而使用过的 材料。与我一同i ：作的同忠对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学1 f 7 _ 论文作者签名： 锷脚签字日期：6 ) 年口阴t 日 ，r一 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金g l ；l ：些厶堂有荚保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有芙鄢j 或机构送交论文的复印件和磁 ； 。允许论文被商阅和借阅。本人授权盒蟹工 业厶：兰町以将。学位论文的全部或部分内容编入有芙数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 l 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适川本授权1 5 ) 似论文作者签名防膨 签字日期：( 夕年d 6 尉一e t 学伊论文f r 荷毕业去向 作单位 通；“地址： 导师签名 网 i 一 签字日期：哆年c 6 月可一日 电话： 邮编： 致谢 在读博的这一段可贵的人生历程里，遇到了很多压力、困难和挑战，更得到 了许许多多的帮助，是大家的帮助使我得以顺利完成论文。 首先，对我的导师潘见教授致以深深的谢意。与潘老师相识于己卯年五月， 至今整整八年的光阴，我的每一点进步、每一份成果，无不包含着他的敦敦教诲 和殷殷期望。潘老师治学之严谨、学识之渊博、视野之雄阔，置身其旁，潜移默 化，将一个科研的1 3 夕b 汉领进了分离科学的殿堂，在学术上和生活上都使我受益 匪浅，更让我领悟了“学高为师、身正为范”的真谛。 感谢农产品生物化工教育部工程技术研究中心谢慧明老师、曾庆梅老师、王 国霞老师、张文成老师、袁传勋博士和陈彦博士。感谢他们为我的博士论文在思 路上出谋划策，在实验中挽袖襄助，在困扰时指点迷津。几位老师对待学术求真 求实，对待生活朴实无华，每当想起点滴，暖意沁浸全身。 感谢杨毅博士、夏潇潇博士在实验上给予的大力帮助。与甘昌胜老师、惠爱 玲老师、黄训端老师、王武老师、金日生博士、王海翔博士、何亚荟博士的探讨 总是使我获益良多。 最后要把我的谢意留给我的家人。父母无私的关爱与付出，为我的成长含辛 茹苦，一篇博士论文远非我报答养育之恩的终点，我将继续努力，以更大的成绩 回报父母，以及所有关心过我成长的亲人们。 徐涛 2 0 0 7 年4 月 第一章绪论 第一章绪论 1 1 课题来源 本文研究黄酮类活性成分的配位色谱分离技术，课题来源于国家自然科学基金重点项目： 天然产物活性成分高效精制与纯化新技术、新方法研究( 编号：2 0 1 3 6 0 2 0 ) 。本文是该项目研 究的一部分 1 2 选题背景及意义 中药是中华民族五千年来师法自然的结晶，是中国的国粹之一。中药或天然产物活性成 分含量低、复杂多样。而活性成分是天然产物药效的物质基础i l l 。天然产物活性成分的分离 纯化是中药现代化的关键技术1 2 中药现代化是我国中长期发展的战略重点之一。天然产物中所含化学成分复杂，其中活 性成分的分离一直是一项十分复杂的工作。传统的分离方法对含量低、结构和性质相似及不 能结晶的组分的分离提纯常常受到限制。长期以来，中药活性成分主要采用溶剂萃取等方法 得到，生产成本高、产品纯度低，很难满足国际贸易标准的要求。同时，为明确中药组分之 间的君，臣、佐、使作用，又必须对复方中各个组分分别进行分离纯化和生物学实验，再进 行不同的复配以证实各自的作用和药效1 3 1 因此，发展高分辨率、高处理量( 即高通量删) 和低成本的分离技术对中药现代化具有重要意义。 1 3 国内外研究现状 黄酮是天然产物中的一种典型化合物。黄酮类化合物1 1 1 主要是指基本母核为2 - 苯基色原 酮的化合物，泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物。 其基本骨架是由三个丙二酰辅酶a 和一个桂皮酰辅酶a 生物合成而生成的。 3 。 7 6 27 3 6 4 3 。 7 6 4 色原酮2 苯基色原酮 c 6 - c 3 - c 6 图1 1 黄酮类化合物的基本结构图 黄酮类化合物具有典型的生物活性和生理作用，特别是抗氧化，抗自由基及抗癌、防癌 的作用，药理活性多样。如槲皮素、葛根素具有活血化淤和明显的扩冠作用，用于临床治疗 冠心病；染料木素和大豆营元等异黄酮类具有雌激素样及缓解高血压引起的头痛的作用；山 2 合肥工业大学博士论文 奈酚和槲皮素有抗病毒及抗菌作用。 人类崇尚自然、回归自然的浪潮使黄酮类化合物的研究进入了一个崭新的阶段。截止 1 9 7 4 年，国内外已发表的黄酮类化合物共1 6 7 4 个p l ，到1 9 9 3 年，黄酮类化合物总数已达4 0 0 0 个阿。广泛存在于药物根茎叶及粮食、蔬菜和水果中【7 1 某些成分在植物体内的分布和不同 种属之问的差异还可作为特征指示剂。日常生活中黄酮类化合物的应用和来源较为广泛，在 药物、食物、饮料及染料中均有一定的含量 8 1 。 1 3 1 黄酮类化合物分离技术研究进展 黄酮类化合物的分离纯化方法很多，如溶剂萃取、薄层层析、p h 梯度萃取，铅盐沉淀等。 其中，色谱方法在天然产物分离中占有重要地位，包括硅胶色谱、聚酰胺色谱、大孔吸附树 艚色谱、凝胶色谱、高速逆流色谱、模拟移动床色谱、超临界流体色谱和分子印迹技术等。 1 3 1 i 溶剂萃取法 利用目标黄酮类化合物与其他黄酮类化合物或杂质极性的不同，选用不同的溶剂系统进 行萃取达到分离精制的目的。萃取分离的用途分为两种：( 1 ) 除去杂质。用石油醚萃取植物 叶子的酵提液，可除去叶绿素、胡萝h 素等脂溶性色素。在浓缩后的植物提取物水溶液中加 入多倍醇，沉淀除去多糖、蛋白质等水溶性杂质。黄酮苷类具有一定的极性和酸性，可溶于 水、易溶于碱性水，难溶于酸性水协同其酸碱性进行分离，可以将粗提物用碱性水提取， 再将碱水调节至酸性，黄酮苷类沉淀析出。达到黄酮类化合物同其他杂质的分离。( 2 ) 分离 苷与昔元、极性苷元与非极性苷元等。可以采用p h 协同的方法提高分离的效率，如p h 梯度 萃取法适用于酸性强弱不同的黄酮苷元的分离。根据黄酮苷元母核上酚羟基数目和位置的不 同，苷元的酸碱性强弱有微小的差异。将混合物溶于有机溶剂后，用p h 依次增高的碱性水 溶液依次萃取，达到依次分离的目的。 1 3 1 2 色谱分离法 硅胶柱色谱是分离黄酮类化合物的典型方法，适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇 及高度甲基化的黄酮和黄酮醇。加水去活化可分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及苷 类。 聚酰胺是黄酮类化合物常用的吸附剂。对不同目标产物的吸附强度取决于黄酮类化合物 中羟基的位置和数耳、溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。对于 相同的营元，洗脱的顺序一般是叁塘苷、双糖苷、单塘苷和苷元；母核上羟基的增加，洗脱 速度相应减慢：分子中芳香核、共轭双键多者吸附力强；不同类型黄酮类化合物，流出顺序 为异黄酮、二氢黄酮醇、黄酮，黄酮醇。 葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物分为两种情况：分离游离黄酮主要靠吸附作用，吸附程度 取决于游离酚羟基的数目的多少；分离黄酮苷时，分子筛性质起主导作用，苷的洗脱顺序按 照分子量由大到小的顺序流出柱体。 高速逆流色谱 9 1 利用了一种特殊的流体动力学( 单向流体动力学平衡) 现象，使两个互不相 溶的溶剂相在高速旋转的螺旋管中单向分布。其中一种溶剂作为固定相，载着样品的流动相 穿过固定相，利用样品在两相中分配系数的不同实现分离。对于黄酮常用的溶剂系统有水 第一章绪论 乙酸乙酯和正丁醇一石油醚等 1 3 1 3 借助分子中某些特定官能团的分离法 对黄酮类成分的混合物，根据具有邻二酚羟基的成分被醋酸铅沉淀、不具有邻二酚羟基 的成分被碱式醋酸铅沉淀的特点，将两类成分分离与黄酮类成分混存的杂质的分子中如有 羧基或邻二酚羟基时，也可被醋酸铅沉淀达到去除杂质的目的。 1 3 2 黄酮类化合物分离中存在的问题 现有黄酮类化合物制备分离中存在的缺点：步骤繁琐，操作过程难以定量，自动化程度 低，得率低，处理周期长，对环境污染大。一般方法的建立是根据经验和文献，依靠试验研 究判定现有方法是否适用于新化合物的分离工作不适应中药多品种小批量的生产。 黄酮类化合物的分析分离中存在的问题l l o 】i ：黄酮类化合物含量较低( 约占植物体重量o 1 左右) ，结构复杂多样；一些物质结构不稳定，对环境敏感等。黄酮类化合物同其他物质混 为一体难以分离；黄酮类同系物即类似物多且结构差异小。本文拟构建配位色谱方法，用于 黄酮类化合物的分析与分离 1 3 3 配位色谱简介 1 3 3 1 配位色谱特点 配位色谱【1 0 1 的构建原理如下：利用现有的色谱填料( 如氧化锆，氧化铝、r p - c 4 、r p - c 。 等) 作为基质，引入耦合剂，耦合剂与基体配位结合形成耦联臂( 功能同键合相色谱填料的 空间臂。此处之所以不称空间臂，是为了区别于空间臂的共价键合。) ，耦联臂再与配位剂耦 联。基质、耦联臂和配位剂的有序组合制备成配位色谱分离介质。 其结构原理示意如下： o s i o t | 基体耘联臂e eolo 配住剂目标拍 图1 2 配位色谱分离介质原理示意图 配位色谱的特点：配位色谱是依配位化学反应的高度选择、可逆结合特点和色谱分离的 高效性，根据天然产物有效成分具有亲和、配位、立体选择特性丽设计的一种分离方法，是 吸附、分配、亲和、配位、空间位阻、色谱等分离功能的集成该技术除具有一般色谱技术 的特点外，还具有分离条件温和、选择性高、不损伤天然产物有效成分的活性、分离效率高、 柱容量大、活性中心多等特点。 配位色谱的关键在于如何实现其选择性。黄酮类化合物的结构特点是其色谱分离的基础， 黄酮类化合物的结构差异通过配位剂的结合得以在色谱分离过程中放大，色谱分离过程受各 种非键相互作用的协同作用。 1 3 3 2 非键相互作用 配位作用是指配位剂和目标产物之问通过配位键形成配位化合物，它既包括金属离子与 有机配体之间的相互作用，也包括各种弱的相互作用l l “，如静电作用，x - z 相互作用、氢键、 4 合肥工业大学博士论文 疏水和范德华力等 表l i 各种分子间作用力的结合能量表 作用力类型作用力大小( 单位：k c a l m o l 。1 ) 离子离子相互作用 偶极离子相互作用 偶极偶极相互作用 阳离子呱 觚( 嚣堆积作用) 氢键 疏承或僧水效应 范德华力 静电作用包括离子一离子，偶极一离予以及偶极- 偶极相互作用、阳离子m 和冗堆积作用等。 1 3 3 2 1 范德华力 范德华力是分子偶极之间的作用力。分子之间的偶极分为永久偶极、诱导偶极和瞬间偶 极等。上述几种偶极之间的相互作用将范德华力分为取向力、色散力和诱导力 n , s p c 。与原子的电负性合原子大小有关 2 常见取代基基团的配位能力( 提供电子的能力) - o h - o c h s - c h 3 3 母核的配位能力受取代基影响：氨基或烷氧基等作为电子释放取代基，提供靠- 电子给芳 香环，提高其电子密度；硝基等吸电子取代基从芳香环处接受m 电子，降低其电子密度。 4 取代基基团的位置即黄酮类化合物母核对取代基配位能力的影响，如黄酮类化合物a 环 和c 环形成共轭体系，取代基的电负性大于黄烷醇类的对应取代基。 5 基团的组合黄酮类化合物中的基团通常与其邻近的基团协同作用，c 环4 位羰基与其邻 位的羟基的配位能力强于邻二羟基。 6 黄酮类化合物的分子整体效应，包括：螯合效应或大环效应、配体的酸性及空间位阻等。 黄酮类化合物可以形成螯合或大环结构的，其稳定性增加，比较稳定的环结构一般为五 元环或六元环空间位阻导致体积较小的形成体可以形成稳定的配位结合 配位结合的同时不发生氧化还原反应。结合强度要求适中，结合强度太强难以拆分，后 续处理难度较大或增加额外的步骤；太弱对分离效果的影响作用不显著。如果配位作用在色 谱分离中很弱，可以通过多种相互作用的加合来提高选择性。 2 1 5 配位作用的时效 配位作用的反应动力学，即配位结合的快慢影响配位色谱的分离效率。与有机化学中的 过渡态理论1 2 0 l 类似，从反应物到活性过渡态需要的活化能的多少，决定着反应速度的快慢。 金属离子作为配位色谱的配位剂，对于该配位剂的取代反应机理主要分为3 种：即离解 机理、交替机理和缔合机理。原来的键断裂是决定反应速率的步骤，称为离解机理或单分子 取代反应。新键的生成是决定反应速率的步骤，称为缔合机理或双分子取代反应大多数反 应中键的断裂和生成是同时发生的，即配体取代的交替机理。 影响取代反应速度的因素包括( 1 ) 组分的大小和电荷：从静电的观点来考虑，中心原子 种类、进入配体和离去配体的电荷、大小对取代反应的速度起着重要作用( 2 ) 配位结合的 时效受中心离子及配体的半径、电荷的影响。黄酮类成分的配合物以八面体构型居多，具有 代表意义。配体的选择性结合即色谱流动相中配位水被黄酮类化合物取代反应。配位水的取 代速度与取代水的配体的性质关系不大，与溶液中处于外配位层中的水分子与内配位层的水 分子的交换速度一致。不同金属离子的配合物的稳定性大不相同，但是配体取代的速率有着 相似的数量级，表明金属离子和水分子凭借静电引力而联系着，m - o h 2 的键强度是随着电荷 增加和体积减少增加。取代反应速度决定于m - o h 2 键的断裂，而后发生配体取代。根据速率 常数的不同分为如下四类：1 ) 速率常数1 0 8s e c 1 。包括碱土金属和碱金属和c u 2 + 和c p ；2 ) 1 0 5 1 0 。s e 4 。 1 ，m 9 2 + 和镧系离子等；3 )i - 1 0 4 s e c ，大多数三价过渡金属离子和b 矿+ 、a l ”和 v 2 + ：4 )l o - 1 1 0 母耐1 ，c ，+ ，c o 、r h 3 + ，扩等。 大环化合物的性质与上述性质类似。 合肥工业大学博士论文 2 2 配位剂的选择 通过上述黄酮类化合物的结构分析，根据从头算的理论化学计算分析配位剂与黄酮类物 质的相互作用。分析色谱分离中配位剂在目标化合物分子上的可能的配位点，分子内部各个 配位点的结合力差距，不同分子间的配位结合力差异，即综合分析配位剂对黄酮类化合物的 配位结合选择性。对优选出来的配位剂进行色谱分离试验研究，实现配位色谱的高效分析和 分离。 在黄酮类化合物分离的计算、色谱以及光谱分析中，配位剂的选择是提高配位色谱分离 效率的关键因素。同目标化合物的分析类似需要从不同角度即配位剂的结合位点、空间形 貌、分子大小等以及配位结合前后的有关性质变化等，分析配位荆在配位色谱中的作用。 基于上述因素具体分析，将配位剂的选择分为金属离子和大环化合物两个方面进行讨论。 2 2 1 黄酮类化合物与过渡金属离子配位结合分析 自1 8 9 3 年w e m e r 发表的第一篇有关配位学说的论文1 2 l j ，金属离子的配位一直处于配位 化学研究的中心位置。黄酮类化合物与过渡金属离子配位结合之后，性质发生了改变，导致 其色谱保留行为的改变。 通常金属离子接受配体提供的电子形成配位化合物，金属离子的d 电子进入配体e 成键 轨道，从而使得金属离子中的d 电子通过键轨道移向配体。金属离子为电子给予体，配 体为电子接受体，这种金属离子和配体间的相互作用称为反馈作用，形成反馈键。 对于同一主族元素，过渡金属原子中心原子的d 电子数目依次增加。对应中心原子的性 质变化规律：电荷增高，半径减小，电离势增高，生成的配合物越稳定。第一过渡系的金属 离子与某些含氧含氮等配体生成配合物的稳定性有如下i r v i n g - w i l l i a m 顺序i 捌： m n 2 + m 2 + 0 2 + z n 2 + p e a r s o n 对配位作用的解释即软硬酸碱原