（环境科学专业论文）飞灰颗粒物上有毒金属形态分布及生物氧化性损伤研究.pdf

a b s 仃a e t i no r d e rt oe x p l o r et h et o x i cm e t a lc o n t e n ta n ds p e c i a t i o ni nf l ya s h e sa n dh o wt h e ya f f e c t t h ec a p a b i l i t yo ft h eb i o l o g i c a lo x i d a t i o n , f o u rc o a lc o m b u s t i o nf l ya s hp a r t i c u l a t es a m p l e sf r o m c o a l - f i r e dh e a t i n gb o i l e r sa n do n ec o a lc o m b u s t i o nf l ya s hf r o mc o a l - f i r e dt e a k e t t l ea n do n ew o o d e o m t m s t i o nf l ya s hw e r eo o l l e e t e dt oa n a l y z et h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ec a p a b i l i t yt og e t t e r a t e o x i d a n tf r o md i f f e r e n tf l ya s h e sa n dt h et o x i cm e t a le x t r a c t i o nc o n c e n t r a t i o n , t h em e t a ls p e e i a t i o n d i s t r i b u t i o na n dt h ea d s c i t i t i o u sd i f f e r e n tc h e l a t o r s t h ef o l l o w i n gr e s u l t sa r ef o u n d ： d o m i n a n tm e t a lc o n c e n t r a t i o n si nv a r i o u sf l ya s h e sw e l - ed i f f e r 衄t , d e p e n d i n g0 1 3 t h ef l y a s h e s ，t y p e so fe x t r a c t a n t sa n dm e t a l s ；m e t a ls p e e i a t i o ni sc l o s e l yr e l a t e dt ob i o a v a i l a b i l i t y , t o x i c i t y , a n dm o b i l i t y t h es p e c i a t i o nd i s t r i b u t i o no ft o x i cm e t a le l e m e n t si nf l ya s h e sw f l , s d i f f e r e n tb e c a u s eo f t h ed i f f e r e n ts o i i i c i a n dt h ed i f f e r e n tc o m b u s t i o nt y p e s b yl l l e a n so ft h ec l e o x y r i b o s eo x i d a t i o na s s a y , t h er e s u l t sd e m o n s l r a t et h a tt h ec o r r e l a t i o n b e t w e e nt h em e t a ls p e c i a t i o nc o n c e n t r a t i o no fd i f f e r e n tf l ya s h e sa n dt h ep r o p e r t i e so fo x i d a t i o n a s s o c i a t e df l ya s hp a r t i c u l a t e sw a ss i m i l a rw i t h o u ta n yc h e l a t o r so rw i t he d t ae x l r a c t a n t ；t h e c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ee x t r a c t i o nc o n c e n t r a t i o no fr e d u c i b l eo x i d e sa n dt h ep r o p e r t i e so f o x i d a t i o na s s o c i a t e df l ya s hp a r t i c u l a t e sw a ss t r o n gw i t he d t ao rn t ao rw i t h o u ta n yc h e l a t o r s ； t h ee f f e c to fd i f f e r e n tc h e l a t o r s0 1 3c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h em e t a ls p e c i a f i o nc o n c e n t r a t i o no f d i f f e r e n tf l ya s h e sa n dt h ep r o p e r t i e so fo x i d a t i o na s s o c i a t e df l ya s hp a r t i c u l a t e sv a r i e dg r e a t l y , a n dw i t he x t r a c t a n tc i t , t h e r ew a sa l m o s t n oc o r r e l a t i o n b ym e a l l so ft h ed e o x y r i b o s eo x i d a t i o na s s a y , t h er e s u l t sa l s od e m o n s t r a t et h a tt h el e v e l so f o x i d a t i v ei n j u r yb yf l ya s i ap a r t i c u l a t e sa r es i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t ew i t hi r o n , z i n c , , l e a dm a n g a n e s e w i t he x t r a e t a n t si - i c la n dn t a ；f o rt h e t o o , s o n so f t h en a t u r a la b u n d a n c eo f i r o na n di t sp r o p e n s i t y t oc a t a l y z er 瑚t c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，i ti sp r o p o s e dt h a tt h ee x t r a c t i o ne o n e e a t r a t i o r tw i t he d t a ， d t p aa n dc 1 tc o u l dn o tc h a r a c t e r i z et h ep r o p e r t i e so fo x i d a t i o na s s o c i a t e dw i t hf l ya s h p a r t i c u l a t e s i tw a sc o n f i r m e dt h a tt h ec a p a b i l i t yt og e n e r a t eh i g hr e a c t i v eo x i d a n tf r o md i f f e r e n ts o i 1 r c c s o ff l ya s h e si sd i s s i m i l a r ；, f u r t h e l 3 3 1 0 l ef l ya s h e sw i t hv a r i o u st y p e so fc o m b u s t i o nh a v ed i f f e r e n t c a t a l y s i se i f tf o rg e n e r a t i o no f o x i d i z e dp r o d u c t s t h eg 既训曲n so fh y d r o x y lr a d i c a lo 】【i d m t b yf l ya s h e s 黜s t r o a g t yd e p m d c n to np r o p e r t i e so f e x t e r n a lc h e l a t o r s k e yw o r d s ：f l ya s hp a r t i c l e , t o x i cm e t a l ，c h e l a t o r , r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ， d e o x y n l o o s ea s s a y 第一章前言 1 研究背景 大气颗粒物指的是分散在大气中的固态或液态颗粒状物质，根据其粒径大小，又可分 为总悬浮颗粒物a s p ( 空气动力学直径小于或等于1 0 0 p , m ) 、可吸入颗粒物p m l o ( 空气动力 学直径小于或等于1 0 弘m ) ；可吸入颗粒物又可分为细粒( 空气动力学直径小于或等于2 5l a m ) 和粗粒( 空气动力学直径介于2 5i xm 至1 0 l im ) t 1 1 。可吸入颗粒物的来源主要为天然源和 人为源。天然源包括地面扬尘、海浪溅出的浪沫和盐粒、火山爆发所释放出来的火山灰、 森林火灾的燃烧物、宇宙陨星尘埃以及植物的花粉、孢子等。人为源主要是燃料燃烧过程 中形成的烟尘、飞灰等，各种工业生产所散发出来的原料或产品微粒、汽车排放出来的含铅 化合物以及矿物燃料燃烧所排放出来的s 0 2 在一定的条件下转化成的硫酸盐粒子等。大气 颗粒物的来源和发生量会因不同国家和地区的经济发展、能源结构、工艺方法以及管理水 平等的不同而存在很大的差别【2 】。可吸入颗粒物因其细小而不受人的鼻腔阻档，可以直入 人肺部并存留在肺的深处，不易被排出体外，是大气颗粒物中对人体健康威胁最大的一类。 近年来，人们进一步认识到可吸入颗粒物中的细粒( p m 2 j ) 易于富集空气中的有毒重金属、 酸性氧化物、有机污染物、细菌和病毒等，其对人体健康的危害远比空气动力学直径在2 5 l l m 至1 0 u 1 1 1 之间的粗粒大。因此，美国国家环保局于1 9 8 5 年将原来的颗粒物质指标t s p 项目修改为空气动力学直径小于或等于1 0 1 tm 的大气颗粒物，即p m l o 后，又于1 9 9 7 年再 一次修改了大气质量标准，并规定了p m 2 5 的最高限值，以保护人体健康【3 1 。 近几年来，随着国民经济的持续发展，我国的大气污染问题日益严重，可吸入颗粒物 已成为诸多大城市的首要空气污染物，因此，对可吸入颗粒物的人体健康效应的研究具有 重要的现实意义。可吸入颗粒物是组成成分复杂的有机、无机污染物混合体，其对人体生 物学损伤的研究近年来受到各学科的普遍关注 4 1 ，流行病学研究表明，死亡率( m o r t a l i t y ) 和 发病率( m o r b i d i t y ) 与大气中可吸入颗粒物浓度有明显的统计学相关性【5 埘，而与其它有毒污 染物相关性不强，因此，近年来有关颗粒物的生物损伤机理研究大量报道 9 , 1 0 1 ，由于颗粒物 成分复杂，目前还没有一种全面的损伤机理被公认 1 1 】，为此提出了几种不同假说【1 2 】，其中 主要包括颗粒物上有机物毒效应假说，颗粒物物理特性损伤假说，以及颗粒物上可变价金 属参与的氧化性损伤假说等，从不同的侧面来考察颗粒物可能的损伤机制。 颗粒物对生物体( 主要是呼吸系统) 的损伤是多方面的，其组成成分复杂，含有大量 的有机物( 如多环芳烃及其衍生物) 、无机物( 如金属离子，含氧酸盐) 。颗粒物上所含大 量可变价金属不仅可以在大气环境中参与复杂的物理、化学反应过程，而且在体内也可能 参与催化各种活性氧产生及转化。活性氧与人体多种疾病发生、发展有密切关系1 4 1 。颗 粒物上金属介导的生物损伤机理认为，颗粒物被吸入人体后，通过各种生理作用，在可变 价金属离子的参与下，产生大量的活性氧皿o s ，崩l c 曲eo x y g e ns p e c i e s ) ，如h 2 0 2 、0 2 一、 。o h 等，从而损伤生物大分子，其中包括蛋白质、d n a 和生物膜。 目前煤炭在世界一次能源消费结构中占的比重将近3 0 ，而且因其丰富的储量和相对 便宜的价格，煤炭资源将有可能再一次成为主要一次能源，在整个世界能源结构中越发重 要。现在全球每年的耗煤量约4 4 亿吨，主要用于燃煤电厂【1 5 1 。虽然拥有非常先进的燃煤污 染物排放的控制技术及设备，燃煤颗粒物仍然成为大气颗粒物的主要来源。而体内( i nv i v o ) 及体外( i nv i t r o ) 实验证实，矿物燃料飞灰可以促进损伤机体的氧化剂如羟自由基的产生 1 6 r 丌。 2 2 铁介导的羟自由基产生机理 近年来，t ( r e a c t i v eo x y g e n 印e c i 哟的产生及对各种生物分子的损伤机理方面 的研究受到各学科的普遍重视，许多疾病与活性氧的介入有密切关系 1 钉。一般认为，活性 氧既包括各种自由基如o h ( h y d r o x y lr a d i c a l ，羟自由基) 、0 - 2 ( s u p c r o x i d oo x y g e na n i o n ， 超氧阴离子自由基) 、l 0 0 ( 1 i p i dp e t o x y lr a d i c a l ，脂过氧自由基) 等，同时也包括与各种 自由基作用行为密切相关的非自由基组分，如h 2 0 2 、1 0 2 ( 单线态氧，s i n 舀砹o x y g e n ) 及次 氯酸等【1 9 1 。正常情况下，机体内含有可灭活某些活性氧组分的酶，如s o d ( s u p c 剪o x i d e d i s m u t a s c , 超氧化物歧化酶) 、c a t ( c a t a l a s e ，过氧化氢酶) 和水溶、脂溶性抗氧化剂组成 的防御系统，使氧化性损伤趋势与抗氧化防御系统在正常生理情况下处于动态平衡状态中 【2 0 1 。由于o h 与任何生物分子都以近乎扩散控制的反应速率反应，而h 2 0 2 及o _ 2 等的反 应活性与o h 相比不是很高，很可能o 和h 2 0 2 等对生物体的损害是通过金属离子如铁、 铜转变为o h 而起作用，因此o h 可能是对生物体危害最大的氧自由基1 2 1 。 由于大多数生物有机分子都是以单自旋态( s i l l g l e ts p i ns t a t e ) 黼在，而氧分子是以三 线态( t r i p 敞s p i ns t a t e ) 形式存在，所以大多数生物分子与分子氧作用产生活性氧自由基的 反应一般是不可能发生的，是自旋禁止反应，这一点成为生物体在自然界得以动力学稳定 存在的重要原因固。金属离子能够克服自旋能垒，为氧化反应的发生提供低能量路径，成 为氧分子与生物有机分子之间反应的桥梁。由于铁在大多数生物体中的含量比其它微量元 素的总和还多，所以被认为是生物体中非正常性氧自由基产生的主要参与者，虽然其它金 属如铜也具有十分重要的生物学作用f 2 3 】。 在长期的进化过程中，生物体形成了一套有效的机制以利用必要的铁来合成各种生物 体内必须的酶，同时利用具有转运功能和贮藏功能的酶来降低细胞内及细胞间液中的游离 态铁离子( 卅。这种对过渡金属离子的锁定作用( s e q u e s t r a t i o n ) 是机体防御系统的重要组成部 分。但是，氧化应激( o x i d 撕v cs t r e s s ) 制；自身提供用于自由基反应的铁离子，另外细胞本 身也含有一个小的低分子量铁贮池( 1 0 w - m o l e c u l a r - m a s sp o o lo f i r o n ) 提供用于羟自由基形 成的催化剂圆。 铁催化下活性氧的产生机理被广泛地研究 2 3 1 ，一种典型的反应机理如下： r e d 4 + 取) _ r e d “+ 见( ) - ( 式卜1 ) f c ( i i ) + 0 2 f e ( ) + o f h o ；+ o g + 日+ _ d 2 + 日2 d 2 f e ( i i ) + h 2 0 2 一n ( 皿+ 明+ o h 一( 瑚4 ) ( f c n t o nr e a c t i o n ) 其中r e d 代表生物体内可被氧化的还原性物质，反应式( 1 - 4 ) 就是著名的f c n t o n 反应。 在f c n t o n 反应中，除羟自由基产生外，也可能有其它高反应活性中间体如f e ( i v ) = 0 2 + 产生 2 6 1 。 4 3 铁介导的羟自由基对生物分子的损伤机理 3 1 对蛋白质的损伤机理 蛋白质是细胞中易被氧化剂损伤的组份之一。增加的羰基含量可以用来表征蛋白质被 氧化的程度。氧化应激是与机体内促氧化剂( p r o o x i d a n t ) 和抗氧化剂( a n t i o x i d a n t ) 的平 衡移动相联系的，在氧量增加，代谢速度加快，细胞内正常抗氧化剂水平下降及具有氧化 还原能力的外源体进入等情况下，均能发生氧化应激。蛋白质的氧化性损伤将导致蛋白质 更新速度增加和酶功能的下降，虽然蛋白质氧化而被标记降解是正常的生理学过程，但是 在氧化应激情况下，蛋白质被氧化程度将有明显提高。有报道表明，红细胞中蛋白质的氧 化损伤是比脂质过氧化更敏感的损伤指标( d a v i e s 1 9 8 7 ) 。s t a d t m a n 认为【2 刀，在蛋白质更新 过程中酶被金属离子催化氧化( m c o ，m e * t f l li o n - c a t a l y z e do x i d a t i o n ) 具有重要意义，在组成 蛋白质及各种酶的氨基酸中，赖氨酸、脯氨酸、组氨酸及精氨酸对氧化损伤最敏感。由于 羟自由基的高反应活性，它只能与产生地相临近的生物分子发生反应，其中蛋白质位置特 异性地被m c o 系统所氧化的机理( s i t e s p e c i f i cm e c h a n i s mo fp r o t e i no x i d a t i o nb ym c o s 毽t e m ) 受到普遍重视。最初由m c o 系统通过酶或非酶参与过程首先产生过氧化氢和二价 铁离子，这些产物以位置特异性方式来修饰蛋白质中与金属键合的氨基酸残基( 本文以赖 氨酸为例) ，如图i - i 所示。 m c o 系统把f ) 及0 2 分别还原为f i i ) 及h 2 0 2 ( 图1 - 1 中步骤1 ，2 ) ，赖氨酸残 基e 一氨基基团( - c h 2 n r 1 2 ) 作为配位体与f e ( i i ) 键合( 步骤3 ) ，之后键合f e ( i i ) 的蛋白质 被h 2 0 2 氧化生成o h 和o h ( 步骤4 ) ，此o h 从c h 2 n h 2 基团的碳原子上获取氢原子形成 烷基自由基( 步骤5 ) ，此烷基自由基再把孤电子转移给该配合物的f e ( i i ) 形成f e ( i i ) ，而 s 一氨基基团将衍生为亚氨衍生物( 步骤6 ) ，亚氨基团的歧化水解导致f e ( i i ) 的释放及赖氨 酸侧链醛衍生物的生成( 步骤7 ) ，最后经氧化修饰的蛋白质被细胞内蛋白酶降解( 步骤8 ) 。 图1 - 1 蛋白质被m c o 系统氧化的特异位置机理p t 代表蛋白质 o | | p t 剁 a m i n oa d d s p e p t i d e s 上述机理得n t 以下实验结果的支持： m c o 系统所生成的羟自由基不能被通用的羟 自由基清除剂如甘露醇、乙醇及苯甲酸等清除；对特定的酶亚基只有一种或几种氨基酸 残基被m c o 体系所修饰；能催化酶氧化修饰的所有m c o 系统均能使0 2 及f e ( i i i ) 催化 还原为h 2 0 2 及f e ( i i ) ；只有f e ( i i ) - - 与h 2 0 2 组成的混合体系能使酶氧化失活，而f e ( i i i ) 与h 2 0 2 体系则不能：被观察到的几乎所有酶的氧化修饰均能被c a t 所抑制；某些螯 合剂对某些酶的失活有阻止作用。 3 2 对i ) n a 的损伤 p r y o r 认为【2 8 】，羟自由基是机体内d n a 损伤的主要物质。因为产生羟自由基的物质如 铁经常键合到d n a 上，这样就使得羟自由基可以直接在d n a 的临近位置产生，对d n a _ 产生位置特异性损伤，另外，可损伤d n a 的自由基，不但要满足热力学方面的条件，而且 要具备一定的动力学能量以达蔓f 其损伤位置并与d n a 发生反应。以下三方面的特异性使羟 自由基成为损伤d n a 的主要自由基，即高亲电子性、高热力学反应特性及临近d n a 的产 生机制。由于d n a 在生命活动中的特殊地位，近年来有关羟自由基及可能相关的其它氧化 物对d n a 的损伤作用研究报导较多，又由于超氧阴离子和过氧化氢在无金属离子的参与下 几乎不与d n a 发生作用瞄l ，所以金属介导下的羟自由基与d n a 作用机理的研究更加受到 人们的重视。l u o 等人在研究f e 2 + 、f c ( ) ( 2 ，2 - d i p y ) 3 2 + ( 2 ，2 - d i p y ，2 j 联砒啶， 2 , 2 曲y r i d i n e ) 及f c ( 1 ，1 0 - p h c n ) s 2 + ( 1 ，1 0 - p h c n ，l ，1 0 菲罗啉，1 ，1 0 1 ，h e n 8 n t h r o l i n e ) 与过氧化氢 组成的氧化系统对d n a 损伤过程中，提出如下作用机理【3 0 】，如图1 - 2 所示。 ( t y p ei io x i d a n t s ) ( t y p eio x i d a n t s )( t y p e i i i oxidantstightly b o u n d l o o s e l yb o u n d f r e e l yd i f f u s i b l e ) f i g 2m o d e l sf o rt h eo r i g i no fo x i d a n t si n ( f e = h h 2 0 = ) a n dc h e l a t o r s ( 2 ，2 - d i p y ，1 ，1 0 一p h e n 图1 - 2 在d n a 存在条件下，f e 2 + h 2 0 2 及螯合剂( 2 ，2 - 联砒啶、1 ，l o 菲罗啉) 体系中氧化剂的产生模型 b 一其它基团；固。磷酸根：n = 1 3 他们以f c 2 + 与d n a 相互作用的不同形式提出三种基于f e n t o n 反应的不同类型氧化剂 3 0 l 。在第一种类型氧化剂产生过程中f e 2 + 仅以静电吸引力与d n a 发生微弱作用，易与h 2 0 2 发生反应，对h 2 0 2 浓度很敏感，但只有清除剂在高浓度情况下才能被有效地清除。在第二 种类型氧化剂产生过程中f e 2 + 与d n a 内部碱基环上的氮或同时与磷酸根及碱基环上的氮 紧密结合，形成配位键，此种类型的氧化剂可能对h 2 0 2 及抗氧化剂浓度均不敏感，与d n a 直接发生反应的可能性极大。在第三种类型氧化剂产生过程中f e 2 + 以游离的形式存在，由 此而产生的羟自由基不可能与d n a 发生反应，而很快与其它有机物分子发生作用，从而很 快被清除。 3 3 脂质过氧化 铁在脂质过氧化中的行为机理被广泛地研究，但至今还有许多问题没有彻底解决 3 1 1 。 脂质过氧化( 1 i p i dp e r o x i d a f i o n ) 就是多不饱和脂肪酸( l h ，p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ) 转 化为脂质氢过氧化物( l o o h ，l i p i dh y d r o p e r o x i d c s ) 的过程。m i n o t t i 提出了一种铁介导的 脂质过氧化机理【3 2 1 ，如图1 - 3 所示。 通常商品化的l h 均被l o o h 一定程度地污染，同时通过各种途径也可以污染生物膜。 这种预存在的l o o h 在体外实验中极大地影响脂质过氧化机理。当预存在的l o o h 浓度低 时，新的l o o h 主要是通过外来的高反应活性物质r 参与形成的，而更最有可能是非血铁 与分子氧或过氧化氢的反应产物。此高反应活性的r 克服l h 中烯丙基的c h 键能，夺取 其氢原子形成脂烷基自由基l ( 1 i p i da n c y lr a d i c a l ) ，此l 可以快速与分子氧结合生成脂过氧 自由基l o o ，之后l 0 0 再通过夺取l h 中烯丙基上的氢原子以l o o h 形式释放出来，与 此同时另一个脂烷基自由基形成，此第二个l 继续启动过氧化过程，如图i - 3 路径所示， m i n o t f i 把此过程称为脂质过氧化的l o o h 无关引发( l o o h - i n d e p e n d e n ti n i t i a t i o n ) 。当预 存在的l o o h 十分丰富时，将发生l o o h 相关引发过程( l o o h d e p e n d a a ti n i t i a t i o n ) ，如 图1 3 ( b ) 路径所示，丰富的l o o h 被f o ( 1 ) 所分解，生成高反应活性的脂烷氧自由基l o ( 1 i p i da l k o x y lr a d i c a l s ) ，其夺取l h 中的氢原子形成l 。 剐扣 ( c ) l r 发 l o o h l 图1 3 铁相关的腊质过氧化引发和传递 f ) 州) ( b ) 图1 - 3 ( c ) 路径描述了铁参与的脂质过氧化的链式传递过程。b u c t t n e r ( 1 9 9 3 ) 运用动力 学及热力学数据，也证明了上述机理的可能性，幸运的是在脂质过氧化反应的链传递过程 9 州吲删 )摹p 多 中，反应式( 1 5 ) 的速率很低，这为机体启动本身防御功能以消除脂质过氧化的发生提供了 可能： l 0 0 + 一日一三一o o h + 五( 式1 - 5 ) 这是生物体长期进化的结果。 综上所述，铁介导下产生的羟自由基对生物分子的损伤机理是复杂的，多方面的，某 些实验结果甚至是相互矛盾的。对铁参与下的羟自由基产生及生物损伤机理研究具有重要 的理论价值和生物医学意义，随着实验分析手段的不断发展以及理论研究的逐步深入，其 机理将会被最终阐明。 1 0 4 立题来源及研究内容 为配合国家自然科学基金项目“可吸入颗粒物典型污染物形态及活性氧介导复合损伤 机理”，本论文主要对飞灰颗粒物上典型有毒金属的形态分布及生物氧化性损伤作初步的研 究，主要内容有： 1 ) 选取来源明确的五种燃煤飞灰颗粒物试样( 其中包括四种经机械燃烧产生的飞灰及 一种手烧茶炉产生的飞灰) 以及一种燃术产生的飞灰颗粒物；典型有毒金属主要选取可能 与生物毒性有关的n i 、l v i n 、f c 、c o 、c a 、z n 、p b 、c r 八种金属。 2 ) 研究化学浸取剂e d t a p b m n ；n i 、c o 、c u 、z n 和c r 与a 5 3 2 的相关性不明显。金属 f e 和p b 的( a e c + r c d ) 和浓度与a 5 3 2 值也表现出一定的相关性，但其相关系数较氧化物 键合态与a s 3 2 值低。相关系数的不同表明在颗粒物参与的活性氧反应过程中，各种金属所 表现的反应活性可能是不同的。 表3 - 3 无外加络合剂情况下金属形态浓度 与燃煤及燃木飞灰氧化剂产生能力间的相关系数 4 3e d t a 存在下颗粒物羟自由基产生能力与金属形态浓度的相关性 络合剂的加入可以显著改变金属催化活性氧产生及转化能力，e d t a 是应用较广的用 于改变固相金属浸出及氧化还原能力的一种螯合剂。如表3 - 4 所示，除c u 外，a e c 的形 态浓度与颗粒物氧化能力不存在线形相关性，e d t a 盼存在可以改变颗粒物生物氧化特性 嗍，但此条件下的氧化物键合态的m n 、f e 和p b 与颗粒物氧化能力的相关性与无外加络合 剂加入体系相似，相关系数由大到小次序为m n f e p b ，除m n 的排列次序有较大改变外， 其它两种金属的相关系数次序与无外加络合剂情况相同。( a e c + r e d ) 与颗粒物氧化能力相 关性亦不如r e d 形态浓度与颗粒物氧化能力相关性好。 表3 - 4 络合剂e d t a 参与情况下金属形态浓度 与燃煤及燃木飞灰氧化剂产生能力问的相关系数 4 4n t a 参与下飞灰产生活性氧能力与金属形态浓度的关系研究 n t a 可极大地提高可变价金属通过f e n t o n 反应路径介导的氧化损伤能力 4 9 】，如表3 - 5 所示，多种形态分布的金属与颗粒物生物氧化能力相关性发生了极大的变化，与无外加络 合物和e d t a 存在环境中相关性有较大的不同。金属c o 、p b 的a e c 及r e d 形态浓度及 ( a e c + r e d ) 浓度与颗粒物在该体系中的生物氧化能力均表现出较好的相关性，由表3 5 可 知，氧化物键合态浓度与其相关性最好；此外，n i 、f e 、c u 、z n 及。的氧化物键合态浓 度与舢五光度值相关性亦较好，但它们a e c 形态浓度与其没有相关性，m n 的各种形态浓 度与颗粒物氧化能力均无相关性。本文推测，由于n t a 在f e 虹t o n 类型反应体系中螯合及 促氧化能力的相互协同作用使金属存在形态于反应过程中发生变化，从而造成相关性发生 较大改变。 表3 5 络合剂n t a 参与情况下金属形态浓度 与燃煤及燃木飞灰氧化剂产生篚力间的相关系数 4 5c i t 存在环境中颗粒物氧化能力与金属形态浓度的关系研究 由表3 - 6 可知，在c i t 存在条件下，所有金属各形态浓度与颗粒物的氧化剂产生能力 均不相关。c t 存在环境下金属催化活性氧产生及转化机理的研究具有一定意义，实验研 究表明 5 5 1 ，与活性氧相关的典型人体病理环境中，金属离子很可能以( 3 1 t 络合物形式存在。 本文的实验结果提示，利用颗粒物上金属形态分布浓度方法不大可能准确地描述它们在 c i t 环境中对模拟生物分子脱氧核糖的氧化情况。 表3 - 6 络合剂c r r 参与情况下金属形态浓度 与燃煤及燃木飞灰氧化剂产生能力间的相关系数 5 小结 本文探讨了燃煤及木材飞灰颗粒物在脱氧核糖氧化体系中氧化能力与其所含不同形态 可变价金属n i 、m n 、f e 、c o 、c u 、红、p b 和c r 浓度的相关性，同时亦考察了不同络合 剂e l y r a 、n t a 和c 1 t 对相关性的影响，结果表明： ( 1 ) 脱氧核糖氧化方法是一种快速、灵敏、准确的用于研究固体颗粒物上金属催化氧 化能力的体外实验方法； ( 2 ) 无外加络合剂及e d t a 存在情况下，飞灰颗粒物上金属形态浓度与颗粒物的氧化 能力相关性基本上是相似的，但m n 的相关系数排列次序有所不同； ( 3 ) 在e d t a 、n t a 及无外加络合剂的反应条件下，氧化物键合态金属浓度与颗粒物 生物氧化能力相关性较好( 除e d t a 条件下的c u 外) ，此结果与前人的假设基本相符( 5 6 ； ( 4 ) 不同络会剂对颗粒物上金属形态浓度与氧化剂产生能力的相关性影响不同，c i t 存在条件下，金属的形态浓度与颗粒物生物氧化能力不存在相关性。 第四章飞灰颗粒物金属浸取浓度与颗粒物氧化剂 产生能力的关系研究 1 引言 本文以燃煤及木材产生的飞灰为例，利用典型的活性氧产生模型体系，来考察颗粒物 上金属参与催化活性氧损伤的可能性，金属的存在形式与其反应活性有密切关系，如存在 于晶体晶格中的金属是不太可能参与氧化还原反应的，为此本文选取了既有重要环境意义 4 4 ，同时又有重要生物学意义悯的金属螯合剂e i ) t a ( 乙二胺四乙酸) 和n 1 a ( 氨三乙酸) 来 考察它们的金属溶出浓度与氧化典型生物分子之间的关系，考虑到人体在典型活性氧参与 的病理环境中，金属离子可能以柠檬酸( c ) 络合物形式存在 蛔，同时颗粒物介导的活性氧 损伤程度可能与稀盐酸溶出的可离子化浓度有关，故也同时探讨了金属被盐酸( 1 o 旧和柠 檬酸溶出浓度与颗粒物氧化性损伤的关系。 2 材料与方法 2 1 试剂与仪器 盐酸、氢氧化钠、氯化镁、醋酸钠、双氧水、硝酸、盐酸羟胺，均为分析纯试剂； 7 , - - 胺四乙酸、氨三乙酸、柠檬酸：按常规方法用m i u - q 超纯水配制成2 0m m o y l 提 取液； i c p 6 1 发射光谱仪：美国热电子公司 b 0 1 2 1 s 电子天平：m a d eb ys a r t o r i u s m f l i qr q 超纯水净化系统：韩国y o u n g l i n 公司 l d 5 。2 型电动离心机：北京医用离心机厂 t h a - s 型气浴恒温振荡器：江苏恒丰仪器厂 7 2 0 p 型p h 计：北京渠道科学器材公司 常用玻璃仪器。 2 2 样品的采集 选取四处经取暖锅炉旋风除尘下来的飞灰( 编号分别为n o 1 、n o 2 、n o 3 、n o 4 ) 及 一处手工茶炉产生的飞灰( 编号n o 5 ) ，所用煤均为天津市统配煤，以及大兴安岭森林中燃 木取暖产生的飞灰( 编号n o 6 ) ，六种飞灰过筛( 2 0 0 目) 得7 4 u m 以上颗粒物，低温保存备用。 3 6 2 3 活性氧反应体系的选择及过氧化值的测定 脱氧核糖( d r ) 是一种对o h 十分敏感的反应底物，h a l l i w e l l 等人利用典型f e n t o n 反应， 以脱氧核糖为底物，曾经测定了许多典型o h 清除剂的二级动力学反应常数，与用经典射 解方法( p u i s 础d i c 岈s i s ) 所得测定值可比性很好，从而刨造了脱氧核糖用于o h 及清除剂反应 程度测定的脱氧核糖氧化方法川，目前已应用于石棉碍1 、煤尘嘲及人为源颗粒物叫等典型颗 粒物氧化性损伤的体外实验研究。其反应过程如下： m l ”1 + a s e 岭俨+ o x - a s e ( 式3 1 ) 俨+ h 2 0 2 斗俨1 + o h 。+ o h( 式3 2 ) ( f e n t o n 反应) o h - k d r 争f m g - d r 争m d a( 式3 3 ) m d a + 2 t b a - - c h r o m o g a a ( 式3 q ( 光度测定a = 5 3 2 n m ) 上式中，m 代表可参与活性氧反应的金属：a s e 代表抗坏血酸； o x - a s c 代表氧化态 的抗坏血酸； f r a g - d r 代表与羟自由基反应产生的脱氧核糖碎片； m d a 代表丙二醛 ( m a l o n d i a l d e h y d e ) ：t b a 代表硫代巴比妥酸( t h i o b a r b i m r i ca c i d ) ；c h 砌m o g 代表用于光 度测定的最后产物，显红色。该反应灵敏，快速，准确可靠。 称取飞灰1 0 m g ，各分别加入2 m l 抗坏血酸、脱氧核糖和h 2 0 2 ，它们于混合液中的初 始化浓度均为1 0 m m o l l ，3 7 c ，恒温振荡3 0 m i n ，1 2 0 0 0 r m i n 离心3 0 m i n ，取上清液l m l ， 再加入l m l 1 0 ( w v ) t b a 及l m l 冰醋酸，1 0 0 加热1 0 m i n ，于冰水中冷翘，取该试液 于l = 5 3 2 n m 波长下测定吸光度值。 所用水为m i l i q 超纯水，并冲n 21 5 r a i n 以除去溶解氧。 2 4 金属浸取浓度的测定 称取1 0 0 r a g 试样，各分别加入经稀盐酸或n a o h 调至p h7 4 的n t a 、e d t a 、c i t 溶 液浓度均为2 0 m m o l l2 0 m l ，以及h c l1 0 m o l l2 0 m l ，3 7 c 恒温振荡6 h ，离心，取 上清液用于金属离子测定。 7 2 4 1 仪器测定条件 采用美国热电子公司生产的i c p - 6 1 发射光谱仪并经m m p c 机进行数据的采集处 理，测定条件为：功率1 1 k w ，a r 冷却气流量1 5 l r a i n ，a r 载气流量o 6 l r a i n ，观测 高度1 6 r a m ，狭缝2 0 p m 。被测元素波长如下。 被测元素 n i m n f e c 0 c u z n p b c r 分析线1 1 1 1 1 2 3 1 6 0 4 2 5 7 6 l o 2 5 9 9 4 0 2 2 8 6 1 6 3 2 4 7 5 4 2 1 3 8 5 6 2 2 0 3 5 3 2 6 7 7 1 6 2 4 2 试剂配制 7 ) 标准储备液 均以高纯或光谱纯金属、金属氧化物或金属盐类按标准方法配成1 0 0 0 m g l 的储备液。 8 ) 标准应用液 高标准溶液一吸取上述储备液各1 0 o om 1 置于1 0 0 0m l 容量瓶中配制成各元素的 浓度均为1 0t lg m 1 的l mh e l 混合标准溶液。 低标准溶液1 mh e l 空白溶液。 9 ) 试验用水 m i l i - q 超纯水。 2 4 3 校正曲线的绘制 以1 mh c l 空白溶液为低标，以1 0 肛g m l 各元素混合物标准液为高标，调仪器的冲洗 时间为6 0 s ，曝光积分时间5s ，曝光3 次，上机分析低标和高标。绘出各元素的强度对浓 度值的校正曲线，并于微机内储存。 2 4 4 试样的前处理及分析 将待测样品以与校正曲线相同的仪器条件上机分析，分析后微机自动记录测定结果。 2 5 数据处理 p e a r s o n 相关系数 利用p e a r s o n ( 皮尔生) 乘积矩相关系数r 来确定两个数据集合( 两种属性) 之闻的 关系，这是一个范围在一1 0 到1 0 之间( 包括一1 0 和1 0 在内) 的无量纲指数，反 映了两个数据集合之间的线性相关程度。 回归线的r 值为： 3 9 3 结果与分析 3 1 飞灰颗粒物氧化能力与金属浸取浓度的关系 为了考察颗粒物氧化能力与各种金属可能溶出浓度的相互关系，本文分别测定了变价 金属n i 、m n 、f e 、c o 、c u 、z n 、p b 、c r 在1 0 m o l lh c l 溶液，2 0 m m o l le d t a 、n t a 及c r r 溶液中的溶出浓度，并进行了相关性比较，如表4 1 所示。被盐酸溶出的金属离子 浓度( 可离子化浓度) 与颗粒物氧化能力有很大的相关性，相关系数由大到小顺序为： r f o r z 。 r m 。 r p b ，而c r 、c u 、n i 、c o 的可离子化浓度与氧化能力之间不存 在明显的相关性。同时被n t a 螯合剂浸取的离子浓度与颗粒物氧化性相关性亦很好， 顺序为：r f 。 r z 。 r m 。 r p b ，与可离子化浓度表征的相关顺序是相似的。由于f e 是最典型的介导氧自由基过程的过渡金属m ，在本文六种颗粒物上的含量与其它可变价金 属相比最高，因而最有可能在氧化损伤生物分子过程中起主导作用。虽然e d t a 浸取条件 下的m n 、z n 、c d 及c i t 浸取条件下的m n 等金属浓度与颗粒物氧化能力之间有一定相关 性，但由于含量最高的可变价金属铁在该条件下没有很好的相关性，因而此两种络和剂作 用下离子溶出浓度不能很好地表征颗粒物氧化损伤情况。 表4 1 飞灰颗粒物在脱氧核糖氧化体系中的氧化能力与被溶出金属浓度的相关系数 4 0 4 讨论 g h i o 等人认为飞灰中颗粒物氧化往损伤与可离子化浓度相关，是由于用该方法溶出的 金属均参与了催化活性氧产生反应1 ，但由表1 可知，并不是所有的具有可变价金属的可 离子化浓度与颗粒物氧化能力呈线性相关。n t a 是具有重要环境意义且生物学毒性显著的 一种螯合剂，可引起肾脏癌变，其致癌机理很可能与金属离子参与介导的活性氧损伤有关 【4 9 1 。本文研究结果表明，n t a 溶出的金属离子与颗粒物氧化生物分子的能力极大的相关性， 因而该浸取剂作用下的金属浓度指标