（细胞生物学专业论文）寄生基因编码蛋白质结构特点及数学分类模型的建立.pdf

寄生基因编码蛋白质结构特点分析及数学分类模型建立 中文摘要 寄生蠕虫能分泌出一系列蛋白质到体表或者宿主体内，这类蛋自质被称为 分泌蛋白质( e sp r o t e i n s ) ，它们具有不同的生物功能，它们帮助蠕虫入侵宿主 组织，抵抗宿主免疫系统，是蠕虫能成功完成寄生生活史的关键因素。对分泌蛋 白质的研究是研究蠕虫寄生机制，并从中寻求疫苗及药物用以防治蠕虫危害的重 要手段。如果可以建立一个可以筛选、预测寄生蛋白质的模型，用来分析未知功 能的蛋白质是否具有寄生功能，可缩小研究范围、大大减少工作量，使研究目标 物更加明确。本文通过对寄生蛋白质序列特征的分析，建立了寄生蛋白质分类模 型，为今后建立寄生蛋白质筛选模型提供基础。 目前，有多个假说用以解释寄生蠕虫如何获得适应寄生生活的能力的分子 机制，但是没有定论。越来越多的研究指出这类参与蠕虫寄生过程的分泌蛋白质 是由已经在自由生活物种中存在表达的蛋白质获得新的功能进化而来的。如果表 达分泌蛋白质的基因的迅速进化是蠕虫适应寄生生活所必需的，那么是否具有分 泌功能的蛋白质都具有更快速进化的特征呢? 针对这一问题我们以马来布鲁丝 虫为模型进行了研究。我们利用b l a s t p 蛋白质序列比对工具及s i g n a | p 蛋白质 n 端分泌信号肽分析工具分析由马来布鲁丝虫( b r u g i am a l a y i ) 基因组计划得到 的蛋白质其n 端分泌信号的分布情况；初步探讨了具有分泌功能的蛋白质在非 寄生序列中是否也处于更高进化地位的问题。我们一共分析了5 5 2 条蛋白质序 列，其中1 8 8 ( 1 0 4 5 5 2 ) 的序列具有n 端分泌信号肽或者分泌信号锚定位点。 序列比对结果显示虽然有部分具有n 端分泌信号的蛋白质序列没有在其它物种 中发现同源蛋白质，但是也有同样数量的具有n 端分泌信号的蛋白质序列是高 度保守的。并且多数自由生活线虫表达的与马来布鲁丝虫表达的具有分泌功能的 蛋白质同样具有n 端信号肽或信号锚定位点，我们认为具有分泌功能的蛋白质 并不一定具有更高的进化地位。 既然n 端分泌信号肽并不能在广泛的意义上代表生物分子的进化特征。我 们将研究的重点放到寄生蛋白质全序列分析上。我们根据多序列比对的结果，选 择那些在寄生序列中高度保守并且不同于不具有寄生功能的序列的特定氨基酸 位点作为聚类分析的变量，并根据氨基酸极性特性用l 2 0 的数值来代表2 0 种基 本氨基酸，采用不同的聚类分析算法，得到了准确率最高的分类模型：以所选择 的寄生蛋白质特定保守氨基酸位点，并且给这些氨基酸定义数值为变量，并以皮 尔逊相关系数为相似性测度，用组内联结法进行聚类计算的寄生蛋白质分类模 型。我们分析了2 8 种寄生蛋白质家族，利用我们对变量的定义，综合运用各种 聚类方法，2 4 种蛋白质家族能被成功聚类，将寄生蛋白质与非寄生蛋白质区别 开来，成功率达到8 5 7 ：而利用我们建立的模型，其中1 8 种的蛋白质家族能 被成功聚类，成功率达到了6 4 。3 。 关键词：寄生蠕虫：分泌蛋白质；聚类分析 a b s t r a c t n e m a t o d ep a r a s i t e sd on o tm u l t i p l yi nt h ed e f i n i t i v eh o s tb u tm o l t , g r o wa n dm a t u r e f o rap e r i o df o l l o w i n gi n f e c t i o n i no r d e rt os u r v i v ei n t h e i rh o s t s ，l o n g l i v e d n e m m o d ep a r a s i t e sh a v et os u b v e r tt h eh o s ti m m u n ed e f e n s e ，u s i n gs t r a t e g i e sh o n e d d u r i n g t h e i r l o n gc o e v o l u t i o n a r y i n t e r a c t i o nw i t ht h eh o s ti m m u n es y s t e m e x c r e t o r y s e c r e t o r y ( e s ) p r o d u c t sa r es u p p o s e dt op l a yav i t a lr o l e i np a r a s i t m i f t h e r ei sas c r e e n i n go rp r e d i c t i n gm o d e lf o rp a r a s i t i cp r o t e i n s ，i tw i l lb eh e l p f u lf o r p a r a s i t i cp r o t e i n sr e s e a r c h w ea n a l y z e dt h ec h a r a c t e r i s t i c so f t h ee sp r o d u c t st ob u i l d u pac l u s t e r i n gm o d e lo fp a r a s i t i cp r o t e i n s ，w h i c hw i l l b et h ef o u n d a t i o n go ft h e s c r e e n i n gm o d e lb u i l d i n g c o n c e p t u a l l y , s e v e r a l m e c h a n i s m s a f f e c t i n g e v o l u t i o nt o p a r a s i t i s m c a nb e e n v i s i o n e d ，i n c l u d i n g ：a d a p t a t i o no fp r e e x i s t i n gg e n e st o e n c o d en e wf u n c t i o n s ； c h a n g e si ng e n e sr e g u l a t i n gm e t a b o l i co rd e v e l o p m e n t a lp a t h w a y s ；g e n ed u p l i c a t i o n ； g e n el o s s ；a c q u i s i t i o no fg e n e sf r o mo t h e rs p e c i e sv i ah o r i z o n t a lg e n et r a n s f e r m o r e a n dm o r ee v i d e n c e ss h o wt h a tt h ee v o l u t i o nh i s t o r yo fs e c r e t e dp a r a s i t i cp r o t e i n si s l i k e l yt ob et h a to fr e c e n ta d a p t a t i o nf r o ma n c e s t r a lg e n e s t h a tf u l f i l l e do t h e rf u n c t i o n s i nf r e e 1 i v i n ga n c e s t o r s ，w ew o n d e r e dw h e t h e rt h i st h e o r yw o r k se x t e n d e di ns i g n a l p e p t i d e b e a r i n gs e q u e n c e s a r et h e s es e c r e t o r yp r o t e i n s u n d e r g o i n g a c c e l e r a t e d e v o l u t i o n ? t a k i n gag e n o m i ca p p r o a c ht oc h a r a c t e r i z ep o t e n t i a ls e c r e t e dp r o d u c t s ，w e a n a l y z e dp u t a t i v ep r o t e i ns e q u e n c e sf r o m 厨u g am a l a y i w h o l eg e n o ms h o t g u n s e q u e n c i n gp r o j e c t s i g n a l pa n a l y s i sw a sa p p l i e dt op r e d i c t e dp r o t e i ns e q u e n c e st o i d e n t i f yp o t e n t i a ls i g n a lp e p t i d e sa n da n c h o r s w ea n a l y z e d5 5 2s e q u e n c e s ，o f w h i c h 8 8 ( 15 9 ) b e a rp r e d i c t e ds i g n a l s e q u e n c ec o d i n gr e g i o n s c o m p a r i s o n so fs e q u e n c e s w i t hh o m o l o g sf r o mo t h e rs p e c i e s ，w ef o u n dt h a ta l t h o u g hs o m eo ft h es e q u e n c e sw i t h s i g n a ls e q u e n c e sh a v en o tg o th o m o l o g s w i t ho t h e r s ，t h e r ea r ea l m o s tt h es a n l e a m o u n t so ft h es e q u e n c e sw i t hs i g n a l st h a ta r eh i g h l yc o n s e r v e d i ts e e m st h a tt h i s t h e o r yt h a tp r o t e i n sw i t hn t e r m i n a l s i g n a lp e p t i d e sa r eu n d e r g o i n ga c c e l e r a t e d e v o l u t i o nc o u l dn o tw o r ki na ne x t e n d e df i e l d w er e c o m m e n dt h a tf u r t h e rr e s e a r c hb e n e e d e di nt h i st h e o r y s i n c er a p i de v o l u t i o no fs e c r e t e dg e n ep r o d u c t sw a sn o te v i d e n ti ng r e a t e rd i v e r s i t y a m o n gs i g n a lp e p t i d e - b e a t i n gs e q u e n c e st h a na m o n gg e n e sc o d i n gf o rn o n s e c r e t e d p r o t e i n s w ep u to u r a t t e n t i o nt ot h em a s s a g eo fw h o l es e q u e n c ec o n t a i n i n g w ec h o s e s p e c i f i ca m i n oa c i ds i t e sw h i c hc o n s e r v e da m o n gp a r a s i t i cp r o t e i ns e q u e n c e sb u t d i f f e r e n tf r o mn o n p a r a s i t i cs e q u e n c e sa c c o r d i n gt or e s u l t so fm u l t i p l ea l i g n m e n t s 2 寄生幕凶编码蟹臼质结构特点分析及数学分类模型建立 t h e nw ed e f i n e dt h ea m i n oa c i d sw i t hn u m e r i c a lv a l u ef r o m1t o2 0r e s p e c t i v e l y w e d i dc l u s t e r i n ga n a l y s i s ，f i n a l l yb u i l tu pac l u s t e r i n gm o d e lf o rp a r a s i t i cp r o t e i n s e q u e n c e s ：u s i n gt h en u m e r i c a lv a l u e sf o re a c ha m i n oa c i d so ft h es p e c i f i cs i t e so f p a r a s i t i cp r o t e i ns e q u e n c e sa sv a r i a b l e s ，m e a s u r e db yp e a r s o nc o r r e l a t i o na n d c a l c u l a t e db yb e t w e e ng r o u p sm e t h o dt ob u i l du pt h ec l u s t e r i n gm o d e l w ea n a l y s e d 2 8p a r a s t i cp r o t e i nf a m i l i e s ，w i t ho u rd e f i n i t i o no ft h ev a r i a b l e s ，2 4o ft h e mc o u l db e c l u s t e r e ds u c c e s s f u l l y , t h ea c c u r a c yr a t ew a s8 5 7 ：18o ft h e mc o u l db ec l u s t e r e db y o u rm o d e ls u c c e s s f u l l y , t h ea c c u r a c yr a t ew a sa sh i g ha s6 4 3 k e yw o r d s ：h e l m i n t h ，e x c r e t o r y - s e c r e t o r yp r o d u c t s ，c l u s t e r i n ga n a l y s i s 3 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 珞缈i 稻丽：争 ) 课题( 组) 的研究成果，获得( 亨夫r ) 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在( 罗人武 ) 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 了乡 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年 月臼解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ： 矽多年7 月砂日 寄生基因编码蛋白质结构特点分析及数学分类模型建立 1 分泌蛋白质 1前言 蠕虫( 线虫、绦虫、吸虫) 寄生是影响范围最广的寄生虫病之一，全世界 大约有2 0 亿人是蠕虫携带者，特别是在一些经济不发达地区尤其严重f l j 。并且， 这类寄生虫中的一些种类是主要的家畜、家禽和农作物寄生虫，给世界农业发展 造成巨大损失。与病毒、细菌、原虫不同，蠕虫寄生并不是依靠高速的自我复制 以及频繁的基因突变来实现寄生生活的成功。蠕虫侵入宿主，并且在宿主体内发 育成熟，产生受精卵或幼虫，由宿主排出体外或迁移到其它宿主开始新一轮生活 史。寄生蠕虫能分泌出一系列蛋白质到体表或者宿主体内，这类蛋白质被称为分 泌蛋白质( e sp r o t e i n s ) ，它们具有不同的生物功能，它们帮助蠕虫入侵宿主组 织，抵抗宿主免疫系统，是蠕虫能成功完成寄生生活的关键因素。这些蛋白质复 杂多样，各有功能，包括：蛋自质水解酶类，它们帮助蠕虫侵入宿主组织，消化 胞外蛋白质，并且对寄生虫取食有重大作用【2 ，3 ，4 j ：蛋白酶抑制剂类，它们不仅抑 制宿主的蛋白酶，还抑制蠕虫自身的蛋白酶以调节蠕虫发育过程1 5 j ：细胞因子同 源物，与蛋白酶抑制剂共同作用，能影响宿主t h 2 类型的炎症反应【6 ，7 ，剐；氧化 物还原酶类，保护寄生虫不受主要由宿主巨噬细胞产生的过氧化物等的伤害一j ； 物质代谢酶类，改变宿主细胞新陈代谢过程，为蠕虫提供合适的食物来源等 w l 。 这类与蠕虫寄生生活密切相关的蛋白质是蠕虫最为适应寄生生活的进化特征，因 此，这类蛋白质又被称为寄生蛋白质，而表达它们的基因被称为寄生基因。 分泌蛋白质是蠕虫得以完成寄生生活的关键因素，因此对它们的研究是研 究蠕虫寄生机制，并从中寻求疫苗及药物用以防治蠕虫危害的重要手段。目前， 对这类蛋白质的研究主要从分离分泌蛋白质、分离与寄生有关的e d n a 来进行的。 抗原抗体特异识别反应、h p l c 及二维聚丙烯酰胺凝胶电泳在分泌蛋白质的研究 上得到广泛的应用。指纹图谱技术与基因芯片技术比较线虫不同生活时期及不同 组织m r n a 的表达情况筛选与寄生相关的基因；建立寄生虫e s t e d n a 文库，通 过对同源基因的筛选、核酸杂交技术、抗体识别表达e d n a 文库分离寄生相关基 因都是重要的研究方法。r n a i 技术也是研究基因功能的有力手段，已越来越多 地应用到寄生相关基因的研究上。随着基因组技术和生物信息学的发展，大规模 高通量研究亦可以实现【i 。我们先就已发现的蠕虫分泌蛋白质综述如下。 1 1 蛋白质水解酶 根据蛋白酶在活性位点上的残基种类，可以将蛋白酶分为：丝氨酸蛋白酶、 天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。蛋白质水解酶催化一系列重要 4 寄生基冈编码蛋白质结构特点分析及数学分类模型建立 的生化反应，这些反应在激活各种酶类、激素及多肽营养的获得中起重要作用； 此外，在凝血反应、纤维蛋白溶解、蛋白质代谢和免疫反应及组织重建中也发挥 重要的作用【1 2 b l 。 蛋白质水解酶对自由生活及寄生生活的原虫、蠕虫、节肢动物同样重要。例 如，线虫的蜕皮过程受到激素的调节，并且有各种蛋白质水解酶参与降解表皮蛋 白质。分泌蛋白质水解酶降解表皮并完成蜕皮过程是所有线虫所共有的特征，包 括自由生活线虫和寄生生活线虫【l 训。半胱氨酸蛋白酶对秀丽线虫的胚胎发生具有 重要作用。研究表明，若缺乏半胱氨酸蛋白酶活性，则卵黄蛋白将发生异常修饰 和或蛋白质构象变化，使得卵黄发生不正常盘状聚剿”】。蛋白质水解酶的这类 功能也是自由生活线虫与寄生生活线虫所共有的。但是，分泌蛋白质降解细胞外 基质的能力却是寄生线虫所特有的。有实验表明，秀丽线虫无论在幼虫期还是成 虫期都不会分泌出蛋白酶，更不会降解细胞外基质【l6 1 。分泌蛋白质水解酶是线虫 由自由生活的幼虫状态转变为寄生生活状态的重要特征【1 7 嘲。蛋白质水解酶能 帮助寄生虫入侵宿主组织、降解宿主蛋白质。并且，它们能保护寄生虫免于受宿 主免疫反应的伤害，防止宿主血液凝集【i2 1 。 1 1 1降解细胞外基质 最早发现的具有降解细胞外基质功能的分泌蛋白酶是金属蛋白酶及丝氨酸 蛋白酶，并且在多种蠕虫中均有发现【1 2 ，1 9 2 劲。如旋盘尾线虫( o n c h o c e r c av o l v u l u s ) 及马来布鲁丝虫( b r u g i am a l a y i ) 能分泌出具有降解胶原蛋白质的金属蛋白酶及 丝氨酸蛋白酶1 2 ，并且在旋盘尾线虫中，这类分泌蛋白酶能降解细胞外基质蛋白， 如纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白i v ，但不能降解免疫球蛋l 兰t i g g 。并且 这些蛋白质在p h 中性时活性最耐2 3 j 。 最近的研究发现，半胱氨酸蛋白酶也在蠕虫侵入宿主组织中起重要作用【2 】。 有些物种分泌出半胱氨酸蛋白酶不仅用于线虫在宿主中的移行，而且在线虫对宿 主组织的取食过程中起重要作用，如捻转血矛线虫( h a e m o n c h u sc o n t o r l u s ) 、巴 西日圆线虫( n i p p o s t r o n g y l u sb r a s i l i e n s i s ) 、鼠类圆线虫( s t r o n g y l o i d e sr a t t i ) 及 犬钩虫( a n c y l o s t o m ac a n i n u m ) 。寄生蠕虫的半胱氨酸蛋白酶比它们的宿主表达 的同源蛋白酶能适应更广泛的化学环境。除了组织蛋白酶s ，哺乳动物表达的半 胱氨酸蛋白酶只在偏低的p h 值范围内具有活性，而寄生蠕虫的半胱氨酸蛋白酶 在p h 中性时活性最高。这些能在p h 中性时表现高活性的蛋白酶说明这类蛋白质 的功能是表现在溶酶体外的，是表明其具有在细胞外降解蛋白质功能的重要依 据。 研究还发现，天冬氨酸蛋白酶同样具有降解细胞外基质的功能。在美洲板 口钩虫( n e c a t o ra m e r i c a n u s ) 中发现分泌出的天冬氨酸蛋白酶可以降解胶原蛋 寄生肇凼编码蛋白质结构特点分析及数学分类模型建立 白i 、i i i 、i v 、v 型，及纤维粘连蛋白、层粘连蛋白及弹性蛋白，说明这个蛋白酶 对美洲板口钩虫侵入宿主皮肤组织可能具有重大的作用【2 训。 1 1 2 降解血球蛋白 对宿主蛋白质降解机制研究最为清楚的两个寄生虫蛋自酶系统为恶性疟原 虫( p l a s m o d i u m f a l c i p a r u m ) 消化液泡内的蛋白酶f a l c i p a i n2 【2 5 j 和曼氏血吸虫 ( s c h i s t o s o m am a n s o n i ) 肠道表达的组织蛋白酶b 1 2 0 3 。研究发现血球蛋白降解蛋 白酶系统同样在肝片吸虫( f a s c i o l ah e p a t i c a ) 中表达，这个蛋白酶系统包括： 组织蛋白酶b 、组织蛋白酶l 同源蛋白酶，二肽酰肽酶i 及天冬酰胺内肽酶【2 。相 似的血球蛋白及纤维粘连蛋白降解途径可能也存在于以血液为食的线虫e s 分泌 蛋白质中。 美洲板口钩虫的成虫寄生在人小肠内，它们吸附在小肠壁上，以血液及组织 分泌物为食。美洲板口钩虫的成虫分泌蛋白质包含了多种蛋白酶，至少包括个 组织蛋白酶b 及组织蛋白酶l 同源物，一个天冬氨酸、一个丝氨酸蛋白酶1 2 8 j ；并 且还有报道称在分泌蛋白质中还检测到具有抗凝血作用的金属蛋白酶活性【2 引。捻 转血矛线虫是以血液为食的寄生虫，它寄生在羊及反刍动物的胃里。第四期幼虫 与成虫的寄生将造成严重的皱胃粘膜损伤，以及慢性贫血。从捻转血矛线虫分泌 蛋白质中发现能降解纤维粘连蛋白及血红蛋白的半胱氨酸蛋白酶及天冬氨酸蛋 白酶p o 孔j 。体外实验表明，虽然被降解的血红蛋自减少了5 0 ，半胱氨酸蛋白酶 抑制剂并不能阻止捻转血矛线虫对血红蛋白的吸收【3 2 l 。这可能说明半胱氨酸蛋白 酶在血红蛋白的降解中起重要作用，但是在寄生虫吸收血红蛋白的过程中不起作 用。这个过程可能由金属蛋白酶及丝氨酸蛋白酶来完成。 1 1 3 破坏宿主免疫反应 研究发现，许多寄生虫分泌的半胱氨酸蛋白酶具有抑制t l l l 免疫反应的作用 【3 引。肝片吸虫分泌出的组织蛋白酶l 能抑制干扰素i y n y 的产生及t 1 1 l 型免疫反 应p2 | 。并且肝片吸虫分泌出的组织蛋白酶l 能抑制羊t 细胞的增殖，减少人与牛t 细胞表面c d 4 + 分子的表达【3 4 1 。在猪带绦虫( t a e n i as o l i u m ) 分泌蛋白质中也发现 了半胱氨酸蛋白酶具有抑制人淋巴细胞c d 4 + 分子的表达的功能。这表明猪带绦 虫可能通过调节c d 4 + 分子的表达来控制宿主的炎症反应1 3 引。联系更早期的研究， 发现猪带绦虫的寄生能抑制细胞因子i l 2 、i f n 吖、i l 4 和t n f c t 的表达i 删，因此 半胱氨酸蛋白酶对宿主体液免疫和细胞免疫反应均有重大的影响。 蠕虫分泌蛋白酶对宿主免疫反应的破坏还表现在对免疫球蛋白的降解上。 这个功能对寄生虫能成功完成寄生生活有重要的作用，不仅表现在寄生虫通过降 解免疫球蛋白破坏了宿主产生的以抗体为依托的细胞毒性1 3 7 1 ，并且免疫球蛋白的 6 寄生基冈编码蛋白质结构特点分析及数学分类模型建立 降解产物是具有与免疫活性细胞表面受体相结合并促进细胞因子释放的功能p 引。 因此，免疫球蛋白的降解可能影响到某些蠕虫能否成功实现寄生生活。曼氏血吸 虫表达的胰蛋白酶类似物与氨基肽酶可以在免疫球蛋白保守区域( f c ) 被蠕虫受 体结合的时候降解其抗原结合域( f a b ) 3 9 】。而肝片吸虫可以释放出具有在体外 降解哺乳动物免疫球蛋白能力的组织蛋白酶b 和l 的同源蛋白质1 3 7 , 4 0 ；并且其组 织蛋白酶l 可以阻止由抗体介导的嗜酸性粒细胞对幼虫的吸附。猪带绦虫中发现 的金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶在体外具有降解免疫球蛋白的 能力【4 l 】，在犬恶丝虫( d i r o f i l a r i ai m m i t i s ) 微丝蚴中分离到的丝氨酸蛋白酶也具 有降解免疫球蛋白的功能【4 2 1 。 1 2 蛋白酶抑制剂 蛋白质水解酶在所有的生物体内都有存在，它们参与多种蛋白质信号传递， 是调节生物体生长，发育和免疫防御的重要功能蛋白质。因此，蠕虫分泌的蛋白 酶抑制剂在蠕虫与宿主角力过程中就显得尤其重要。 1 2 1 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 在寄生虫中第一个被发现的半胱氨酸抑制剂是从旋盘尾线虫中发现的【4 引。最 初，研究发现这个蛋白质的底物是寄生虫自身表达的半胱氨酸蛋白酶，其调节线 虫的蜕皮过程。然而，随后对维特氏棘唇线虫( a c a n t h o c h e i l o n e m av i t a e ) 的研 究发现，该线虫在不发生蜕皮的雄虫成虫期及血液寄尘的微丝蚴期也能分泌出半 胱氨酸蛋白酶抑制剂m l ，这表明蠕虫分泌的蛋白酶抑制剂可能不仅仅以自身表达 的蛋白酶为底物。随着研究的深入，发现丝虫【4 5 】及消化道线虫表达的半胱氨 酸蛋白酶抑制剂能抑制参与降解蛋白质的组织蛋白酶l 和s 。并且，在马来布鲁 丝虫分泌的半胱氨酸蛋白酶抑制剂能抑制一类天冬酰胺酰内肽酶l e g u m a i n h 丌。这 表明线虫表达的半胱氨酸抑制剂既能抑制自身表达的半胱氨酸蛋白酶，又能抑制 宿主表达的蛋白酶，并且对宿主抗原呈递过程起抑制作用。这类天冬酰胺酰内肽 酶参与抗原呈递过程的蛋白质降解，这类肽酶还能降解组织蛋白酶s 、l 和f m 4 9 1 ，其中组织蛋白酶s 和l 在酶切m h ci i 型异链中起重要作用。相似的结果 也在巴西r 圆线虫中发现，在体外实验中，巴西日圆线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制 剂可以抑制组织蛋白酶b 和l 的降解，表明它可能对同样在溶酶体内发生的抗 原降解过程能起抑制作用【4 剐。 除了抑制蛋白酶活性，线虫表达的半胱氨酸蛋白酶抑制剂还具有影响细胞 因子表达的功能。已检测出丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有诱导一系列具有抗炎 症反应的细胞因子表达的功能脚，4 5 1 。用旋盘尾线虫和秀丽隐杆线虫 ( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 表达的半胱氨酸蛋白酶抑制剂分别感染人外周血单核 7 寄生基因编码蛋白质结构特点分析及数学分类模型建证 细胞( p b m c ) ，发现与秀丽隐杆线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂诱发t h l 类型细 胞因子( 包括t n f a ，i l 1 2 ) ，并能促进t 细胞增殖【5 0 l ，旋盘尾线虫的却能诱发 细胞因子t n f q 的表达，促进i l 1 0 的表达而降低i l 1 2 的表达，这些都是抑制 炎症的t h 2 类型免疫反应【45 ，并且能抑制t 细胞增殖。线虫半胱氨酸蛋白酶抑 制剂所引发的不同细胞因子表达的分子机制还不清楚。妨碍宿主抗原呈递过程， 抑制t 细胞增殖，这些功能都是寄生线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂所特有，而自由 生活线虫不具有的功能。说明寄生线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂可能是在线虫与宿 主共进化过程中进化而来的【”j 。 与其它物种表达的半胱氨酸蛋白酶抑制剂相同，寄生线虫表达的半胱氨酸蛋 白酶抑制剂同样具有促进由i f n 0 7 介导的巨噬细胞对一氧化氮的表达【5 0 】。由鸡半 胱氨酸蛋白酶抑制剂诱导表达的一氧化氮足以治愈小鼠的利氏曼原虫病【5 2 】，并且 一氧化氮也能够抑制受丝虫感染的小鼠抗原特异t 细胞的增殖例。因为丝虫半 胱氨酸蛋白酶抑制剂是很强的一氧化氮诱导剂，它可能对杀死微丝蚴即抑制t 细胞免疫反应起作用。 1 2 2 丝氨酸蛋白酶抑制剂 丝氨酸蛋白酶抑制剂在哺乳动物中是最重要的调控蛋白之一。它们具有多种 细胞外功能，如补体激活、纤维蛋白溶解、凝血和炎症反应1 5 4 1 。丝氨酸蛋白酶抑 制剂在秀丽隐杆线虫、寄生线虫和吸虫( s c h i s t o s o m a ) 中都有发现 5 引。在这之中， 一类特殊的小分子丝氨酸蛋白酶抑制剂被发现，成为s m a p i n 。这些小分子均小 于1 0 0 个氨基酸残基，并且具有1 0 个保守半胱胺酸残基，形成5 个二硫键。 虽然线虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂与哺乳动物的同源性很低，它们的序列在特 定位点具有很高的保守性【55 。由于丝氨酸蛋白酶抑制剂在哺乳动物免疫反应中起 重要的作用，我们可以猜测线虫分泌出的丝氨酸蛋白酶抑制剂对抑制宿主免疫反 应可能有重要作用。研究发现，马来布鲁丝虫丝氨酸蛋白酶抑制剂b m s p n 2 在 线虫入侵宿主组织时起重要作用，它能抑制由嗜中性粒细胞表达的丝氨酸蛋白 酶、组织蛋白酶g 和弹性蛋白酶。由于由嗜中性粒细胞表达的组织蛋白酶g 是 重要的t 淋巴细胞和单核细胞刺激物，所以b m s p n 2 对抑制宿主免疫反应可能 起重要作用，但还需进一步研究。吸虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫体表和内 部都有发现，并且分子质量要比其他物种表达的高，具有复杂的结构，可能还具 有同源的蛋白酶活性1 5 叫。吸虫蛋白酶抑制剂，s m p i 5 6 ，拥有抑制自身表达的及宿 主表达的弹性蛋白酶活性，说明这个蛋白酶抑制剂可能具有调节自身弹性蛋白酶 活性的能力，有可能参与抑制宿主炎症反应中嗜中性粒细胞的激活。 在寄生虫中，小分子丝氨酸蛋白酶抑制剂按功能划分可分为两类。一类是如 在蛔虫属( a s c a r i s ) 中表达的s m a p i n ，它能保护蛔虫不受宿主蛋白酶降解。这 8 寄生基冈编码蛋白质结构特点分析及数学分类模型建立 些抑制剂在发育中的虫卵表面、幼虫体表及虫体肠道上皮细胞表面分布，与宿主 蛋白酶相结合，形成酶一抑制剂复合物。这些在幼虫体表表达的s m a p i n 在幼虫 移行过程中可能还起到保护幼虫免受宿主免疫系统伤害的作用。对钩虫来说，这 类蛋白酶抑制剂起到抗凝血的作用。在犬钩虫中发现的不同小分子丝氨酸蛋白酶 抑制剂拥有不同的抑制宿主凝血丝氨酸蛋白酶底物。在猪毛首线虫( t r i c h u r 括 s u i s ) 成虫中发现两个糜蛋白酶抑制剂，t s t c i 和t s c e i ，可能对肥大细胞相关 的、蛋白酶介导的免疫反应起抑制作用【57 1 。从绦虫( t a e n i at a e n i a e f o r m i ) 分离 发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂能抑制鼠淋巴细胞表达的细胞因子i l 1 和i l 2 ，它 是抑制宿主免疫反应的重要影响因烈5 5 j 。 1 2 3 天冬氨酸蛋白酶抑制剂 天冬氨酸蛋白酶抑制剂在多个寄生线虫及秀丽隐杆线虫中均有发现。这些线 虫表达的天冬氨酸蛋白酶抑制剂都具有一个信号肽序列，并且成熟的蛋白质有四 个保守的半胱氨酸残基位点【5 8 1 。从旋盘尾线虫分离出的0 v 3 3 5 9 1 及猪蛔虫( a s c a r i s s u u m ) 中分离出来的i p 3 【6 0 】能抑制天冬氨酸蛋白酶如胃蛋白酶和组织蛋白酶e 的酶活性。猪蛔虫表达的天冬氨酸蛋白酶抑制剂已被证实具有抑制宿主胃内的蛋 白酶活性，保护幼虫不被消化的功能。而从犬钩虫和蛇形毛圆线虫 ( t r i c h o s t r o n g y l u sc o l u b r i f o r m i s ) 中分离得到的天冬氨酸蛋白酶抑制剂a c a p i 6 1 】 和t c o a p i 1 1 5 州不具有抑制猪胃蛋白酶的功能。有些线虫能分泌非溶酶体天冬氨 酸蛋白酶到体外，在分泌时可能是以酶一抑制剂复合物的形式出现，这种形式能 抑制蛋白酶的活性。a c a p i 在线虫所有发育阶段都有表达，并且在成虫分泌的 蛋白质中出现，表明a c a p i 可能能影响宿主免疫反应。旋盘尾线虫表达的天冬 氨酸蛋白酶抑制剂o v 3 3 能诱导免疫球蛋白i g e 和i g g 4 抗体的表达1 5 9 l ，因此线 虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂被认为能诱发宿主t h 2 型免疫反应。并且由于线虫表达 的天冬氨酸蛋白酶抑制剂能抑制组织蛋白酶e 的活性，而组织蛋白酶e 对宿主 的抗原呈递有重要的作用。因此，天冬氨酸蛋白酶抑制剂对破坏宿主的免疫反应 可能起关键作用。 1 2 4 金属蛋白酶抑制剂 第一个寄生蠕虫金属蛋白酶抑制剂同源蛋白质是从犬钩虫( 彳c a n i n u m ) 中 分离出来的a c t m p ，这个蛋白与人和秀丽隐杆线虫的金属蛋白酶抑制剂具有比 较高的同源性，尤其是在n 端。a c t m p 的生物学功能还不清楚，但它是犬钩虫 分泌蛋白质中量最多的蛋白质之一，这意味着它可能在线虫与宿主间相互作用上 有重要作用，成为疫苗研究的热点之一1 6 2 1 。 1 3 细胞因子同源物 9 寄生基因编码蛋白质结构特点分析及数学分类模型建立 研究发现肠道线虫鼠鞭虫( t r i c h u r i sm u r i s ) 分泌一种与干扰素i f n 吖同源 的蛋白质，它能结合宿主淋巴细胞表达的干扰素受体，并诱发与宿主自身表达的 干扰素i f n q 相似的细胞反应【6 川。同样，在肥头绦虫( t a e n i ac r a s s i c e p s ) 分泌蛋 白质中发现一种与鼠源干扰素i f n 吖具有相似功能的蛋白质p 6 6 。它能够诱导脾 脏t 细胞增殖，并且促进这些细胞中干扰素i f n 吖及白细胞介素i l 1 0 的表达。 并且，p 6 6 能促进巨噬细胞分泌具氧化毒性的一氧化氮产物( n o ) 6 4 1 。p 6 6 及鼠 鞭虫分泌的i f n 吖同源蛋白质在调节宿主免疫反应中起怎样的作用还需进一步 研究。 在蠕虫中，发现了p 转化生长因子( t g f p ) 的表达。p 转化生长因子是一 类多功能蛋白质，并且构成一类基因超家族。它们参与多种蛋白质信号传导，在 发育过程及免疫反应过程中起重要作用【6 引。在马来靠鲁丝虫中发现了两个b 转 化生长因子的同源蛋白质，分别命名为b m t g h 1 和b m t g h 2 。在蠕虫寄生过 程中，b 转化生长因子的主要作用是抑制宿主炎症反应，如抑制一氧化氮的产生。 为了达到这个目的，蠕虫p 转化生长因子必须能够与宿主多转化生长因子相互 作用。从蛋白质一级结构来看，b m t g h 1 的结构与组织分化诱导蛋白质具有更 高的同源性m j ，而b m t g h 2 则与秀丽隐杆线虫蛋白质d a f 7 以及哺乳动物细 胞因子t g f 1 3 更为近似【s j ，并且，b m t g h 2 在幼虫期及成虫期都有表达，并能 分泌到体外，在体外实验中b m t g h 2 能与宿主b 转化生长因子受体相互作用。 研究还发现，蠕虫与哺乳动物同样表达i 型和i i 型d 转化生长因子受体家族蛋白 质【6 7 ，6 8 1 。虽然只有i 型p 转化生长因子受体家族蛋白质从马来丝虫及血吸虫中分 离出来，但是在秀丽线虫中分离出p 转化生长因子受体( 如d a f - 4 ) 表明在蠕虫 寄生虫中可能也存在着两种类型的受体。 巨噬细胞抑制因子( m i f ) 参与引发哺乳动物获得性免疫应答，并且是t 细胞活性的重要调节因子【6 9 1 。第一个蠕虫巨噬细胞抑制因子同源蛋白质是从旋毛 虫( t r i c h i n e l l a s p i r a l i s ) 中分离得到的【7 。巨噬细胞抑制因子同源蛋白质在彭亨 布鲁丝虫( b r u g i a p a h a n g i ) 、马来布鲁丝虫( 丑m a l a y i ) 、班氏丝虫( w u c h e r e r i a b a n c r o f t i ) 、旋盘尾线虫、鼠鞭虫【7 i 7 2 1 和人鞭虫( t r i c h u r i st r i c h i u r a ) 7 3 】中发现。 哺乳动物源与丝虫表达的巨噬细胞抑制因子具有高度保守的半胱酰胺残基位点， 这些位点被认为与氧化还原反应有关p 引。通过氨基酸序列比对发现，旋毛虫和人 鞭虫表达的巨噬细胞抑制因子与哺乳动物的及其它线虫表达的同源蛋白质分别 有2 5 和4 6 的相似性，这些蛋白质都有共同的保守位点。但是，旋毛虫和人 鞭虫表达的巨噬细胞抑制因子缺乏半胱氨酸残基1 7 3 1 。与入源巨噬细胞抑制因子作 用相似，旋毛虫分泌的巨噬细胞抑制因子在体外同样表现出抑制单核细胞迁移及 趋化作用的功能。旋毛虫分泌的巨噬细胞抑制因子在分泌蛋白质中的浓度达到 1 8 5 5n g m g 蛋白质，远远高于人血清中的浓度( 0 0 4 - , - 0 4n g m g 血清蛋白) ， i o 寄生基因编码蛋白质结构特点分析及数学分类模型建芷 这样的浓度应该足以抑制单核细胞向被寄生组织迁移。总之，无论从结构上还是 对细胞迁移的抑制能力上，对旋毛虫巨噬细胞抑制因子的研究都表明这个蛋白质 是同源蛋白质，并且可能对破坏宿主免疫防御起重大作用。 1 4过氧化物还原系统 对所有好氧生物来说，过氧化物还原系统对生物的生存都具有重大的意义， 它们能保护分子不受活性氧自由基的破坏。活性氧自由基包括超氧自由基 ( 0 2 - - ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 及羟自由基( o h ) 等。寄生虫不仅受到自身细胞代谢产生 的活性氧自由基的威胁，它们还受到宿主嗜中性粒细胞和巨噬细胞受寄生刺激而 产生的活性氧自由基的威胁【7 4 】。 1 4 1 谷胱甘肽过氧化物酶 超氧化物歧化酶及降解超氧自由基的酶在各种蠕虫中均有发现【7 5 j ，但是却 极少发现分解羟自由基的酶。由于过氧化氢和超氧自由基裂解后都将形成羟自由 基，因此对过氧化氢和超氧自由基的防御是控制羟自由基的关键步骤。在哺乳动 物中，对这两种活性氧自由基的防御是由硒依赖型谷胱甘肽过氧化物酶来完成 的。这个酶催化过氧化氢及氢过氧化物还原，而自身谷胱甘肽被还原成谷胱甘肽 二硫化物1 9 1 。但是，在寄生线虫内并没有发现硒依赖型谷胱甘肽还原酶，却有不 含硒的谷胱甘肽还原酶存在。这类不含硒的谷胱甘肽还原酶只有很低的或不具有 催化还原羟自由基的功能。与哺乳动物的谷胱甘肽还原酶主要定位在细胞质及线 粒体中不同，寄生线虫的还原酶分布在体表，是一类具有分泌能力的变异体。这 类还原酶在彭亨布鲁丝虫【7 6 l 、马来布鲁丝虫、班氏丝虫以及犬恶丝虫中均有发现， 但是在旋盘尾线虫并没有发现1 9 】。这类还原酶具有还原脂肪酸和磷酸化氢过氧化 物的能力，但是不具有催还还原过氧化氢的能力。 1 4 2 过氧化氢酶 另一类过氧化氢酶( c a t a l a s e ) 能将过氧化氢分解成水和氧分子，这类酶虽 然在寄生线虫中被检测到，但是活性较低。然而，在某些寄生虫，如捻转血矛线 虫【7 7 1 和猪蛔虫f 7 8 1 中发现一类结构特异的过氧化氢酶，并且从马来布鲁丝虫中还 分离得到一种具有高活性的过氧化氢酶【7 9 】。 1 4 3 过氧化物酶 近来，新的过氧化物酶( p i ) 被发现，并且研究还发现这类过氧化物酶 是寄生线虫及其他寄生虫催化还原过氧化氢的最主要的催化酬8 0 l 。在寄生线虫 中，p r x 既参与过氧化物还原反应，又参与细胞信号传导，其