（化学工程专业论文）酪蛋白多级结构及聚集行为的多尺度研究.pdf

中文摘要 酪蛋白是乳品中含量最高的蛋白质，也是乳品科学研究的核心。为了获得酪 蛋白的多级结构信息及聚集行为特性，本文综合运用液质联用、圆二色、二阶紫 外、光散射等多种现代分析技术，对o 【。、p 酪蛋白、全酪蛋白胶束的各级结构进 行了多尺度系统研究，并对酪蛋白胃蛋白酶体系的酶解过程进行了全面解析， 主要工作如下： 酪蛋白单体分离及一级结构鉴定采用r p h p l c 、电泳、膜等分离方法， 实现了对各酪蛋白单体的有效分离：运用e s i m s 对酪蛋白各单体进行质谱鉴定， 确定了单体类型。 酪蛋白二级结构解析 通过远紫外c d 研究了不 h - j p h 及温度下0 【。、1 5 - c n 的 二级结构变化规律，结果表明：加热导致0 t 。及1 3 c n 螺旋含量逐渐增加，且总体 为热不可逆过程( p l q 8 0 ，1 3 - c n 例外) ，p h 8 0 时魄及d c n 具有更好的热稳定性； 温度、乙醇、酯化影响实验表明酪蛋白胶束具有稳定的二级结构。 酪蛋白三级结构表征近紫外c d 及二阶紫外对不 h - p h 及温度下o r , 。、1 3 - c n 三级结构的研究表明：随温度增加，各p h 下芳香族氨基酸侧链总体上更易于包 埋在疏水环境中，且该过程均不可逆，p h 8 0 时的三级结构均具有更好的稳定性； 近紫外c d 对酪蛋白胶束的研究表明其三级结构具有较好的热稳定性，在乙醇的 作用下芳香族氨基酸侧链被逐渐包埋，而酯化则导致部分芳香族氨基酸暴露于极 性环境中。 酪蛋白四级结构及聚集行为研究d l s 对o r , 。、1 3 - c n 的研究表明：加热导致 其聚集，且随着p h 增大，聚集能力减弱；s l s 对酪蛋白胶束的分析得到了其基本 构象参数；酪蛋白溶液的s e c l s 研究表明胶束与单体间存在一动态平衡；d l s 测定了温度、浓度、溶液p h 、磷酸盐离子强度、乙醇、阳离子浓度及酶解等因 素对酪蛋白胶束尺寸及光强的影响，得到了其聚集解聚行为规律。 酪蛋白的胃蛋白酶水解产物鉴定及历程解析利用h p l c e s i m s m s 技术 分析了酪蛋白的胃蛋白酶水解产物，鉴定了主要产物多肽的级序列及释放规 律。利用d l s 及s e c l s 得到了酪蛋白酶解过程中胶束尺寸和分子量的变化规 律，并得到了产物分子量分布，同时解析了水解产物中五类特定分子量片段的释 放动力学历程。 关键词：酪蛋白，胶柬，多级结构，酶解，高效液相色谱一串联质谱， 圆二色，光散射，聚集 a b s t i 认c t c a s e i ni st h em o s ta b u n d a n tp r o t e i ni nm i l k ，s oi ti st h ec o r eo fr e s e a r c hi nd a i r y s c i e n c e t oo b t a i nt h em u l t i l e v e ls t r u c t u r a li n f o r m a t i o na n da g g r e g a t i o nb e h a v i o ro f c a s e i n ，av a r i e t yo fm o d e ma n a l y t i ct e c h n i q u e s ，i n c l u d i n gh p l c e s i - m s m s ，c i r c u l a r d i c h r o i s m , s e c o n d - d e r i v a t i v eu va b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p ya n dl i g h ts c a t t e r i n gh a v eb e e n u s e dt os y s t e m i c a l l yi n v e s t i g a t et h em u l t i l e v e ls t r u c t u r e so fi x s - c a s e i n ，1 3 - c a s e i n ，c a s e i n m i c e l l e sa n di n t e g r a t e da n a l y z et h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i sp r o c e s so fc a s e i n 。p e p s i n s y s t e m t h em a i nc o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w i n g ： s e p a r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fc a s e i nm o n o m e r s ：t h ei n d i v i d u a l c a s e i n s w e r ee f f e c t i v e l y s e p a r a t e db yr p h p l c ，e l e c t r o p h o r e s i s a n dm e m b r a n e t h e i n d i v i d u a lc a s e i n sw e r ei d e n t i f i e db ye s i m s s t u d yo nt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fc a s e i n ：c h a n g e si ns e c o n d a r ys t r u c t u r eo f i x s a n d1 3 - c a s e i na td i f f e r e n tt e m p e r a t u r ea n dp hw e r ei n v e s t i g a t e db y f a ru vc i r c u l a r d i c l l r o i s m t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e0 【h e l i xo fb o t hi n d i v i d u a lc a s e i n si n c r e a s e d g r a d u a l l yu p o nh e a t i n ga n dt h ep r o c e s sw a si r r e v e r s i b l ea te x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s e x c e p th e a t i n go f1 3 - c a s e i na tp h 8 0 t h er e s u l ta l s os h o w e dt h a tb o t hc a s e i n sw e r e m o r et h e r m a ls t a b i l ea t p h 8 0 t h ei n f l u e n c e c o n d i t i o n si n c l u d i n gt e m p e r a t u r e ， e t h a n o lc o n c e n t r a t i o na n de s t e r i f i c a t i o no nc a s e i nm i c e l l e sa l s oi n d i c a t e dt h a tt h e y p o s s e s s e dm o r es t a b i l es e c o n d a r ys t r u c t u r e t e r t i a r ys t r u c t u r ea n a l y s i so fc a s e i n ：t h et e r t i a r y s t r u c t u r eo fi n d i v i d u a l c a s e i n sa tv a r i o u sp ha n dt e m p e r a t u r ew e r es t u d i e db yn e a ru vc i r c u l a rd i c h r o i s m a n ds e c o n dd e r i v a t i v eu va b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ea r o m a t i c a m i n oa c i ds i d ec h a i n so fc a s e i n sw e r ei n c l i n e dt oi n c o r p o r a t ei n t oam o r eb u r i e d , l e s s p o l a re n v i r o n m e n t a s e l e v a t i n gt h et e m p e r a t u r ea t d i f f e r e n tp h ，w h i c hs h o w e d i r r e v e r s i b i l i t ya f t e rc o o l i n g t e r t i a r ys t r u c t u r e so f b o t hc a s e i n sw e r ea l s oi i l o r es t a b i l ea t p h 8 0 t h en e a r - u vc di n v e s t i g a t i o no nc a s e i nm i c e l l e si n d i c a t e dt h a tt h et e r t i a r y s t r u c t u r eo fm i c e l l e sw a ss t a b i l ea f t e rh e a t i n g t h ea r o m a t i cs i d ec h a i n sw e r e i n c o r p o r a t e di n t oam o r eb u r i e d ，l e s sp o l a re n v i r o n m e n ta si n c r e a s i n gt h ee t h a n o l p r o p o r t i o n ，b u tw e r ee x p o s e d m o r ep o l a re n v i r o n m e n ta f t e re s t e r i f i c a t i o n t h eq u a t e r n a r ys t r u c t u r ea n da g g r e g a t i o nb e h a v i o ro fc a s e i n ：d y n a m i cl i g h t s c a t t e r i n g ( d l s ) a n a l y s i so nt h ea g g r e g a t i o nb e h a v i o ro fc t s - a n dp - c a s e i ni n d i c a t e d t h a tt h e a g g r e g a t i o ni n c r e a s e da se l e v a t i n gt h et e m p e r a t u r e t h ep r o c e s sw a s d e p e n d e n to np h ，w h i c hs h o w e di e s ss t a b i l ea tp h 8 。0 。t h ec o n f 0 1 1 1 1 a t i o np a r a m e t e r s o fc a s e i nr n i c e l l e sw e r eo b t a i n e db ys t a t i cl i g h ts c a t t e r i n g ( s l s ) s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dw i t ham u l t i - a n g l el a s e rl i g h ts c a t t e r i n g ( s e c m a l l s ) r e s u l ts h o w e dt h a tt h e r em i g h tb ead y n a m i cs y s t e mb e t w e e ni n d i v i d u a lc a s e i n sa n d c a s e i nm i c e l l e s t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e ，p r o t e i nc o n c e n t r a t i o n ，p h ，i o n i cs t r e n g t h ， e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ，c a t i o n s t r e n g t ha n de n z y m a t i ch y d r o l y s i so nt h ea v e r a g e h y d r o d y n a m i cr a d i u s 职h ) a n dl i g h ts c a t t e r i n gi n t e n s i t y 仉) o fc a s e i nm i c e l l e sw e r e a l s os t u d i e du s i n gd l s t h er e s u l td e s c r i b e dt h ea g g r e g a t i o nb e h a v i o ro fc a s e i n p r o d u c tc h a r a c t e r i z a t i o no fp e p s i ni n d u c e dh y d r o l y s i so fc a s e i n - t h e p r o d u c t o fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sw e r es e p a r a t e da n di d e n t i f i e db yh p l c e s i m s m s t h e s e q u e n c ea n dt h er e l e a s ec h a r a c t e r i s t i c so fe a c hp e p t i d ec o u l db eo b t a i n e d c h a n g e si n a v e r a g eh y d r o d y n a m i cr a d i u s ，m o l e c u l a rw e i g h ta n di t sd i s t r i b u t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d b yd l sa n ds e c m a l l s m o r e o v e r , t h ek i n e t i ca p p e a r a n c eo ff i v em o l e c u l a rw e i g h t f r a c t i o n sw a sa l s oa n a l y z e dd u r i n gp e p t i ch y d r o l y s i so fc a s e i n k e yw o r d s ：c a s e i n ；m i c e l l e s ；m u l t i l e v e ls t r u c t u r e ； c h r o m a t o g r a p h y t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ；c i r c u l a r a g g r e g a t i o n e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；l i q u i d d i c h r o i s m ；l i g h ts c a t t e r i n g ； 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 鸯宴a 式 签字日期：曰年 月季d 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤洼盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权盘鲞盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 鸯窍氓 签字r 期：订年f 月o 日 导师签名： 圈 _ - - _ h - 一 签字吼夕年岁月；d 日 前言 j - j - 月i j吾 酪蛋白是乳品蛋白中的主要成分，是由c 【s 1 酪蛋白、c t s 2 酪蛋白、b 酪蛋白、 k 酪蛋白等四种单体以聚体形式组成的胶束。它不仅是一种极具营养价值的蛋白 质( 含有人体全部必需氨基酸) ，可为新生儿输送绝大部分所需的矿物质元素( 钙和 磷) 用于他们的骨骼生长，而且还是十大类百余种活性多肽的有效肽源，功能涵 盖免疫调节、自由基清除、矿物质载体、抗癌、抑菌、溶栓、降压等。 由于结构复杂性及功能多样性，酪蛋白胶束及各单体酪蛋白均被作为模式蛋 白，成为科学家们研究的热点。酪蛋白之所以具有如此丰富的生物学功能，与其 独特的结构密切相关。因此，测定它们的各级结构是研究其生物学功能的基础。 然而，酪蛋白的结构并不是固定不变的，它受到众多外界因素的影响，包括：温 度、p h 、浓度、变性剂等等，而这些影响过程中又必不可少地涉及酪蛋白的聚 集和解聚，并造成其生理功能的改变。因而，酪蛋白的结构测定成为蛋白质化学 研究中的个难点和热点，至今p d b 库中尚无相关结构信息。此外，酪蛋白的 人体吸收必定涉及酶解反应，而该过程伴随着众多活性多肽的产生，因此解析酶 解过程中酪蛋白高级结构的变化及水解多肽的释放规律对酪蛋白单体及胶束的 结构研究具有重要指导意义，继而指导功能性多肽的高效制备，并成为乳品科学 研究的焦点问题。 液相色谱质谱串联质谱联用( h p l c e s i m s m s ) 是以h p l c 为分离手段， 以m s 为检测器的一种现代分析技术。它集l c 的高分离能力及m s 的高灵敏度 和极强的定性能力于一体，成为蛋白、多肽分析分离与一级结构鉴定方面的一种 有效工具。近年来，许多学者已经利用液质联用技术对全酪蛋白和酪蛋白单体的 水解终产物进行了分离和鉴定。 n - - 色技术( c d ) 是定量研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简便、且较准 确的方法，它包括远紫外c d 和近紫外c d 。其中，远紫外c d 测定的数据能分 析蛋白质二级结构；近紫外c d 在解析蛋白质三级结构中具有独特优点，它还能 作为一种灵敏的光谱探针，反映蛋白质中芳香族氨基酸残基和二硫键的微环境变 化。圆二色技术曾被用来研究各酪蛋白单体的二级结构，但在单体三级结构及胶 束结构的研究中鲜有报道。 激光光散射技术( l s ) 分为静态光散射( s l s ) 及动态光散射( d l s ) ，静态光散射 可测定蛋白质链的构象参数；动态光散射能得到高分子的尺寸分布以及平移扩散 系数，两者结合是研究蛋白质四级结构变化及聚集、解聚行为的有力工具。此外， 前言 体积排阻色谱与光散射联用( s e c l s ) 作为一种测定绝对分子量的方法，可用于研 究蛋白质的分子量分布及链构象转变，曾被应用于乳蛋白聚集及解聚过程的研 究。 基于上述背景，本文将以酪蛋白单体( 魄、p - c n ) 及胶束为研究对象，对它 们在不同物化条件下的多级结构和聚集行为进行深入系统研究。第二章涉及单体 酪蛋白的分离及一级结构鉴定：分别利用r p h p l c 、电泳、膜对酪蛋白进行分 离，并结合各单体酪蛋白的性质，应用h p l c e s i m s 对其一级结构进行分析， 为研究高级结构做准备；第三章分析了酪蛋白二级结构及其构象变化：利用远紫 # b c d 深入研究了0 【。、p 一酪蛋白在不同温度、p h 下的二级结构变化，初步研究了 温度、变性剂( 乙醇) 、酯化等对酪蛋白胶束二级结构的影响；第四章考察了酪蛋 白三级结构变化规律：首先利用近紫外c d 及二阶u v 光谱研究0 l 。、d 酪蛋白的芳 香族氨基酸侧链在不同温度、p h 下所处微环境的变化，从而得到其三级结构变 化特性，后初步研究了酪蛋白胶束在各条件下的三级结构变化特点。第五章解析 了酪蛋白的四级结构变化规律及聚集行为，利用s l s 得到酪蛋白胶束的构象参 数，同时利用s e c l s 考察胶束的分子量分布规律，并利用d l s 研究魄、d 酪蛋 白单体在不同温度、p h 下的水力学半径变化特点及其聚集行为，以及酪蛋白胶 束在各种条件下( 温度、浓度、离子强度、p h 、变性剂、阳离子强度) 的聚集解 聚行为。以上三章为酪蛋白的高级结构研究提供了大量基础数据。第六章将着重 研究酪蛋白的胃蛋白酶水解行为，利用色谱分离和质谱鉴定并结合数据库搜索， 鉴定酪蛋白经胃蛋白酶水解后的产物组成及其释放规律，并利用d l s 和s e c l s 联合分析酪蛋白的酶解历程及酶解过程中底物的结构变化与产物的分子量分布， 为酪蛋白的多尺度研究提供结构信息。 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 酪蛋白研究现状简述 牛乳蛋白包括酪蛋白、球蛋白、乳清蛋白和多种蛋白酶，其中酪蛋白含量最 多，占到了牛乳蛋白的8 0 。它主要包括0 【s 1 酪蛋白( 0 【s 1 一c n ) 、0 【s 2 一酪蛋白( 2 一c y ) 、 p 一酪蛋白( p c n ) 、佟酪蛋白( k c n ) 等四种单体，在溶液中，酪蛋白并非以单体形 式存在，而是以多个单体聚集而成的胶束形式存在。酪蛋白具有极高的营养价值， 是生物大分子领域研究中的模式与热点物质。 1 1 1 酪蛋白的氨基酸组成特点 目前酪蛋白的氨基酸序列已被准确测定。在氨基酸组成上，酪蛋白具有很多 特点【1 】： ( 1 ) 极性和非极性氨基酸分布不均匀，以极性簇和非极性簇分布，因此 具有明显的亲水区和疏水区，使得酪蛋白具有良好的乳化性能；( 2 ) 在四种酪蛋 白序列中，非极性氨基酸含量较高，脯氨酸的含量较高，使得酪蛋白伐螺旋及p 折叠较少，容易被蛋白酶水解；( 3 ) 酪蛋白，特别是啦c n 中富含赖氨酸，加热 时与还原糖发生较为强烈的非酶美拉德褐变反应；( 4 ) 酪蛋白中相对缺少含硫氨 基酸，故其生物价较低。 酪蛋白中含有较多的磷酸化基团，这些磷酸化基团主要以共价键形式与酪蛋 白结合。在酪蛋白序列中，多为丝氨酸与磷酸分子发生酯化。由于丝氨酸在酪蛋 白序列中的特殊分布，使得大部分磷酸化基团以簇的形式存在【2 】。酪蛋白的磷酸 化丝氨酸簇可以与钙离子强烈结合，这是酪蛋白在生理和营养功能方面最重要的 特点。 1 1 2 酪蛋白的结构及模型研究进展 根据结构中心法则，蛋白质的空间结构决定其生物学功能。为了充分发挥酪 蛋白作为乳品蛋白对人类健康的贡献以及作为模式大分子的理论指导作用，科学 家纷纷对酪蛋白进行研究，并成为一个热点；同时，由于酪蛋白特殊的胶束结构 又使得其研究成为一个难点。但近年来，对酪蛋白各种单体及胶束结构的研究均 取得了较大的进展。 第一章文献镕e 112i 酪蛋白单体结构的研究进展 酪蛋白单体结构是研究胶束结构及聚集行为的基础，四种单体纷纷成为研究 的热点，在i - c n 的研究中，m a l i 口1 发现：室温下1 - c n 仅含有少量d 螺旋。 c r e 锄廿p 1 以及c u d 培分别通过傅立叶变换红外光谱和拉曼光谱首先研究了 1 c n 的高级结构。此外，k u m o s i n s k 等“ 贝0 通过分子模拟得到了l d 的三维 结构，见图i 1 左。1 c n 存在较强自聚能力，能形成二聚体、三聚体、六聚体 等，影响其自聚的囡素也很多，如离子强度、p h 值等。在低离子强度( 0 0 0 3 0o l m o l p l ) ，碱性条件下i c n 为单体们。随着离子强度增加，自聚作用增强； d h 值对它的影响则正好相反，其增加导致自聚作用减弱：温度对它的自聚影响 相对较小。 图1 - 1t h o m a sfk u m o s i n s k l 模拟分子三维结构左( 啦! - c n ) ，中( 删，右( k c n ) f i g i - i 仙眦_ 凼啪m m m o l e c u l a r m o d e l i n go f l a s e 虹郾a s e i na n d k - c “e i nb y t h o m r k o m o b i n s k i 在b c n 的研究中，n o e l k 8 j 早在1 9 6 8 年就曾预测其在水溶液中主要以无规 卷曲形式存在，仅含有极少量的规则结构，但这与现今的一些研究结果想背离。 f a r r e l l 9 1 的研究指出：在室温下，b c n 含有大约8 0 的规则结构，与很多学者的 研究结果相符。k u m o s i n s k 等【嘲利用分子模拟并结合p c n 的二级结构进一步得 到了它的三维结构图，见图1 - 1 中。b 吲的自聚是两性分子自聚的典型。其胶体 形成驱动力是c 端琉水相互作用。它的自聚主要依赖于离子强度、温度及蛋白浓 度，s c h m i d t r ”1 以及k c e d c s 等”】的研究表明：离子强度在p - c n 的自聚中影响很大， 随着离子强度的增加，b _ c n 的聚合作用增强，在经历一个吸热自聚过程后达到 一个最大的分子尺寸：温度对它的影响与离子强度类似，在低温低离子强度时， b _ c n 仅以单体形式存在，随着温度逐渐增加，自聚能力加强；浓度的影响与它 们不同存在一个节点浓度”，当b - c n 的浓度大于该浓度后，自聚作用才会逐 渐增强并达到最大：d h 对俐自聚的影响则尚未完全确定。 c n 中a 螺旋含量明显多于其它酪蛋白，经过序列预测，c t 螺旋和b 折叠主 要集中在c 端，n 端则易形成亲水无规卷瞌结构。e 电- c n 的自震”与1 - c n 类似， 第一章文献综述 主要取决于离子强度，随着离子强度增加，聚合度增大，聚合能力增强，但当离 子强度大于0 2 m o l l 时，聚合反而减弱。 k c n 在维持酪蛋白胶束结构稳定性中起着至关重要的作用，它位于胶束表 面，在疏水酪蛋白与水环境之间起到了很好的过渡【15 1 。同时所含二硫键使k c n 有着很多独有的性质【16 1 。1 c c n 的三维结构虽未被直接测定，但k u m o s i n s k i t l 7 】己 通过分子模拟方法得到( 图1 - 1 右) ，同时也可以从酪蛋白物化性质及序列组成来 推测其结构。光谱性质，包括圆二色和拉曼光谱，以及一级结构预测均表明k c n 具有较高的二级结构含量【1 8 】。k - c n 单体性质难以测定，因为它总以聚体形式存 在，l c c n 的自聚和d c n 类似，其多聚体是由多层易变的多聚肽区域包围着的核 组成，n 端部分构成核心，c 端呈易变性，中间区域介于k c n 氨基酸残基8 6 - 9 6 之间。k - c n 的自聚形态与b c n 不同，在一定范围内不受温度、离子强度影响， 形成固定大小的聚合体。 1 1 2 2 酪蛋白胶束结构及模型研究现状 酪蛋白在溶液中的聚集形态直接影响着人们对牛奶中酪蛋白的吸收，故酪蛋 白胶束的结构一直都是乳品研究的热点问题。但由于它的结构十分复杂，其确切 结构至今尚未确定。在过去几十年中，科学家纷纷提出关于酪蛋白胶束结构的理 论模型，目前被广泛接受的主要有亚胶束模型、h o l t 模型以及最近提出的双结合 模型。 亚胶束模型阵t m o r r l l 9 】最先提出，这个模型中酪蛋白胶束是由磷酸钙连接起 来的酪蛋白亚胶束构成，每个亚胶束有一个0 c s 、k - c n 形成的核，以及由两者包 裹的表面，所有胶束中亚胶束均由相同蛋白组成。 1 9 7 3 年，s l a t t e r y 和e v a r d t 2 0 】提出由不同组成亚胶束构成胶束粒子的模型，这 个模型中部分亚胶束含有a 。、p c n ，其余还含有k c n 。0 l s 、p c n 的存在使得 亚胶束表面形成疏水区域，k c n 聚集在表面亲水区域，疏水区域负责胶束表面 的亚胶束相互结合，亲水k c n 暴露在溶剂中，当胶束表面被k c n 覆盖时将停止 生长，据此可认为能利用k c n 含量决定胶束的大小分布。研究中虽已经认识到 钙、磷酸盐离子对酪蛋白胶束的重要性，但磷酸钙在胶束中未作为单独相考虑， 钙结合于酪蛋白并通过减少负电荷调整了亚胶束的疏水相互作用，无机磷酸盐在 相邻酪蛋白分子间则通过磷酸钙并应用静电相互作用使亚胶束相互作用。 s c h m i d t 和p a y e n s 2 l 】认为亚胶束是通过磷酸钙连接在一起，该模型中亚胶束 有被组成蛋白极性区域包围的疏水核心，除k c n 位于胶束表面外，亚胶束的组 成不确定，后来s c h m i d t 从s l a t t e r y 和e v a r d 的模型中借用了不同亚胶束组成的概 念，仅仅保留磷酸钙对亚胶束连接负责的概念。w a l s t r a t 2 2 】对亚胶束模型进行了 进一步研究，认为k c n 对酪蛋白的空间结构起稳定作用，其c 端部分伸出胶束表 镕一 女献综述 面进入周围溶剂( 图l - 2 ) 。 虽然亚胶柬模型能解释一些问题但它未能解释亚胶束的形成t 同时与 m e m a h o n 和m c m a n u s 2 3 l 的电镜结果也明显相违背。 h o i t 模型i “, 2 s 1 是h d t 分别于1 9 9 2 和1 9 9 4 年提出的胶束结构模型( 图1 - 3 ) 。在 该模型中酪蛋白胶柬是由酪蛋白分子缠结在一起，形成的类似凝胶的网状结构， 在该结构中胶体磷酸钙微簇与酪蛋白中的磷酸丝氨酸簇结合在一起，形成内部 完美的结构，胶束表面是k - c n 突出的c 末端，形成一个毛发层。 h o l t 模型与m c m a h 。n 和m c m a n 璐【圳的扫描电镜结粜相符台。同时，它沿用了 亚胶束模型中两个中心特征，胶体磷酸钙的结合作用及k - c n 主要位于胶束的表 面。但是h o h 认为酪蛋白磷酸丝氨酸簇与胶体磷酸钙之间的相互作用使胶束能聚 于一起这与亚胶束模型所坚持的疏水相互作用促使亚胶束的形成不同。 h o l t 模型主要的不足是没有明确说明k - c n 在胶束中的职责因而无法给山 限制酪蛋白胶束尺寸增的内在机制，如果没有限制，胶束将会持续增大直到 乳中形成一个大凝胶，这明显与实际矛盾。此外关于如何控制胶束稳定性等问题 也没阐述清楚。 臻o 兰- - 崦 图1 - 2 w a l s t r a 提出的亚胶束模型 f i g1 - 2 t h es u b - m i e e n e s m o d e l p m p o s o d b y w a l s t r a 圈1 - 3h o l t 提出的胶柬模型 f i gi - 3c a s e i nm i c e l l e sm o d d p r o p o s e d b y h o l t 燕_ 图1 4 h o m e 提出的双结台模型 f i g1 - 4 t h ed u a lb o d d i n g m o d e lo f m i c e l l es t l a l c k l r e h h o m e 图i - 5 酪蛋白溶液肢束的电镜照片 f i g1 - 5 e l e c t r o n m i c r o s o o p y o f c a s e i n m i c e l l e sb v d o u g l a s g 双结合模型【”1 是h o m e 于1 9 9 8 年提出的。该模型中( 图1 - 4 ) ，胶束的集结和 生通过多聚过程实现。在该过程中存在两种不同的结合形式：一是酪蛋白疏 第一章文献综述 水区的交联作用，另一是磷酸钙微簇的键桥作用。该模型同时指出：酪蛋白胶束 是完整的，胶束的稳定性依靠局部抵消静电排斥作用后多余的疏水相互作用维 持。每个酪蛋白分子在自我缔合平衡过程中相互作用。 在胶束中，1 c n 通过疏水区可形成螺纹状多聚链，到一定程度时，亲水区 域的静电排斥作用将限制链的进一步增长。同时，0 l 。l c n 也可通过带负电的磷酸 丝氨酸簇与带正电的磷酸钙微簇交联发生多聚作用。正负电荷中和又使仅s 1 - c n 分 子可进一步参与聚合作用，并通过疏水作用连接到酪蛋白微簇的疏水区中。b c n 则通过磷酸簇和疏水区形成多聚物连接到网络中，使多聚链延伸。啦c n 通过2 个磷酸簇和疏水区相互聚合能紧密集合到胶束网络中。k c n 在这一模型中对胶 束集结和结构最重要，它通过疏水性n 端聚合成链，而c 端没有磷酸丝氨酸簇， 因而不能通过微簇连接使多聚链延长，从而使酪蛋白多聚链和网络形成中止。 双结合模型与胶束表观特性和散射特性相吻创2 7 1 。位于表面的k - c n 起到限 制胶束增大的作用。能很好地解释凝乳酶水解过程中胶束的凝聚现象、牛乳酸化 导致胶束稳定性下降等很多问题。是一种适合各种乳品酪蛋白胶束的结构模型。 在这些理论模型提出之时，科学家又纷纷从实践角度研究胶束结构。 k u m o s i n s k i 2 8 】在1 9 9 6 年对含有较少单体个数的酪蛋白( 含4 个1 c n ，2 个b c n 和一个k c n ) 的高级结构进行了计算机模拟，模拟结果基本正确。但在实际溶液 中，酪蛋白通常含有几十个甚至上百个单体，因此分子模拟的方法难以实现结构 预测。h o m e 等人【2 9 】通过粘弹特性测量发现：酪蛋白是由多个单体通过化学和物 理作用力结合起来的坚硬的网状结构。m c m a h o n 2 3 】等通过透射电镜观察了酪蛋 白，发现胶束内部为不均匀结构。此后，d a l g l e i s h 等人【3 0 】通过场发射扫描电镜观 测了酪蛋白在溶液中的形态( 图1 5 ) ，发现胶束在溶液中并非光滑球状体，而是 存在着许多空隙，胶柬还表现出明显管状结构而非球状单体构成。 1 1 2 3 酪蛋白胶束中的作用力 酪蛋白单体之所以能够结合成胶束，除了由于钙离子的粘合之外，还由于它 们之间存在很多作用力，包括疏水相互作用、静电相互作用、氢键、二硫键等， 它们成为研究酪蛋白胶束结构的基础。 疏水相互作用在维持酪蛋白胶束结构稳定上起到了很大的作用。c a r r o l l 的研 究发现：在低温或者高压下，各酪蛋白单体一定程度上从胶束脱落，尽管这时疏 水键已经明显弱于其它的相互作用，但它仍是促使这些蛋白继续聚集于胶束的一 种重要作用力，这主要是由于大量的疏水键形成于蛋白的非极性端【3 。d o s a k o 等【3 2 】曾研究过1 和k c n 的盐析作用，显示在1 和k c n 形成共聚物的过程中疏 水相互作用起到主要作用，而静电相互作用并没有参与形成。疏水相互作用同时 也是促使酪蛋白胶束间聚集的一种作用力，因为酪蛋白的强疏水相互作用阻止了 7 第一章文献综述 酪蛋白形成球形结构，从而防止非极性残基完全包埋在蛋白分子内部。 存在于酪蛋白中的静电相互作用对稳定酪蛋白胶束结构同样起着重要作用， 特别是羧酸盐残基与二价金属离子间的静电相互作用能很好地维持酪蛋白胶束 结构的稳定性，但t h o m p s o n 和f a r r e l l e 3 3 】发现各酪蛋白在不存在聚体的情况下， 带负电荷的羧酸基与正电荷链问的静电相互作用几乎对蛋白稳定性不起作用。由 于胶束表面k c n 的存在，静电相互作用成为胶束聚合的障碍，故当蛋白酶剪切 表面k c n 后，静电壁垒作用减小，表现为酪蛋白易于聚集。 在稳定酪蛋白三级结构和空间结构中，氢键并不起主导作用，它对胶束的作 用与蛋白残基中氨基与羧基的相互作用相当。氢键能稳定蛋白内部极性氨基酸相 互作用。b l o o m f i e l d t 3 4 】通过研究发现在酪蛋白中氢键主要存在于内部分子的交界 面上。它们对各酪蛋白单体中不同构象如a 螺旋、p 折叠的形成有影响，进一步 能影响胶束的空间结构。 二硫键是一种共价键，多数蛋白具有二硫键，二硫键的形成使蛋白质肽链的 空间结构更为紧密，因此对稳定蛋白质结构有着重要的作用。然而在酪蛋白中， 二硫键非常稀少，仅在0 l s 2 和k c n 中发现存在半胱氨酸残基，它们能够形成二硫 键。r a s m u s s e n 等【”】的研究指出：在牛、羊、猪的乳中，s 2 和k c n 的二硫键更 易于在同类型蛋白问形成，因此易于产生自聚体，而在人乳中二硫键使仅s 2 和k - 酪蛋白更易于形成异聚体。虽然在酪蛋白胶束中的二硫键有利于胶束整体结构的 稳定性，但在酪蛋白形成胶体颗粒的过程中，二硫键并不是一种主导力。然而， 在乳加工过程中二硫键的作用显著增强，特别是在乳的热处理中，二硫键在酪蛋 白和乳清蛋白的相互作用中起到了主导作用。 1 2 蛋白质结构及其聚集行为研究进展 1 2 1 蛋白质的结构层次 蛋白质一级结构是指蛋白分子中氨基酸的排列顺序。天然蛋白质是由2 0 种 氨基酸通过肽键这一共价作用形式结合在一起的高分子化合物。根据a n f i n s e n 等 人的经典观点，蛋白质的一级序列决定了其高级结构。因此，一级结构的测定在 研究蛋白质高级结构以及生理功能中尤为重要。现有蛋白质测序方法包括n 末端 序列测定的e d m a n 法、c 末端酶解方法、c 末端化学降解法等 3 6 1 。但这些方法均 存在一些缺陷，远远满足不了生命科学的需要。质谱技术则由于其很高的灵敏度、 准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而得到广泛应用。 蛋白质的二级结构是指多肽链骨架的规则排列，即肽链中局部肽段的构象， 但并不涉及侧链的类型和构象。蛋白质分子的结构单元主要是仅螺旋、p 折叠。 第一章文献综述 此外，还含有部分规则二级结构，主要是转角。蛋白质二级结构在不同环境条件 下是可变的。早期研究发现：p h 能改变肽链的二级结构，还能改变侧链基团的 电荷而引起构象变化。温度也影响蛋白质的二级结构，一些蛋白多肽链在低温下 为a 螺旋，而升高温度后转变为1 3 折叠。此外在一些极端变性条件下，蛋白的肽 链将完全松散，各种二级结构构象单元将不复存在。 蛋白质的三级结构是蛋白质分子内所有原子在三维空问的立体排布。是二级 结构和非二级结构在空间中的进一步盘曲、折叠，形成包括主侧链在内的专一性 三维排布。四级结构则是一些特定三级结构肽链通过非共价键而形成大分子体系 时的组合方式，作为四级结构组分的肽链则被定义为亚基。 蛋白质的分子量很大，在水中容易形成胶体，具有布朗运动、光散射现象、 电泳现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力等特性。 1 2 2 蛋白质聚集及其影响因素 蛋白质聚集是当今研究的一个热点，它是影响蛋白质稳定性的一个重要因 素；同时，聚集还影响蛋白质构象及生理功能，研究结果表明蛋白质的聚集与一 些疾病有关，如：帕金森综合症、肌肉萎缩性侧索硬化症等【3 7 】。 早期研究表明形成聚集体的蛋白质是在一定浓度变性剂中形成的去折叠中 间体【38 1 。目前一般认为蛋白聚集体是由折叠中间体形成的，发生在折叠中间体疏 水表面之间的错误相互作用是导致聚集的直接原斟”】。蛋白质的聚集通常是不可 逆的，这是因为聚集体解聚的速率很慢，而且平衡有利于聚集体的形成。虽然可 以通过改变溶液环境，如升高温度，加入低浓度变性剂等，促使聚集可逆，但是 在生理环境中，聚集不会自发可逆，只有在分子伴侣h s p 7 0 和h s p l 0 4 的帮助下 才能解聚t 4 0 。 导致蛋白质聚集的因素很多，这些因素包括结构方面( 内部因素) 和环境方面 ( 外部因素) 。蛋白质的一级结构对其聚集行为影响很大，s o t o 等【4 l 】研究表明改变 多肽或蛋白中的一个氨基酸就能剧烈地增加蛋白的聚集倾向。b o o t h 等【4 2 】发现在 加热条件下人类溶菌酶的两个变异体( 1 5 6 t 和d 6 7 h ) l = i 二野生型更易于聚集。肽和蛋 白质的二级结构同样在控制聚集过程中发挥极大的作用。在一般情况下，当蛋白 或肽含有大量1 3 片层结构，而仅含少量a 螺旋结构时易于形成聚集体。这主要由 于仅螺旋所拥有的更强的偶极矩【4 3 1 。另外，溶液的环境条件也是决定蛋白质是否 聚集及聚集程度和速率的主要因素，包括溶液p h 、温度、离子强度、蛋白质浓 度、分子伴侣的存在与否及溶液中的其他溶质( 变性剂、有机小分子等) 。在这些 因素中，温度是最重要也是最常见的因素，增加温度可以增加分子碰撞的频率和 疏水相互作用从而增强蛋白聚集速率【棚。同时，温度也能通过改变蛋白质的二级 9 第一章文献综述 结构而改变其聚集行为。 1 2 3 研究蛋白质结构及聚集的物理方法 近年来，随着结构生物学和分子生物物理学的迅速发展，用于研究蛋白质结 构的方法日益增多，