（材料学专业论文）n亚甲基磷酸化修饰的壳聚糖非病毒转基因载体的研究.pdf

摘要 本工作采用均相反应法制备n 亚甲基磷酸化壳聚糖衍生物( n m p c s ) ，研 究了其与d n a 的复合能力，并将所形成的复合物用于介导体外基因转染，同时 考察了载体及其复合物的细胞毒性，主要内容包括以下四个部分： ( 1 ) 以红外光谱( f t - m ) 分析表明改性后的壳聚糖的特征基团有显著变化： 1 3 c n m r 检测进一步证明了亚甲基磷酸基团的引入，结合元素分析确定了 取代度。 ( 2 ) 通过复凝聚的方法，制备了纳米尺寸的仰c s d _ n a 聚电解质复合物。考 察了共聚物与d n a 的相互作用情况，复合物中d n a 的构象变化和复合物 的形态和粒径。圆二色谱结果表明d n a 与壳聚糖作用形成纳米尺寸的复 合物后仍然保持着典型的b 型构象。透射电镜，原子力显微镜检测结果表 明，不同n p 下的n 亚甲基磷酸化修饰的壳聚糖d n a 纳米复合物呈现较 规则的球形，且在高电荷比时可形成尺寸较小的纳米尺度颗粒。 ( 3 ) 以人肝癌细胞h e p g 2 和人宫颈癌细胞h e l a 为宿主细胞，尝试了以n m p c s 为载体介导含荧光素酶的p g l 3 质粒的体外转染，重点研究了p h 值和n p 比对转染效率的影响。实验结果表明，载体可有效将质粒转染h e l a 和 h e p g 2 细胞，获得的最佳转染效率远高于裸d n a 和c s ，与p e i 相当。基 于磷酸基团对钙离子有良好的鳌合能力制备了聚合物盐型n m p c s c a 载 体，并用于介导基因转染，其转染过程类似于传统的p c a 载体，并认为 c a 2 + 离子通道促进了转染过程。考察了1 6 一c s 和n m p c s 载体协同介导基 因转染研究，结果表明亲疏水相互作用影响复合物的形成和基因转染活性。 ( 4 ) 利用m t t 实验初步研究了衍生物载体及其复合物在上述两种细胞中的毒 性，结果表明在实验条件下，载体和复合物的毒性要远远小于同等浓度时 p e i 的毒性，而载体的毒性要稍高于对应复合物的毒性，且体现一定的浓 度依赖性。 关键词：非病毒载体，基因运载，壳聚糖，自组装，亲水性亲油性 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , n - m e t h y l e n ep h o s p h o n i cc h i t o s a n ( 卜m m c s ) ，锄a m p h i p h i l i c m a e r o m o l e c u l ew i t hp o w e r f u lc h e l a t i n ga b i l i t yo fc a ri o n s ，w a ss y n t h e s i z e da n d c h a r a c t e r i z e d , t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nn m p c sa n dp l a s m i dd n a ，t h eg e n e t r a n s f e c t i o na n dd e l i v e r ym e d i a t e db yn m p c s d n ac o m p l e x e s ，a n dc e l lc y t o t o x c i t y o ft h ed e r i v a t i v ea n dt h e i rc o m p l e x e sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h em a i nw o r ki s s u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) n - m e t h y l e n ep h o s p h o n i cc h i t o s a n ( n m p c s ) w a ss y n t h e s i z e du s i n gao n e - s t e p r e a c t i o nt h a ta l l o w e dh o m o g e n e o u sm o d i f i c a t i o n sw i t h o u ta n ys h a r pd e c r e a s ei n i t sp r o p e r t i e s f t - i r , c n m r ，a n de l e m e n ta n a l y s i sp e r m i t t e dt h ei d e n t i f i c a t i o n o f t h es t r u c t u r ea n dt h ed e g r e eo f s u b s t i t u t i o no f n n m c s ( 2 ) n m p c s d n ac o m p l e x e sw e r eo b t a i n e du s i n gac o m p l e xc o a c e r v a t i o np r o c e s s ， c h a r a c t e r i z e db ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sr e t a r d a t i o na s s a yf o rt h e i rs t a b i l i t i e s ， a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) ，t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) a n d l a s e rs i z ea n a l y s i z e ro b s e r v a t i o nf o rm o r p h o l o g ya n ds i z e ，r e s u l t ss h o w e dt h a ta t c h a r g er a t i o2 ：1 o ra b o v e ，d n ac o u l db ec o m p l e t e l ye n t r a p p e da n ds p h e r i c a l c o m p l e x e sw i t hm e a ns i z eo f8 0 - 2 10 n mw e r ef o r m e d ，c ds p e c t r av e r i f i e dt h a t t h e 、i n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n dn a 口c sc a u s e das l i g h tp e r t u r b a t i o no nd n a b o n d sa n dd n as t i l lr e m a i n e db c o n f o r m a t i o nw i t h i nt h ec o m p l e x e s ( 3 ) c o m p l e x e sw e r ef u r t h e re m p l o y e dt ot r a n s f e e th e l aa n dh e p g 2c e l l s ，a n d t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yw a si n v e s t i g a t e du s i n gt h ep g l 3l u c i f e r a s er e p o r t e rg e n e i nc e l lc u l t u r em e d i u mw i t hd i f f e r e n tp hv a l u e s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c i e sw e r es t r o n g l yd e p e n d e n to nt h ec h a r g er a t i oa n dp h v a l u eo fc u l t u r em e d i u m ，f o rh e l ac e l l s ，t h eh i g h e s te f f i c i e n c yo b t a i n e da tr a t i o o f4 ：1a n dp h6 2w a sg r e a t l yh i g h e rt h a nt h a tf r o mc s d n ac o m p l e x e so r n a k e dd n aa n da p p r o x i m a t et ot h a tf r o mp e i d n ac o m p l e x e s ，a l t h o u g hh e p g 2 c e l l sw e r el e s se f f i c i e n t l yt r a n s f e c t e d p o l y m e r - i n o r g a n i cs a l tt y p en m p c s - c a v e c t o rs h o w e ds o m es i m i l a r i t i e sw i t ht r a d i t i o n a lc a - p ，g i v i n gh i 曲e f f i c i e n c i e s p r o b a b l yo w et op o s i t i v er o l eo fc a 计i o nc h a n n e l s y n e r g i s t i ce f f e c to f16 n - d o d e c y l a t e dc h i t o s a n ( 16 - c s ) o nt h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yo fn m p c s d n a c o m p l e x e si n d i c a t e dt h a th y d r o p h o b i ca n dh y d r o p h i l i ci n t e r a c t i o n si n f l u e n c e d t h ef o r m a t i o no ft h ec o m p l e x e sa n dt h u st h ew a l l s f e c t i o np r o c e s s ( 4 ) t h ec y t o t o x i t yo fd e r i v a t i v ea l o n ea n di t sc o m p l e x e sw i t hp l a s m i dd n aw e r e d e t e r m i n e db y3 - ( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z d - 2 - 、一) - 2 ，5 - d i p h e n y l t - e n t r a z o l i u mb r o m i d e ( m t t ) a s s a yb o t h 0 1 1h e p g 2a n dh e l ac e l l s ，t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e d e r i v a t i v ea l o n ea n dt h e i rc o m p l e x e ss h o w e ds i g n i f i c a n t l yl o w e rt o x i c i t yt h a n p e ia n dp e i d n ac o m p l e x e s ，r e s p e c t i v e l y ，a n dn e v e r t h e l e s s ，b o t hn m p c s a l o n ea n di t sc o m p l e x e sa l s os h o w e dad o s e - d e p e n d e n tc y t o t o x i c i t y k e y w o r d s ：n o n - v i r a lv e c t o r ，g e n ed e l i v e r y ，n - m e t h y l e n ep h o s p h o n i cc h i t o s a n s e l f - a s s e m b l y ，h y d r o p h i l i c l i p o p h i l i c 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津 大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 学位论文作者签名：扣匆心 签字日期：沙口7 年月c 妒e t 学位论文版权使甩授权书 本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文 的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件 和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名j 拙彻向 导师签名： 签字日期：泸 年l 月l 可日 硼协唾 签字日期：年 “ 7 乒少鼍 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 生物体的一切生命活动，从出生成长、到出现疾病、衰老直至死亡都与基因 有关，基因调控着细胞的生长、分化、老化及死亡等各种功能。长期以来科学家 们一直思考着人类能否最终依靠无论是人本身或外源的遗传物质来治疗疾病，包 括纠正人自身基因的结构或功能上的错乱、阻止病变的进展、杀灭病变的细胞或 抑制外源病原体遗传物质的复制，达到治疗疾病的目的。2 0 世纪9 0 年代以来， 世界各国纷纷将人类基因组计划列为国家重大研究项目，正如很多人认为，这可 能是当代及整个时代最重要的科学事业【l 】。随着人类基因组计划完成和后基因组 计划实施，功能基因不断涌现使得基因药物开发和展开基因治疗将成为研究热 点。1 9 9 0 年，美国用a d a ( 腺苷酸脱氨酶) 基因治疗了一位因a d a 基因缺陷 导致严重免疫缺损的4 岁女孩，致使世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮【2 1 。 经十多年的发展，基因治疗尽管仍有许多障碍有待克服，但总的趋势令人鼓舞。 据统计，截止1 9 9 8 年年底，世界范围内已有3 7 3 个临床法案被实施，累计3 1 3 4 人接受了基因转移试验，充分显示了其巨大的开发潜力及应用前景。随着基因工 。 程、分子生物学、免疫学等理论和技术的飞速发展，基因治疗已成为诸多学科研 j 究的一个非常活跃的领域，临床研究也取得很大进展。正如基因治疗的奠基者们 当初所预言的那样，基因治疗这一新技术的出现将推动下一世纪医学的革命性变 化。著名遗传学家谈家桢教授高瞻远瞩地指出：“2 1 世纪的医疗革命将取决于基 因治疗研究的成功。” 1 1 1 基因治疗的概念 基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的功能性基因通过一定方式和 手段导入人体靶细胞，表达成所需的特异性蛋白，以纠正基因的缺陷或者发挥治 疗效用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因治疗的范围很广：遗 传性病变，即遗传物质缺陷所致疾病，通过基因治疗可以修正、补充、或取消致 病基因；肿瘤性疾病，肿瘤细胞常常会有多种基因的改变，因此，目前将一些 涉及肿瘤的主要基因进行基因治疗，如p 5 3 抑癌基因，r a s 癌基因等；多基 因遗传性疾病，如糖尿病、高血压、动脉硬化；基因疫苗，即导入一些病原体 第一章绪论 基因，刺激机体产生特异的免疫力，以抵抗这些病菌的侵袭。目前基因治疗研究 已经广泛应用于遗传病、肿瘤和病毒性疾病，并且取得了一定的成功，成为生命 科学领域里的研究热点之一【3 羽。 1 1 2 基因治疗的策略和途径 随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗 方法获得了较大的发展【7 1 。根据所采用的方法不同，基因治疗的策略大致可分为 以下几种：基因置换，基因修复，基因修饰，基因失活免疫调节等。基因治疗的 策略较多，不同的方法在实践中各具有优缺点，而基因的治疗本身也并不局限于 遗传病的治疗，现已扩展到肿瘤、病毒性疾病等，也可用于疾病的预防。基因治 疗的途径如图1 1 所示主要有两种，即体内疗法( i nv i v o ) 和离体疗法( e xv i v o ) 。 体内疗法是将外源基因直接或通过基因转移系统导入体内相关组织细胞，导入体 内之后必须进入靶细胞，有效表达并达到治疗目的。体内疗法的直接注射是最简 易的基因转移方法，是具有极大吸引力的方法，易被临床医生采纳。该法较适宜 的受体细胞是肌肉细胞，转移基因似乎以未整合的染色体外状态存在，外源基因 表达持续时间数个月不等，但该法离临床应用还有一段距离，存在的主要问题为 转染效率和表达水平均较低，因此该法也有待进一步深入探讨。目前研究和应用 较多的还是体外疗法，即先将合适的靶细胞从体内取出，在体外扩增，并将外源 基因导入细胞内使其高效表达，然后将这种基因修饰过的靶细胞回输病人体内， 使外源基因在体内表达，从而达到治疗目的f 8 】。这种疗法程序繁杂，所用技术专 业性强，要求条件高且花费昂贵，在一般医疗机构难以实施，即使有效也很难被 临床医生接受。 i n d i r e c t ( e xv i v o ) t a r g e 网裹- f fc 吣e l l 。 | n o n - v i r a i d i r e c t 【i nv i v o ) n o - n - v i r a ll 图1 1 基因治疗常用策略和途径 f i g 1 ls t r a t e g yf o rt r a n s f e ro f ag e n ei n t oap a t i e n t 第一章绪论 1 1 3 基因治疗的步骤 基因治疗的步骤主要包括目的基因的选择和准备、受体细胞的培养、载体的 选择、目的基因导入靶细胞以及转导细胞的选择和鉴定掣9 1 。具体过程通常包括： 1 、制备的适宜的载体，该载体可与d n a 复合，以防止细胞内特定酶( 如核酸 酶) 对d n a 的降解，对d n a 起保护作用；2 、载体与d n a 通过特定的相互作 用( 阳离子聚合物主要是静电相互作用) 形成复合物，也可运用其他方法如物理、 化学、融合、非病毒及病毒载体方法经过血液循环或者直接注射到达耙细胞；3 、 复合物通过胞吞或融合等入膜途径跨过细胞膜开始在细胞质内多个细胞器的运 送；4 、复合物顺利由细胞质进入细胞核，从而实现基因的表达【l o 】。具体过程如 图1 2 所示：( 以阳离子非病毒载体为例体现细胞转染的整个过程) 。 e x p r e s s e dp r o t e i n _ b a m e mt os y s t e m i ca n dl o c a ld e l i v e r y 一； 图1 2 非病毒载d n a 复合物的转基因过程示意图 f i 9 1 2b i o l o g i c a lb a r r i e r st og e n et h e r a p y , ( 1 ) c o m p l e xf o r m a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n ， ( 2 ) t r a n s p o r ti nb l o o dc i r c u l a t i o n ，( 3 ) u p t a k e e n t r yi n t ot h ec e l l ，( 4 ) r e l e a s ef r o m e n d o s o m e ，( 5 ) d i s s o c i a t i o nf r o ms y n t h e t i cv e c t o r ，( 6 ) t r a n s i tf r o mc y t o p l a s mt on u c l e u s ， ( 7 ) u p t a k e e n t r yi n t on u c l e u sa n d ( 8 ) t r a n s g e n ee x p r e s s i o n 。 1 2 基因转运递送过程 1 2 1 转运递送过程的障碍 基因递送的确切障碍依赖于所采用的基因治疗策略，转基因可以应用于体内 或体外研究，目前体外实验策略的优势在于可以避免许多体内存在的生物学屏 障，可通过移除目标组织或体外转染靶向细胞，通过合理地选择和设计以提高宿 驰娥 第一章绪论 主细胞被转染比例的过程，最终将所存活的被转染的靶细胞再移植于体内。可是 体外基因递送方式中仍存在许多潜在的障碍。主要包含体外转基因表达效率的诸 多限制条件，选择中的时间和劳力密集型过程，该过程通常导致显著的组织缺失 及体内变性细胞的再引入】。治疗基因作为药物发挥作用首先必需克服两大障 碍：( 1 ) 胞外屏障，主要指注射载体后到达靶细胞过程的影响因素，包括细胞 吞噬系统，胞外基质、降解酶等；( 2 ) 胞内屏障，主要指细胞膜、内涵体( e n d o s o m c ) 、 溶酶体( 1 y s o s o m c ) 及核膜对靶基因进入核内有效表达的影响。 1 2 1 1 细胞外的障碍 体内基因递送体系的细胞外障碍是从注射点到靶细胞表面间所遇到的制约 性因素。基因纳米粒子进入体内后首先要克服的是细胞外的这些不利于纳米粒子 到达靶细胞的系统性因素，如受细胞外核酸酶的降解，体内网状内皮细胞的吞噬 清除作用，d n a 与非病毒载体的复合物也可能与血清蛋白相互作用使其在滞留 在体内很细的毛细血管【1 2 】，且反复的体内应用还可能会引起抗核酸抗体的产生， 激活免疫反应。同时载体基因复合物的稳定性对于延长循环时间是必要的，对 特定靶向细胞更是必需的，因为保护性的静电双层在高离子强度的溶液中被减 弱，纳米颗粒在离子溶液中可快速聚集。另外，对阳离子非病毒载体而言，带正 电的复合物易与细胞外基质：细胞膜表面和血浆蛋白( 都为电负性物质) 发生非特 异性反应，且带正电荷的基因纳米粒子可能会非特异地结合在体内的其他非靶细 胞上，并被这些细胞非特异性地吞噬。体系的稳定性可通过在阳离子脂质或阳离 子聚合物表面形成亲水性的郇刷子层”而得到改善，从而降低自身或非自身造成的 非特异性反应。 1 2 1 2 细胞内的障碍 阳离子脂质体和阳离子聚合物可通过两种途径进人细胞。一种途径是与细 胞膜表面的蛋白多糖发生静电介导的反应；另一种途径是在配体一受体结合时发 生的以受体介导的内吞作用。这两种方法最终结果都可导致复合物被摄入囊泡， 其内涵物部分递送给溶酶体。细胞内障碍存在于基因递送过程中所经历的与细胞 膜结合、内涵体释放、向细胞核的转运、进入细胞核和定向摄取等各个方面。 ( 1 ) 细胞膜由极性头部朝向水相，疏水性非极性尾部相对的磷脂双分子 层组成了生物膜的基本骨架，蛋白质分子以不同的方式镶嵌在脂双分子中或结合 在其表面，就构成了细胞膜的基本结构。经过细胞膜的物质转运有主动运输，被 动运输以及胞吞和胞吐作用。1 0 0 5 0 0 n m 的基因纳米粒子主要是通过细胞内吞作 用进入细胞的，可以是受体介导的也可以是非受体介导的【l 3 1 。 4 第一章绪论 ( 2 ) 内涵体一溶酶体复合物纳米粒子被细胞内吞后形成内涵体，在内涵 体的膜上通常伴随着质子泵的活动，使内涵体中p h 值下降，若是受体介导的细 胞内吞在酸性环境中将发生受体与配体的分离，受体经过内涵体的循环后又会回 到细胞表面。含有内吞物的内涵体可与溶酶体融合，而溶酶体中的各种酸性水解 酶可以对内吞物降解，溶酶体上也有许多质子泵，使溶酶体内的氢离子浓度可以 高出细胞质近一百倍。 ( 3 ) 细胞质在细胞质中存在着对复合物扩散阻力以及酶的降解作用，液 相的细胞质中包埋着由微丝，微管和中间丝所组成的细胞骨架成分，还溶解有许 多生物大分子和一些小的有机或无机分子。若载体d n a 复合物纳米粒子能从内 涵体一溶酶体逃逸，就需要经过重重扩散阻力到达核孔附近。同时还需要抵抗细 胞质中核酸酶的降解作用，目前的研究尚未清晰说明d n a 在这个过程中是否与 载体解离，以及何时解离。若d n a 在进入细胞核之前己与载体解离，则d n a 就可能被细胞质中的核酸酶所降解。因此应尽量在载体与d n a 解离前复合物应 到达细胞核，以保护d n a 不被细胞质中核酸酶所降解。 ( 4 ) 核膜核膜是由内外两层平行但不连续的单位膜构成，分内层核膜和 外层核膜，两层核膜厚度均为7 5 r i m ，都相当于细胞膜的厚度，中间是2 0 - - - 4 0 纳米的核周间隙，内外层核膜在某些部位相互融合形成环状开口，成为核孔，核 孔上镶嵌着核孔复合体，在真核细胞细胞周期中核膜有规律的解体和重建。在分 裂期，崩解，在分裂末期又形成。通过核膜的物质运输只能通过核孔，包括主动 运输和被动运输。被动运输时核孔复合体作为被动扩散的亲水通道其有效直径是 9 1 0 n m 即相当于允许相对分子质量在4 0 x 1 0 3 到6 0 x 1 0 3 以下的蛋白质分子自由 通过核孔。但有些小分子由于带有含信号功能的氨基酸序列可以通过主动运输进 入细胞核。通过核孔复合体的主动运输有亲核蛋白的核输入如组蛋白，核糖体蛋 白以及d n a 和r n a 的合成酶，r n a 分子及r n p 颗粒的核输出等，具有高度的 选择性且是双向的。主动运输颗粒比被动运输大，达到2 6 n m 即核孔复合体的有 效直径的颗粒均可被调节。通过核孔的运输是一个信号识别与载体介导的过程， 需要消耗能量且是双向的。由此可见较大的物质不能通过被动运输通过扩散作用 入核，只能通过主动运输进入细胞核。 显然易见，基因纳米粒子之所以转染效率较低是因为需要跨越细胞体内重重 障碍，抵抗各个阶段核酸酶的降解作用。自然界中的病毒却可将自己的遗传物质 高效地运送到靶细胞核，并能整合到细胞基因组中达到稳定的表达，且随着细胞 的分裂而复制分裂。此外，体内的一些激素也可以特异地进入细胞核发挥作用。 对这些生物体中存在的分子及它们进入细胞核的内在机理的了解，可为提高载基 因纳米粒子的转染活性和效率提供一些思路。 第一章绪论 1 2 2 基因转染过程中复合物跨越各道障碍的可能方法和途径 在转染过程中复合物能否跨越各道障碍决定了基因纳米粒子能否顺利到达 特定靶细胞的细胞核而使得特定的有效或治疗基因得以表达，达到治疗的目的， 从基因纳米粒子随血液进入体内到被特定的靶细胞吞噬，首先需要克服的是其与 血浆蛋白的相互作用，因为此种相互作用的增强可能会加速其在体内的清除。其 次是要抵抗核酸酶的降解，此外还要减少非特异细胞的摄入。这首先要求基因纳 米粒子要有适当的粒径和z e t a 电位，粒径的大小与它被网状内皮细胞细胞吞噬 清除及在血管中滞留的凡率有关。z e t a 电位是指基因纳米粒子表面所带静电荷的 多少，一般为正电而使得其可以通过与细胞膜表面负电荷的相互作用黏附在细胞 表面，有利于被细胞内吞。z e t a 电位同时还影响纳米粒子与血浆蛋白间的相互作 用，通过静电相互作用与细胞表面的结合是一种非特异的结合，如果所带的电荷 过大会使纳米粒子与非靶细胞的结合过多，使到达靶细胞的纳米粒子减少，同时 增加对细胞的毒。自然界中许多物质是通过受体和配体之间的相互作用与细胞的 特异性结合，可以通过在纳米粒子上偶连上与靶细胞表面特异结合的分子。在基 因转染研究中对壳聚糖进行半乳糖化修饰，将其与d n a 制成复合物对h e l a 细胞 进行转染，正是基于此种相互作用【。同时通过z e t a 电位与细胞表面的菲特异 结合的静电作用，有助于受体配体之间的相互靠近而产生特异结合。因此必定存 在一个最适宜的z e t a 电位可使特异的细胞结合最多。以壳聚糖为例，粒径和z e t a 电位的大小与n p 比值及其的分子量、脱乙酰度等有关【1 5 i 酣。聚乙二醇的修饰可 以减小纳米粒子与血浆蛋白间的相互作用i l 川。 ( 1 ) 穿过细胞膜有包膜的病毒是通过包膜与细胞膜之间的融合，将病毒 的内容物释放入细胞，而没有包膜的病毒主要是通过受体介导的细胞内吞作用。 体内还有多种受体和非受体介导的细胞内吞作用首先都始于受体和配体问的特 异结合或者是非特异地黏附在细胞表面。因此为了实现高效而特异的靶向运输， 可以在纳米粒子上偶连上各种特异的配体。在肝癌细胞，卵巢癌细胞的表面有较 多的叶酸受体，可在纳米粒子上用叶酸作为配体i l 引。在白血病细胞的表面有较多 的铁传递蛋白的受体，可在靶细胞是白血病细胞的纳米粒子上偶连上铁传递蛋白 1 9 j 。另外还有在t 细胞的表面有较多的c d 3 分子【坝，在许多上皮细胞癌的细胞 表面有许多表皮生长因子的受体【2 。同时可以用长的烷基链修饰壳聚糖增加它对 细胞膜的扰动作用，有利于复合物粒子进入细胞。 ( 2 ) 内涵体一溶酶体逃逸当载基因纳米粒子进入细胞后形成内涵体，由 于内涵体膜上有质子泵活动使其p h 下降，然后内涵体与溶酶体融合，p h 值进 一步降低，同时还得抵抗溶酶体中酸性核酸酶的降解作用。多肽在酸性环境中会 6 第一章绪论 发生构象变化，构象变化后的多肽可以便溶酶体的膜破裂【琵2 3 1 。这些小分子多 肽的偶联可能会有利于载基因纳米粒子从内涵体溶酶体中逃避。另一种关于内 涵体逃避是通过质子海绵作用实现的，即进入溶酶体的基因载体上有仲胺和叔胺 基团，在质子泵活动使得p h 值下降的过程中，这些基团有缓冲作用，可以结合 游离的氢离子，使p h 值下降延缓，从而使溶酶体中的酸性核酸酶失去活性。由 于这种缓冲作用的存在，质子泵持续活动，氢离子进入溶酶体的数量不断增加， 在电荷的作用下也有大量的氯离子进入溶酶体中，最终会由于渗透性膨胀，使溶 酶体膜破裂。其他的一些学者认为长的疏水性碳链的修饰可以破坏溶酶体的膜结 构。些药物的使用也可以使基因纳米粒子免受核酸酶的降解，如氯喹是可以穿 过溶酶体膜的碱性药物，可以中和氢离子，使溶酶体中的p h 值不下降，从而使 酸性的水解酶不能发挥作用，保护基因纳米粒子免受核酸酶的降解【2 引。 ( 3 ) 沿细胞质的扩散以及抵抗细胞质核酸酶的降解先前的诸多研究表明 将质粒d n a 注射入细胞核中报告基因的表达要比将质粒d n a 注射入细胞质中 表达量高1 0 0 1 0 0 0 倍【2 ”7 】，过去对这个现象的解释是由于核膜的作用，近期研 究认为是细胞质中核酸酶的降解作用1 27 1 ，及纳米粒子在高度粘性的细胞质中运动 迟缓也起到了一定的作用。因此，对核酸的进行包装使它能够抵抗核酸酶的作用， 且有合适的形态使其易于穿过细胞质。病毒可以通过沿着细胞内的微丝微管细胞 骨架系统使其在细胞质中运动速度加快。有些研究在脂质体上连上一种动力蛋白 驱动装置，使它能沿着微管到达迅速到达核周，但并未说明具体的转运机制。 ( 4 ) 核膜较大的粒子通过核膜都需要经过核孑l 的主动运输，已知亲核蛋 白都有一个核定位信号，通过核定位信号可以与核孔中负责物质运输的蛋白相互 作用，经过核孔复合物的共同作用使蛋白从细胞质进入核内。各种核定位序列里 并没有同源性，目前认为n l s 是存在于亲核蛋白内的一些短的氨基酸序列片段， 富含碱性氨基酸，可以是连续的，也可以是分开的。第一个被确定的n l s 序列 来自猴。肾病毒s v 4 0 的t 抗原，由七个氨基酸序列组成p r o 1 y s 1 y s 1 y s - a r g l y s v a l ， 同时认为核定位信号周围的氨基酸序列对亲核蛋白进入细胞核也有影响。 ( 5 ) 其它存在其它一些因素影响着基因纳米粒子的转染效率，阳离子聚 合物和d n a 之间相互作用力包括静电相互作用，疏水和亲水作用，大小应该适 度，首先它要确保载体对d n a 的包埋作用，其次需要载体和d n a 在进入细胞 后在合适的部位解离，无论是在溶酶体中或是距离细胞核较远的细胞质中解离， 都会增加其被核酸酶降解的几率，因此需要考虑多方面的因素以提高转染效率。 第一章绪论 1 3 非病毒转基因载体递送体系 目前基因治疗的首要问题及主要发展障碍之一，就是如何将治疗基因输送 并进入特定的靶细胞，而能在该细胞中得到高效表达【8 】，因此基因治疗首先是一 个基因的运载过程。随着基因治疗研究的不断深入，人们越来越认识到选择适当 的载体，使得目的基因靶向、可控有效地表达，且产生较小的副作用，即载体效 率、靶向性和安全性问题，是基因治疗成功的关键。通常认为载体要能有效地避 免或减弱宿主细胞对异体基因材料的不利反应，理想的载体具有以下能力：( 1 ) 优先和特异靶细胞结合：( 2 ) 转导分化与未分化的细胞；( 3 ) 有效地使基因和宿 主d n a 整合；( 4 ) 能调控蛋白质以适宜治疗水平进行短期或长期表达：( 5 ) 以 高效价制造所需基因。目前，应用于基因治疗的载体主要有病毒载体( v i r a lv e c t o r ) 和非病毒载体( n o n - v i r a lv e c t o r ) 两种。采用的病毒载体主要有逆转录病毒【n 黜， 腺病毒【2 9 】，腺相关病毒【3 0 】，疱疹病毒f 3 l 】等。各种病毒都有其独特的性质，如逆 转录病毒只感染那些正在分裂中的细胞，对那些不在分裂期的细胞无感染性；腺 病毒比较容易引起免疫反应等。病毒载体由于充分利用了病毒高度进化所具有的 感染和寄生特性，在转染率上有很大优势【3 2 - 3 5 1 ，目前绝大多数临床应用于基因治 疗的载体通常为病毒载体。但是目前研究和应用的病毒载体仍存在许多不足，主 要体现在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小，靶向特异性差、制备较复杂及 费用较高等 3 6 - 3 9 1 ，非病毒载体，因具有低毒性、低免疫反应，外源基因整合率低、 携带基因类型大小不受限制，及载体对细胞的靶向性和特异性可设计性等优点， 越来越受到人们的重视l 4 引。 1 3 1 目前非病毒基因递送体系存在的不足【1 1 】 一个理想的载体系统必须满足至少两个条件，即有效性和安全性。目前普遍 用于基因治疗临床实验的载体仍以病毒载体为主，但遗憾的是存在许多潜在的危 险，非病毒载体可以克服病毒载体的许多缺点，但菲病毒基因递送体系仍存在着 诸多不足： ( 1 ) 相对于病毒递送体系，非病毒基因递送体系的转染效率较低，粗略估计病 毒和非病毒的差距大约有1 0 0 0 1 0 0 0 0 倍； ( 2 ) 影响聚复合物( 聚阳离子化合物与d n a 的复合物) 的自组装及溶剂行为 的因素需要迸一步定义和说明； ( 3 ) 运用聚复合物进行基因转染的机制及影响转染效率的相关因素及其内在机 理还不是非常清晰了解，如果不进行深层次的了解，就不可能运用合理且 可行的方法去获得与病毒基因递送体系相近的转染效率的聚合物复合物； 第一章绪论 ( 4 ) 聚复合物应用于体内后，对影响和控制转基因表达的药理动力学及生物分 布的相关因素有待具有更高水平的了解。 解决了与聚复合物递送体系相关的上述任何一个问题均可协同提高该体系 的效率，而为了克服在聚复合物应用的基因治疗的这些障碍，有必要对阳离子聚 合物d n a 复合物的物理化学性质及对该体系的基因转染机制进行研究。根据应 用的基因治疗的策略的不同，转基因的表达持续时间的要求也由短暂、转瞬即逝 中间时段终身、稳定的表达。 1 3 2 非病毒载体 非病毒载体的作用应包括：( 1 ) 携带和运输作用，应具有特异靶向性，能辅 助基因进入胞内，核内；( 2 ) 保护剂的作用，防止基因被降解或失活；( 3 ) 使携 带的基因或核酸序列发挥治疗作用。在目前的研究中，非病毒载体主要包括裸 d n a 、脂质体( 1 i p o s o m c ) 、阳离子高聚物( p o l y c a t i o n s ) 以及复合载体等， 其 中后两者进展较快。 裸d n a 载体将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射而不依赖其 它物质的介导，是结构最简单的非病毒载体。由于其需要避开细胞内外的屏障才 能发挥作用，因此一般都采用物理方法( 如基因枪m 】、超声波【4 5 】、电穿孔【4 6 】) 导入基因转染的特定部位( 如骨骼肌肉 4 7 - 5 3 】，肝脏，心肌【5 4 】) 。裸d n a 的优点 是可以利用细菌比较廉价地大量生产带有药物基因的质粒。但其稳定性和转染效 率均不高，也很难有靶向性，同时只能在局部使用，不能转染大量细胞，可能还 需进行外科手术以暴露靶器官。j 脂质体最初是由英国学者b a n g h a m 和s t a n d i s h 用电镜观察分散在水中的磷 脂是发现的。分散在水中的磷脂形成多层囊泡，每层均是脂质的双分子层，囊泡 中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4 n m 。后来这种类似生物膜结构 的双分子小囊被成为脂质体。 脂质体是具有双层脂膜的封闭式微粒，又称为人工膜，其主要特点是含有水 相内核的脂质双分子微囊结构，形状微球形，直径约为几十纳米到既几十微米。 它与生物膜有较大的相似性和组织相容性，易于组织吸收，是一种无毒、无免疫 原性、可生物降解的基因载体。含有d n a 的脂质体为中空球形体，其外层是脂 双层膜，内部是d n a 的水溶液，这种结构使其在溶液中具有最稳定的状态和最 低的能量。一般而言，脂质体的内径为0 0 2 5 - - 0 1 i a n a ，而基因d n a 的长径约 2 o “m 。因此，仅少数受损的d n a 质粒才能被包裹，为了提高脂质体的包裹率， 人们发展了不同类型的脂质体。目前应用最为广泛的非病毒载体就是基于脂质体 的人工合成的大分子。其主要是由疏水部分和极性的头部，以及两者的连接部分 9 第一章绪论 组成，某些脂质体含有许多天然或合成的聚阳离子【州。早在1 9 8 7 年，f e i g n e r 就 首次报道了利用脂质体可体外转染培养细胞，1 0 年多的研究该系统已取得了重 大进展 s s - s s 】。根据脂质体包裹d n a 方式的不同可将其分为阳离子脂质体、阴离 子脂质体、p h 敏感脂质体及融合脂质体等【别，其中阳离子脂质体在体外应用较 多，由带正电荷的脂类和中性辅助脂类组成，与带负电荷的d n a 之间可以有效 地形成尺寸较小的复合物，电中性或带正电的有利于进入细胞膜的结构，与细胞 膜带负电荷的唾液酸结合后促使细胞通过内吞作用摄取载体复合物，脂质体是一 种人工的脂质双层结构，可以通过与细胞膜的融合或受体介导的细胞吞饮，将外 源d n a 送入细胞内，同时内涵体中所含的负电荷脂类可以有效地将阳离子脂质 体从复合体上解离下来，使d n a 释放到胞浆中，进而进入细胞核后进行有效表 达。l i p o f e c t i n 和l i p o f e c t a m i n e 都属于这类脂质体。 研究表明，脂质体的结构对转染效率有着很大的影响，其阳性头部，疏水部 分和连接部分都对转染有一定的影响【删，极性头部起到与质粒d n a 结合的作用， 同时还有助于脂质体d n a 复合物与细胞膜或细胞内其它组分的相互结合【6 u ；连 接基部分决定了脂质体的化学稳定性，被生物降解的能力及转染效率，同时连接 基还能提供引入新侧面链为电以提高靶向性，其长度和空间位置也决定了极性头 部的质子化能力及与核苷酸的磷酸基团的结合能力t 6 2 】，脂质体组成物的细胞毒性 也和其相关；疏水部分对脂质体的卷曲能力和其与质膜结合后的流动性起到一定 的影响。 在脂质体介导的基因转染实验中，在复合物中加入少量的赖氨酸或鱼精蛋白 等可形成类似病毒样的颗粒，能减少复合物间的凝聚，增加对d n a 的结合力， 提高脂质体在体外的转染效率。加入中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺( d o p e ) 可 提高转染效率。 阳离子聚合物载体含有高密度在特定p h 值下可质子化的氨基基团如一 n h 2 ，一n h 一，有时还含有一些靶向配体或者核定位信号等功能结构。阳离子 聚合物可以通过静电相互作用与d n a 形成聚合物配合物( p o l y p l e x ) ，复合物表 面一般带正电荷，这样有利于结合表面带负电荷的细胞膜从而有利于跨膜过程。 目前研究较多且效果较好的聚阳离子载体为聚乙烯亚胺( p e i ) 及其衍生物【2 1 6 3 埘】，树枝状高分子f 6 5 矧，明胶【6 7 】，聚氨基酸及其衍生物如聚l 赖氨酸【6 8 7 0 ， 聚精氨酸f 7 j 7 2 1 ，以及包含组氨酸碳环结构的聚4 一乙烯基咪唑等 7 3 - 7 5 】。近年来壳 聚糖以其良好生物相容性、生物降解性、跨膜特性及结构的可设计性而广泛用作 非病毒载体介导基因转染。 1 0 第一章绪论 1 3 3 壳聚糖及其衍生物在非病毒载体中的应用 基因治疗是将外源性基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治疗疾病的 目的。壳聚糖是一种生物相容性良好、可降解的，细胞毒性较低的天然碱性多糖， 是天然存在的甲壳素的脱乙酰产物，其结构类似于细胞外基质中的糖胺聚糖，在 水溶液中其表现为双亲分子的特征，是为数不多的无生物学毒性的碱性多糖，具 有良好的组织相容性，对其物化和生化性质的认识也不断深入。壳聚糖具有增强 生物大分子药物的透膜能力以及良好的生物黏附性和降解性，有助于增加生物大 分子在体内的吸收，因此在生物大分子药物递送体系中有良好的应用前景。壳聚 糖可作为酶抑制剂载体、可制备微粒制剂、混合胶体和包衣制剂等，这些药剂形 式都能在一定程度上避免肠胃道p h 环境和酶对生物大分子药物的降解，提高生 物利用度。壳聚糖作为一类聚阳离子化合物，壳聚糖糖链骨架所具有的高密度的 氨基基团，在p h 值低于6 0 时，其可质子化，其作为一种高效载体用于基因治 疗领域的研究不断深入