（神经生物学专业论文）双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射.pdf

双斑蟋昕器结构及其鼓膜神经在 前胸神经节内的中枢投射 中文摘要 听器是普遍存在于发音昆虫中的一种弦音感器。蟋蟀的听器感受声波刺激以接受外 界环境信息，通过神经系统和分泌系统协调作用，共同调节和控制着昆虫的生理和行为 反应。本文以双斑蟋( g r y l l u sb y m a c u l a t u s ) 为实验材料，通过组织解剖学的研究方 法，研究蟋蟀胸部前足听器和腿节鼓膜神经的分布情况，进一步研究蟋埠听器鼓膜神经 在前胸神经节的中枢投射情况。 在实验过程中采用组织解剖和石蜡切片法，观察双斑蟋听器结构和前胸神经节的侧 根分支；氯化镍顺行染色和亚甲基兰染色法，研究前足神经的走行情况；氯化镍逆行染 色法，研究鼓膜神经在前胸神经节的中枢投射。 蟋蟀成虫听器在胸部前足胫节近基部的位置上，是一个膜状构造，主要由气管支撑， 胫节两侧均有鼓膜。外侧鼓膜为卵圆形，内侧鼓膜为扁椭圆形。若虫阶段鼓膜第一次出 现发生在表皮无毛区，从六龄若虫开始在前足胫节近基部后侧出现后鼓膜，八龄若虫开 始在胫节前部出现前鼓膜。鼓膜器官较偏向于胫节背部，膝下器、中间器和听脊沿胫节 气管背侧近远端方向依次排列。鼓膜神经紧贴前气管的走行。胫节近端声气管经历两次 分开、合并的变化规律。 前胸神经节的神经侧根n 5 是前足的主要神经，进入前足腿节后分为n 5 8 1 和n s b 2 两个分支，n s b l 分支之一t b 的末端在胫节近端与鼓膜听器相连，t b 为实际上的鼓膜神 经，t b 在股节和胫节有多个分支。n 5 8 1 和n 5 8 2 神经均有分支与胫节膝下器相连。 鼓膜神经在前胸神经节的中枢投射结果表明：有7 根感觉纤维分别向前方、中央和 后方延伸。有2 根纤维的主要分支向前方和后方延伸，并向背侧扩展为少量分支；其他 5 根纤维沿神经节的背腹中部向中央延伸，但都在同侧分布，在近中央处有大量细微分 支且呈“y ”字形。各个神经纤维应为听觉感觉纤维，且可能与蟋蟀感应不同的声音频率 有关。 关键词：蟋蟀，昕器，鼓膜神经，中枢投射 s t r u c t u r eo fa u d i t o r yo r g a na n dc e n t r a lp r o j e c t i o no f t y m p a n a ln e r v e w i t h i nt h ep r o t h o r a c i cg a n g l i o no ft h e c r i c k e tg r y l l u sb i m a c u l a t u s a b s t r a c t t h ea u d i t o r yo r g a ni sc o n l n l o ne x i s t e n c ea so n ek i n do fc h o r d o t n a lo r g a ni nt h e p r o n u n c i a t i o no fi n s e c t s ，t h ea u d i t o r yo r g a no fc r i c k e tf e e l t oe x t e r n a ls t i m u l a t i o no f e n v i r o n m e n t a l t h e yr e g u l a t ea n dc o n t r o lt h ei n s e c tp h y s i o l o g i c a la n db e h a v i o r a lr e s p o n s e s b yw h i c ht h en e n ，o u ss y s t e mc o o r d i n a t ew i t ht h ee n d o c r i n es y s t e m b a s e do ng r y l l u s b i m a c u l a t u se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s ，w er e s e a r c ht h es t r u c t u r eo ft h ea u d i t o r yo r g a na n d d i s t r i b u t i o no ft y m p a n a ln e r v eo ff o r e f o o tt h r o u g ht h es t u d yo fa n a t o m yo r g a n i z a t i o n , w h i c h f u r t h e rr e s e a r c ho nc e n t r a lp r o j e c t i o no ft y m p a n a ln e r v ei nt h ep r o t h o r a c i cg a n g l i o no f c r i c k e t w eu s e dh i s t o l o g i c a la n a t o m ya n dp a r a f f i ns e c t i o n i n gm e t h o dt h a to b s e r v et h es t r u c t u r e o f t h ea u d i t o r yo r g a na n dl a t e r a lr o o to f t h ep r o t h o m c i cg a n g l i o no fg r y l l u sb i m a c u l a t u s t h e n i c k e lf i l l i n ga n dm e t h y l e n eb l u es t a i n i n go b s e r v e dd i s t r i b u t i o no fn e r v ei nf o r e f o o t t h e n i c k e lb a c k - f i l l i n gr e s e a r c h e dt h ec e n t r a lp r o j e c t i o no f t y m p a n a n ln e r v ew i t h i nt h ep r o t h o r a c i c g a n g l i o n t h ea u d i t o r yo r g a no fa d u l ti si nt h en e a rp o s i t i o no ft i b i a i ti sam e m b r a n es 仃u c t i l r e t h a ti ss u p p o r t e dm a i n l yb yt h et r a c h e a , b o t hs i d e sh a v es h i nt y m p a n a lm e m b r a n e t h e e x t e r i o rt y m p a n i cm e m b r a n ei sr o u n d ，t h ei n t e r i o rt y m p a n i cm e m b r a n ei so v a l t h e t y m p a n u mo fn y m p hs t a g ef i r s to c c u r i nt h ee p i d e r m a lh a i r l e s sa r e a t h ee x t e r i o rt y m p a n i c m e m b r a n eo fs i xi n s t a rn y m p hi sf o u n di nt h en e a rp o s i t i o no ft i b i a , t h ei n t e r i o rt y m p a n i c m e m b r a n ei sf o u n da te i g h ti n s t a r s a u d i t o r yo r g a nt e n d st ob eb a c ko ft i b i a s u b g e n u a l o r g a n , i n t e r m e d i a t eo r g a na n de r i s t aa c u s t i c aa r ea l o n gt h eb a c ko ft i b i a lt r a c h e ai nd e s c e n d i n g o r d e r t y m p a n a ln e r v ec l o s e st ot h ef o r m e rt r a c h e a a c o u s t i ct r a c h e ao ft h ep r o x i m a lt i b i a h a v et w os e p a r a t i o na n dm e r g e m t i o no f t h ec h a n g e s n 5n c i v ei st h em a i nn e r v ei nf o r e f o o t i ti sd i v i d e di n t on 5 8 2a n dn 5 8 1 t bn e r v ei s o n eo ft h eb r a n c h e so fn 5 8 1 t h ee n do ft bn e r v ea s s o c i a t e dw i t ht h ea u d i t o r yo r g a n t b n e r v ei st h ea c t u a lt y m p a n a ln e r v e t bh a v em o r eb r a n c h e si nt h ef e m u ra n dt i b i ao ff o r e f o o t b o t hb r a n c h e so f n 5 8 1a n dn 5 8 2c o n n e c tt h es u b g e n u a lo r g a no f t h et i b i ao f l e g c e n t r a lp r o j e c t i o no ft y m p a n a ln e r v ew i t h i nt h ep r o t h o r a c i cg a n g l i o no fc r i c k e ts h o w s ： s e v e ns e n s o r yf i b e r sa r et ot h e 丘o n t c e n t r a la n dt h er e a l e x t e n s i o n m a i nb r a n c h e so ft w o f i b e r sa r et ot h ef r o ma n dr e a re x t e n s i o n , w h i c has m a l ln u m b e ro fb r a n c ht ot h ed o r s a l e x p a n s i o n f i v ef i b e r sa l et ot h ec e n t r a le x t e n s i o na l o n gt h ed o r s a lo fg a n g l i o n , b u ti nt h e i p s i l a t e r a ld i s t r i b u t i o n i nt h ec e n t r a lal a r g en u m b e ro fm i n o rb r a n c hf o r m ”y ”s h a p e a l l n e r v ef i b e r sa r ea u d i t o r ys e n s o r yf i b e r s t h e s ef i b e r sm a yb er e l a t e dw i t l ld i f f e r e n tv o i c e s i n d u c t i o nf r e q u e n c y k e yw o r d s ：c r i c k e ta u d i t o r y c e n t r a l p r o j e c t i o n 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 第一章前言 在神经科学研究中以人及哺乳动物等脊椎动物的脑为对象的研究迅速发 展，其详细的机能不断地被揭示，给脑科学研究带来了一场革命性的变化。 从生物学的观点看，脊椎动物的脑是动物在长期的进化过程获得的情报处理 机能的一种实现样式。但在实际研究中无脊椎动物的神经系统对探讨与神经 系统有关的各种问题也至关重要。尤其突出的是，其基本机制在进化阶梯中 是相对保守的。以无脊椎动物进行实验有利于为哺乳类动物中相似的问题研 究提供启示。如通过对昆虫感觉器官的研究，了解昆虫感觉的神经传导机制， 并进一步揭示昆虫的认知过程，可以为人类的脑科学、认知科学、心理学、 仿生学等诸多学科的发展提供理论依据和重要启示。 世界上许多脑科学研究者把昆虫的脑与“巨大脑”相比，称为“微小脑”。 认为不论是巨大脑还是微小脑，其机能不能简单的理解为各自的细胞、分子 机能的代数总和，作为器官的脑是具有固有的创发性特征的复杂系统。昆虫 “微小脑”体积上较小，但它在本质上却有许多巨大脑所拥有的结构和机能。 而且相比哺乳动物的神经系统，昆虫神经系统具有独到之处。首先，昆虫具 有相对较少的神经元，而且神经元结构简单，涉及的系统也不象哺乳动物那 样复杂；其次，昆虫的很多神经元比较大，在技术上可把电极放在神经元的 多个部位来研究其内部的信号处理过程，并且易于对传入神经元、中间神经 元和传出神经元的特性和连接进行鉴定；第三，在操作过程中昆虫神经元易 于接近，不会被血液的流动所阻碍。因此昆虫作为理想的实验材料之一，在 神经生物学研究中广为利用，尤其多以果蝇、蝗虫、蟑螂、蟋蟀等为实验研 究材料，在感觉、运动、学习记忆等各个领域开始广泛研究 1 4 1 。蟋蟀作为 一种易采集、易饲养且神经系统结构清晰的昆虫，是研究神经解剖、神经生 理和神经基础研究的理想实验材料。 本研究拟通过研究直翅目昆虫蟋蟀机械感受器一听器的结构、感觉神经 分布和中枢投射，了解蟋蟀听器鼓膜神经在中枢的分布情况，为研究感受不 同声频刺激昕觉神经元的分布和中央投射提供了依据，也为进一步研究蟋蟀 听觉认知的中枢神经控制系统奠定基础，并可作为今后高等动物听觉认知相 关研究的理论参考。 1 1 昆虫机械感受器概述 昆虫在进化过程中形成了适应本身需要的感受器和感觉器官，能够不断 地监测复杂地外部和内部环境的变化，既是通过感觉器官将外界产生的刺激 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 能量或者较不明显地由虫体内部产生的刺激能量转换成神经冲动，神经冲动 在传至某一中央神经节之后，再经中枢神经系统的加工处理，通过传出神经 将冲动传到肌肉等效应器完成动物的反射活动，最终导致昆虫的行为改变或 者维持某些原来的活动，以此控制和调节昆虫的行为和生理过程。如果动物 丧失感觉机能，就不可能对外界的刺激做出反应，也就无法适应外界环境的 变化。感觉机能与运动机能相互密切联系，是动物机体适应外界环境变化所 不可缺少的。 昆虫具有为数众多而且相当发达的感觉器官，它们的功能常是专一的， 即每一种感觉器官只能感受一定性质的刺激。感受器既能独立行使感觉功能 ( 如体表的单根感觉毛) ，也能组成复杂的感觉器官，行使复杂的感觉功能 ( 如单眼、复眼、江氏器、鼓膜听器等) 。昆虫还能发光、发声，并可产生 复杂的信息化合物，进行种内和种间的通讯联系。依据形态和结构以及信息 的来源和性质，昆虫的感觉器官依其机能可以主要分为三类：机械感受器、 化学感受器、视觉感受器。 昆虫的机械感受器( m e c h a n o r e c e p t o r ) 是指能够感受机械力刺激的器 官，能够因包括感受器某一部分受机械变形过程而引起兴奋。可以传导触觉， 包括与固态物体、气流或水流的接触；还可以对表皮内发生的机械应力起反 应，故其作用有如内感受器( p r o p r i o c e p t o r ) ；某些情况下机械感受器对空 气声、超声波及基底振动刺激起反应，作用类似于声音感受器。机械感受器 分四种主要的结构类型：感觉毛、钟形感受器、弦音器( 橛形感受器或剑鞘 感器) 、多极伸长受器抽】。 直翅目昆虫( o r t h o p t e r a ) 的听觉感受器( a u d i t o r yr e c e p t o ro r g a n ) 或听器( a u d i t o r yo r g a n ) ，是指能够感受空气声及基底震动刺激的感受器 官，属于动物中敏感的机械感受器。直翅目昆虫的听器据其所在的位置不同 可分为三类：一类是腹听器，位于蝗总科昆虫第一腹节背板两侧盯刮；另一 类是腿节弦音器，位于昆虫各足的腿节扣1 ；第三类是足胫器( t i b i a lo r g a n ) ， 位于昆虫各足的胫节，一般由2 3 部分感受器官所组成，故亦称复合胫器 【6 ，i 0 一t 4 1 2 国内外对蟋蟀总科听器的研究概况 蟋蟀总科( g r y l l o i d e a ) 的听器位于前足胫节基部，是成对的结构，由 一层表皮薄膜即鼓膜( t y m p a n u m ) 与气管气囊( t r a c h e a la i r - s a c ) 及弦音 器联结而成。蟋蟀总科足胫器属于较进化的类型，由膝下器( s u b g e n u a l o r g a n ) 、中间器( i n t e r m e d i a t eo r g a n ) 和昕脊( c r i s t aa c u s t i c a ) 三部 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 分组成，后两者是鼓膜器官主要组成，且仅在前足的足胫器才分化为鼓膜器 官，中间器和听脊作为听觉感受器。中间器按其具橛感器树突的指向又可分 为近端中间器和远端中间器，中间器和听脊被有覆膜。关于蟋蟀总科鼓膜听 器的研究，学者们对a c h e t ad o m e s t i c u s ( p a t o ne ta 1 ，1 9 7 7 ) 、t e l e g r y l u s c o m m o d u s ( y o u n ga n gb a l l ，1 9 7 4 ；b a l la n dy o u n g ，1 9 7 4 ) 、6 r y l l u s p e n n s y v a n i c u sa n dt e l e o g r y l l u so o e a n i c u s ( p a t o ne ta 1 ，1 9 7 7 ) 、 6 r y l l u sc a m p e s t r i s ( e i b l ，1 9 7 8 ) 、g r y l l u sa s s i m i l i s ( f r i e d m a n ，1 9 7 2 ) 等 六种蟋蟀的研究工作开展的最多“”】。s c h w a d e ( 1 9 0 6 ) 对爿d o m e s t f c u s 鼓 膜器官( t y m p a n a lo r g a n ) 的研究对以后这方面的研究工作打下了基础。 s c h w a d e 认为鼓膜器官属于一种弦音器，每一个感受树突都与一个感橛相连 ”。f r i e d m a n ( 1 9 7 2 ) 通过对一种黑蟋蟀( 6 r y l l u sa s s i m i l i 0 的电镜研究发 现，感橛中的轴丝( t h r e a d ) 是一种变化了的纤毛n ”。 y o u n ga n gb a l l ( 1 9 7 4 ) 研究发现zc o m m o d u s 前足胫节机械感受器由 膝下器和鼓膜器官组成。膝下器含有1 8 2 0 个感橛，这些感橛从胫节前面 的神经元到股节后壁的附着点呈帆状排列瞪“”1 ，鼓膜器官位于前气管背侧， 含有7 0 个具橛感器，这些具橛感器可分为两个主要类群：近端群和远端群。 这两个主要类群又可以进一步分为五种类型：近端群a ；具有近端神经 元的近端主要群；具有远端神经元的近端主要群；远端群的近端部分； 远端群的远端部分。蟋蟀总科和螽斯总科的前足胫节鼓膜听器内部结构相 似，以图1 所示螽斯前足听器内部机构来参考蟋蟀听器的内部结构。 近 胫 持带 图i 螽斯( d e c t i t u s ) 前足胫节纵切面模式图( 忻介六，1 9 8 7 ) 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 y o u n ga n db a l l ( 1 9 7 4 ) 和b a l la n dy o u n g ( 1 9 7 4 ) 两篇论文分别阐述了 c o m m o d u s 鼓膜听器的结构与发育n 。圳，r o n a l dr h o y ( 1 9 8 5 ) 研究表明 t e l e o g r y l l u so c e a n i c u s 的鼓膜听器从3 龄若虫开始发育陋”，后鼓膜在8 龄 时发育，前鼓膜在1 0 龄时发育，半透明的成体鼓膜发生在1 1 龄。p a t o ne t a 1 ( 1 9 7 7 ) 认为气管腔可能是一种声音机械调节的来源，气管腔的声音共振频 率依赖于气管的大小和形状，并且与管腔内声音的速度成适当比例“”。 a r t r u m ( 1 9 4 1 ) 和a r t r u me ta 1 ( 1 9 4 8 ) 复合胫器的功能进行研究发现膝下器 的感受细胞对基底震动敏感，而昕脊的感受细胞对频率高于i k h z 的空气声敏 感妇。2 ”，z h a n t i e v ( 1 9 7 8 ) 中间器的感受细胞则对低频空气声和基底振动有反 应幢”。n o c k e ( 1 9 7 2 ) 蟋蟀前足胫节的听神经即对空气声也对基底振动作出反 应陋”。单个的听觉感受细胞只对某一特殊的频率范围敏感，而整个听觉感受 器群体对大约由2 k h z 至最少达5 0 k h z 之间的频率范围敏感心”1 。 d a m b a c h ( 1 9 7 2 ) 和h u t c h i n g sa n dl e w i s ( 1 9 8 1 ) 报道了有关此类胫器的生理学 研究”- 3 ”。 1 3 国内外对蟋蟀总科听器鼓膜神经的研究概况 对于蟋蟀前足听器鼓膜神经分布及走向的相关文献较少，w o h l e r sa n d h u b e r ( 1 9 8 5 ) 。a t k i n sa n dp o l l a c k ( 1 9 8 7 a ) ，s t i e d le ta 1 ( 1 9 9 7 ) 在研究 中提到前胸神经节侧根n 5 是前足的主要神经，听器鼓膜神经的轴突即包含于n 5 中h ”1 。s c h w a b e ( 1 9 0 6 ) 把n 5 b i 神经分支称为t y m p a n a ln e r v e 旺。h i r o s h i n i s h i n o ( 1 9 9 7 ，2 0 0 3 ) 对双斑蟋g r y l l u sb i m a c u l a t u s 的前足和后足股节的神经走 向和分布作以简单的描述，前足神经在进入股节后主要有两个分支，分别为 n 5 b i 和n 5 8 2 ，n 5 b i 在股节中沿着背侧走行，且在近转节处分为三个主要分支， 其中一个较粗的分支向股节远端走行，后胸足部股节的主要运动神经与前足 n 5 8 2 神经的分布有相似之处h 3 1 ”。 m i c h e l ( 1 9 7 4 ) ，y o u n ga n db a l l ( 1 9 7 4 ) 和i m a i z u m ia n dp o l l a c k ( 2 0 0 1 ，2 0 0 5 ) 报道中描述蟋蟀的每个听器应有若干感觉神经纤维向神经节投 射“1 ”。听觉神经元的轴突在前胸神经节的中央投射在e s c he ta 1 ( 1 9 8 0 ) ， e i b ln 9 7 4 ) 和i m a i z u m ia n dp o l l a c k ( 2 0 0 1 ，2 0 0 5 ) 报道中有描述，轴突末梢 多分布在前胸神经节的腹中侧，但并没有延伸到对侧h ”例，分布区域大致相 同，但是具体的纤维投射情况有所不同。其中i m a i z u m ia n dp o l l a c k ( 2 0 0 5 ) 认为不同的听觉感觉神经纤维感应不同的声音频率，即听觉纤维与声音频率是 一一对应的h ”。e i b l ( 1 9 7 4 ) 把投射到神经节腹中侧的感觉神经纤维分布区域， 认为是听觉神经投射分布区h ”。e s c he ta 1 ( 1 9 8 0 ) 把前足胫节中在前胸神 经节的腹中侧分布呈新月形状的感觉纤维归为听觉神经纤维“”。 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 1 4 国内外对蝗总科和螽斯总科听器及听神经的研究概况 蝗总科( a c r i d o i d e a ) 的听觉感受器类型为腹听器。根据学者们的研究， 蝗总科的腹听器位于第一腹节背板两侧各有一个鼓膜听器即腹听器，可以分为 三类：外露式，没有听盖，听膜全部露出；掩盖式，听盖中等大小，听膜 下陷，一部分被听盖所掩盖；囊袋式，听盖很发达，将听膜全部掩盖，只剩 下一小缝通于外界”1 。刘维德( 1 9 5 2 ) 研究了飞蝗腹听器的形态及其发生，发 现飞蝗腹听器的具橛感器在一龄时已充分发育阻1 。腹听器的听神经和后胸神经 相连，表现出对声音方向的敏感性，根据种类的不同，h a s k e l l ( 1 9 5 8 ) 发现蝗 虫能辨别速率为每秒9 0 3 0 0 次的声脉冲“”。它们反应的频率范围很宽，由 i 5 k h z 至8 0 k h z 。而且蝗虫的腹听器能在某种程度上区分不同的频率晦”。 r e h b e i n ( 1 9 7 4 ) 以蝗虫为实验材料研究发现蝗虫听觉感觉纤维在后胸神经节中 的分布不同，即感受低频的感觉纤维和感受高频的纤维分布在神经节的不同区 域】。 螽斯总科( t e t t i g o n i o i d e a ) 的听觉感受器也是在前足胫节足胫器分化为 鼓膜器官，r o e s s l a r ( 1 9 9 2 a ，1 9 9 2 b ，1 9 9 4 a ，1 9 9 4 b ) 螽斯与蟋蟀的听器位置与 结构相似n ”1 。r o e s s l e re ta 1 ( 1 9 9 4 a ) 对d e c t i c u sa l b i f r o n s , d e c t i c u s v e r r u c i r d ，u s 和p h o l i d p t e r a e r i s e o a p t e r a 的研究发现，其听阈的最敏感范围 都是6 2 5 k h z ，具橛感器在听脊上的分布并无明显差别n ”。k a l m r i n g ( 1 9 7 8 ) 在以b u s h c r i c k e t s 为实验材料的研究中发现了听觉感觉纤维在前胸神经节的 投射区域是集中在腹中侧，认为这一区域是6 “s 西c ，c 膏p s 的听觉感受投射区 n ”。螽斯的胫节近端气管在膝下器和中间器位置是一个近乎圆形的管，在听脊 处气管开始分为前后两支，最后在听脊远端变为一个直径很小的管腔【2 乳3 2 i 。 我国学者对蟋蟀听觉听器鼓膜神经分布和在神经节中央投射的研究在国 内很少。只有闰冬春( 1 9 9 7 ，2 0 0 1 ，2 0 0 2 ) 对暗褐蝈螽g a m p s o c l e i ss e d a k o v i i 鼓膜器官和复合胫听器进行了形态学方面的研究哺3 “”。徐风早( 1 9 5 2 ) 、刘维 德( 1 9 5 2 ) 和刘玉素( 1 9 6 0 ) 对蝗科昆虫的腹听器有过相关结构方面的研究 【7 9 】 1 5 本研究的内容和目的意义 到目前为止有关蟋蟀听觉中枢神经控制结构及微小脑的控制原理、其听 器传入神经的形态分布及其在前胸神经节的投射还没有详细研究。而且值得 指出的是，这方面的研究多集中在g r y l l u sc a m p e s t r i s 、t e l e o g r y l l u so c e a n i c u s 和t e l e o g r y l l u sc o m m o d u s 这几个种上，但相关听觉神经纤维的中枢投射模式 却没有明确一致的表述，而以双斑蟋( g r y l l u sb i m a c u l a t u s ) 为实验材料进行 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 相关的研究文献却很少。针对以上存在的这些问题，实验采用双斑蟋为实验 材料。研究听器结构、鼓膜神经在腿节的走向与分布，并试图阐明鼓膜神经 在中枢神经节内投射的空间布局情况。 1 5 1 研究主要内容 ( 1 ) 双斑蟋前足听器的外部形态观察。 ( 2 ) 用石蜡切片法研究双斑蟋听器内部结构。 ( 3 ) 双斑蟋前胸神经节侧根分支观察。 ( 4 ) 用亚甲基兰染色法和氯化镍顺行染色法研究双斑蟋胸部前足股节 和胫节的神经分布情况 ( 5 ) 用氯化镍逆行染色法研究双斑蟋听器鼓膜神经在前胸神经节的投 射分布情况。 1 5 2 研究目的意义 了解蟋蟀听器鼓膜神经在中枢的分布情况，为研究感受不同声频刺激听 觉神经元的分布和相应的中央投射提供了依据，也为进一步研究蟋蟀听觉认 知的中枢神经控制系统奠定了基础。 蟋蟀的神经结构简单，与高等动物相比，神经元的数量要少很多，但是 所有动物的神经控制原理是相似的。因此弄清控制蟋蟀鼓膜听器的神经结构， 不但可以为以后更加深入地研究不同昆虫的听觉生理机制提供依据，还可以 为高等动物听觉研究提供参考。 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料 本实验所用材料为直翅目蟋蟀科双斑蟋( 6 r y l i u sb i m a c u l a t u s ) 的成体 和各龄若虫。在实验室内，在光照l d = 1 2 ：1 2 ，温度2 7 3 ，湿度6 0 1 0 的条件下，用固体人工合成饲料进行继代饲养，最后一次蜕皮两周以后的成 虫及继代饲养的各龄幼虫供实验使用。 2 2 实验方法 2 2 1 双斑蟋昕器外部形态观察 取双斑蟋成虫和各龄若虫各3 0 只，测量前足股节的长度，结果分析后确 定各龄期前足股节的长度范围，便于实验过程中通过前足股节的长度以确定 实验虫体的龄期。双斑蟋听器在前足胫节近基部，将各龄期的若虫和成虫的 前腿沿腿基部剪下，放在双目实体显微镜下观察胫节鼓膜听器的外部形态结 构，进行各龄期鼓膜发育情况的对比，绘制前足模式图。 2 2 2 双斑蟋听器结构观察 取刚羽化的雌性双斑蟋成虫用乙醚轻度麻醉后，用手术剪在蟋蟀前足胫 节近端靠近膝关节处剪下，远端在离胫跗关节约i 3 处剪下。注意不可剪得 太靠近听器，以免器官受损和变形，剪口要垂直于胫节长轴。将切除后的听 器在c a r n o y 固定液中固定2 4 小时、经一系列梯度酒精脱水处理、二甲苯透 明后于石蜡( 融点6 0 6 2 ) 中包埋、以切片厚度为7 岫做连续切片。然后 对切片进行脱蜡复水处理后，用n i s s l 染色液进行染色( 染色时间以5 m i n 为宜) ，二甲苯透明后用中性树胶封片，然后在光学显微镜下观察，数码相机 拍照。结果细胞核为蓝色，染色背景为淡蓝色。 相关主要试剂的配制方法：c a r n o y 固定液的配制由无水酒精，氯仿和冰 醋酸按6 ：3 ：1 的比例混合；n i s s l 染色液为原液稀释一百倍制得。 2 2 3 前胸神经节侧根分支观察 将双斑蟋用乙醚麻醉，剪去所有的足、翅、触角和尾须，用昆虫针以背 侧上位将其固定在底部铺了硅树脂的丙烯酸树脂的容器( 7 0 m m x5 0 m m x 2 0 m m ) 中。从腹部沿背中线剪至颈部，去除消化管和内部生殖腺，然后在双 目实体显微镜下摘除脂肪体和气管，充分暴露出前胸神经节及其周围的肌 肉，滴加2 3 次生理盐水洗净体液，用亚甲基蓝溶液对神经系统进行活体 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 染色“，具体方法是用0 5 的亚甲基蓝溶液，直接滴加在标本上，充分染 色1 5 3 0 分钟，之后在解剖镜下观察前胸神经节的侧根分布情况。染色液 组成为0 5 克亚甲基蓝溶于1 0 0 m l 生理盐水。 2 2 4 前胸神经节侧根神经在前足内分布观察 将双斑蟋用乙醚麻醉，将双斑蟋成虫固定在蜡盘上，前足背侧朝上并与 虫体水平垂直的方向固定。在双目实体显微镜下，在腿节紧挨基节之间剪一 个u 形的切口，用打磨后的锋利昆虫针从前足背侧面将前足股节和胫节部划 开，用锋利的镊子将表皮撕去，并将真皮部分去除，但不要伤害到周围的组 织。充分暴露出腿部神经和气管，滴加1 2 次生理盐水，但不要摘除腿部气 管，用亚甲基蓝溶液对腿部神经进行活体染色观察【 】。因股节和胫节较细， 实验中要用l m l 的注射器滴加生理盐水和亚甲基蓝溶液。 用亚甲基蓝溶液进行活体染色观察后，再用氯化镍神经染色法观察腿节 神经分布，两种染色结果可互为补完善充。用乙醚将蟋蟀麻醉，固定，打开 胸腔，用上述2 2 3 中叙述的方法找到前胸神经节控制腿部的神经n 5 ，在其 基节处剪断n 5 。把聚乙烯毛细管尖端融化弄弯拉细，保证其中空。管内用 l m m 注射器注满3 氯化镍染色液，然后将装满氯化镍的毛细管尖端( 与虫体 有一段距离) 插入所剪断n 5 的末端，毛细管的另一端固定于蜡盘的边缘， 使其固定不动。将蜡盘放入小托盘中，4 c 黑暗条件下保存1 5 - 2 0 小时，为了 防止标本干燥，将托盘内装有少量水。1 5 2 0 小时以后将标本取出，在基节 处将腿剪断，放到生理盐水中反复洗涤干净后( 直至生理盐水不变色为止) ， 固定好，解剖暴露出腿节神经，再将其推浸没在含有红氨酸的生理盐水中， 用双目实体显微镜观察。 2 2 5 听器鼓膜神经的逆行染色 为了研究听器鼓膜神经在前胸神经节的分布及走行情况，对鼓膜神经 进行逆行染色( b a c k f i l l ) 。具体方法是：用上述2 2 4 中叙述的方法使 腿部股节和胫节的神经充分暴露，找到所要染色的鼓膜神经。把聚乙烯毛 细管尖端融化弄弯并用刀片削成斜坡状，保证其中空。管内用l m m 注射器 注满3 氯化镍染色液。将装满氯化镍的小毛细管尖端与虫体有一段距离， 将一端剥离的神经末梢用玻璃钩搭在毛细管的尖端有染色液的部分，毛细 管的另一端用橡皮泥固定于蜡盘的边缘，使其固定不动，具体染色部位如 图2 所示。在实验室内，在光照l d = 1 2 ：1 2 ，温度2 7 3 c ，湿度6 0 1 0 的条件下，用固体人工合成饲料3 5 天后，用上述2 2 3 中叙述的方法找 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 到前胸神经节使之充分暴露，找到神经侧根n 5 和其他侧根从中枢端近基部 剪断。将标本取出，在生理盐水中漂洗三次，每次十分钟，之后向其中滴 加2 3 滴二硫带草酰胺无水乙醇饱和溶液使之显色，在显色时要注意不要 将显色液直接滴到神经节上。显色后，将标本放入5 、1 0 的福尔马林溶液 中各固定l o 分钟，之后用梯度浓度( 7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 ) 的酒精溶液 中依次分别进行脱水处理，时间各5 分钟。最后用水杨酸甲脂进行透明。 标本完全透明后即可以在显微镜下观察神经节内部神经末梢的分布及走行 情况，同时绘图、拍照。 本实验中蟋蟀所用的生理盐水的组成是：1 5 3 m li m o l ln a c l ，2 6 m l i m o l l k c i ，1 8 m ll m o l lc a c l 。充分混合后用蒸馏水定容至1 0 0 0 m l ，然 后加n a h c o 。调p h 值至7 3 0 i 。 图2鼓膜神经氯化镍逆行染色部位示意图( 箭头a 指示为具体染色部位) k 0粥n 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 第三章实验结果 依次记述实验中听器外部形态和内部结构，前胸神经节侧根神经纤维在 前足腿节的分布情况以及鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射分布情况。 3 1 双斑蟋听器外部形态 在双斑蟋蜕皮为成虫大约3 4 天以后，达到完全性成熟。蟋蟀成虫前足 股节长约4 9 5 m m ，胫节长约3 7 5 m m 。双斑蟋是一种渐变态昆虫，幼虫称为若 虫。从卵孵化出若虫，再从若虫经过8 次蜕皮逐渐变成成虫，在此过程中， 它们要经过外部形态、内部结构以及生活习性上的一系列变化，前足长度自 然也随之增长，通过测量各龄的前足股节的长度范围，做为实验过程估测虫 体龄期的重要依据( 如表1 所示) 。l 一2 龄若虫在听器实验研究中意义不大， 故其前足股节长度未作测量。 蟋蟀鼓膜听器都位于前足胫节上，成虫听器距近胫节基部约0 5 2 m m ，外 观观察为半透明的膜质结构，鼓膜裸露，无鼓膜盖保护。在外侧和内侧各有 一个，外侧外形为卵圆形，面积约为0 2 6 m m 0 2 3 m m ；内侧为扁椭圆形，且 内侧的较大，面积约为0 9 m m 0 4 2 m m 。从外部形态观察的结果来看，双斑蟋 若虫前五个龄期的若虫前足并没有出现成虫的鼓膜结构；若虫阶段鼓膜第一 次出现发生在表皮无毛区，从第六龄阶段后鼓膜出现，外观观察发现无类似 成虫的半透明结构，仅为表皮有部分的凹陷，凹陷区域随龄期增加也有所扩 大；在第八龄阶段前鼓膜出现，也发生在表皮的无毛区，同样也无类似成虫 的半透明结构，表皮仅有较浅的凹陷，凹陷区域与成虫前鼓膜面积略小。 表l 双斑蟋( g r y l l u sb i m a c u l a t u s ) 各龄前足股节的长度范围 龄期股节长度最大限( m m ) 1 2 2 1 7 9 2 3 8 3 1 l 3 7 8 4 4 9 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 图3 双斑蟋成虫左前足听器鼓膜外侧( a ) 内侧( b ) 图4 双斑蟋前足模式图( 右前足内侧) 3 2 双斑蟋听器显微结构 双斑蟋前足胫节背腹径略小于前后径，胫节听器由膝下器( s u b g e n u a l o r g a n ) 、中间器( i n t e r m e d i a t eo r g a n ) 和听脊( c r i s t aa c u s t i c a ) 三部分组成。 由切片的观察可以看出鼓膜器官较偏向于胫节背部，膝下器、中间器和听脊 沿胫节气管背侧近远端方向依次排列。听脊位于血淋巴腔中沿前气管背侧分 布，听脊的近端具橛感细胞群离前气管背侧较近，而远端具橛感细胞群离胫 节背侧表皮较近。听神经即鼓膜神经紧贴前气管，横切面形状为一个沿前气 管背壁的隆起。n s b 2 神经在胫节中沿腹侧走行。 前足气管在胫节近端分为较小的前气管和较大的后气管，形状不规则； 前后气管在中间器位置处合并，管腔近扁梯形。听脊出现时，合并的前后气 管又分离，听脊近端气管背壁向腹部弯曲，并由背壁后端向腹侧凸出逐渐形 成分隔膜，分隔膜逐渐向气管腹部延伸。分支后的前气管和后气管之间有明 显的上皮连接，背腹径均小于前后径，后管腔大于前管腔，且两个管腔形状 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 不规则。前后气管在听脊远端消失后重又合并成一个不规则的扁形气管，合 并后的气管与分支前差别较大，往胫节远端管腔有减小的趋势。 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 图5 双斑蟋左前足腔节近端横切照片 图a h 示鼓膜器官及气管的变化，标尺为2 0 p m ；图i 为e 图听器部分放大；图j 示备横切 面在胫节中的位置；a 示膝下器，气管分隔；b 示中间器，气管合并；c 示听脊出现；d 示气管 开始分隔；e 气管完全分隔，听脊和鼓膜神经切面积减小jf 听脊消失；g 气管合并；h 气管 切面积减小 c u 角质层；e p 表皮；f 脂肪组织；l t 后鼓膜；o t 前鼓膜；s o 膝下器；i o 中间器；c a 听脊it b 前气管；t t 后气管；t e 气管上皮连接；t n 鼓膜神经；n s b 2 胫节神经fs l 悬韧连 接。 3 3 前胸神经节的侧根分支 前胸神经节上连食道下神经节，下接中胸神经节，其发出的神经主要支 配前足、胸部的部分肌肉及部分内脏。研究前胸部位的神经分布情况，结果如 一1 3 双斑蟋听器结构及其鼓膜神经在前胸神经节内的中枢投射 图6 所示，前胸神经节共发出6 对神经侧根，将这些侧根简单的称为n 1 n 6 。 这些侧根有些位于神经节的背面，有些位于神经节的腹面。在这些侧根中， n 1 侧根与食道下神经节n 6 相连；n 6 侧根与中胸神经节n 1 连接；n 2 、n 3 和 n 4 侧根主要支配胸部的部分肌肉及部分内脏；n 5 为支配前足的神经，听器的 鼓膜神经就包含在其中。本论文中神经侧根的命名方式遵照c a m p b e l l ( 1 9 6 1 ) 对l o c u s t am i g r a t o r i am i g r a t o r i o d e s 神经侧根的命名方式i 。 图6 双斑蟋( g r y l l u ab i m a c u l a t u s ) 前胸神经节侧根分布( 标尺：3 0 0 um ) 图7 前胸神经节及其侧根模式图 图中表示的是g r y l l u sb i m a c u l a t u s 前胸神经节背面的模式图。p g 是p r o t h o r a c i cg a n g l i o n 的缩写，为前胸神经节的简称。n 1 n 6 表示6 对神经侧根，其中n 5 为肢神经。图中神经侧根的命 名方式遵照c a m p b e l l ( 1 9 6 1 ) 对l o c u s t am i g r a t o r i am j g r a