（农业生物环境与能源工程专业论文）SOD和APX与切花月季‘Samantha失水胁迫耐性间的关联.pdf

摘要 已有研究表明，植物体内抗氧化系统与植物对环境胁迫的耐性关系密切。本研究的目的是 探讨抗氧化系统关键酶超氧化物歧化酶( s o d ) 和抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 与月季切 花失水胁迫耐性之间的关联。试材选用切花月季s a m a n t h a ，分别用这两个关键酶的抑制剂和 促进剂进行1 2h 预处理，接着进行不同时间的失水胁迫处理，然后进行瓶插观察。结果表明： 1 与直接瓶插对照比较，失水胁迫显著提高了切花的弯颈事、降低了复水率、抑制了切花的开 放进程，缩短了瓶插寿命。与对照相比，失水胁迫处理明显提高了切花花瓣中s o d 活性、m d a 含量和相对电导率，显著降低了a p x 活性和抗坏血酸( a s a ) 含量。 2s o d 的专一性抑制剂，二乙基二硫代氨基甲酸钠( d d t c ，2 0m m ) 预处理在显著抑制花瓣 s o d 活性的同时，明显减弱了切花失水胁迫耐性，表现在切花弯颈率明显提高，复水率和水势 值明显降低，瓶插寿命显著缩短。在花朵自然开放初期，花瓣中存在m n s o d 、f e s o d 和 c u - z n s o d3 种类型同工酶。其中，m n s o d 有1 种，f e s o d 有3 种，c u z n s o d 有2 种；迁移 率大小依次为c u z n s o d f e s o d m n s o d ：谱带强弱依次为f e s o d c u z n s o d m n s o d 。经失水胁迫处理花瓣中诱导产生了3 条新的f e s o d ( f e s o d 4 、f e s o d 5 和f e s o d 6 ) 条带，与此同时m n s o d 条带消失。经d d t c 预处理的花瓣失水胁迫后观察不到上述条带。 3 与胁迫对照相比， 1 0 0 0m g la s a ， a p x 的底物预处理有效地提高了切花的复水率，延长 了瓶插寿命，保证了花朵的开放进程，同时显著提高了花瓣中的a p x 活性和a s a 含量，降低 了花瓣中的相对电导率；而5 0 0 i t i l 对氨基酚( 1 3 - a m i n o p h e n 0 1 ) ，a p x 的自杀性抑制剂预处理 得到了相反的效果。 4 通过5m ma s a 和6m mb a m i n o p h e n o l 预处理成功地调节了失水胁迫花瓣中的a p x 活性。 与胁迫对照相比，提高a p x 的活眭可延长切花的瓶插寿命，改善切花的开放状态和花枝的水分 状况，提高花瓣中s o d 活性，降低花瓣中的m d a 含量：而通过抑制a p x 的活性达到了理想 的反证效果。 6 利用简并引物从切花月季s a m a m h a 花瓣中克隆到一个5 6 9b p 的c d n a 片段，通过氨基酸序 列分析推断所得到的r h - a 户 肼为细胞质型的a p x 片段。n o r t h e r n 分析表明r h - a p x l 表达的 变化动态与a p x 酶活性变化一致，推测a p x 酶活性可能是在转录水平调控的。 关键词：月季切花，失水胁迫，超氧化物歧化酶，抗坏血酸过氧化物酶，同工酶，基因表达 a b s t r a c t i th a sb e e nr e p o r t e dt h a tt o l e r a n c eo fp l a n t st oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e si sc l o s e l yr e l a t e dt or e g u l a t i o n o f a n t i 。o x i d a n ts y s t e mi np l a n t st h e m s e l v e s t h i se x p e r i m e n tw a sa i m e dt oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nk e ye n z y m e si na n t i o x i d a n ts y s t e m ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) a n da s c o r b a t ep e r o x i d a s e ， ( a p x ) a n dt o l e r a n c et ow a t e rd e f i c i ts t r e s si l lc u tr o s e s ( r o s a y b r i d a ) f l o w e r so f s a m a n t h a w e r e p r e t r e a t e dw i t he n h a n c e m e n tr e a g e n to r a n di n h i b i t o r so f t h et w ok e ye n z y m e sf o r1 2h ，w a t e rd e f i c i t s t r e s s e df o rd i f f e r e n tp e r i o d ，a n dv a s e df o rl a t e ro b s e r v a t i o n t h er e s u l ts h o w e d ： 1 c o m p a r e dw i t hn o n - s t r e s s e dc o n t r o lf l o w e r s ，w a t e rd e f i c i ts t r e s si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yb e n tn e c k r a t e ，r e d u c e dw a t e rr e c o v e r yr a t e ，i n h i b i t e df l o w e ro p e n i n gp r o c e s sa n ds h o r t e n e dv b s el i f eo f f l o w e r s w a t e rd e f i c i ts t r e s st r e a t m e n ti n c r e a s e do b v i o u s l ys o da c t i v i t y , m d ac o n t e n ta n dr e l a t i v ee l e c t r i c c o n d u c t i v i t ya n dd e c r e a s e dm a r k e d l ya p xa c t i v i t ya n da s c o r b a t ea c i d ( a s a ) c o n t e n t ， 2 s o da c t i v i t yi np e t a l sw a sr e m a r k a b l yi n h i b i t e db y2 0m md d t cp r e t r e a t m e n t ，a n df l o w e r t o l e r a n c et ow a t e rd e f i c i tw a so b v i o u s l yd e c r e a s e d ，w h i c hw a se v i d e n c e db yt h eo b v i o u si n c r e a s eo f b e n tn e c kr a t e ，t h es i g n i f i c a n td e c r e a s eo fw a t e rr e c o v e r yr a t ea n df l o w e rw a t e rp o t e n t i a la n dt h e d r a m a t i cr e d u c t i o no fv a s el i f e t h r e et y p e so fs o dw e r eo b s e r v e di nt h ep e t a l so fc o n t r o li nt h e e a r l i e rs t a g e so f f l o w e ro p e n i n g , a n dt h e r ew e r et h r e ef e s o di s o f o n n s ，t w oc u - z n s o di s o f o r m sa n d o n em n s o di s o f o r m ，r e s p e c t i v e l y t h et u r no fm o b i l i t yw a sc u z n s o d f e s o d m n s o d ；a n d b a n d sa c t i v i t yw a sf e s o d c u - z n s o d m n s o d b yw a t e rd e f i c i ts t r e s s t h r e en e wb a n d s n a m e d f e s o d 4 6 ，w e r ei n d u c e da n dm n s o dd i s a p p e a r e ds i m u l t a n e o u s l y h o w e v e r , t h en e w l yi n d u c e d b a n d sb yw a t e rd e f i c i ts t r e s sa b o v ew e r ei n h i b i t e db yd d t cp r e t r e a t m e n t 3 c o m p a r e dw i t hs t r e s sc o n t r o l ，p r e t r e a t m e n tw i t h10 0 0m g la s a ，as u b s t r a t eo fa p x ，i n c r e a s e d e f f e c t i v e l yw a t e rr e c o v e r yr a t eo ff l o w e r s ，e x t e n d e dv a s el i f ea n di m p r o v e df l o w e ro p e n i n gp r o c e s s t h ep r e t r e a t m e n ta l s oe n h a n c e de f f e c t i v e l ya p xa c t i v i t ya n da s ac o n t e n ti np e t a l s ，b u td e c r e a s e d r e l a t i v ee l e c t r i cc o n d u c t i v i t y a so u re x p e c t a t i o n ，p r e t r e a t m e n tw i t h5 0 0m g lp - a m i n o p h e n o l ，a s u i c i d ei n h i b i t o ro f a p x ，a c q u i r e dc o n t r a r yr e s u l t s 4 a p xa c t i v i t yi np e t a l so fw a t e rd e f i c i ts t r e s s e df l o w e r sw a se f f e c t i v e l yr e g u l a t e db y5m ma s aa n d 6m m1 3 - a m i n o p h e n 0 1 c o m p a r e dw i t hs t r e s sc o n t r o l ，v a s el i f ew a se x t e n d e d ，f l o w e ro p e n i n gp r o c e s s a n dw a t e rr e l a t i o nw a sa l l e v i a t e d ，m d ac o n t e n tw a sd e c r e a s e da n ds o da c t i v i t yw a si n c r e a s e di n f l o w e r si nw h i c ha p xa c t i v i t yw a si n c r e a s e d i d e a lc o u n t e r e v i d e n c ew a so b t a i n e di nf l o w e r si nw h i c h a p xa c t i v i t yw a si n h i b i t e d 5 ac d n af r a g m e n to f5 6 9b pw a si s o l a t e df r o mp e t a l so fc u tr o s e s a m a n t h a u s i n gd e g e n e r a t e d p r i m e r s a n di tw a si n f e r r e df r o ma m i n oa c i ds e q u e n c ea n a l y s i st h a tr h - a p x lc l o n e db e l o n g e dt o c y t o s o l i ca p xg e n ef a m i l y i tw a ss h o w nb yn o r t h e r na n a l y s i st h a te x p r e s s i o nc h a n g i n gp a t t e m so f r h - a p x lw e r ea l m o s ti d e n t i c a lw i t ht h o s eo f a p xa c t i v i t y , s u g g e s t i n gt h a ta p xa c t i v i t yw a sp o s s i b l y i i r e g u l a t e da tt r a n s c r i p t i o n a l e v e k e yw o r d s ：c u tr o s e ，w a t e rd e f i c i ts t r e s s ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s es o d ，a s c o r b a t ep e r o x i d a s e a p x ，l s o e n z y m e ，g e n ee x p r e s s i o n i i i 缩写词 a b a a o s a p x a s a b s a c a t c n d a c u - z n s o d d d d t c d l g e c o l i e b e d l a n 舢 f e - s o d f w g 2 5 0 g a g p x g r g s h 0 s s g h h 2 0 2 i a m d a m e t 缩略词表 a b b r e v i a t i o n s 全称 a b s c i s i ca c i d a c t i v e o x y g e ns p e c i e s a s c o r b a t ep e r o x i d a s e a s c o r b a t ea c i d b o v i n es e r u ma l b u m i n c a t a l a s e c o m p l e m e n t a r yd n a c o p p e r - z i n cs u p e r o x i d e d i s m u t a s e d a y d i e t h y l d i t h i o c a r b a m a t e d i g o x i n e s c h e r i c h i ac o l i e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i u n e t e t r a a c e t i c a c i dd i s o d i u ms a l t i r o n s u p e r o x i d e d i s m u t a s e f r e s hw e i g h t c o o m a s s i eb r i u i a n tb l u e g 2 5 0 g i b b e r t l i ca c i d g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e g l u t a t h i o n e r e d u c t a s e r e d u c e dg l u t a t h i o n e o x i d i s e dg l u t a t h i o n e h o u r h y d r o g e np e r o x i d e i o d o a c t i ca c i d m a l o n d i a l d e h y d e m e t h i o n i n e 中文名 脱落酸 活性氧 抗坏血酸过氧化物酶 抗坏血酸 牛血清白蛋白 过氧化氢酶 互补d n a 铜锌超氧化物歧化酶 天 二乙基二硫代氨基甲酸钠 地高辛 大肠杆菌 溴化乙锭 乙二胺四乙酸二钠 铁超氧化物歧化酶 鲜重 考马斯亮蓝g 2 5 0 赤霉素 谷胱甘肽过氧化物酶 谷胱甘肽还原酶 还原型谷胱甘肽 氧化型谷胱甘肽 小时 过氧化氢 碘乙酸 丙二醛 l 一甲硫氨酸 1 v m i n m n s o d m o p s n b t o ， o ，一- oh p c d p c r p o d p v p q r n a r t - p c r s d s s d w s o d t b a d t b a r s t c a 1 y i s m l n u t e m a n g a n e s es u p e r o x i d e d i s m u t a s e 3 一i n m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i ca c i d n i t r o t e t r a z o l i u m b l u e c h l o r i d e s i n g l eo x y g e n t h e s u p e r o x i d e r a d i c a l h y d r o x y l r a d i c a l p r o g r a m m e d c e l l d e a t h p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p e r o x i d a s e p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e u b i q u i n o n e r i b o n u c l e i ca c i d r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e m s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e - p o l y a c r y l a m i d e s t e r i l ed i s t i l l e dw a t e r s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t h i o b a r b i t u r i ca c i d t h i o b a r b i t u r i ca c i dr e a c t i v es u b s t a n c e s t r i c h l o r o a c e t i ca c i d t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 分钟 锰超氧化物歧化酶 3 一( n - 吗啡啉) 乙磺酸 氯化硝基四氮唑蓝 单线态氧 超氧阴离子 羟自由基 程序化细胞死亡 聚台酶链式反应 过氧化物酶 聚乙烯吡咯烷酮 辅酶q 核糖核酸 反转录聚合酶链式反应 十二烷基硫磺酸钠 灭菌双蒸水 超氧化物歧化酶 硫代巴比妥酸 硫代巴比妥酸反应底物 三氯乙酸 三羟甲基氨基甲烷 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：缘 时间： 7 。f 年厂月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：管型乏 时间：- 8 。o f 年其 彳b 导师签名：丢，红豸 时间：h r 年j 月否日 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 月季切花是当前市场上最重要的切花种类之一。据不完全统计，2 0 0 3 年我国主要鲜切花产区年产 月季切花1 9 2 7 7 9 8 万枝，占切花总数的2 8 7 ，而2 0 0 2 年年产切花月季1 4 9 6 3 8 4 万枝，占切花总 数的1 6 6 无论从产量还是所占的比例都有提高( 农业部农业统计摘要，2 0 0 3 ) 。 出于能源和劳动力成本等考虑，世界鲜切花生产中心正向气候温暖，劳动力资源丰富的发展中国 家和地区转移，而消费市场仍集中在以美国、欧洲和日本为代表的发达国家，产销进一步分离使切 花的运输距离不断增大。虽然采用了空运和冷链运输等技术措施，但是由于运输距离过于遥远切 花在采后贮运过程中难免遭受各种逆境胁迫。出于成本考虑，现在切花多采用干式运输，运输时间 大多超过2 4h 。干式运输的切花处于失水胁迫逆境状态下( 高俊平等，1 9 9 6 ) 。由于失水胁迫引起的 切花瓶插寿命缩短，采后品质下降是全球性的难题。 1 失水胁迫与切花衰老 1 1 失水胁迫对切花的影响 月季切花对水分平衡状态的变化十分敏感( m a y a k 等，1 9 8 7 ) 。正常瓶插条件下月季切花花枝鲜 重先逐渐增加，达到最大值后再逐渐降低。但是当失水量超过吸水量时花朵开放受到影响，失水量 超过一定程度时花朵无法正常开放，出现“僵花”、“僵蕾”、萎蔫、弯头等现象，严重降低切花采后 吊质( 高俊平等1 9 9 5 ) 。各种切花失水胁迫后能够恢复的极限不同，如菊花失水胁迫后可恢复的 极限为鲜重的7 0 ( n a k a m u r e 和i t o ，1 9 7 5 ) 。月季切花失水胁迫后可恢复的极限因品种而异，且失 水胁迫后瓶插寿命缩短百分率与花朵水势显著相关( 唐雪梅，1 9 9 7 ) 。依据2 4h 失水胁追后瓶插寿命 缩短百分率，月季切花可分为耐失水胁迫、中度耐失水胁迫和不耐失水胁迫三大类( 唐雪梅等， 1 9 9 9 ) 。相同失水胁迫程度对不同切花月季品种的影响不同：不同失水胁迫程度对同一品种花材的开 放和衰老影响也不同，表现为失水胁迫程度较轻时能够恢复，程度较重时无法恢复( 唐雪梅，1 9 9 7 ) 。 1 2 失水胁迫相关的生理和技术研究概况 失水胁迫对月季切花的生理影响研究较多。在失水胁迫条件下，月季切花的赤霉素含量和乙烯生 成量发生变化( z i n s l i n 等，1 9 9 4 ；张常青等，2 0 0 2 ) ，细胞膜的透性提高( 李永红等，2 0 0 3 ) ，相 关的内肽酶活性也发生变化( 丛日晨等，2 0 0 3 ) 。 研究人员采取了一系列措施来减轻失水胁迫对月季切花的影响，如控制运输环境的温、湿度 ( z i n s l i n ，1 9 8 9 ) ，或者利用薄膜包装限制水分外逸( 高俊平等，1 9 9 6 ) ，还有在花枝失水胁迫后吸 收表面活性剂以提高月季切花的复水能力( v a nd o o m 等，2 0 0 2 ) 。抗氧化剂预处理可延长失水胁迫 月季切花的瓶插寿命，其中以抗坏血酸和0 胡萝 素处理效果最好( 李永红等，2 0 0 0 ) 。 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 2 活性氧与逆境胁迫 活性氧( a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，a o s ) 是指分子氧部分还原后形成的一系列比分子氧具有更活泼 化学反应性质( 如还原性、高能、不稳定性等) 的氧的某些代谢产物及其衍生物，包括超氧阴离子( o 。2 ) ， 单线氧( 1 0 2 ) ，过氧化氢( h 2 0 2 ) 和羟自由基( o h ) 等( k a r ，1 9 7 6 ) 。 2 1 活陛氧产生的场所 在植物细胞正常代谢过程中，活性氧可由多种途径产生。叶绿体、线粒体和质膜上的电子传递至 分子氧过程伴随产生活跃的、具有毒性的活性氧。生物和非生物胁迫的介入会使电子传递链和酶代 谢紊乱，活性氧水平随之升高( s h i g e o k a 等，2 0 0 2 ) 。 2 2 活性氧的危害 当处于失水胁迫等逆境条件下时，植物体内活性氧大量积累，活性氧的代谢平衡被打破，对植物 细胞造成多种伤害。活性氧自由基会攻击各种蛋白质上的氨基酸残基，使其金属结合位点被优先氧 化，组氨酸、脯氨酸、精氨酸和赖氨酸残基是氧化作用的主要靶子( s t a d t m a n ，1 9 9 3 ) 。活性氧中的 o 。对细胞有很强的毒害作用( s a l i n ，1 9 8 7 ) ，可启动膜脂中不饱和脂肪酸的过氧化作用，而过氧化作 用过程中又产生o “，如此反复，使质膜受到严重的伤害。活性氧一| l 的o h 能直接启动膜脂过氧化的 自由基链式反应( 王爱国，1 9 9 8 ) ，其产生的脂质过氧化物继续分解形成低级氧化产物如丙二醛( m d a ) 等。m d a 对细胞质膜和细胞中的许多生物功能分子均有很强的破坏作用，它能与膜上的蛋白质氨基 酸残基或核酸反应生成s h i f f 碱，降低膜的稳定性提高膜透性，促进膜的渗漏，严重时导致植物细 胞死亡f 刘国琴和樊卫国，2 0 0 0 ) 。因此m d a 的增加既是细胞质膜受损的结果，也是伤害的原因之一 ( 陈由强等，2 0 0 0 ) 。另外，干旱时活性氧自由基还会使膜脂发生脱脂化作用，使不饱和脂肪酸含量 减少，不饱和脂肪酸指数( i u f a ) 下降，导致膜功能丧失( 沈秀瑛等，1 9 9 5 ) 。 2 3 活性氧清除系统 植物存在着内源抗氧化系统以保护自身免受活性氧的伤害，这一系统包括抗氧化酶类和非酶抗 氧化剂。抗氧化酶类包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 等，具体见表l 一1 。 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 表l 1 植物体内主要抗氧化酶类 _ = = 卫幽型旦坐二型堕幽兰! 唑巴箜也e ! 型： 酶类 缩写e c 标号 一 1 甄硒蕊瓯丽西面鬲丽再矗忑万面矿n 矗 抗坏血酸过氧化物酶( a s c o r b a t ep e r o x i d a s e ) a p x1 1 1 11 1 单脱氢抗坏血酸还原酶( h l o n o d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c t a s e )m d i u r1 6 5 4 脱氢抗坏血酸还原酶( d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c t a s e )d h a r1 8 5 1 谷胱甘肽还原酶( g l u t a t h i o n er e d u c t a s e ) g r1 6 5 1 过氧化氢酶( c a t a l a s e )c a t 1 1 1 1 6 谷胱目肽过氧化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e )g p x11 1 1 9 抗氧化剂主要包括还原型谷胱甘肽( g s h ) 、抗坏血酸( a s a ) 、类胡萝h 素( c a r ) ，a 生育酚( 砷、 类黄酮、生物碱、半胱氨酸( c y s ) ，氢醌及甘露醇等有机小分子等。这些物质与植物体内主要抗氧化 酶类协同作用，使体内活性氧的产生与猝灭处于动态平衡状态。 圉1 1 高等植物体内活性氧清除系统( s h i g e o k a 等，2 0 0 2 ) f i g u r e l 。1s c a v e n g i n gs y s t e mo f t h ea c t i v eo x y g e ns p e c i e si nh i g h d rp l a n t s ( s h i g e o k ae ta l ，2 0 0 2 ) 3 植物抗氧化系统中的s o d 、a s a 和a p x 与切花衰老 3 1s o d 与切花衰老 3 1 1s o d 分类比较 3 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 s o d 作为植物抗氧化系统的第一道防线，可以催化o 。生成h 2 0 2 和0 2 ，从而清除细胞中多余的 o 2 。s o d 在植物抗氧化酶中居于核心地位( e l s t n e r ，1 9 9 1 ) 。根据其辅基部位结合的金属离子不同， 高等植物中s o d 分为三类：m ns o d 、f es o d 和c u - z ns o d 。不同种类的s o d 同工酶对不同抑制 剂的敏感程度不同，如c u - z ns o d 酶活性受h 2 0 2 和k c n 的抑制：f es o d 的酶活性只受h 2 0 2 的抑 制；而m ns o d 的酶活性不受h 2 0 2 和k c n 的抑制( 马旭俊和朱大海，2 0 0 3 ) 。c u - z ns o d 是植物体 内含量最：# 富的一类s o d ，主要存在于叶绿体、胞质和过氧化物体中。m ns o d 和f es o d 每个亚基 都只古一个金属离子，m ns o d 主要位于线粒体中，从f es o d 的一一些生化特性及前导序列推测该酶 存在于叶绿体中。f es o d 和m ns o d 在序列和结构上具有很高的同源性，丽c u - z ns o d 与f es o d 或m ns o d 同源性较低。s o d 存在于植物细胞内所有能够产生活性氧的亚细胞结构中，在不同植物 或同一细胞的不同亚细胞结构中的s o d 类型和酶活性存在差异( a l s c h e r 和h e s s ，1 9 9 3 ) 。 3 1 2s o d 活性对失水胁迫的响应 作为植物体清除活性氧的第一道防线，s o d 对失水胁迫等多种环境胁迫做出响应，其活性因植 物种类、品种、生理状态及胁迫程度等多种因素而异。失水胁迫导致植物体内活性氧含量激增，s o d 的活性随之变化( c a m p e t a ，1 9 9 6 ) 。失水胁迫程度较轻时花椰菜中s o d 活性急剧升高，当胁迫加重 对s o d 活性下降( y a n g 等，1 9 9 8 ) 。在于旱胁迫时槭树叶片中s o d 活性先下降，再上升至接近正 常水平( h u 等，1 9 9 9 ) 。失水胁迫后，耐失水的品种s a m a n t h a 花瓣中s o d 活性比不耐失水的品种 g a b r i e l l a 高( 庸雪梅，1 9 9 7 ) 。 3 1 1 3s o d 基因和同工酶在逆境条件下的表达 在不同的发育阶段进行不同的胁迫处理，s o d 基因表达各不相同。烟草细胞质型c u - z ns o d 在热 激、低温及百草枯处理后表达量明显提高( t s a n g 等，1 9 9 1 ) ：在高光强下用百草枯处理可同时诱导 番茄叶绿体c u z ns o d 和胞质c u z ns o d 基因的表达，但干旱只能诱导细胞质型c u - z ns o d 基因 表达量提高( p e r l 等，1 9 9 3 ) 。 环境胁迫会影响s o d 同工酶的表达( b o w l e r 等，1 9 9 4 ) 。在对拟南芥( r u t h 等，2 0 0 2 ) 、豌豆( 1 l u b e r 等，1 9 9 8 ) 、橡树( m i a o 和g a y n o r ，1 9 9 3 ) 、番茄( p e r l 等，1 9 9 1 ) 等植物体内s o d 同工酶的研究 发现。不同植物、同一植物不同品种、器官、生长阶段及不周胁迫和胁迫程度对s o d 同工酶的影响 不同。例如对豌豆品种l i n e l i n 进行轻度的失水胁迫，其叶片中c u z ns o d 活性上升，f es o d 活 性下降，而m ns o d 变化不显著( 1 t u b e r 等，1 9 9 8 ) ；而另一个豌豆品种p u g e t 经长时问的n a c i 处理后出现了一条f es o d 带和一条c u z ns o d 带( g 6 m e z 等。2 0 0 4 ) 。 3 1 4s o d 转基因研究 植物体内抗氧化酶s o d 、a p x 、g r 和c a t 等活性的提高能增强植物对多种氧化胁迫的抗性。 到目前为止，不同类型的s o d 基因已经被转化到多种植物中，转基因植株中过量表达s o d 不同程度地 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 提高了植物对环境胁迫的抵抗能力，如用叶绿体特异的前导序列取代m ns o d 基因的线粒体前导序列， 然后将此m ns o d 融合基因转到烟草巾，这种转基因烟草能够抵抗除草剂引起的氧化胁迫( b o w l e r 等， 1 9 9 1 ) 。将烟草的m n 转入苜蓿使其在线粒体中过量表达。得到的转基因植株总s o d 酶活性是对照植 株的2 倍，对冷窖的耐受性和下一年的产量都有所提高( m c k e r s i e 等，1 9 9 3 ) 。但有的研究表明s o d 过量表达并未提高植株的抗氧化能力( t e p p e r m a n 和d u n s ，1 9 9 0 ) 。 3 2a s a 与切花衰老 3 2 1a s a 的生物合成和代谢途径 很早就发现a s a 广泛存在于植物体内。叶绿体可积累浓度很高的a s a ，达到叶片，涛, a s a 含量的 1 2 3 0 ( f o y e r 等，1 9 9 6 ) ，a s a 也稳定存在于质外体、胞质和液泡中。线粒体中也存在大量a s a ， 因为催化其生物台成最后一步的l 半乳糖酸y 内酯脱氢酶( g l d h ) 存在于线粒体中( b a r t o l 等， 2 0 0 0 ) 。近年来对a s a 的生物合成的研究取得长足的进展( 陈坤明等，2 0 0 4 ) 。已经证明催化a s a 生 物合成最后一步的l 半乳糖酸y 一内酯脱氢酶( g l d h ) 存在于线粒体内膜。g l d h 对g l 有很高的专一 性并且需要细胞色素c ( c y ! c ) 作为次级底物。l 半乳糖在g l d h 的作用下可生成a s a 。给不同的植物 组织饲喂g l f i 嘲快变为a s a ( c o n k l 等，1 9 9 6 ) 。 a s a 作为电子供体通过连续的两步反应参与电子的转移。首先是形成a s a 自由基( 或被称为单脱 氢抗坏血酸，m d h a ) ，然后被完全氧化为脱氢抗坏血酸( d h a ) 。m d h a 和d h a 在溶液中相当不 稳定。由于可很快转化为d h a 和a s a ，m d h a 在细胞中的浓度通常根低，而且由于很少与细胞内 的其它分子发生反应，其毒性也相对很低。在环境条件较合宜时a s a 在氧化型和还原型之间循环的 效率很高，因而d h a 很少被降解( h o r e m a n 等1 9 9 8 ) 。 3 2 2 植物a s a 库与环境胁迫 作为植物细胞中最重要的抗氧化剂a s a 的个重要功能是保护亚细胞器免受氧化损伤。光合作 用和呼吸过程可以产生活性氧( a o s ) 。在叶绿体中，a p x 利用a s a 将h 2 0 2 还原为h 2 0 ，同时形成 m d h a 。m d h a 的半衰期很短，可很快不成比例地被还原为a s a 或氧化为d h a 。在植物细胞中，m d h a 既可以作为内囊体膜外侧上的还原型铁氧还蛋白的直接电子受体而赢接被还原为a s a ，也可以通过抗 坏血酸谷胱甘肽循环( a s a g s h 循环) 酶促还原为a s a ( n o c t o r 和f o y e r ，1 9 9 8 ) 。在活细胞内，抗坏 血酸氧化还原系统由还原型( a s a ) 、半还原型( m d h a ) 和氧化型( d h a ) 分子组成。 a s a 的含量、氧化还原状态( a s a d h a b t 率1 及其合成与代谢相关酶类活性的变化涉及植物对一 系列环境胁迫的响应。盐胁迫可明显降低小麦植株a s a 含量，耐盐品种的降低幅度小于不耐盐品种， 而a p x 的活性在盐胁迫时提高( s a i r a m 等，2 0 0 2 ) 。在番茄根中，盐胁迫使盐敏感品种的a s a 含量降 低，d h a 的含量升高，a s a d h a 比率降低，a p x 和m d h a r 活性也降低；然而盐耐受品种与之刚好 相反表明番茄较高的抗盐性，至少部分地来自于a s a 含量、a s a d h a 比率和某些相关酶活性的提 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 高( s h a l a t a 等，2 0 0 1 ) 。失水胁迫可导致玉米a s a 含量降低，a p x 活性也低于对照( l i 和v a ns t a d e n ， 1 9 9 8 ) 。干旱使橡树总a s a 含量降低而还原型a s a 含量升高( s c h w a r t z 等，1 9 9 6 ) 。a s a 库及其氧化还 原状态参与植物对环境胁迫的响应的现象也被其它一些研究所证实( p o t t e r s 等，2 0 0 2 ；d r a z k i e w 等， 2 0 0 3 ) 。质外体a s a 的水平和氧化还原状态对植物响应环境胁迫也具有十分重要的作用。质外体a s a 可以保护植物质膜免受环境胁迫引起的氧化损伤，尤其当植物遭受臭氧或其它大气污染物胁迫时。 在臭氧胁迫条件下，耐受食荚菜豆品种叶片中总抗坏血酸的台量比敏感品种高，且耐受品种能维持 相对较高的a s a 库水平；此外质外体总抗坏血酸含量耐受品种远远高于敏感品种，其a s a ( a s a + d h a ) 比率也相对较高，表明植物对臭氧的耐性与质外体抗坏血酸的含量和氧化还原状态密切相关( b u r k e y 等，2 0 0 2 ) 。 除了内源a s a 在胁迫条件下发生变化外，已有的研究表明外源a s a 可提高植物对环境胁迫的适应 能力，如提高番茄对盐胁迫的耐性( a b e d 和p e t e r ，2 0 0 1 ) ，保护大麦免受臭氧伤害( f e l i x 和m i c k a e l ， 1 9 9 5 ) ，并延缓燕麦叶片段的衰老( b o r r a c c i n o 等，1 9 9 4 ) 。 总之，作为高等植物抗氧化系统的重要组成成分，a s a 在植物细胞对氧化胁迫的抵抗中发挥着重 要作用。 3 3a p x 与切花衰老 3 3 1a p x 的产生，分布与定位 a p x 的发现至今已有2 0 多年。f o y e r 和h a l l i w e l l ( 1 9 7 6 ) 年发现以a s a 为电子供体的一种过氧 化物酶。n a k a n o 和a s a d a ( 1 9 8 1 ) 报道了完整的菠菜叶绿体中存在以光化学还原剂作为电子供体的过 氧化物酶，但在破碎的叶绿体中活性很低，1 9 8 1 年他们正式确定这种存在于叶绿体的基质中的酶为 a p x 。研究人员对其酶学特性、分布、定位、作用机制、生理功能以及分子生物学特性等方面都作 了研究。 a p x 催化的反应为：2 a s a + h 2 0 2 2 m d a + 2 h 2 0 。已经发现a p x 存在于菠菜、豌豆、棉花、黄 瓜、蓖麻、向日葵、茶叶、小麦、大麦、玉米、烟草、西葫芦等多种植物的叶片中，同时在豆科植 物的根瘤、蓖麻等油料植物种子、马铃薯块茎以及藻类中也检测到a p x ( s h i g e o k a 等，2 0 0 2 ) 。高 等植物的a p x 存在着多种同工酶。一种是光合器官型，又称叶绿体型同工酶，包括位于基质中的 a p x ( s a p x ) 和同类囊体膜结合的a p x ( t a p x ) ：另一种是非光合器官型，在植物细胞的胞浆、线粒体 和乙醛酸循环体中均已发现，且这类酶在总的a p x 中所占的比例最高( a s a d a ，1 9 9 4 ) 。 3 3 2a p x 的作用机制和生理功能 a p x 是植物a s a g s h 氧化还原途径的重要组分之一，这个途径在时绿体、线粒体及细胞质中均 已发现。h 2 0 2 是植物体内代谢反应的产物是具有毒害