（微生物学专业论文）链霉菌sm037抑制绿脓杆菌活性物质合成条件及提取方法研究.pdf

摘要 从l a 含量为1 4 0 0 p p m 的土壤中筛选对绿脓杆菌有抑制活性的放线菌株，其中菌 株s m 0 3 7 的抑制活性较高，并且对金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、鸡白痢、大 肠杆菌、白色念珠菌均有抑菌作用，是一株具有广谱抗菌活性的菌株，因此实验对 s m 0 3 7 进行了进一步的研究。 根据s m 0 3 7 菌株在高氏1 号上的菌丝形态、孢子形状；在不同培养基上的培养 特征及明胶液化、淀粉水解、纤维素上生长情况、h 2 s 的产生、碳源利用等一系列生 理生化特征，将s m 0 3 7 菌株归类为金色类群，初步鉴定为黄雀链霉菌黄雀变种。 为提高抑菌活性物质的产量，对s m 0 3 7 的液体培养基成分进行了优化。通过杯 碟法检测发酵液中活性物质的含量，筛选出最佳碳源为可溶性淀粉，最佳氮源为硝酸 钾：通过改变碳、氮比的实验及关于碳、氮源及磷酸盐的正交实验，获得碳源、氮源 及磷酸盐配比为：可溶性淀粉4 ，k n o ，o 2 ，k 2 h p 0 4o 0 5 。 发酵工艺条件的研究结果表明最适初始p h 为7 5 8 0 ，最适温度为2 8 ，最适 接种量为7 ，2 5 0 m l 的三角瓶装入5 0m l 为最佳装液量，最适接种菌龄4 8 h 。在优化 后的培养基和最佳发酵条件下，9 6 1 0 8 h 抑菌活性物质的分泌量达到最高峰。经过 培养基和发酵条件的优化，发酵液中抑菌活性物质的效价由原来的3 2 6 u m l 1 提高至 1 5 9 2 u m l 。 发酵液的抑菌活性物质在6 0 。c 水浴3 0 m i n 后仍然稳定，在7 0 。c 时开始变性， 8 0 1 2 1 活性丧失较快。在碱性条件下，发酵液的抑菌活性能力随着p h 值逐渐上升 而缓慢减少；在酸性条件下，随着p h 逐渐下降，抑菌活性降低较快。实验说明，该 抑菌活性物质在碱性条件下较稳定，在酸性条件下不稳定。 对发酵液进行醇沉、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、g f 2 5 4 硅胶板薄层分析等方法 进行活性物质的分离纯化，用质谱检测活性物质的分子量，发现活性物质中主要含有 三个信号较强的物质，分别记为s i ，s i i ，s i i i 。对s i ，s i i ，s i i i 的二级质谱进行 分析，结合天然活性物质库查询，推测s i ，s i i ，s i i i 的可能分子式为c l o h l5 n 3 0 3 ， c 1 7 h z s n s 0 8 ，c 2 4 h 5 2 n s 0 2 分别为抗生素e u l i c i n ，c a i r o m y c i nb 和a n t i b i o t i cl l a c5 4 1 。 关键词：链霉菌抑菌活性物质分类鉴定发酵条件分离纯化 a b s 仃a c t n i n t y - e i g h t a c t i n o m y c e t es t r a i n sp r o d u c i n ga n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e st or e s t r a i nt h e g r o w t ho fp s e u d o m o n a sa e r u g m o s a , w e r ei s o l a t e df r o mt h es o i lw i t h1 4 0 0p p mo fl a 2 0 3 i ni t a m o n gt h e s es t r a i n s ，s m 0 3 7h a dt h es t r o n g e s ta c f i v i t ya g a i n s t 尸a e r u g i n o s a ， s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s s ( g r a m - p o s i t i v eb a c t e r i a ) ，b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ( g r a r n - p o s i t i v e b a c t e r i a ) ，e s c h e r i c h i ac o b ( g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a ) ，s a l m o n e h ap u l l o r u m ( g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a ) a n dc a n d i d aa l b i c a n s ( f u n g a l ) t h a tm e a n tt h es t r a i ns m 0 3 7w a sas t r a i no f y i e l d i n gb r o a d s p e c t r u ma n t i b i o t i c ，a n dh a sb e e ns t u d i e df u r t h e ri nt h i sp a p e r a c c o r d i n gt ot h em o r p h o l o g yo f m y c e l i u ma n ds p o r e si ng a u s e ss y n t e f i cn o lm e d i a ， t h eg r o w t hf e a t u r e si nd i f f e r e n tm e d i a ，t h ec a p a b i l i t yo fu s i n go fas e r i e sc a r b o nr e s o u r c e s ， t h ep h y s i o l b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c si n c i u d i n gt h ea b i l i t yt ol i q u a t eg e l a t i n ，t oh y d r o l y z e s t a r c ha n dc e l l u l a s ea n d t o p r o d u c eh 2 s ，t h e s m 0 3 7w a si d e n t i f i e da s s t r e p t o m y c e sc a n a r i e sv a t c a n a r i e st e n t a t v i l y f o ri n c r e a s i n gp r o d u c t i o no fa n t i b i o t i c ，t h el i q u i dm e d i ac o m p o s i t i o nw a ss t u d i e d a n t i b i o t i cc o n t e n to ft h ef e r m e n t e dl i q u i dw a sd e t e r m i n e db yc y l i n d e p l a t em e t h o d t h e s c r e e n i n gd a t ai n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a lc a r b o ns o u r c ew a ss o l u b l es t a r c h ，a n dt h eo p t i m a 】。 n i t r o g e ns o u r c ew a sk n 0 3 b yc h a n g i n gt h er a t i oo fc a r b o ns o u r c ea n dn i t r o g e ns o n r c e ， a n db yu s i n gt h eo r t h o g o n a lt e s t so fc a r b o n , n i t r o g e na n d p h o s p h a t e ，t h eo p t i m a l 。p r o p o r t i o n o ft h e s ec o m p o n e n t + sw a so b t a i n e d t h ep e r c e n t a g eo ft h e s ec o m p o n e n t sw a sa sf o l l o w i n g ， s o l u b l es t a r c h4 k n 0 30 2 a n dk 2 h p 0 40 0 5 t h es t u d ys h o w e dt h a ts u i t a b l et e c h n i c a lp a r a m e t e r si nf e r m e n t a t i o nw e r e ：i n i t i a lp h 7 0 - 7 5 7 i n o c u l u m ：i na5 0m ll i q u i d ( i n2 5 0 m lf l a s k ) a t2 8 u n d e rt h es u i t a b l e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o na n di nt h eo p t i m a lm e d i at h ea n t i b i o t i cy i e l do fs t r a i ns m 0 3 7 r e a c h e dm a x i m u md u r i n g9 6 - - 1 0 8h o u r s a f t e rt h eo p t i m i z a t i o ns t u d y i n go ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ，t h ep o t e n c yu n i to ff e r m e n t a t i o nl i q u o rw a si n c r e a s e df r o m3 2 6 u m l 一1t o 1 5 9 2 u m l t h ea b i l i t yo fb i o l o g i c a la c t i v es u b s t a n c e si nf e r m e n t a t i o nl i q u i dk e p ts t a b l ei n6 0 。c w a t e r b a t hf o r3 0 m i n ，s t a r t e dt od e c l i n ea t7 0 c ，a n dt h ea c t i v i t yr e d u c e df a s tb e t w e e n8 0 a n d1 2 1 i nt h ea l k a l ie n v i r o n m e n t ，t h ea n t i m i c r o b e sa b i l i t yo ff e r m e n t a t i o n l i q u i d s l o w l yr e d u c e dw i t ht h ei n c r e a s i n go fp hv a l u e ，a n do nt h eo t h e rh a n d ，a st h ep hv a l u e r e d u c i n g ，t h ea n t i o r g a n i s ma c t i v i t yr e d u c e dq u i c k l yi na c i d i ce n v i r o n m e n t t h es t u d y s h o w e dt h a tt h ea c t i v es u b s t a n c e si ss t a b l ei n a l k a l ie n v i r o n m e n ta n du n s t a b l ei na c i d i c e n v i r o n m e n t i i t h e b i o l o g i c a l a c t i v es u b s t a n c e sw e r ep u r i f i e dt h r o u g he m p l o y i n gd i f f e r e n t f r a c t i o n a t i o na n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d ss u c ha se x t r a c t e db ye t h y la c e t a t e ，c h r o m a t o g r a p h e d b y2 0 0 3 0 0s i z es i l i c ac o l u m n ，a n dd e t e r m i n e db ys i l i c ag f 2 5 4 ，b ym sc h e c k i n g ，t h r e e m a i ns u b s t a n c e sw e r ef o u n d ，w h i c hn a m e ds - i ，s - i i ，a n ds i i i a c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i so f m sd a t aa n dt h es e a r c h i n gr e s u l t so ft h eb i o l o g i c a la c t i v es u b s t a n c ed a t ab a s e ，t h e s t r u c t u r e so fs i ，s i i ，a n ds - 1 1 1w e r ed e t e r m i n e dp r i m a r i l ya sc l o h l 5 n 3 0 3 ，c i t h 2 8 n s o s ， a n dc 2 4 h 5 2 n s 0 2w h i c ha r ee u l i c i n ，c a i r o m y e i nba n da n t i b i o t i cl l - a c5 4 1r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：s t r e p t o m y c e s ，a n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e s ，i d e n t i f i c a t i o n ，f e r m e n t a t i o n p a r a m e t e r s ，e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o n i i i 独创性声明 9 5 0 7 3 0 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 _ 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：幽 时间：2 0 0 6 年5 月2 8 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名时间：2 0 0 6 年5 月2 8 日 导师签名：2 逊时间：2 。6 年5 月2 8 日 综述 1 链霉菌抗生素生物合成基因表达与调节 链霉菌在分类地位上属放线细菌纲，放线菌目，链霉菌科。它是一类胞壁类型为i 型、革兰氏阳性、好气，g + c 含量为6 9t 0 0 1 7 8t o o l 的放线菌【l 2 j 。链霉菌具 有广泛的物种多样性和代谢多样性，是重要的资源微生物。自2 0 世纪4 0 年代初， w a k s m a n 用链霉菌进行系统筛选新抗生素以来，放线菌已被认为是新抗生素产生菌的 主要来源。至今发现的近万种天然抗生素中约有2 3 由放线菌产生，其中许多具有重 要的医学价值而应用于临床。放线菌中又以常见放线菌链霉菌产生抗生素种类最 多，占总数的5 2 咙。在链霉菌中大多数抗生素生物合成途径十分复杂，涉及多种基因 和协同调节机制p l 。 1 1 抗生素生物合成基因簇 抗生素的生物合成过程涉及到几十个基因产物的作用，这些基因往往呈簇状排列 在染色体上。这些基因簇中含编码抗生素生物合成过程中所需酶的结构基因，有的还 连锁了抗生素耐药性基因及调节基因【4 l 。 抗生素普遍存在于土壤环境，对细菌的生存造成了压力，而链霉菌除了受到环境 中的抗生素压力外，还首当其冲地受到自身所产生的抗生素的压力。因而链霉菌的抗 生素耐药基因的表达与调控机制就比非抗生素产生菌复杂，它作为激活生物合成基因 进行转录的必需成分参与了抗生素的合成调控，以确保抗生素耐药性的及时表达，从 而免受自身抗生素的破坏，只有当菌体的抗性建立以后，生物合成基因的转录才能进 行。 调节基因的作用是增加或降低抗生素的产量1 5 j 。在次甲霉素中调节基因的作用是 降低产物的产量。在放线紫红素、b i a l a p h o s 、链霉素及十一烷基灵菌红素的基因簇中 也发现了调节基因，它们对于各自结构基因的作用是正向调节，加速各种抗生素的生 成。调节基因的发现表明通过基因工程的方法提高抗生素产量是可行的。 1 2 与抗生素产生有关的基因 1 2 1a 因子 a 因子 6 1 是灰色链霉菌细胞分化及产生链霉素所必须的自动调控因子，在放线菌 中许多属都能产生a 因子。在缺失a 因子的突变体中的次级代谢产物的生成下降，气 生菌丝及孢子发育也受到影响，而当加入外源性a 因子时，产物产量增加，抗性水平 恢复正常，形态及发育也恢复到野生状态。a 因子通过直接加速生物合成途径中酶的 合成而控制次级代谢产物生成：并诱导磷酸酶，使抗生素磷酸化而失活，从而导致抗 性水平增加1 7 】。 1 2 2b i d 基因 在天蓝色链霉菌a 3 ( 2 ) 中，分离出一种突变体，这些突变体由于不能形成气生菌丝， 所以其菌落比野生型集落更为平滑，故称为b l d 基因突变【8 】。在b l d 基因簇中有许多成 员，其中最重要的是b l d a 基因【9 。它的产物是与蛋白质合成有关的t r n a ，此t r n a 是 一个可辨别稀有t t a 密码子的亮氨酸i r m a ，亮氨酞t r n a 只在快速营养性生长后才被 合成，为抗生素的产生合成必需的活化剂。 1 3 抗生素基因表达的调控 1 3 i 多种基因的调节 在抗生素生物合成过种中，往往有几类基因，分别作用于不同水平，形成一个管 理的级联系统。在产生抗生素的链霉菌中一般都含有几个抗生素生物合成基因簇。在 不同条件下，引起不同基因簇激活，使各种产物表达；未表达的基因簇成了“沉默基 因”暂不表达。因而抗生索的生物合成基因簇构成了对抗生素产生的最低水平的调节 与控制。根据最近刚刚完成的天蓝色链霉菌( s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o ra 3 ( 跏的基因组序 列分析，a 3 ( 2 ) 拥有大约7 8 2 5 个基因，通过对基因组的比较发现仅有2 0 0 0 个基因是 维持该菌株生长和繁殖必需的，而剩余的大量的基因都可能涉及到各种次级代谢活 动。 1 3 2 磷酸盐对基因表达的控制 磷酸盐、碳、氮等的转录水平控制着次级代谢产物的生物合成。高浓度磷酸盐抑 制许多抗生素生物合成酶的生成。例如，与杀念菌素( c a n d i c d i n ) 生物合成有关的p a b a 酶，在产生过程中明显受到磷酸盐的影响【l0 】。利用p a b s 克隆的基因片段做为探针， 通过点杂交来检测特殊的m r n a ，结果发现，当培养基中的磷酸盐浓度增高 ( 7 5 r e t o o l l ) 时，合成p a b a 酶的m r n a 含量下降9 5 。由于全部的r n a 合成是通 过磷酸盐来激发的，所以，p a b s 基因受到磷酸盐的抑制作用具有特殊性。从p a b s 结 构基因上游区域已克隆出磷酸盐控制启动序列【1 1 】，对与磷酸盐控制有关的几种抗生素 生物合成基因上游序列进行分析发现，磷酸盐控制序列存在总与这些基因的启动序列 相连。这些似乎说明磷酸盐在转录水平上控制了抗生素的生物合成。 1 3 3r n a 聚合酶对启动的识别 在链霉菌属中，很多转录起始区域的上游部分存在两个以上的启动子1 2 。通过不 同的r n a 聚合酶先后识别不同排列的启动子从而导致不同基因的表达。例如，天蓝 色链霉菌的琼脂酶( d a g a ) 基因，包含了4 个不同的启动子，由至少3 个组成不同的 r n a 聚合全酶来转录【1 3 】。 2 绿脓杆菌致病作用和抗药性 绿脓杆菌( pa e r u g i n o s a ) 又称铜绿假单胞菌，属假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) ，是 一种人和动物共患的条件性致病菌。该菌在自然界中广泛存在，具有多种m 清型，可 产生多种致病因子，是烧伤、创伤及术后感染的主要病原菌，还可引起脓毒败血症、 脑炎、肠炎、肺炎和角膜炎等疾病【1 4 1 。绿脓杆菌感染的危害性已引起人们的高度重视。 由于绿脓杆菌耐药谱广，致病因素复杂，使得该病的预防和治疗非常困难。近年来， 随着科学技术的发展，人们对绿脓杆菌致病因素的认识不断深入，防治方法也取得了 显著进展。 2 1 绿脓杆菌的致病因素 绿脓杆菌有多种致病因子，包括菌体表面物质( m e p ) 、内毒素和菌体产生的物质， 如外毒素a 、各种细胞外酶等【1 5 1 ，这些因素对绿脓杆菌的致病作用有重要意义。 2 1 1 胞外粘液多糖( m e p ) m e p 是绿脓杆菌粘液株产生的一种粘液多糖物质，包绕在菌体外周，具有与肺炎 球菌荚膜相似的功能，可抵御宿主吞噬细胞和抗生素等对菌体的杀灭作用。m e p 还 具有粘附作用，可粘附于正常呼吸道细胞上【1 “。因此，胞外粘液多糖在协助绿脓杆菌 侵入机体、保护绿脓杆菌方面起重要作用。 2 1 2 内毒素 内毒素是菌体表面结构成分，在菌体死亡或崩解后被释放出来。内毒素中的脂 多糖( l p s ) 是重要的致病因子，它引起人与动物的体温升高、白细胞数量降低及实质 器官营养障碍，造成肠粘膜营养障碍和肠腔出血病变。内毒素蛋白质部分( o e p ) 是 一种高分子低毒性物质，具有较强的免疫原性和非特异性抗感染的保护作用 1 8 , 1 9 。 h o m m a 研究表明，这种蛋白质对2 1 个血清型绿脓杆菌感染均有保护作用。 2 1 3 外毒素a 约8 0 9 0 的绿脓杆菌都可产生外毒素a 。在多种菌体成分及产物中，外毒素 a 的毒性最强，其毒性为内毒素的几万倍，能在核糖体水平上抑制各器官蛋白质合 成，对t 、b 淋巴细胞有细胞毒性作用，可以抑制抗体的产生【1 7 1 。过去人们一直认 为内毒素是绿脓杆菌感染中的主要致病因子，近年来的研究表明，外毒素a 才是主 要致病因子。 2 1 4 蛋白分解酶 绿脓杆菌能产生多种酶，最重要的是弹性蛋白酶，8 5 的菌株可产生这种酶，该 酶可引起皮肤溃疡和出血性坏死，有利于该菌侵入机体。 2 1 5 细胞溶解毒素 约4 的菌株能产生高特异性的杀白细胞素，它可引起白细胞的肿胀和溶解。磷 脂酶c 和糖脂是两种溶血素，有报道认为肺部感染中的组织坏死及角膜感染与这两 种溶血素有关。 2 2 绿脓杆菌的耐药机理 绿脓杆菌耐药株逐年增多，究其机理主要与三个方面有关，即主动排外系统，b 一内酞胺酶及外膜的通透性2 0 0 1 02 1 。 2 2 1 主动排外系统 绿脓杆菌具有主动外排系统，通过膜融合蛋! 白( m e x a 、m e x b 、m e x c 、m e x d ) 与 外膜通道相连排除底物。从而减少抗生素进入细胞，减少抗生素的杀灭作用。 2 2 2b 一内酰胺酶 p 一内酰胺酶是一类能使p 一内酰胺抗生素降解失活的酶。典型的p 一内酰胺酶分 布于革兰氏阴性菌细胞膜内外层之间的周质中。该酶可通过b 一内酰胺抗生素诱导产 生。介导b 一内酰胺酶的质粒可通过接合、转导和转化等方式在绿脓杆菌之间及不同 菌种间传递。目前认为细菌产生b 一内酰胺酶是绿脓杆菌耐药性的主要机理。 2 2 3 外膜通透性瞄1 绿脓杆菌外膜由磷脂、脂多糖和多种蛋白组成，某些外膜蛋白被认为是许多抗生 素进人细菌体内的主要途径。而绿脓杆菌外膜脂多糖层与磷脂层之间，由鲍林蛋白形 成的孔道比一般革兰阴性杆菌的狭小，多种抗革兰阴性杆菌抗生素难以通过，故绿脓 杆菌对多种抗生素具天然耐药。病人接受广谱抗生素后，敏感细菌清除，绿脓杆菌却 继续生长。 综上所述，绿脓杆菌不仅具有对多种抗生素天然耐药的特性而且对常用抗生素的 耐受性更是不断增加。为了降低绿脓杆菌对人类健康的危害，人们一直致力于寻找更 多的对其有较强抑制作用的新抗生素。 3 稀土对生物机体效应机理的研究 稀土元素是原子序列5 7 7 1 的1 5 个镧系元素和与镧系元素性质极为相似的钪、钇 共1 7 种元素的总称。稀土是典型的金属，具有金属的通性，能够导热、导电，延展性 好j 。从1 9 3 3 年起到现在，世界各国的学者已经发现稀土对生物圈中诸多微生物、动 植物包括人体有着极其广泛的生物效应 2 5 , 2 6 , 27 1 。各国科学工作者从稀土对细胞质膜， c a m 水平调节的作用，到对蛋白质、d n a 的影响等不同层次和水平进行了深入的研 究。 3 1 对细胞质膜的影响 3 1 1 对细胞膜流动性的影响 早在1 9 6 6 # r o j a s 等四就曾指出p m 3 + 能吸附在磷脂酰丝氨酸( p s ) 的单分子层上， 低浓度稀土离子能促进p s 脂质体的融合，而高浓度则破坏p s 的融合作用。李新民等口9 1 还以人红细胞为材料，研究稀土对细胞膜的影响。应用荧光探针技术研究发现：低浓 度稀土离子对红细胞膜流动性影响较小，而较高浓度稀土离子则使膜的有序性增大， 流动性减小，这与对膜质体的研究结果吻合。 3 1 2 对细胞膜通透性的影响 目前，多数研究认为稀土离子能与细胞膜作用，但不能透过细胞膜。在稀土离子 浓度低于l m m o l lo 时不能透过细胞膜，而稀土浓度增加则会使细胞膜破坏口“。程 驿等【3 l 】研究指出，g d 可缓慢穿过红细胞膜的双脂层，其转运机理可能与g d 诱导的膜 表面孔洞的形成有关；质子诱导x 射线测定结果显示，将人红细胞与g d 柠檬酸、乳 酸配合物温育时，g d 能够键合在红细胞膜蛋白和膜脂上，导致膜蛋白和膜脂的构象 变化，使红细胞膜通透性发生变化，使得g d 配合物进入细胞。 3 2 对钙调蛋白( c a m ) 水平的调节 3 2 1 对c a ”的影响 胞内c a 2 + 不仅是一类重要的信使物质，而且也是c a 2 + a t p 酶活性的一种调节因 素，细胞内游离c a 2 + 宜维持在一定的浓度水平，若c a 2 + 超负荷会对细胞造成各种病理 损伤，产生诸多不良后果 3 2 , 3 3 】。由于稀土的离子半径( 如镧，钇) 与钙相似，因而稀土 在动物体内常作为钙的拮抗剂和取代剂干扰钙的正常生理功能。 3 2 2 对c a m 的影响 钙调蛋白( c a m ) 是一种普遍存在的多功能的钙结合蛋白【3 4 】。它是真核细胞内依赖 于钙代谢过程的综合调节剂，参与介导调节细胞内众多的生理生化过程，在细胞增殖、 运动、转化、程度性死亡中都起着重要的作用。稀土元素对c a m 的活性存在着剂量 效应。研究发现，低浓度的稀土离子能够促进c a m 的活性，但高浓度时却表现出抑制 作用【3 5 娜, 3 7 , 3 9 1 。 3 3 对蛋白质的影响 3 3 1 对酶活性的影响 不同浓度的稀土离子对酶的活性影响有所不同，也存在着“低促高抑”效应，即 稀土元素在低浓度下可激活某些酶，是酶的激活剂：而在高浓度下抑制某些酶的活性， 是酶盼抑制剂。比如低浓度时，稀土离子对乙酰胆碱脂酶有变构激活作用，但浓度较 高时，则又表现为竞争一非竞争性抑制。用蚕豆为材料的研究3 9 1 表明，稀土对膜 c a 2 + m g ”一a t p a s e 有抑制作用，且随浓度增加而增加。稀土元素l a 牙f i c e 对谷氨酸、丙 酮酸转氨酶( g p t ) 和谷氨酸脱氢酶活性有影响。除此以外，稀土元素尚可影响琥珀酸 脱氢酶、细胞色素氧化酶、谷丙转氨酶、酸性磷酸酶系的活性。 3 3 2 对某些蛋白质功能的影响 不同浓度的稀土离子与蛋白质结合，通过改变蛋白质微构象或干扰蛋白质对其它 离子结合两者程度的不同而发挥其剂量效应，影响蛋白质功能。 3 4 对d n a 的影响 3 4 1 增j n d n a 苣 量 a r a m i n ijm 等人的研究结果显示【4 0 】，一定剂量的铈和钆可以促进胸腺嘧啶对人 二倍体细胞的渗入，有促进人二倍体细胞d n a 复制的作用。聂毓秀等 4 1 1 研究表明：低 浓度的c e 3 + 能促进肝细胞i 为d n a 的合成，从而促进肝细胞增殖。 3 4 2 与d n a 结合 h e i c l a r 等【4 2 1 研究指出，稀土离子能够与d n a 结合，其结合位点与稀土离子的浓度 有关。黄德盈等的实验表明，稀土离子与d n a 的摩尔比在小于l 柚o 时，主要与d n a 分子的磷酸基作用，在1 4 0 1 ：l 时与d n a 的g 碱基相作用，在稀土浓度达至l j m m o1 l 级以上时将切断d n a 的磷酸二酯键，钆浓度低时较钙易与d n a 结合。 3 4 3 对d n a 热变性影响 兰金贵等【4 3 l 研究了y 3 十、s m3 + 、r a 3 + 等稀土离子对小牛胸腺d n a t m 值的影响，结 果表明在低浓度时t m 变化不大；当摩尔比为2 0 以上时，t m 明显降低，3 种离子使t m 下降的趋势为：s m l a 3 + y 3 + 。i n a r a 等刚研究发现稀土离子尚能明显降( k 玉d n a 的 解链温度，c d 谱表明可能是稀土离子改变了双链d n a 高度有序结构的缘故，提示稀 土离子对d n a 的双链结构可能有去稳定化的作用。 3 4 4 水解d n a 的磷酸二酯键 小宫山真曾报道浓度为0 0 1 m ol l 。的稀土离子能水解d n a 的磷酸二酯键，且 其水解效率高于限制性内切酶百万倍甚至亿倍1 4 4 , 4 5 。t a k e d a 等1 4 6 1 发现高剂量的稀土会 使水生生物的d n a 溶解，严重抑制其自我复制，最近，k o m i g a m a m 4 7 】发现：在生理 条件下，简单的稀土金属离子如c e 离子( o 0 1 m 0 1 ) 具有催化水解断裂d n a 磷酸二酯键 的功能，为d n a 链的断裂提供了快捷的“分子剪刀”。和其它各种稀土离子相比， 倪嘉缵【4 8 】等发现只有c e 离子对单核苷酸具有快速断裂作用。 1 引言 1 1 研究价值和理论依据 绿脓杆菌( pa e r u g i n o s a ) 属假单胞菌属册e u d o m o n a s ) ，是临床上较常见的条件 致病菌之一，可引起烧伤、创伤及术后伤口的严重感染还可引起脓毒、败血症、脑 炎、肠炎、肺炎和角膜炎等疾病m 5 0 】。随着抗生素的大量使用，绿脓杆菌耐药范围和 耐药水平不断上升，不仅对多种抗菌药物产生俐药性且常常表现为多重耐药，这给临 床治疗带来了极大的困难。为了降低绿脓杆菌对人类健康的危害，人们一直致力于寻 找更多的对其有较强抑制作用的新抗生素。 自2 0 世纪4 0 年代初，w a k s m a n 用链霉菌进行系统筛选新抗生素以来，放线菌已 被认为是新抗生素产生菌的主要来源。至今发现的近万种天然抗生素中约有2 3 由放 线菌产生，其中许多因具有重要的医学价值而应用于临床。放线菌中又以常见的链霉 菌产生抗生素种类最多，占总数的5 2 。随着人类认知放线菌的能力和手段不断的 提高，越来越多的放线菌种类被发现和描述，但是，尽管新的种、属不断被发现，据 估计，目前分离到的自然界中的放线菌种类仍仅为实际存在种类的0 1 1 ，还有 十分丰富的种群的放线菌未被发现【5 “。因此，从土壤中分离放线菌、寻找新的具有抑 菌活性的次生代谢产物仍然是目前开发新抗生素的主要手段。 世界各国的学者已经发现稀土对生物圈中诸多微生物、动植物包括人体有着极其 广泛的生物效应。稀土对微生物影响的研究目前已有较多报道，已发现土壤微生物在 稀土的作用下，种群结构、生理类群等多方面均有较大变化 5 2 , 5 3 , 5 4 , 5 5 , 5 6 , 5 7 , 5 8 , 5 9 , 6 0 ”。唐 欣昀等【6 2 j 发现在高浓度稀土胁迫下，土壤中放线菌种群组成发生改变，当土壤中l a 积累至吸附容量2 0 以上时，在常规分离条件下不易被察觉的白孢类群成为生长优势 菌种。 因此，鉴于高浓度稀土可改变土壤中放线菌种群组成和稀土有可能调节菌株的代 谢过程从而产生结构新颖的活性物质这两方面原因，本论文拟从l a 积累量达2 0 a d ( 2 0 o f a d s o r p t i o nc a p a c i t y ) 的土壤中筛选对绿脓杆菌有较高抑制活性的放线菌株， 以期发现在常规分离检测条件下未被发现的新的菌种或新的活性物质。 1 2 本论文拟解决的问题 1 2 1 从l a 积累量达2 0 a d 雕j 土壤中筛选对绿脓杼菌有较高抑制活性的放线菌株： 1 2 2 参照放线菌的分类和鉴定、放线菌( 第二卷) 、链霉菌鉴定手册 对活性较强的菌株进行分类鉴定。 1 2 3 确定该菌株的发酵条件。测定不同碳源、不同氮源及其不同浓度对产抑菌活性 物质的影响；测定发酵温度、发酵时间、接种菌龄、接种量、培养基起始p h 等对产 抑菌活性物质的影响，通过优化培养基和发酵条件提高活性物质的效价a 1 2 4 对抑菌活性物质进行初步的分离纯化。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 材料来源 土壤：采自安徽农业大学农场校医院土壤表层，土质潮湿蓬松，p h 7 2 。 指示菌： 表2 - 1 实验用菌株 ! 些：；：! ! b ! ：! 虫! j ! ! 丝堕塑! 虫虫 菌种来源 绿脓杆菌p x e u d o m o n o ua e r “g i n o s a 安徽医科大学提供 金黄色葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 中科院青岛海洋所提供 苏云金芽孢杆菌b a c i l l u at h u r i n g f e n s i s本实验室保藏菌种 大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l i本实验室保藏菌种 鸡臼痢s a l m o n e “a p u l l o r u m 中国兽药监察所 白色念珠菌c a n d i d aa l b i c a n s安农大森林保护学院 堡堡丝! 型坐查茎墅至堡堕璺塑 2 1 2 培养基 鉴定用培养基 马铃薯培养基：马铃薯去皮去芽眼，切成斜面状的长方块，用水洗净： 明胶培养基：蛋白胨5 9 ，葡萄糖2 0 9 ，明胶2 0 0 9 ，水1 0 0 0 m h 牛奶培养基：脱脂牛奶1 0 0 0 m l ，c a c 0 30 0 2 9 ； 淀粉水解培养基：淀粉1 0 9 ，k a h p 0 40 3 9 ，m g c 0 3l g ，n a c l0 5 9 ，k n 0 3l g ， 琼脂1 5 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 7 2 7 4 ： 纤维素分解培养基：m g s 0 40 5 9 ，n a c l0 5 9 ，k 2 h p o40 , 5 9 ，k n 0 3 0 5 9 ，滤纸， 水1 0 0 0 m l ； t r e s n e r 培养基：蛋白胨1 0 9 ，柠檬酸铁0 5 9 ，琼脂1 5 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h7 2 ： 普戈二氏培养基：( - 1 4 ) 2 s 0 42 6 4 9 ，k i - 1 2 p 0 42 3 8 9 ，k 2 h p 0 45 6 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 1 0 9 ，c u s 0 4 。5 h 2 0o 0 0 6 4 9 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 0 1l g ，m n c l 2 4 h 2 0o 0 0 8 9 ，z n s 0 4 7 h 2 0 o 0 0 1 5 9 ，琼脂1 5 9 ，水1 0 0 0 m l ； 甘油天冬素琼脂( i s p l ) ：甘油1 0 9 ，c a c l 2 0 1 9 ，天门冬氨酸钠l g ，k 2 h p 0 41 0 9 ， 琼脂1 5 9 ，水1 0 0 0 m l ； 无机盐淀粉琼脂( i s p 2 ) ：可溶性淀粉l o g ，k 2 h p 0 41 0 9 ，m g s 0 4 1 0 9 ，c a c 0 32 0 9 ， 9 ( n h 4 ) 2 s 0 4 2 0 9 ，n a c l1 5 0g ，水1 0 0 0m l ，p h7 4 ； 酵母精麦芽精琼脂( i s p 3 ) ：酵母膏4 0g ，葡萄糖4 0g ，麦芽膏1 0g ，n a c i1 5 0 g ，水1 0 0 0m l ，p h 7 2 7 4 ； 燕麦粉琼脂( i s p 4 ) ：燕麦3 0 9 ，琼脂1 5 9 ，水1 0 0 0 m l ： 蔗糖硝酸盐琼脂：蔗糖3 0 9 ，k c io 5 9 ，n a n 0 32 0 9 ，f e s 0 4o 0 1 9 ，m g s 0 4o 5 9 ， 琼脂1 5 9 ，水1 0 0 0 m l ： 葡萄糖天门冬素琼脂：葡萄糖1 0 9 ，天门冬氨酸钠0 5 9 ，k 2 h p 0 40 5 9 ，琼脂1 5 9 ， 水1 0 0 0 m l ； 苹果酸钙琼脂：苹果酸钙1 0 9 ，k 2 h p 0 4o 5 9 ，n h 4 c o 5 9 ，甘油1 0 9 ，琼脂1 5 9 ， 水1 0 0 0 m l 。 放线菌培养基 高氏一号培养基：k n 0 3l g ，k 2 h p 0 4o 5 9 ，m g s 0 40 5 9 ，n a c ! o 5 9 ，f e s 0 40 0 1 9 ， 可溶性淀粉2 0 9 ，琼脂2 0 9 ，水1 0 0 0 毫升；p h7 2 7 4 分离培养基采用高氏一号培养基，加入k 2 c r 2 0 7 使终浓度达5 0 m g m l “ 改良高氏一号培养基：k n 0 32 9 ，k 2 i - i p 0 4 0 ，5 9 ，m g s 0 4o 5 9 ，n a c l0 5 9 ，f e s 0 4 0 0 1 9 ，可溶性淀粉3 0 9 ，水1 0 0 0 毫升；p h 7 2 7 4 ， 指示菌培养基 培养绿脓杆菌、大肠杆菌、苏云金杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢所用培养基 为牛肉膏蛋白胨培养基；牛肉浸膏5 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l5 9 ，琼脂2 0 9 ，水1 0 0 0m l ， p h 7 2 7 4 ： 白色念珠菌采用沙氏葡萄糖琼脂：葡萄糖4 0 0 9 ，蛋白胨l o o g ，琼脂2 0 o g ，水 1 0 0 0 m l ： 根霉采用马铃薯蔗糖培养基：马铃薯2 0 0 9 ，蔗糖2 0 ，琼脂2 0 o g 。 2 1 3 主要仪器与试剂 主要仪器 表2 - 2 实验用仪器 ! ! ! ：! ：! ! 坠! ! ! 业! 坐! ! 塑! ! 塑! ! 生! z 设各名称公司或厂家 s b - j c - t a 超净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 s k b - 叭电热恒温培养箱 湖北黄石医疗器械厂 h e - 2 0 1 0 k 恒温摇瓶柜太仓科教仪器厂 7 2 2 紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司 h h - 4 恒温水潜锅 江苏荣华仪器公司 y c l 型层析实验冷柜北京德天佑科技发展公司 】0 高速冷冻离心机珠海黑马医学仪器有限公司 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 s h z 1 1 1 型循环水式真空泵上海亚荣生化仪器厂 f d l 冷冻干燥机北京博医康技术公司 a q u a p r o 标准型实验室纯化水机 重庆颐洋企业发展有限公司 l e i c a d m l b 荧光显微镜 德国荣卡公司，p o w e r s h o t $ 4 0 相机 l c qa d v a n t a g e t h e r m of i n n i g a n w h 撒型涡旋混台仪上海沪西仪器厂 超低温冰箱日本三洋 1 0 l - l 型电热鼓风箱上海市上海县实验仪器，1 m o d e lv x q s g 4 1 2 8 0 b 型高压蒸汽灭菌锅上海医用核子仪器厂 主要试剂 柱层析用2 0 0 3 0 0 目硅胶( 上海五四化学试剂公司) 、g f 2 5 4 硅胶板( 青岛海洋 化工分厂) ，l a 2 0 3 ( 上海跃龙化工厂出品) ，其它试剂除注明外，均为国产分析纯。 2 2 方法 2 2 1 土壤稀土及土壤处理 ( 1 ) 土壤稀土的处理 试验土壤为黄褐土，p h 7 0 由文献【6 3 可知，黄褐土对镧的吸附容量为7 0 7m g g ( 以 l a 2 0 3 计算) 。称取一定量的土壤，风干、碾碎过筛：称取l gl a 2 0 3 ，溶于h c l 中