（环境科学专业论文）抗铅联合苯酚降解多功能菌的构建.pdf

摘要 l i i ii i ii i i iiii i i ii ii il y 17 3 5 0 3 2 本文对高效降酚菌和抗铅菌做质粒消除实验，并提取相关质粒转化到大肠杆菌 d h 5q 中，初步定位相关功能基因的位置。 通过质粒转移方法构建抗重金属铅联合苯酚降解的环境多功能菌。测试转化子在 含铅环境下的降酚效果，同时提取抗铅降酚转化子中的质粒电泳进行分子验证。 研究了不同环境条件对转化子的生长状况的影响，及不同环境条件下转化子对苯 酚的降解效果及质粒遗传稳定性。 取得研究结果如下： 1 通过质粒消除实验，高效降酚菌株降酚能力显著降低，抗铅菌株仍然保持原有抗 铅性状。提取高效降酚菌株中质粒转化到大肠杆菌d h 5q 中，转化后大肠杆菌d h 5 q 获得了降酚性能。 2 提取高效降酚菌质粒，转化到抗铅菌感受态细胞，筛选出有效的转化菌株，测试 抗铅降酚转化子在含高浓度铅时的降酚能力，转化子在l o o m g l 铅浓度下，对 5 0 0 m g l 苯酚降解率在第8 9 h 达到9 7 4 ，确认用质粒转移方法能够成功构建既能抗 重金属铅又能有效降解苯酚的多功能菌。 3 通过接入一定量的抗铅降酚转化子富集液到以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中， 隔一定时间测其苯酚降解率，观察不同条件下抗铅降酚转化子的降解活性。在铅浓度 5 0 - - - ，3 0 0 m g l ，转化子都能快速有效降解底物中的苯酚。不同苯酚初始浓度下，苯酚 被转化子完全降解所需时间差异较大，随着酚浓度增大，其所需时间越长，完全降解 所需时间差异主要表现在延滞期所需时间不同。温度对转化子降解苯酚影响表现为， 在2 0 - 2 5 ，随着温度升高，完全降解所需降解时间越短，2 5 、一3 0 随着温度升高 降解时间越长，当温度升至3 5 * ( 2 时，转化子无法有效降解培养液中的苯酚。在p h 值 5 7 时，转化子完全降解苯酚所需时间相差不大，但是当p h 值升高后，苯酚降解受 抑制。向培养基添加葡萄糖时，发现低浓度的葡萄糖能促进转化子对苯酚的降解，高 浓度抑制其对苯酚降解。 4 通过测试抗铅降酚转化子在o d 6 0 0 的吸光度值观察抗铅降酚菌在不同环境中的生 长量，转化子在p h 值5 9 ，温度2 5 , , 4 0 c 范围内生长良好；对苯酚耐受能力较强， 能在5 0 0 m g l 苯酚浓度仍然保持较高的生长量；当转速达到l o o r m i n 后生长旺盛。 5 在不同环境条件下富集培养后的抗铅降酚转化子分别稀释涂布到含酚选择板和无 酚非选择板上培养后，计算选择板与非选择板上菌落数的比值，来衡量环境条件对抗 铅降酚转化子质粒遗传表达稳定性的影响。温度对其稳定性影响较大，达到4 0 高 温转化子质粒容易丢失。酚胁迫下，在苯酚浓度从5 0 - - - 5 0 0 m g l 范围内，随着苯酚 浓度升高，转化子稳定性逐渐提高。适当的振荡培养转速下转化子的稳定性较高，过 低或过高的转速都会降低转化子中质粒的稳定性。p h 值在5 - 9 范围时对质粒稳定性 的影响相对较小，影响不大。 关键词：苯酚，铅，质粒，转化，稳定性 i i a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , d i dp l a s m i de l i m i n a t i o ne x p e r i m e n t so ne f f i c i e n tp h e n o l _ d e g r a d i n g b a c t e r i aa n da n t i 1 e a db a c t e r i a , e x t r a c t e dt h er e l e v a n tp l a s m i da n dt r a n s f o r m e di ti n t oe c o l id h 5 a ，p r e l i m i n a r i l yl o c a tt h er e l e v a n tf u n c t i o n a lg e n e s t h r o u g ht r a n s f e r i n gp l a s m i dt oc o n s t r u c tm u l t i f u n c t i o n se n v i r o n m e n t b a c t e r i aw h i c h c a l lb e a n t i p ba n dd e g r a d a t ep h e n 0 1 t e s tt h et r a n s f o r m a n t s e f f e c t i o no fp h e n o l d e g r a d a t i o ni nt h el e a de n v i r o n m e n t , w h i l ee x t r a c t i o nt h ep l a s m i do ft r a n s f o r m a n t sa n d h a v eal e c t r o p h o r e s i sm o l e c u l a rv a l i d a t i o n s m d i e dt h ee f f e c t so fd i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lf a c t o r so nt h et r a n s f o r m a n t sg r o w t h ，a n d t h e s t a b i l i t y o ft h et r a n s f o r m a t i o nu n d e r d i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h e t r a n s f o t r u a n t sd e g r a d a t i o nc u r v eu n d e rd i f f e r e n tc i r c u m s t a n c e s t h er e s u l t so b t a i n e da r ea sf o l l o w s ： lb yp l a s m i de l i m i n a t i o ne x p e r i m e n t s ，p h e n o l - d e g r a d i n g s t r a i n s c a p a b i l i t y o f p h e n 0 1 d e g r a d i n gs i g n i f i c a n t l yr e d u c e s ，s t r a i no f r e s i s t a n c e l e a dr e m a i n st h eo r i g i n a l a n t i 1 e a dc h a r a c t e r s e x t r a c t e dp l a s m i df r o mt h ep h e n o l - d e g r a d i n gs t r a i n st h e nt r a n s f o r m e d i ti n t oe c o l id h 5 a 。a f t e rt r a n s f o r m e n t ，e c o l id h 5 ao b t a i n e dt h ep h e n o l - d e g r a d i n g p e r f o r m a n c e 2 ，e x t r a c t e dt h ep l a s m i df r o mp h e n o l d e g r a d i n gb a c t e r i at h e nt r a n s f o r m e di n t oc o m p e t e n t c e l l so fa n t i 1 e a db a c t e r i a , s c r e e n e do u tt h ee f f e c t i v et r a n s f o r m a n t ，t e s tt r a n s f o r m a n t s c a p a c i t y o fp h e n 0 1 d e g r a d i n gw h e nc o n t a i n i n gh i g h c o n c e n t r a t i o n so fl e a d ，t h e t r a n s f o r m a n t s ，p h e n o ld e g r a d a t i o nr a t er e a c h e d9 7 4 o n5 0 0 m g lo fp h e n o li nt h ef i r s t 8 9 hw h e nt h ec o n c e n t r a t i o n so fl e a di s 10 0 m g | l t h a tc o n f i r m e dt h a tp l a s m i d t r a n s f o r m t i o nm e t h o dc a nb es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dm u l t i f u n c t i o n a lb a c t e r i aw i t hb o t h a n t i l e a da n de f f e c t i v e l yd e g r a d e dp h e n 0 1 3 ，t h r o u g hi n o c u l a t i n gac e r t a i na m o u n to ft h et r a n s f o r m a n t s e n r i c h e dl i q u i di n t o t h e i n o r g a n i cs a l tm e d i u mw i t hp h e n o la st h es o l ec a r b o ns o u r c e ，t e s tt h ec o n c e n t r a t i o no t p h e n o la f t e rc e r t a i np e r i o do ft i m e ，o b s e r v e dt h e r a t eo fp h e n o ld e g r a d a t i o nu n d e rd i f f e r e n t c o n d i t i o n s ，t h e nm e a s u r e dt h et r a n s f o r m a n t s d e g r a d a t i o n o fs u b a c t i v i t y i nt h el e a d c o n c e n t r a t i o no f5 0 。3 0 0 r a g | l 。t r a n s f o r m a n t sc a nq u i c k l ya n de f f e c t i v e l yd e g r a d et h e p h e n o lo f t h es u b s t r a t e i nd i f f e r e n ti n i t i a lp h e n o lc o n c e n t r a t i o n ，t h et i m er e q u i r e df o rc o m p l e t ed e g r a d a t e dp h e n o l b yt h et r a n s f o r m a n ti sq u i t ed i f f e r e n t ，w i t ht h ep h e n o lc o n c e n t r a t i o nw a si n c r e a s e d ，w h i c h i i i t a k e sl o n g e r d i f f r e n c eo fd e g r a d a t i o nt i m er e q u i r e df o ri sm a i n l yf o rt h et h ed i f f e r e n tl a g t l l et r a n s f o r m a t i o ni nt h e2 0 2 5 ，w i t ht h et e m p e r a t u r e ，c o m p l e t ed e g r a d a t i o nt i m e l e s sr e q u i r e df o r , 2 5 3 0 w i t ht h et e m p e r a t u r ed e g r a d a t i o nt i m et h el o n g e r , w h e nt h e t e m p e r a t u r er o s et o3 5 ，t h et r a n s f o r m a n tc a nn o te f f e c t i v e l yd e g r a d et h ep h e n o li n c u l t u r em e d i u m i nt h ep ho f5 7 ，t h ed i f f e r e n c ei nt i m er e q u i r e df o rc o m p l e t e d e g r a d a t i o no fp h e n o lb yt r a n s f o r m a ti sn o to b v e r s e l y , b u tw h e nt h ep hi si n c r e a s e d ，t h e p h e n o ld e g r a d a t i o nw a si n h i b i t e d w i t hp h e n o la st h es o l ec a r b o ns o u r c et ot h ei n o r g a n i c s a l tm e d i u mc o n t a i n i n gg l u c o s e ，w ef o u n dt h a tl o wc o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s ec a np r o m o t e t h et r a n s f o r m a t i o no ft h ec h i l df o rp h e n o ld e g r a d a t i o n ，h i g hc o n c e n t r a t i o ni n h i b i t e d 4 、 b yt e s t i n gl e a dr e s i s t a n c eo fp h e n o l - d e g r a d i n gt r a n s f o r m a n t s o d 6 0 0a b s o r b a n c ev a l u e s t oo b s e r v e dt h eg r o w t ho ft h et r a n s f o r m a n t si nd i f f e r e n te n v i r o n m e n t s t h et r a n s f o r m a n t s i nt h ep hv a l u eo f5 9 t h et e m p e r a t u r ew i t h i nt h er a n g eo f2 5 4 0 g r o ww e l l ；t h e t r a n s f o r m a n t s p h e n o lt o l e r a n c ei ss t r o n g , w a sa b l et om a i n t a i nah i 曲g r o w t hc a p a c i t yt o 5 0 0 m g lo fp h e n o l ；w h e nt h es p e e dr e a c h e du pt o10 0 r r a i nt h et r a n s f o r m a n t sg r o w v i g o r o u s l y 5 、c u l t u r e e dt h et r a n s f o r m a n t su n d e rd i f f e r e n te n r i c h m e n te n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h e nd i l u t e dt h e t r a n s f o r m a n t st oap h e n o l i cc o a t i n gs e l e c t i o nb o a r da n dn o n - p h e n o l i cn o n - s e l e c t i v ep l a t ec u l t u r e ， c a l c u l a t et h en u m b e ro fs t r a i no ns e l e c t i o nb o a r d sa n dn o n s e l e c t i v i t y , m e a s u r et h et h et r a n s f o r m a n t s s t a b i l i t yo fg e n e t i ce x p r e s s i o np l a s m i di nd i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n sb yt h er a t i oo ft h en u m b e r o fb o a r dc o l o n y , t ot e m p e r a t u r eh a dg r e a ti n f l u e n c eo ni t s s t a b i l i t y , r e a c h e d4 0 t e m p e r a t u r e st h ep l a s m i dt r a n s l a t e di n t oi se a s i e rl o s s u n d e rp h e n o ls t r e s s ，a st h ep h e n o l c o n c e n t r a t i o nf r o m5 0 5 0 0 m g | l ，t r a n s f o r m a n t js s t a b i l i t yi n c r e a s e dg r a d u a l l y o n a p p r o p r i a t es p e e d st h es t a b i l i t yo ft r a n s f o r m a n t si sh i g l l e r , t o ol o wo rt o oh i g has p e e d w o u l dr e d u c et h es t a b i l i t yo fp l a s m i di nt r a n s f o r m a n t s p hi nt h er a n g eo f5t o9p a i r so f p l a s m i do fs t a b i l i t yar e l a t i v e l ys m a l l ，l i t t l ei m p a c t k e yw o r d s ：p h e n o l ，l e a d ，p l a s m i d s ，t r a n s f o r m a t i o n ，s t a b i l i t y i v 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 文献综述1 一引言1 2 1 1 生物强化技术1 2 1 1 1 高效菌株培育1 2 1 1 2 高效菌株构建1 2 1 2 质粒转化构建多功能菌1 3 1 2 1 质粒分离1 4 1 2 2 感受态制备与质粒转化。1 4 1 2 3 转化子筛选与重组子的鉴定。1 5 1 3 质粒稳定性“15 1 3 1 质粒不稳定性类型及原因1 5 1 3 2 遗传因素对质粒稳定性的影响1 6 1 3 3 培养条件对质粒稳定性的影响1 6 1 4 论文研究意义及内容1 7 二材料及方法1 9 2 1 主要实验仪器1 9 2 2 实验药品及培养基1 9 2 3 菌种来源2 0 2 4 苯酚含量测试【8 8 】2 0 2 4 1 试剂配制2 0 2 4 2 实验步骤2 l 2 4 3 苯酚浓度计算2 2 2 4 4 酚去除率计算2 2 2 5 质粒提取及电泳2 2 2 5 1 试剂配制2 2 2 5 2 实验步骤2 3 2 6 感受态细胞制备及质粒转化【8 9 】2 4 2 7 质粒消除2 5 2 8 抗铅降酚转化子的筛选2 5 2 9 抗铅降酚转化子的环境适应性研究2 5 2 9 1 不同条件对抗铅降酚转化子生长量的影响。2 5 2 9 2 不同条件对抗铅降酚转化子稳定性影响2 6 v 2 9 3 不同条件下抗铅降酚转化子的降解特性。2 6 三结果及分析2 8 3 1 苯酚降解菌及抗铅菌的相关功能基因初步定位2 8 3 1 1 苯酚降解菌株及抗铅菌株特性2 8 3 1 2 降酚菌及抗铅菌的相关功能基因初步定位一2 8 3 2 抗铅联合苯酚降解多功能菌的构建2 9 3 2 1 抗铅降酚菌的构建2 9 3 2 2 抗铅降酚转化子抗铅降酚效果2 9 3 2 3 抗铅联合苯酚降解菌株的分子验证3 0 3 3 抗铅降酚转化子环境适应性研究3 0 3 3 1 不同条件下抗铅降酚转化菌酚降解效果。3 0 3 3 2 不同条件对抗铅降酚转化子生长量影响3 3 3 3 3 抗铅降酚转化菌稳定性实验3 5 四讨论3 8 五结论4 0 参考文献。4 1 致谢4 7 作者简介4 8 在读期间发表论文4 9 v i 文献综述 一苯酚废水的来源及其危害 苯酚是1 8 3 4 年德国化学家龙格( r u n g ef ) 在煤焦油中发现的，所以又称石炭酸 ( c a r b o l i ca c i d ) 。苯酚最开始主要从煤焦油中提炼获得，后来随着苯酚需求量的增加， 人们开始采用化学合成法生产苯酚。于1 9 2 3 年苯磺化法合成苯酚技术开发成功，经 过8 0 多年的发展，目前苯酚的生产方法主要有异丙苯法、甲苯。苯甲酸法以及苯直接 氧化法，其中异丙苯法生产能力约占世界苯酚总生产能力的9 2 啦】。 苯酚是一种重要的有机化工原料，在工业上的用途很广，主要用作合成酚醛树脂、 双酚a 、五氯酚、己内酰胺、烷基酚、己二酸、水杨酸等化工产品及中间体，在合成 纤维、合成橡胶、塑料、医药、农药、香料、染料、涂料和炼油工业中也有应用。近 年来，由于电子通讯、汽车工业和建筑行业的迅猛发展，导致双酚a 和酚醛树脂需 求快速增加，从而带动苯酚需求的强劲增长，2 0 0 7 年苯酚的全球消费达到8 5 8 万t ， 预计到2 0 1 0 年总需求量将达到9 5 9 6 万t 。2 0 0 6 年我国苯酚市场需求量达到7 8 o 万t ， 预计到2 0 1 0 年，我国对苯酚的需求量达到1 0 0 万t 【3 】。 ( 一) 含酚废水的污染分布及相关排放标准 环境中的酚污染主要指酚类化合物对水体的污染，含酚废水是当今世界上危害 大、污染范围广的工业废水之一，是环境中水污染的重要来源。在许多工业领域诸如 煤气、焦化、石油化工、炼油、林产化工、木材加工等，以及相关生产酚和用酚类化 合物作为原料的各种工业，如树脂、合成纤维、染料、塑料、农药、医药、消毒剂、 油漆等工业排出的废水中均含有酚。这些废水倘若不经过处理，直接排放、灌溉农田 则可能污染大气、水、土壤和食品【4 | 。 我国对各类水体中酚的浓度有明确规超s 】，如表1 1 ，表1 2 所示。 表l 地表水中挥发酚允许最高含量( 浓度单位：m g l ) t a b l e lt h em a ) 【i m u ma l l o w e dc o n t e n to fv o l a t i l ep h e n o l si ns u r f a c ew a t e r ( c o n c e n t r a t i o nu n i t ：m g l ) 地表水分类 l i i l v 堡茎墼鎏鏖l 至竺受出 2 ：塑；! ：塑：! ：塑i! ：21q ：! 表2 水体中酚的极限浓度规定( 浓度单位：m g l ) t a b l e 2t h el i m i t e dc o n c e n t r a t i o no fp h e n o li nw a t e rr e q u i r e m e n t s ( c o n c e n t r a t i o nu n i t ：r a g l ) 水类别饮用水卫生标准渔业用水农业灌溉水 景观娱乐用水水质标准( a 、b 、c ) 苯酚( m g l ) 5 0 0 0 k ) 的空化气 泡及强氧化性物质( 如o n ) ，使酚类等难降解有机物在此条件下完全氧化降解、无二 次污染睇制。 c h r i s t i a np e t e r i e r 等【2 5 】研究了氯代苯酚及苯酚降解过程，发现这些酚类化合物最 终都能被完全矿化为h c i 、h 2 0 、c o 和c 0 2 。与其他水处理技术相比，超辐射降解 法存在处理量少、费用高的问题，目前仍在探索阶段。 超临界水氧化法 超临界氧化法( s c w o ) 处理工业有机废水是由美国学者m i c h a e lm o d e l l t 2 6 2 7 2 8 1 在 上个世纪8 0 年代中期首先提出的。在国外，s c w o 技术受到了特别的重视，在国内， 这项研究尚处于起步研究阶段【2 9 1 。 超临界水氧化技术【3 0 , 3 1 1 是将水的温度和压力升高到临界点( t c ， 3 7 4 2 。c ，p c 2 2 1 m p a ) 以上，水会出现不同于气、液、固三态的第四态。在超临界条件下，水的性 质发生极大的变化，具有能很好溶解有机化合物和各种气体的特性，使气体、有机物 完全溶于废水中，气液相界面消失，形成均相氧化体系，大大提高了反应速率，许多 有机物在极短时间内就可完全分解，被氧化成c 0 2 、h 2 0 、n 2 及其他无害小分子。 对于催化s c w o 技术而言，催化剂的活性、稳定性等特征对氧化效果、降解条 件影响较大，对于苯酚的催化s c w o ，许多负载的或未负载的金属氧化物，如 m n 0 2 c e 0 2 和v 2 0 5 【3 2 1 ，多孔水泥负载的铜、锌氧化物3 3 1 ，负载于无定形a 1 2 0 3 上的 m n 0 2 c u o 3 4 等做催化剂时，对苯酚完全被氧化为h 2 0 和c 0 2 都表现出很高的活性。 f e n t o n 试剂法 早在1 8 9 4 年，法国科学家h j h f e n t o n 就发现h 2 0 2 在f e 2 + 催化下具有氧化多种 有机物的能力。但是直到1 9 6 4 年，h r e i s e nh o u s e r 才首次使用f e n t o n 试剂处理苯 酚及烷基苯废水，开创了f e n t o n 试剂在工业废水处理领域的应用先例。 得到普遍承认的f e n t o n 反应机理由h a r b e r w e i s s 于1 9 3 4 年提出，酸性条件下， 在f e 2 + 催化作用下，h 2 0 2 能产生活泼的羟基自由基，从而引发和传播自由基链反应， 加快有机物和还原性物质的氧化，把有机物最终氧化为c 0 2 和h 2 0 等无机物质【3 5 1 。 f e n t o n 试剂之所以具有非常高的氧化能力，是因为h 2 0 2 在f e 2 + 催化作用下，产生的 羟基自由基比其它氧化剂具有更强的氧化还原电极电位。 对于酚类有机物，低剂量的f e n t o n 试剂可使其发生偶合反应生成酚的聚合物； 大剂量的f e n t o n 试剂可使酚的聚合物进一步转化成c 0 2 。 赵欣等【6 2 】用h 2 0 2 f e e + 氧化法处理含酚废水，处理后的水样挥发酚清楚率达 1 0 0 。杨润昌等【3 6 】用f e n t o n 试剂加硫酸处理高浓度含酚废水酚去除率达9 8 。 ( 五) 含酚废水的生物处理方法 生化法是目前应用较普遍的含酚废水处理技术。生化法主要是利用微生物的新陈 代谢作用，降解水中的酚类化合物，将其转化为无机物以实现无害化的目的。 活性污泥法 由于许多微生物可利用苯酚作为生长的碳源，活性污泥法是常用的除酚方法。活 性污泥法作为传统的废水生物处理技术，在水污染治理中发挥了极其重要的作用，目 前己成为炼钢、焦化、煤气等诸多行业工业废水的主要治理方法。但是在焦化废水处 理中，由于焦化废水水质成分复杂，含有许多有毒物质，对微牛物的生长产生抑制作 用，使活性污泥中的某些微生物丧失活性，同时该法也存在运行管理要求高、对毒物 承受能力低、不适应冲击负荷、曝气池容积负荷低、污泥产生量大等不足之处，对组 成复杂、浓度较高的含酚废水处理效果不理想【l9 ，3 刀。近年来专家学者在常规活性污泥 基础上做了一些改进。改良工艺有投加活性炭，还有生物铁法，以及近年来开发的膜 分离活性污泥法，这些改进工艺的处理效果均优于常规活性污泥法。 生物流化床 2 0 世纪7 0 年代美国最早开始生物流化床处理污水的研究和应用，国内对生物流 化床的研究始于7 0 年代末。生物流化床是以砂、焦炭、活性炭等颗粒材料为载体， 载体粒径为1 0 2 0 m m ，在载体表面生长、附着生物膜，水流自下向上流动，使载 体处于流化状态。生物流化床既有生物膜法承受负荷变化冲击，又有完全混合式活性 6 污泥法的高效率的双重优点，具有良好的处理效果。 酶处理技术 自2 0 世纪8 0 年代起，就开始了将酶技术用于废水处理的研究。酶是一种高效专 一的生物催化剂，选用适宜的酶来催化降解含酚废水已有报道，如用酪氨酸酶【3 8 】可以 使苯酚得到1 0 0 的降解；用辣根过氧化物酶处理含酚3 3 0 m g l 的废水，酚去除率可 达9 7 - 9 9 。因为水溶性酶属一次性消耗，其处理成本较高。为降低成本、提高酶 活性，酶的固定化技术将是该领域的研究重点。 固定化细胞技术 从2 0 世纪6 0 年代后期国际上开始发展固定化细胞技术，它是通过化学或物理手 段将游离的微生物固定在载体上使其高度密集，并使其保持活性反复利用，有针对性 地处理含有难降解有毒的废水的方法。固定化细胞最初主要用于工业微牛物发酵生 产，直到2 0 世纪7 0 年代后期开始应用于废水处理。普通活性污泥法中微生物易流失、 细胞对毒物的承受能力低，朱柱等【3 9 】用红砖碎粒为载体固定脱酚菌，可将该菌种2 4 h 最大耐酚能力由游离细胞的不足1 8 0 m g l 提高到固定细胞的8 2 0 r a g l 左右，脱酚菌 经固定后，反应速率增大，降解酚的能力大大增强。k a i c h e e l o h t 4 0 1 等用p s e u d o m o n a s p u t i d a 美国型技术4 9 4 5 1 构造的固相细胞膜反应器处理酚，使其从悬浮状态下的 p s e u d o m o n a s p u t i d a 只能降解 1 0 0 0 m g l 的酚提高到可使浓度达2 0 0 0 - - 3 5 0 0 m g l 的 酚完全降解。 固定化细胞技术还处于研究阶段，要投人实际应用，还面临许多问题，如固定化 细胞的侵蚀，致使固定化载体被破坏，微生物析出，以及如何在提高固定化细胞稳定 性的同时，保持固定化细胞原有的降解活性等问题。 高效活性菌种的筛选与培育 为了提高生物法对有毒有害物质的处理效率，除了改进传统工艺以外，还需要加 强高降解活性菌种的选育工作。不少学者进行了高降解活性菌种的筛选及培育工作。 e d g e h i l l 、l e w a n d o n s k i 、林哲等分别进行的研究表明，引入高降解活性菌种能提高含 酚废水的降解率，但要解决的主要问题是如何使这些优良菌种长期地在生物处理系统 中占优势，并保持其高降解活性【2 9 1 。 三重金属铅的危害 ( 一) 重金属铅的来源及相关排放标准 铅被广泛的应用于国民经济的各个领域，采矿、冶炼、蓄电池、交通运输、塑料、 印刷、焊接、陶瓷、涂料、橡胶、农药、汽油添加剂生产等都使用铅及其化合物，全 世界每年铅消耗量约为4 0 0 万吨，这些铅约有1 4 被重新回收利用，其余大部分以各 种形式排放到环境中造成污染。 7 表3 地表水中铅允许最高含量( 浓度单位：m g l ) 【4 1 1 t a b l e 3t h ea l l o w e dm a x i m u ml e v e lo fl e a di ns u r f a c ew a t e r ( c o n c e n t r a t i o nu n i t ：m g l ) 地面水分类il ii i iv 铅m g l 一 i d n a ( 线 性d n a ) 。但经过合适的限制性内切酶处理后，所有结构的质粒d n a 都转为直线型 分子。 1 2 2 感受态制备与质粒转化 处于感受态( 即受体细胞最易接受外源d n a 片段而实现转化的一种特殊生理状态) 的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌普通生理状态的千倍以上，而且不同 细菌间的感受态差异往往受自身的遗传特性、菌龄、生理培养条件等诸多因素的影响。 d n a 片段中具有转化能力的常常是双链d n a 分子，单链d n a 分子很难甚至根本不能 转化到受体菌。 质粒转化的方法【7 6 】主要有c a 2 + 诱导转化，原生质体转化，电穿孔转化，结合转化， 入噬菌体转染。目前c a ：+ 诱导转化已成功用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其他的一些革 兰氏阴性菌的转化。p e g 介导的细菌原生质体转化不仅适用于链霉菌和芽孢杆菌等革 兰氏阳性细菌，对酵母菌、霉菌等真核细胞也有效。对于转化大于1 0 0 k b 的质粒，电 穿孔法可以转化这类较大质粒，且电穿孔法适用于几乎所有的细菌，但是c a 2 + 诱导转 化和p e g 介导的细菌原生质体转化几乎不可能做到。 细菌转化的全过程包括五个步骤感受态形成。感受态细胞能分泌一种小分子量 的激活蛋白或感受态因子，与细胞的表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性 蛋白质的合成，使细胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的d n a 结合蛋白和核酸酶 等。转化因子结合。受体细胞膜上的d n a 结合蛋白可与转化因子的双链d n a 结 构特异性结合，但是单链d n a 或r n a ，双链r n a 以及d n a r n a 杂合双链都不能 结合在膜上。转化因子吸收。双链d n a 分子与蛋白作用后，激活邻近的核酸酶， 1 4 其中一条链被降解，另一条链则被吸收到受体菌种。整合复合前体的形成。进入受 体细胞的单链d n a 与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体，它能有效 保护单链d n a 免受各种保内核酸酶的降解，并且将单链d n a 引导至受体菌染色体 d n a 处。转化因子单链d n a 的整合。供体单链d n a 片段通过同源重组，置换受 体染色体d n a 的同源区域，形成异源杂合双链d n a 。 细菌受体细胞转化一般有以下五种方法：c a + 诱导转化p e g 介导的细菌原生 质体转化结合转化电穿孔驱动的完整细胞转化入噬菌体的转染。 表1 1 大肠杆菌五种常用转化方法的最佳转化率比较 t a b l e l 1c o m p a r i s o no f t h eb e s tc o n v e r s i o nr a t eo f e c o l ii nf i v ec o m m o n l y u s e dt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d s 查鲨墨垡箜丝皇! 鲎垡三：! 兰业型垒 ! c a 2 + 诱导转化 1 0 7 1 0 8 原生质体转化 1 0 5 1 0 6 结合转化 1 0 4 1 0 5 电穿孔转化 1 0 6 1 0 9 ( l 时，即使培养物每代时间内质粒丢失率很低，无 质粒细胞也会很迅速地繁殖，从而使带有质粒的细胞所占细胞总数的百分比迅速下 降。对此可以通过分段培养法，在前期控制外源基因的过量表达，使重组质粒能得到 稳定地遗传，在后期通过提高质粒拷贝数或提高转录转译效率使外源基因高效表达。 1 3 3 培养条件对质粒稳定性的影响 重组菌的稳定性受遗传和环境两方面因素的控制。可以通过基因水平的控制来限 制反应器中无质粒细胞的繁殖，提高系统中含质粒细胞的比例外脚】。还可以通过在重 组菌培养过程中增加“选择压力 ，提高重组菌的稳定性。培养基组成成分，及组成 分的比例对质粒的稳定性影响也较大，j o n e s 和m e u i n g 研究连续培养中e c o l i 中几种 质粒的稳定性时，分别以葡萄糖、磷酸盐和无机盐作为限制性基质，发现以磷酸盐为 限制性基质时，除p b r 3 2 5 外的大部分质粒在很快丢失 8 4 】。周宇荀等也发现抗菌肽基 因a d e n o r e g u l i n ( a d r ) 培养基中适当加入葡萄糖，对质粒的稳定性及蛋白表达量有重 要作用【8 5 】。也有研究发现e c o l id h 5q ( p j m r l 7 5 0 ) 的质粒丢失几率随c n 比增加而增 1 6 大，含质粒p c p p s 一3 1 的e c o l id h 5q 的质粒稳定性随培养基复杂性降低而提高。 培养过程中的氧传递，温度以及p h 值对重组菌中质粒稳定性影响也很大。有的 质粒属温度敏感型质粒，如农杆菌质粒，当农杆菌培养温度超过