（生理学专业论文）激活第Ⅲ组代谢型谷氨酸受体对aβ3135所致神经毒的作用观察.pdf

山西医科大学博士学位论文 激活第1 组代谢型谷氨酸受体对a1 33 1 - 3 5 所致神经毒作用的观察 中文摘要 a l z h c i m c r d i s e a s e ( a d ) 是一种以老年斑、神经纤维缠结、神经元死亡为特征性病理改变， 以记忆减退、认知障碍、人格改变为主要临床表现的神经退行性疾病。其病理和发病机制 复杂，虽然学说很多，但确切机制不明，因而缺乏对a d 有效的预防及治疗。在众多a d 病 因学说中，a 1 3 沉积被认为是最重要的发病机制。a p 是d d 3 9 4 3 个氨基酸组成的具有p 折叠结 构的小肽，它们在细胞外沉积，聚集会形成不溶性多肽，产生对神经元的毒害作用。临床 病理资料证实，a b 是a d 患者老年斑的主要成份，而老年斑是a d 患者的特征性病理改变， 也是病理上诊断a d 的重要指标。越来越多的实验证据证实，完整肽链( a 1 8 1 - 4 2 ) 和a b 2 5 3 5 片段对离体培养的神经元具有毒性作用，其机制包括：通过产生自由基发挥对细胞的损伤 作用；通过增强谷氨酸的神经毒作用，如过度激活n m d a 受体，产生对细胞的损伤：通过 诱导n o 对细胞产生毒性作用；通过刺激产生炎症，由活化的小胶质细胞和过度表达的细胞 因子产生损伤作用；通过影响胞内c a 2 + 稳态产生钙超载而引起神经元的损伤；以及通过细 胞凋亡诱导神经元死亡。新近的资料显示，a 1 3 3 1 3 5 ，一个更小的a b 片段也能产生与完整 肽链及a 胆5 3 5 相同的神经毒作用，提示a 1 3 31 3 5 可能是a b 肽链最短的活性肽段或关键的活 性部位。 谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性递质，其受体可分为离子型谷氨酸受体( i n o t r o p i c g l u t a m a t er e c e p t o r s ，i g l u r s ) 和代谢型谷氨酸受体( m e t a b o t r o p i eg l u t a m a t er e c e p t o r s ，m g l u r s ) 。 代谢型谷氨酸受体是一个与g 一蛋白偶联的受体家族，激活后通过产生第二信使而发挥其生 物学效应。依据代谢型谷氨酸受体氨基酸序列的同源性、胞内信号转导机制及药理学特性， 将其分为三组共8 型。其中第1 组m g l u r s 包括m g l u r l 和m g l u r 5 ，主要位于突触后，通过 激活p l c 产生i p 3 、d g 发挥作用，通常表现为与离子型受体如n m d a 受体类似的作用。第 1 i 组m g l u r s ( 包括m g l u r 2 和m g l u r 3 ) ，尤其是第1 h 组m g l u r s ( m g l u r 4 ，m g l u r 6 ，m g l u r 7 m g l u r 8 ) 主要位于突触前，它们通过与g i 蛋白偶联而抑制c a m p 的生成，表现为对谷氨酸 释放的负反馈调节，即通过突触前机制抑制谷氨酸释放，防止谷氨酸过量，从而发挥可能 的神经保护作用。b r u n o 等最近的报道显示，在离体实验的条件下，第i 组m g l u r s 激动剂 对离体培养的神经细胞的损伤发挥了保护作用：c o p a n i 等发现激活第1 i i 组m g l u r s 对由 a p 2 5 - 3 5 诱导的神经元凋亡有保护作用。有鉴于此，本实验拟进行以下几方面观察： i i l 两医辩大学博士学位沧直 1 、a 1 3 3 1 3 5 对离体培养的大鼠皮层神经元的致凋亡作用；2 、第i 组m g l u 地激动剂l 一- s o p 和限，, s ) - p p g 齐j a 3 3 1 3 5 诱导的培养神经元致凋亡作用的观察：3 、探讨激活第1 组m g l u r s 抑制a 1 1 3 1 - 3 5 致凋亡的机制：4 、第1 i i 组m g i u 黜激动剂对a b 3 l 一3 5 诱导的培养神经元的胞内 c a 2 + 浓度的影响。 第一部分 a1 33 1 - 3 5 对离体培养神经元的致凋亡作用 取新生w i s t a r 大鼠大脑皮层神经元，选择培养状态好，即折光性及活性强的细胞做进一 步的观察。 l 、神经元鉴定经m a p 2 ( m i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e dp r o t e i n - - 2 ) 和c y 3 双标免疫荧光染色 后，神经元呈强阳性着色，镜下呈红色，可显示细胞体及突起。 2 、凋亡观察在培养液中加) x a l b 3 1 - 3 5 ( 2 5 肛m ) 后，利用透射电镜、t u n e l 染色法及流 式细胞检测方法观察神经元的凋亡情况。结果显示：1 ) 在台a 1 3 3 1 3 5 的培养液孵育2 4 小时 后，电镜观察可见神经元出现了凋亡的特征性的改变，如细胞浆固缩，致密化，细胞器退 变；细胞核染色质聚集成致密团块，并在沿核膜处凝聚，胞核出现固缩，核膜凹陷，核裂 解成碎块，胞膜突起形成大泡，包含着核碎片和退变细胞器的大泡从细胞表面脱落下来， 形成凋亡小体等。2 ) t u n e u 染色见凋亡细胞核呈现棕黄色( d a b 显色) ，且凋亡细胞核占 细胞总数的2 6 3 2 ，而正常组凋亡细胞数为5 7 9 ( p o 0 5 ) 。3 ) 用流式细胞仪检测可见 a n n e x i n v 标记的早期凋亡细胞出现，其荧光强度可达2 8 8 9 ：t = 4 6 7 ，较正常组8 6 9 a = 2 5 1 明显 增高，凋亡百分率由正常的1 j 8 4 4 - 1 4 5 增加至2 1 6 4 土6 7 6 ( p 0 0 5 ) ：2 ) 当l s o p 浓度升高到3 0 “m 时，细胞荧光染色强度为 1 2 6 4 士3 2 8 ，较对照组有明显降低( p 0 0 5 ) ；3 ) l s o p 浓度的升高达1 0 0 9 m 时，a n n e x i n v 标记阳性的早期凋亡细胞数明显减少，其荧光强度为7 5 9 士1 6 4 ，与a 1 3 3 1 - 3 5 相比具极显著差 另l j ( p 0 0 1 ) ；4 ) t u n e l 检测结果与这一结果相一致，a p 3 1 3 5 对照组凋亡细胞数为2 6 3 2 ， l s o p ( i o o o m ) 组为8 2 4 ，具有显著性差别( p o 0 1 ) 。 2 、( r ，s ) 一p p g 对a b 3 1 - 3 5 诱导的神经元凋亡的保护作用：方法同上，在自h a a l 3 3 1 - 3 5 前， 分别预先加入不同浓度的( r ，s ) 一p p g ( 1 0 9 m ，3 0 p m ，1 0 0 肛m ，每组n = 5 ) ，2 4 d 时后用流式细 胞检测及t u n e l 染色法观察( r ，s ) 一p p g 对a p 3 l 一3 5 致凋亡作用的影响。结果显示：1 ) 加入低 浓度( r ，s ) 一p p g ( 1 0 “m ) 时，a n n e x i nv 标记细胞荧光强度仍高达3 3 9 4 士7 5 5 ，与单独加入 a 1 3 3 i - 3 5 对照组无差别；2 ) 在加入3 0 州( r ，s ) p p g 时，细胞荧光染色强度为1 1 7 5 士2 9 5 ，较 对照组明显降低( p o 0 5 ) ；3 ) 当( r ，s ) - p p g 浓度增加至1 0 0 0 m 时，它的保护作用明显， a n n e x i nv 标记阳性的细胞明显减少荧光值为7 4 1 士1 3 8 ，与对照组( 2 8 8 9 - 3 ：4 6 7 ) 十t 比，具 有显著差别( p o 0 1 ) ；4 ) t u n e l 检测结果与上述结果相一致，应用( r ，s ) p p g ( 1 0 0 1 t m ) 后其 凋亡细胞数7 8 4 ，与a 1 3 3 1 3 5 组相比具有显著性差别。 以上结果表明，第1 i i 组m g l u r s 激动剂l s o p 和( r ，s ) 一p p g 对a f t 3 l 一3 5 诱导的培养神经元 的凋亡具有保护作用，其保护作用呈剂量依赖性，当低浓度时( 1 0 i _ t m ) 无保护作用，随着浓 度的增加，其保护作用明显增强( 效应在1 0 0 1 a m ) 。 第三部分 激活第1 i i 组代谢型谷氨酸受体拮抗 a1 33 1 - 3 5 毒性作用的机制探讨 前期的实验观察证实，应用第1 l i 组m g l u r s 激动剂l - s o p 和( r ，s ) ，p p g 可抑制a 1 3 3 l 3 5 所致的神经元凋亡，在此基础上利用同样的实验条件，即离体培养的皮层神经元，通过测 定c a s p a s e s 酶系统( 包括c a s p a s e s 3 、_ 8 、9 ) 的活性和流式细胞检测细胞凋亡率，结合应 用p k a 的激动剂s p c a m p 和抑制剂r p - c a m p ，探讨激活第1 i i 组m g l u r s 抑制a p 31 - 3 5 致 凋亡的机制。结果显示：1 ) a 1 3 3 1 3 5 ( 2 5g t m ) 作用于培养神经元2 4 h 后，上述三种c a s p a s e s 活性明显增高，包括c a s p a s e 一3 、c a s p a s e 一8 和c a s p a s e 一9 。其o d 值分别由对照组的 o 0 2 2 7 9 土0 0 0 3 9 、o 0 0 5 6 士0 0 0 1 1 和o 0 1 5 士0 0 0 2 7 增至o 0 9 8 6 士0 0 0 6 2 、0 0 2 2 4 士0 0 0 2 1 和 o 0 5 9 士0 0 0 4 6 ，与对照组相比较均具显著性差异，其中e a s p a s e 3 的活性增加最为显著，较 对照组增高达4 倍以上( p o 0 1 ) ；2 ) 在分别应用第1 i i 组m g l u r s 激动剂l s o p ( 1 0 0 “m ) 和 ( r ，s ) 一p p g ( 1 0 0 m ) 后，抑制了a 1 3 3 1 3 5 引起的c a s p a s e 3 、c a s p a s e 一8 、c a s p a s e 一9 的活性升高， o df l , f 分别降低下0 0 2 7 2 5 l _ 00 0 4 7 、0 0 l2 3 4 00 0 8 6 、0 0 1 6 3 3 + 0 0 0 5 5 和0 0 2 6 士0 0 0 4 5 、 0 0 1 0 7 4 - 0 0 0 5 7 、o 0 1 5 6 7 4 - 0 0 0 2 5 ，与a 1 3 3 1 3 5 组相比，各组均具显著性差异：3 ) 应用p k a 的激动剂s p c a m p ( 2 0 0 m ) 明显地减弱了第1 l l 绍m g l u r s 激动剂l s o p 和( r ，s ) 一p p g 对 a 3 3 l 一3 5 致神经元凋亡的抑制作用使凋亡率分别由7 5 9 4 - 1 6 4 ( l - s o p + a 3 3 l 一3 5 ) 和 7 4 1 4 - 1 3 8 ( ( r ，s ) 一p p g + a 1 3 3 1 3 5 ) 增加至 1 83 7 4 - 14 3 ( s p c a m p + l s o p + a f 3 3 1 - 3 5 ) 和 1 5 4 8 4 - 1 4 1 ( s p c a m p + ( r ，s ) p p g + a 1 3 3 l 一3 5 ) ，两组分别比较均具有显著性差异。同时还观 察到s p c a m p 减弱了l s o p 年i i ( r ，s ) 一p p g 对a 1 3 3 1 3 5 引起的c a s p a s e s 活性的抑制，使培养 细胞c a s p a s e 一3 、8 9 的活性均分别增强，经统计学处理，均具显著性差异；4 ) 当预先 应用p k a 抑制剂r p c a m p ( i o g m ) 后显示，由a 1 3 3 1 3 5 引起的神经元凋亡受到抑制，其凋 亡率由2 8 8 9 4 - 2 ，6 7 ( a p 3 1 3 5 组) 降至8 9 2 4 - 1 9 5 ，降低幅度约7 0 。与此同时还观察到， 这时a p 3 1 3 5 引起的c a s p a s e - 3 活性也明显降低，其o d 值由0 ，0 9 8 6 4 - 0 0 0 6 2 ( a 1 3 3 1 3 5 组) 减至0 0 2 2 9 8 4 - 0 0 0 4 3 ，降低幅度约7 6 ，具显著性差异( p o 0 1 ) 。r p c a m p 无论是对a 1 3 3 l 一3 5 引起的神经捌i 、：的 1 1 】制，还址刈c a s p a s c 一3 的抑制，i 作川强度都与应用l s o p ( 1 0 0 1 j m ) ) f 1 1 ( r ，s ) 一p p g ( i o o p m ) 产生的抑制效应非常接近，即p k a 抑制剂r p c a m p 可模拟第l i i 组 m g l u r s 激动剂的神经保护作用，而p k a 激动剂s p c a m p 可拮抗这些受体的作用。 以上结果表明，1 a p 3 i - 3 5 通过激活内、外两条途径诱导培养皮层神经元凋亡；2 应用 l s o p t ( r ，s ) - p p g 激活第1 i 】组m g l u r s 既可抑制内源性途径、也可抑制外源性途径引起的 凋亡；3 激活胞内p k a 系统也可介导a 3 3 1 - 3 5 的神经毒作用，抑制该系统则具有神经保护 作用：4 激活第1 i i 组m g l u r s ，通过抑制c a m p p k a 系统使该系介导的a b 3 1 - 3 5 致凋亡也 受到抑制，因而对神经元发挥保护作用。 第四部分 第1 i l 组代谢型谷氨酸受体激动剂对ab3 卜3 5 所致 神经元 c a ” i 升高作用的影响 细胞内c a 2 的动念平衡足细胞进行各项功能活动的基本条件之一，同样对于神经元的 生长发育、突触传递及神经元的代谢调节及病理过程均起着至关重要的作用。尽管a b 的神 经毒作用机制尚不明了，但a p 及其活性片段扰乱神经细胞内c a 2 + 稳态，产生c a 2 + 超载是其 神经毒性作用的重要机制之一。本实验利用c a 2 + 荧光成像技术，y 见察a 1 3 3 1 3 5 对培养神经元 4 州噬科 学博j 学f t 硷义 c a ”】i 水平的影响，并在此基础上观察第1 i l 代谢型谷氨酸受体激动剂l s o p 平1 2 ( r ，s ) 一p p g 对a p 3 1 - 3 5 所致 c a 2 + 】i 升高的影响。结果显示：1 ) 培养液中加入不同浓度的a p 3 1 - 3 5 时，可 引起- n 量依赖性的胞内c a ”升高，即当给予5 p m 的a 1 9 3 t 3 5 时，神经元【c a 2 + i 升高不显著： 而剂量增至1 0 a m 时，有5 0 的神经细胞出现 c a ”】i 升高，潜伏期在4 1 6 7 + 5 3 5 s e c ：在 a 1 3 3 1 - 3 5 ( 2 0 9 m ) 时，有7 0 的细胞出现胞内静息c a ”升高，其紫外激发的荧光比值 r ( f 3 4 0 f 3 8 0 ) 值出8 0 1 2 4 + 1 5 4 3 增加至u 9 6 0 6 2 ：k 2 3 7 6 ，增加了1 9 8 9 ，且胞内钙升高的潜伏 期较前缩短至1 7 6 7 4 - 4 6 8 s e e ；而当a p 3 1 。3 5 的浓度达2 5 1 t m 时，有9 0 的细胞发生【c a ” i ；i t n j ， 其r 值从8 1 0 9 6 士1 4 7 5 增加到1 1 1 4 2 5 ：k 1 5 0 6 4 ，升达3 7 4 1 ，同时潜伏期明显缩短到 7 4 3 士3 4 ls e c ；2 ) 在应用第1 儿组代谢型谷氨酸受体激动女j j l s o p ( 1 0 0 p m ) 预处理后， 耳j u 入 2 5 t m 的a d 3 1 3 5 ， c a ” i y l 高较单独使用a l l 3 1 3 5 的对照组有明显降低，并且潜伏期明显延 i 丈三i ! 1 6 6 6 7 士4 7 2 s e c ；绷i 将r p 独使j 1j a l 3 3 1 3 5 时的升高幅度定为1 0 0 ，应用l s o p 预孵育后 c a 2 + 】i 升高幅度只有4 8 1 6 ，即a 3 3 1 3 5 诱导的 c d + 】i 升高作用被抑制了5 1 8 4 土3 6 l ；3 ) 与l s o p 作用相似，预先加入( r ，s ) p p g ( 1 0 0 1 a m ) 后，极显著地抑制了a 1 3 3 1 3 5 所致升高 c a ”1 i 效应，使其升高幅度明显降低，潜伏期显著延长至8 0 3 2 4 - 3 6 5 s e c ；如将单独使用 a f t 3 1 3 5b 寸 c a ”】i 升高的幅度定为1 0 0 ，应用( r ，s ) - p p g n c a 2 + i f + 高幅度只有3 1 0 6 ，即 a 1 3 3 1 3 5 诱导的 c a 2 + 1 i j 牛高作用被抑制了6 8 9 4 。 以上结果表明，急性给予a p 3 1 3 5 可引起培养神经元的【c a 2 + ”水平呈剂量依赖性的升 高，即随着a 1 3 3 l ，3 5 浓度的增加，其【c a ”】i 升高的幅度逐渐增加，而潜伏期逐渐缩短。经第 1 i i 组代谢型谷氨酸受体激动剂l s o p 或( r ，s ) p p g 的预处理后，使a b 3 i - 3 5 所日i n f c a 2 + l i 的平均升高幅度降低，平均潜伏期明显延长。本实验与上述a 1 3 3 1 - 3 5 所致凋亡的实验相对 照，提示在离体培养的神经元第1 l i 组m o l u r s 的激活可通过抑翻1 a 1 3 3 1 - 3 5 引起的c a 2 + 超载， 从而对a i b 3 1 3 5 诱导的神经元凋亡发挥保护作用。 上述结果提示：1 a 1 3 3l 一3 5 既可通过内源性途径，也可通过外源性途径诱导离体培养 的大鼠皮层神经元凋广= ；2 a p 3 1 3 5 可剂景依赖性地引起培养神经元 c a 2 + 】i 升高( 超载) ， 这l ，_ 能也是诱导掏亡的机制；3 利用l s o p 年t i ( r ，s ) 一p p g 激动第1 i l 组m g l u r s 可抑制a b 3 1 - 3 5 匮导的神经元凋亡；在离体培养的条件下，l s o p 和( r ，s ) p p g 可能主要通过激活m g l u r 4 或m g l u r 4 8 发挥其神经保护作用：4 激活第1 i i 组m g l u r s 抑制培养神经元凋亡的机制至少 包括抑制a p 3 l - 3 5 诱导的内源性途径及外源性途径引起的凋亡和抑制a b 3 i - 3 5 诱i ￥j c a 2 + l i 超载：5 利用s p c a m p 激活胞内p k a 系统介导了a 踯卜3 5 的神绎毒作用，抑制该系统则具 有神经保护作用：6 在离体培养条件下，激活第1 i i 组m g l u r s 通过抑制p k a 的活性而抑制 a b 3 卜3 5 引起的神经元凋亡。 关键词：大鼠、原代培养皮层神经元、a 1 3 3 1 3 5 、凋亡、c a s p a s e 一3 、c a s p a s e 8 、c a s p a s e 9 、 p k a 、 c a 2 + 】i 、第1 i l 组代谢型谷氨酸受体、l - s o p 、( r ，s ) p p g 、神经保护作用 l j 埘医科火学鹇i 学似沧文 n e u r o p r o t e c t i v ea c t i o no fg r o u p m e t a b o t r o p i c g l u t a m a t er e c e p t o r sa g a i n s tn e u r o n a la p o p t o s i s ，w i t hs p e c i a l r e f e r e n c et om o d u l a t i o no nn e u r o n a l c a 2 + l ii n d u c e db y b a m y l o i dp e p t i d e3 1 - 3 5 a b s t r a c t a l z h e i m e r sd i s e a s ei san e u r o d e g e n e r a t i v ed i s o r d e r , c h a r a c t e r i z e d b y s e n i l e p l a q u e s ， n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e ，a n daw i d e s p r e a dl o s so f n e u r o n s ，a l o n gw i t hp r o g r e s s i v ei m p a i r m e n to f c o g n i t i o na n de m o t i o n a la c t i v i t i e s i n c r e a s i n ge v i d e n c e ss h o w nt h a tb a m y l o i dd e p o s i t i o ni st h e l e a d i n gc a u s e f o ra d 3 - a m y l o i dp e p t i d e ( a 1 3 ) i sa3 9 4 3 一a m i n oa c i dp e p t i d et h a ta c c u m u l a t e d a si n s o l u b l ee x t r a c e l l u l a rd e p o s i t si na l z h e i m e r sb r a i na n di sb e l i e v e dt o x i c i t yt on e u r o n s ，i s a l s op r o f o u n d l yi n v o l v e di nt h ep a t h o g e n e s i so f a d g l u t a m a t e ，t h em a j o re x c i t a t o r yt r a n s m i t t e ri nt h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ，a c t i v a t e sd i s t i n c t r e c e p t o rs u b t y p e s ，b r o a d l yd i s t i n g u i s h e d i n t ot w o g e n e r a lg r o u p s ，n a m e di o n o t r o p i ca n d m e t a b o t r o p i cr e c e p t o r s m e t a b o t r o p i cg l u t a m a t er e c e p t o r s ( m g l u r s ) a r ec o u p l e dt ogp r o t e i n s a n da c to nv a r i o u si n t r a c e l l u l a rs e c o n dm e s s e n g e rs y s t e m s m g l u r sa r eg e n e r a l l yc l a s s i f i e di n t o t h r e ec l a s s e sa c c o r d i n gt ot h e i rs c q u c n c ch o m o l o g y ，c o u p l i n gt ot r a n s d u c t i o nm e c h a n i s m sa n d p h a r m a c o l o g i c a la g e n t s g r o u pi ( m g l u r l ，m g l u r 5 ) m g l u r s a r e m a i n l y l o c a t e d p o s t s y n a p t i c a l l y ，a n ds t i m u l a t ep h o s p h o l i p a s eca n dp h o s p h o i n o s i t i d eh y d r o l y s i s ，a n dt h e i r p o s t s y n a p t i cr e s p o n s ea r es i m i l a rt on m d ar e c e p t o ri nm a n yw a y s g r o u pl l ( m g l u r 2 ，m g l u r 3 ) a n d e s p e c i a l l yg r o u pi i i ( m g l u r 4 ，m g l u r 6 ，m g l u r 6 ，m g l u r 7 ，m g l u r 8 ) m g l u r sa r e o v e r w h e l m i n g l yl o c a t e dp r e s y n a p t i c a l l y ，a n dn e g a t i v e l yc o u p l et oa d e n y l yc y c l a s e ，a n di nt u r n i n h i b i tc a m pf o r m a t i o ni th a sb e e nr e p o r t e dt h a tt h e s ep r e s y n a p t i cr e c e p t o ra r ei n v o l v e di n s y n a p t i ct r a n s m i s s i o nb yn e g a t i v ef e e d b a c ko fr e l e a s i n gg h i t a m a t e i nt h i sw a y ，p r e v e n t i o no r r n o t c c t i o n i l e u i o l i nf r o mt h eu cl l l o t o x i c i t y b yo v o i i c l c a s i n go i o v g l a c t i v a t i o no l n m d a r e c e p t o r s r e c e n t l y ，b r u n oe t a lr e p o r t e dt h a ta c t i v a t i o no fg r o u pi i im g l u r sp r o t e c tn e u r o n s a g a i n s te x c i t o t o x i cd e a t hi nv i t r o ；c o p a n ie ta l h a v ed e m o n s t r a t e dt h a ta c t i v a t i o no fg r o u pi i i m g l u r sp r o t e c tc u l t u r e dn e u r o n sa g a i n s ta p o p t o s i si n d u c e db ya p 2 5 3 5 a p 3i - 3 5 ，a ne v e n s m a l l e ra m y l o i dp e p t i d ef r a g m e n th a sb e e nr e p o r t e dp o s s e s s e st h es i m i l a rt o x i c i t ya sf u l ll e n g t h 6 州医科人学晦i j 学化睦史 o fa 1 3a n df r a g m e n to fa 1 3 2 5 3 5d o f h u st h ea i mo ft h i ss t u d yi st oe x a m i n ew h e t h e ra c t i v a t i o n o fg r o u pi i im g l u r sa r ei n v o l v e di nn e u r o p r o t e c t i o na g a n i s tn e u r o t o x i c i t yi n d u c e db ya 1 3 31 - 3 5 t h ep a r tio ft h ep r e s e n ts t u d yi st oo b s e r v et h ea p o p t o s i si n d u c e db ya j 31 3 5i nc u l t u r e d c o r t i c a ln e u r o n s ；t h ep a r t1 1i st oe x a m i n et h ee f f e c t so fa g o n i s t so fg r o u pi i i m g l u r s ， i n c l u d i n gl s o p , ( r ，s ) 一p p go na p o p t o s i si n d u c e db ya 1 3 3 1 3 5 ；t h ep a r ti i ii s t od e t e r m i n e w h e t h e rt h ep r o t e c t i o no fg r o u pi i im g l u r si sa c h i e v e db yi n h i b i t i n gt h ec a s p a s e s d e p e n d e n t i n t r i n s i co re x t r i n s i ca p o p t o t i cp a t h w a y so ri sm e d i a t e db yi n h i b i t i n gt h ea c - c a m p p k a p a t h w a yi nv i t r o ；t h ep a r ti v i st oo b s e r v et h ee f f e c t so fa c t i v a t i o no fg r o u pi i im g l u r so n e l e v a t i o no fi n t r a c e l l u l a rc a l c i u mc o n c e n t r a t i o ni n d u c e db ya 3 31 - 3 5 p a r ti b a m y l o i dp e p t i d e3 1 3 5i n d u c ea p o p t o s i s i ne o r t i c a ic u l t u r e s i nt h i ss t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so fa 1 3 3l 一3 5o nn e u r o n a l a p o p t o s i si nc u l t u r e dc o r t i c a l n e u r o n si nr a t sb ym o r p h o l o g i c a la n a l y s i s ，f l o w c y t o m e t r i ca s s a y s ，a n dt u n e le x a m i n a t i o n s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ：1 t h ec u l t u r e dc e l l sa r et h em a p 2 ( m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i n - 2 ， g e n e r a lm a r k e ro fn e u r o n s ) 一p o s i t i v ec e l l s 2 e x p o s u r e do fc u l t u r e dc o n i c a ln e u r o n st or e s i d u e 31 3 5f r a g m e n to fa 1 3 ( 2 5i x m ) i n d u c e dn e u r o n a la p o p t o s i sa sr e v e a l e db ym o r p h o l o g i c a l a n a l y s i s ，s h o w i n gt h et y p i c a ln e u r o n a lc h a n g e sc h a r a c t e r i s t i co fa p o p t o s i s n o t i c et h a tt h e d i f f e r e n ts t a g e sa p p e a r e dd u r i n gt h ea p o p t o t i cp r o c e s s e s ：p a t c ho fc o n d e n s e dc h r o m a t i nl a i d a g a i n s tt h en u c l e a rm e m b r a n ea n dt h es h a p eo fn u c l e u sb e c a m ei r r e g u l a r , t h e nt h en u c l e u s r e v e a l e dc l e a v a g ef u r r o w sa n df i n a l l yf o r m e dn u c l e a rf r a g m e n t sk n o w na sa p o p t o t i cb o d i e s t h e r e s u l t so b m i n e db yt u n e l f t d t m e d i a t e dd u t pn i c ke n dl a b e l i n g ) a s s a ys h o w e dt h a tt h e p e r c e n t a g eo fa p o p t o s i sc e l l sw a su pt o2 6 3 2 w h e nn e u r o n st r e a t e dw i t ha 3 31 - 3 5 ( 2 5l a m ) ， w h i l et h en o r m a lw a s5 7 9 ( p 0 0 5 ) b yf l o wc y t o m e t r i ca s s a yd e m o n s t r a t e dt h a tt h em e a no f f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y i nc e l l st r e a t e dw i t ha p 31 - 3 5 ( 2 5p m ) a n dn o r m a ln e u r o n sw e r e 2 0 8 9 - a ：4 6 7a n d8 6 2 51 ，r e s p e c t i v e l y ( p 0 0 5 ) o u rp r e s e n tr e s u l t ss u g g e s tt h a tt h es h o nf r a g m e n to fa 3 31 3 5p o s s e s s e st h es i m i l a rb i o l o g i c a l a c t i v i t i e so ff u l l l e n g t ha 1 3m o l e c u l e ，a n di tc a ni n d u c ea p o p t o s i si nc u l t u r e dc o n i c a ln e u r o n sa s f u l ll e n g t ho f a 3o ra f t 2 5 3 5f r a g m e n t ，w h i c hr e c o n c i l ew i t ht h er e s u l t si np r e v i o u ss t u d yi nt h i s l a b 7 l j i ! ! i 医科 学陋 ：学位论文 p a r ti i a c t i v a t i o no f m e t a b o t r o p i cg l u t a m a t er e c e p t o r s p r o t e c t sc u l t u r e dn e u r o n sa g a i n s ta p o p t o s i s i n d u c e db yp - a m y l o i dp e p t i d e3 1 3 5 i nt h i ss t u d y ，w eo b s e r v e dt h ee f f e c t so fm g l u r - l i ia g o n i s tl - s o pa n d ( r ，s p p go nn e u r o n a l a p o p t o s i si n d u c e db ya 1 3 3 1 3 5i nc u l t u r e dc o r t i c a ln e u r o n si nr a t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：1 l s o pp r o t e c tn e u r o n sa g a i n s ta p o p t o s i si n d u c e db ya 1 3 3 1 - 3 5 ：n e u r o n sw a sp r e t r e a t e dw i t h l - s o p ( 1 0g m t3 0g m ，1 0 0g m ，n = 5 ) f o r l o m i n r e s p e c t i v e l y , a 1 3 3 1 - 3 5 ( 2 5p m ) w a sa d d e d t o t h em e d i a ，t h e ni n c u b a t e d t o g e t h e rf o ra n o t h e r2 4 h a d m i n i s t r a t i o no fl s o pw i t hl o w e r c o n c e n t r a t i o n ( 1 0 9 m ) c o u l dn o tp r o t e c tc u l t u r e dn e u r o n sf r o ma p o p t o s i si n d u c e db ya b 3 1 - 3 5 ( 2 5 g m ) e x a m i n e db yb o t hf l o wc y t o m e t r i ca s s a ya n dt u n e l s t a i n i n g ，w h e nt r e a t e dw i t hh i g h e r c o n c e n t r a t i o n ( 3 0 a m ) r e s u l t e di nan e u r o p r o t e c t i o ni nc u l t u r e dn e u r o n s ，a n dt h er e s p o n s ep e a k e d a t1 0 0g m ，s h o w i n gas i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t ht h eg r o u po f a l 3 3 1 - 3 5 ( p 0 0 5 ) ，a n d a l s ot h er e s u l t so ft u n e ls t a i n i n gw e r ec o i n c i d e n tt ot h a to ff l o wc y t o m e t r i ca s s a y ，w h o s e p e r c e n t a g eo fa p o p t o t i cc e l l sw e r e9 2 4 a n d2 6 3 2 i nt r e a t e dw i t hl s o p