（发酵工程专业论文）洋葱布克氏菌burkholderia+cepacia全细胞不对称拆分dl薄荷醇研究.pdf

摘要 摘要 薄荷醇是世界三大香料之一，是一种重要的手性中间体，广泛应用在化妆品、食品、 香料等工业中。使用生物催化剂催化合成化学品的工业生产已经被视为一种环保的合成 方法。全细胞生物拆分弘薄荷醇与化学法合成薄荷醇相比具有反应条件温和、环保、 高效等优点，必将拥有广阔的前景，是一种理想的拆分薄荷醇工业化生产方式。本文以 洋葱布克氏菌( b u r k h o l d e r i ac e p a c i aa t c c 2 5 4 1 6 ) 全细胞不对称拆分办乙酸薄荷酯为研 究对象，对在7l 发酵罐上的发酵和转化、产物对反应的抑制的解除、生物催化剂稳定 性、产物的分离提取进行研究，旨在为生物法生产厶薄荷醇的工业化放大奠定一定的基 础。具体内容包括： 对7l 罐中发酵产酶体系进行了研究。结果表明，由于体系的放大，菌体环境的改 变，对依赖的发酵条件产生了变化。通过对7l 罐发酵条件的优化与选择，解决了罐发 酵过程中严重产泡而造成的逃液现象，并且有效地提高了菌体量以及酶活。最终确定7l 罐上发酵条件为葡萄糖4 0g l ，牛肉膏1 0g l ，蛋白胨1 0g l ，n a n 0 32 0g l ，k 2 h p 0 4 4 g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 2g l ，c a c l 20 1g l ；控制体系p h 7 5 ；搅拌速率控制在4 0 0r m i r a 通气量为6l m i r a 培养发酵时间4 8h 。在此条件下进行的7l 罐发酵产酶，酶活从2 0 0 u l 提高到2 9 8u l ，为摇瓶水平酶活的1 4 9 ；菌体量由摇瓶水平的4 7g l 提高到了 9 8g l ，提高了将近1 0 0 。 对利用原位吸附来减弱产物抑制从而提高底物浓度进行了研究。结果表明反应体系 中添加树脂h z 8 4 5 可以有效地吸附水解反应过程中产生的薄荷醇，极大的减弱了产物 对反应的抑制作用。建立了树脂添加量随底物浓度变化的关系式，通过公式添加树脂将 溶液中产物总浓度控制在最适水平。通过对原位吸附反应体系进行了优化，从而实现高 底物浓度反应。最后在6 0g l a t - z , 酸薄荷酯浓度转化反应体系反应2h 后添加0 3 4g 树 脂，反应2 4h ，产物f - 薄荷醇的p 以值和产率达到9 8 和4 5 ，比优化前反应的以乙酸 薄荷酯浓度提高了5 0 0 。 对称拆分办乙酸薄荷酯产厶薄荷醇反应体系的条件进行了考察研究。确定了最适合 的反应条件，在密闭的条件下，控制转化体系p h 7 0 ，底物浓度为6 0g l ，细胞浓度为 1 6 0g l ，温度3 0 ，搅拌速率为2 5 0r m i n ，转化反应时间为2 4h 。在此条件下，转化 率达4 6 ，产物e e 值为9 8 6 ，达到了原先1m l 反应体系的反应水平。 对产物乒薄荷醇进行了分离纯化的研究。确定产物乒薄荷醇的纯化步骤为吸附、解 吸附、浓缩、柱层析和重结晶。用树脂h z 8 4 5 对厶薄荷醇进行吸附，用乙酸乙酯对吸 附上的产物进行解吸附。经过几步纯化，最终所得产物厶薄荷醇光学纯度保持在9 9 以 上，总收率为6 4 3 。 关键词：洋葱布克氏菌，不对称水解拆分，卜薄荷醇，高底物浓度，提取 a b s t r a c t a b s t r a c t m e n t h o li so n eo ft h ew o r l d st h r e em a j o rs p i c e s ，i sn i li m p o r t a n tc h i r a li n t e r m e d i a t e s ， w i d e l yu s e di nc o s m e t i c s ，f o o d s ，s p i c e sa n do t h e ri n d u s t r i e s s y n t h e s i so ft h eu s eo fb i o l o g i c a l c a t a l y s t si ni n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fc h e m i c a l sh a sb e e ns e e na sae n v i r o n m e n t a l l ym e t h o d r e s o l u t i o no fd - m e n t h o lb yb i o l o g i c a lp r o c e s sw h i c hi sk i n d l y , e n v i r o n m e n t a lf r i e n d l ya n d e f f e c t i v ei sa ni d e a lw a yo fi n d u s t r i a lp r o d u c t i o n i nt h i sp a p e r , t h ee n a n t i o s e l e c t i v eh y d r o l y s i s o fd 一m e n t h y la c e t a t et o - m e n t h o lb yw h o l e - c e l ll i p a s ef r o mb u r k h o l d e r i ac e p a c i aa t c c 2 5 416i na q u e o u sp h a s ew a si n v e s t i g a t e d f o rt h ea i mo fl a y i n gaf o u n d a t i o nt op r e p a r e - m e n t h o lo ni n d u s t r i a ls c a l e ，t h ei n i t i a lr e a c t i o ns u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n , r e u s i n go f b i o c a t a l y s t ，e x t r a c t i n ga n dp u r i f i c a t i o no f - m e n t h o lw e r es t u d i e d s t u d yo nt h em e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fb u r k h o l d e r i ac e p a c i aa t c c2 5 4 16 i i l7lf e r m e n t o r d e f i n i n gt h ec o m p o s i t i o no fm e d i u m ：g l u c o s e4 0g r , ，b e e fe x t r a c t10e d l ， p e p t o n e 10g l ，n a n 0 32 0g l ，k 2 h p 0 44g l ，m g s 0 4 。7 h 2 00 2 g l ，c a c l 20 1g l m e f f e c t so fd i s s o l v e do x y g e n ( d o ) c o n c e n t r a t i o na n df e r m e n t a t i o nt i m eo nt h ec u l t u r eo f 丑 c e p a c i ai na7l s t i r r e df e r m e n t o rw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d ，t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nh a s b e e nc o n f i r m e d ，a i rf l o wr a t ew a sc o n t r o l l e da t6l m i n , t h ea g i t a t i o nr a t ea n dc u l t u r et i m e w e r en o tl e s st h a n4 0 0r m i na n d4 8h i nt h i ss i t u a t i o n , t h ee n z y m ea c t i v i t yi n c r e a s ef r o m2 0 0 u lt o2 9 8u l ，t h em i c r o b i cb i o m a s sc o u l d r e a c h4 7g lm o r et h a n9 8g lo r i g i n a l l y i ns i t ua d s o r p t i o nt e c h n o l o g yw a su s e dt oi n c r e a s et h ei n i t i a lr e a c t i o ns u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb ya d d i n gh z 一8 4 5a d s o r b e n tr e s i ni nr e a c t i o ns y s t e m ， t h ei n i t i a ls u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw a si n c r e a s e d af o r m u l aw a se s t a b l i s h e da b o u tt h er e s i n a d d i t i o na m o u n ta l o n gw i t ht h ec h a n g i n go fs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n , a c c o r d i n gt ot h ef o r m u l a , t h ed - m e n t h y la c e t a t ec o n c e n t r a t i o ni na q u e o u sp h a s ec o u l db ec o n t r o l l e di nb e s tl e v e l t h u s ， t h eh i g hs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n dh i g hr e a c t i o ns p e e dc o u l db ea c h i e v e d t h e no 3 4g i - i z - 8 4 5a d s o r b e n tr e s i nw a sa d d e dt os y s t e ma f t e r2h o u r su n d e ra ni n c r e a s e ds u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o no f 6 0g l a f t e rr e a c t i n gf o r2 4l l ，t h eo p t i c a lp u r i t ya n dt h ey i e l do f - m e n t h o l r e a c h9 8 e e a n d4 5 t h u s ，t h ed l - m e n t h y la c e t a t ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e da b o u t5 0 0 t h a ne v e rb e f o r e i nt h ep i l o t - s c a l ee x p e r i m e n ti n1l s y s t e m ，t h eg o o dr e s u l t 砸t l lo p t i c a lp u r i t ya n dt h e y i e l do fl - m e n t h o lr e a c h9 8 6 p p a n d4 6 w a sa l s oo b t a i n e d d e f i n i n gt h er e a c t i o n c o n d i t i o n s ：d l - m e n t h y la c e t a t ec o n c e n t r a t i o n6 0g l ，p h7 0 ，c e l lc o n c e n t r a t i o n16 0g l ，3 0 0 c ， a g i t a t i o n2 5 0r m i n , r e a c t i o nt i m e2 4h a b s t r a c t t h ee x t r a c t i o na n dr e f i n e m e n to f m e n t h o lw a ss t u d i e d t h r o u g ha d s o r p t i o n , d e s o r p t i o r t , c o n c e n t r a t e d , c o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya n dr e c r y s t a l l i z a t i o n , t h et o t a ly i e l do f - m e n t h o lw a s 6 4 3 诵t ho p t i c a lp u r i t yo f9 9 k e yw o r d s ：b u r k h o l d e r i ac e p a c i a ；e n a n t i o s e l e c t i v eh y d r o l y s i s ；- m e n t h o l ；h i g hs u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n ；e x t r a c t i n g i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 吲携 1 日 期： 沙伊曰f 产 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 刎浮 l 仰 ， 日 期： 第一章前言 1 1 立题意义 第一章前言 手性化合物普遍存在于自然界，在医药、农药、香料、功能性材料的前体、中间体 或终产物在精细化工产品的生产中占有极其重要的地位【l j ，同时分子手性识别在生命活 动中发挥着极其重要的作用。手性化合物在人类生活中起着重要的作用，两种对映体在 药理、生理、毒理及功能等各方面均表现不同，所以制备光学纯的手性化合物在医药、 农业、材料以及环保等领域有着广泛的价值。手性药物已成为世界各国制药公司重点生 产新目标，也是当前国内外新药研究和开发的热点，手性、手性技术成了新药研制中的 重要关键词。手性药物的市场份额逐年扩大，1 9 9 0 年手性药物的市场销售额只有1 8 0 亿， 至0 2 0 0 5 年已经到达了1 7 2 0 亿美元。在2 0 0 6 年全球十大畅销药物排行榜中，前四名均为单 旋体手性药物，2 0 1 0 年可望超过2 5 0 0 亿美元1 2 1 。可见开发和制备手性化合物已经具有重 要的现实意义。 薄荷醇又名六氢化百里酚，俗名薄荷脑，学名1 甲基- 4 异丙基环己3 醇，分子式 c l o h 2 0 0 ，是非常重要的环萜醇手性化合物。由于分子中存在3 个手性中心，通常化学 法合成的薄荷醇存在八种对映异构体( 图1 1 ) 。 h h 。、h ， ? h 3 舸殳 d - i s o m e n l h o ld - n e o m e n t h o id - n e o i s o r e e n t h o l 图i - i 薄荷醇八种异构体的结构式 f i g 1 - 1t h es t e r e o i s o m e r so f m e n t h o l 薄荷醇有8 种异构体，它们的呈香性质各不相同。其中，小薄荷醇和，- 薄荷醇的香 气、气味等感官性质有很大的差别，薄荷醇具有清凉薄荷香、辛香、醚香香气以及凉 香、薄荷味道、气味新鲜、轻快，正薄荷醇则具有霉味，并带有樟脑气味；天然薄荷油 的特征香气是以厶薄荷醇为主体的。由于厶薄荷醇的甲基、异丙基和羟基都位于平伏键， 能量较低，故天然产薄荷醇是都是以f - 薄荷醇存在。 厶薄荷醇不仅是医药、食品和化妆品行业的重要添加剂，而且也是合成手性材料的 必不可少的手性前体，开发乒薄荷醇的研究对推动我国香料产业的技术进步和医药工业 l 江南大学硕士学位论文 的发展都具有重要的战略意义。天然薄荷醇皆为，- 薄荷醇，由于受天气、地域等影响， 产量和质量波动较大，人工合成的薄荷醇产品质量稳定，经对映体拆分后得到的厶薄荷 醇在品质上与天然品差异很小，因而近年来受到广泛的关注，自上世纪二十年代以来， 人们采用了多种方法化学合成了薄荷醇【3 叫。但通常合成薄荷醇为小薄荷醇和厶薄荷醇的 混合物，小薄荷醇的存在大大降低了厶薄荷醇的风味，严重影响了它的实用价值。可见 对合成薄荷醇进行手性拆分是非常重要的。如今每年全球对薄荷醇的需求量也在逐年上 升( 如图1 2 ) ，所以如何大量合成厶薄荷醇以成为人们关注的问题，而今年来工业生产 的清洁化日趋重要，这便给生物法生产薄荷醇提供的生长空间，与发展机遇。 m e n t h o lc o n s u mp t i o n ( m t o n s l 图1 2 薄荷醇世界消费量 f i g 1 - 2w o r l dc o n s u m p t i o no fm e n t h o l 1 2 国内外研究进展 1 2 1 国际上制备，- 薄荷醇的研究现状 1 2 1 1 物理方法与化学方法 目前国际上生产厶薄荷醇的方法非常多，各有差异与利弊。 物理方法制备，- 薄荷醇的方法有冷冻结晶法、精馏一冷冻结晶法、超临界c 0 2 提纯 和柱色谱分离法。其中冷冻结晶耗能高，生产率低，薄荷醇得率也不是很高；精馏一冷 冻结晶法【lo l 是将天然薄荷原油进行真空间歇精馏，然后再进行冷却结晶，得到的晶体纯 度和产量都较高；超临界c 0 2 提纯【l l 】法师采用超临界c 0 2 萃取技术对薄荷原油中薄荷醇 进行提纯，其提取工艺为：薄荷原油_ 静置除水_ 超临界c 0 2 萃取_ 粗醇提取_ 脱水一 压滤_ 配料结晶一烘选- 风凉一筛选一包装：柱色谱分离法工业规模生产还很少，多数 情况仅应用于少量的比较昂贵的药物或试剂的制备，另外设备投资多、操作成本也较高。 2 第一章前言 由于合成薄荷醇经过对映体拆分后，在品质上与天然品并没有多大差异，且产品质 量稳定，因而近年来化学法合成薄荷醇受到广泛的关注。科研工作者对薄荷醇的合成进 行了大量研究工作，许多具有应用发展前景，并且有些已经用于工业化生产。综合起来 有以下两种： 一种是以天然化合物作原料，如由旋光性萜烯酮、萜烯、萜醛及萜醇类为原料合成。 如上世纪八十年代，日本高砂公司以月桂烯( m y r c e n e ) 和二乙胺为原料，利用有机金 属配位体手性催化剂r h b i n a p 催化合成z 薄荷醇【1 2 - 1 4 1 ；又如日本学者s a y o 等【1 5 16 】用过渡 金属厶催化剂还原萜烯酮制备乒薄荷醇，产率和对映体过剩值( e n a n t i o m e r i ce x c e s s ，简 称p e 值) 均达9 0 以上。但由于旋光性萜烯酮多为天然产物，来源受到限制，因此该方 法很少用于高光学纯度，薄荷醇的制备；2 0 0 4 年，t r a s a r t i t 7 】等研究由乒柠檬醛( d - c i t r a l ) 以n i ( 3 ) a 1 m c m - 4 1 为双功能催化剂可直接一步合成薄荷醇，能催化完成由柠檬醛一 香茅醛一异薄荷醇_ 薄荷醇的转化，产物得率为9 0 ，其中办薄荷醇占7 0 7 5 。2 0 0 5 年，m a l 【i a r v e l a 等1 1 8 j 又利用该催化剂催化环化柠檬醛，将弘薄荷醇含量提高到了8 4 。 另一种是以石油化学产品进行合成，如以百里香酚、异戊二烯、异丙叉丙酮和丁烯 酮为原料合成。如h a a r m a n n & r e i m e r 采用百里香酚作为生产消旋薄荷醇的原料，在含 锰和铜的钴催化剂作用下，还原生成的以薄荷醇约占6 0 - - 8 0 的薄荷醇混合物，最后对 混合物进行分级蒸馏、酯化生成外消旋的苯甲酸薄荷酯，经过选择性的酶促水解得乒薄 荷醇。这是目前主要的一条厶薄荷醇的商业化生产路线 1 9 - 2 1 ；2 0 0 2 年，日本t a k a s a g o 公 司实现了由异丙叉丙酮和丁烯酮合成厶薄荷醇的路线1 2 2 】。 1 2 1 2 生物催化合成法 生物催化合成是指利用酶或微生物将无手性或潜手性的化合物催化转化为手性产 物的过程。目前生物催化合成7 - 薄荷醇的例子较少，主要是采用氧化还原酶体系，且仅 限于实验室研究，并且前体必须是旋光性的f - 薄荷酮。日本学者最早使用p s e u d o m o n a s p 甜f 矗缸脱氢酶能够将，薄荷酮转化为厶薄荷醇【2 3 1 。1 9 9 0 年，s h o i c h i 等【2 4 】利用n a d h 依赖的 脱氢酶将z 薄荷酮还原为z 薄荷醇，产量在2 7 0h 以内保持4 6 1 ( l d ) ，不足的是反应过程 中同时产生副产物甲基异丁酮。 1 2 2 生物法不对称拆分护薄荷醇的国内外研究进展 微生物酶作为生物催化剂，与化学催化剂相比，具有更高的催化效率、更高的反应专 一性和立体选择性以及温和的反应条件。拆分时酶的活性中心具有手性特征，对对映体有 识别能力，利用其与酶的活性中心匹配的对映体反应速度高于不匹配的对映体的特征，将 对映体分离。目前由于酶和微生物能催化酯和醇的不对称水解和不对称酯化，国内外学者 主要利用这两种途径来拆分弘薄荷醇。 不对称水解反应法拆分办薄荷醇已经探索多年。z a k s 等较早报道了此类拆分，在固 定化小红酵母( r h o d o t o r u l am m u t a ) 细胞催化下，消旋体丁二酸薄荷酯在水饱和的正庚烷 非水介质中水解生成乒薄荷醇，其对映体过量达1 0 0 。1 9 7 0 年英国专利1 2 5 报道将2 0g 3 江南大学硕士学位论文 的以豆蔻酸薄荷酯由绿霉素菌( zv i r i d e ) 在磷酸葡萄糖蛋白胨介质中催化不对称水解， 反应得到得到1 7g 的厶薄荷醇。同年德国专利【2 6 】也报道了使用酵母和真菌不对称水解 从而获得厶薄荷醇的方法。日本的福井三郎【2 7 】等利用细菌，采用他们的固定形式在有机 溶剂中成功将办薄荷醇羧酸酯催化水解得到，- 薄荷醇。i n a g a k i 等在1 9 8 6 年研究中提取 的假单胞菌n o f 5 ，可以选择性水解拆分办乙酸薄荷酯和弘乙酸异薄荷酯。g a t f i e l d 等 2 8 1 采用自皱摺假丝酵母的重组脂肪酶对弘苯甲酸薄荷酯进行水解产，- 薄荷醇，p 巴 值大于9 9 ，明显优于市场出售的皱摺假丝酵母的选择性。 不对称酯化反应是指将办薄荷醇进行酶促酯化反应，生成厶薄荷醇酯和小薄荷醇； 再将所得的厶薄荷醇酯经过化学水解即可转变为，薄荷醇。1 9 9 8 年，k a m i y a 在对脂肪 酶催化薄荷醇酯化反应的动力学研究出了有机溶液中识薄荷醇的选择性酯化反应是属 于乒乓机理；在k l i b a n n o w 2 9 仓1 建了非水介质中酶反应体系后，k a m i y a l 3 0 等使用非理智 表面活性剂包覆的脂肪酶在有机介质里具有更高的活性，反应速率比粉末脂肪酶高1 0 0 多倍。但是采用大量有机介质，容易对生态环境造成较大的影响，不适宜工业化生产。 目前国内对合成薄荷醇的研究也十分活跃，如浙江大学最近就开展了由异戊二烯合 成薄荷醇的研究工作，华东理工和天津大学也分别对办薄荷醇的酶促拆分进行了研究。 可以预见，随着薄荷醇研究的深入，此行业会在国民经济中扮演更重要的角色。 目前文献报道的用于弘薄荷醇拆分的酶主要有四种：c a n d i d ar u g o s al i p a s e ，c a n d i d ac y l i n d r a c e al i p a s e ，丑c e p a c i al i p a s e ，p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n sl i p a s e ，都是商品化 的脂肪酶，工业化成本较高，且主要是采用脂肪酶催化的非水相选择酯化或转酯化方法 1 3 1 - 3 3 】，以及水相选择性水解的方法f 3 够5 1 。国际上，生物法拆分以薄荷醇主要有两种代表 性拆分工艺： 南非c s 瓜公司：m 甲酚经烷基化作用生成麝香草酚，麝香草酚经加氢还原生成四对 外消旋的非对映异构体，分别是：薄荷醇，异薄荷醇，新薄荷醇，新异薄荷醇。 混合 物经过具有立体选择性的脂肪酶的催化酰基化作用生成e e 值至少超过9 6 的，- 乙酸薄 荷酯。通过蒸馏把，- 乙酸薄荷酯从未参与反应的异构体中分离出来，- 乙酸薄荷酯再经水 解便可以得到，薄荷醇了。此法已应用于一定规模的连续操作系统( 1 0 0 0g h ) 。即使经 过2 0 0 0 d 时的运转，酶的活性依然保持，而且未反应的异构体经异构化作用或者是外消 旋作用又可以再生原始的非对映体混合物，而后又可以用脂肪酶对混合物进行选择性催 化合成，最后几乎所有的麝香草酚都转化成，薄荷醇( 如图1 3 ) 。 4 第一章前言 虫一垒伽一 图l - 3 南非c s 瓜公司f - 薄荷醇合成工艺 f i g 1 - 3c s i rb i o c h e m t e kc o m p a n y - m e n t h o ls y n t h e s i s 该工艺的优点是利用有机溶剂中的酶促转酯化反应，反应底物浓度高，酶便于回收 利用。但是该工艺也存在一些缺点： ( 1 ) 使用假单胞菌脂肪酶立体选择性酯化含特定 讲薄荷醇的混合物时，反应转化率低( 约2 0 0 0 左右) ，反应产物复杂，包括z 乙酸薄荷 酯、有机溶剂、未转化的立体异构体、过量的酯化剂和反应副产物。复杂的反应产物给 后续厶乙酸薄荷酯的分离带来困难，分离程序繁琐且终产物纯度不高，须经过蒸馏或结 晶方法进一步提纯到所需纯度。( 2 ) 利用碱液水解厶乙酸薄荷酯制备厶薄荷醇，转化 率低，小于5 0 。 德国h a a r r n a n n r e i m e r 公司：m 甲酚( m c r e s 0 1 ) 与丙稀在催化剂的催化作用下反应生 成麝香草酚( t h y m 0 1 ) ，麝香草酚经加氢还原生成四对外消旋的非对映异构体，分别是： 薄荷醇，异薄荷醇，新薄荷醇，新异薄荷醇。对混合物进行分级蒸馏便可以获得外消 旋的薄荷醇( f 和办各占5 0 ) ，再与甲基安息香酸发生转酯化作用生成外消旋的安息香 酸薄荷酯，经过选择性的酶促水解便可以将厶和小安息香酸薄荷酯分离，最后将厶安息 香酸薄荷酯水解便可以得到所需产物f - 薄荷醇( 如图1 - 4 ) 。 江南大学硕士学位论文 乒飞h ： 。殳殳 j ( 0 r b t h y m o l 扣 d m e n t h o l 图1 4 德国h a a r m a n n r e i m e r 公司f - 薄荷醇合成工艺 f i g 1 - 4h a a r m a n n - r e i m e rc o m p a n y - m e n t h o ls y n t h e s i s h ， h e n t h o ii s o m e r j 该工艺的缺点：( 1 ) 重组c a n d i d ar u g o s al i p a s el i p l 为一胞外水解酶，在水溶液 中稳定性不高，难于重复回收利用，采用固定化后虽可以提高酶的稳定性，但固定化 引起的酶失活严重，最高活性收率仅4 3 。( 2 ) 重组l i p l 选择性水解z ，苯甲酸薄荷 酯，底物浓度不高，约0 8 。 与酶促选择性酯化方法相比，采用酶促选择性水解制备厶薄荷醇具有产物分离简单， 设备能耗费用低，产物纯度高的优点，并且可以通过选择合适的反应体系及对酶进行固 定化或采用全细胞催化等方法提高反应的底物浓度，提高酶的稳定性。因此，基于以上 特点，本研究室采用选择性酶促水解讲乙酸薄荷酯的方法拆分以薄荷醇。本研究室通 过自主筛选得到优良菌株b u r k h o l d e r i ac e p a c i aa t c c 2 5 4 1 6 ，其全细胞催化不对称水解 讲乙酸薄荷酯制备厶薄荷醇，取得了较好的拆分效果。 6 第一章前言 1 2 3 原位分离技术 原位产物分离技术是在反应体系中产物一经形成便被分离，因而可以减少产物抑制 和对细胞的毒害作用，从而提高反应底物浓度，减少下游提取步骤等【3 6 ，轫。在反应体系 中通过原位吸附策略可以及时吸附反应底物或产物，从而达到降低底物或产物抑制的目 的，同时也可以降低有机物对生物催化剂的毒害作用。在近二十多年的研究中，利用原 位产物分离技术来提高全细胞生物催化和转化产率的报道非常多【3 2 1 。通过原位分离技 术，可以通过以下方式来提高产率【4 3 】： ( 1 ) 减小产物的抑制或是毒害，从而使反应能在不受抑制的情况下持续进行； ( 2 ) 可以改变由于大量产物存在而造成的反应平衡，使反应朝着生成产物的方向进 行； ( 3 ) 产物可能存在降解或是存在其他损失，而通过原位分离技术可以减小损失； ( 4 ) 原位分离是边反应边提取的过程，因此它可以减少下游提取的步骤和成本； 可见原位吸附技术在反应过程中可以起到很明显的作用，对提高底物浓度，减少反 应过程中底物产物的毒害，简化生产步骤，降低生产成本都有很好的效果。在实际反应 过程中，原位吸附技术通常用在一下几个方面： ( 1 ) 降低底物或产物的抑制作用：指在反应体系中加入对产物有吸附能力的吸附 树脂，使产生的产物一产生便被树脂吸附，以减小溶液中产物的浓度，从而达到产物抑 制的目的。或者在反应体系中加入对产物和底物都有一定吸附的树脂，树脂可以起到缓 慢释放底物和吸附底物的作用，对于底物和产物对反应都有抑制的情况，这样的原位吸 附技术最有效。添加吸附树脂是实现原位产物分离的一种重要方式。树脂可以吸附产物， 从而达到减小产物对反应抑制的目的。f u r s t o s s 等m 】人用生物催化b a e y e r - v i l l i g e r 氧化 反应过程中，通过向体系中添加树脂，底物浓度从1g l 提高至2 0g m 。许建和掣4 5 j 在 红酵母催化苯乙酮不对称还原反应中添加树脂可以降低苯乙酮对细胞的毒害作用及产 物对生物还原反应的抑制，提高反应底物的浓度，增加产物的收率。杨忠华掣删用活性 酵母细胞不对称催化苯乙酮还原，反应体系添加树脂使产物( 研苯乙醇浓度从约9 m m o l l 达到1 2 4m m o l l 。然而，关于利用原位吸附对不对称水解拆分反应中提高底物 浓度的研究并未见报道。 ( 2 ) 原位萃取：指在反应水相体系中增加另外一相，如有机溶剂、超临界流体从 而形成两相反应体系；或是增加另一水相形成双水相反应体系。这样，当产物形成时， 被萃取到另外一相中，减小产物对反应的抑制，从而提高反应的底物浓度，提高产率。 t a k o r s 等人在厶苯丙氨酸制备过程中，利用1 0 的煤油二( 2 乙基己基) 磷酸和1m 硫酸 组成的体系作为萃取相，使厶苯丙氨酸产物浓度从3 0g l 提高到l1 0g l 。s t a r k 等人在 2 苯乙醇制备过程中，以油酸作为萃取相，使产物2 苯乙醇的浓度从3 8g l 提高到5 6 g l 。 ( 3 ) 其它原位分离技术：包括原位蒸发技术电渗析、沉淀、络合、结晶等一些原 位分离技术也有一些报道。 7 江南大学硕士学位论文 树脂便是一种有效地吸附工具，在本反应体系中通过添加树脂来及时吸附反应产 物，从而达到降低产物抑制的目的。 1 2 4 生物催化过程对催化剂的要求 1 2 4 1 生长 生长速度较快，短时问内可以获得较高的菌体量，但这种菌体量的提高不能以牺牲 目的酶的表达量为代价。 1 2 4 2 选择性活性 立体选择性好，转化速度快，终产物浓度高。工业生物催化剂一般要求产物e e 值 大于9 5 。 1 2 4 3 催化稳定性 生物催化剂的稳定性是限制其工业应用的重要因素。在静息细胞生物转化过程中， 细胞可能受到底物产物对其的毒害。同时，静息细胞在转化过程中也在代谢，其有一定 的半衰期，全细胞的衰亡使得其利用率不高。 1 2 4 4 底物特异性 底物特异性广泛，能够适用于一系列化合物生产的万能催化剂是工业生物催化期待 的。 1 3 本课题研究的主要目的和内容 本研究室已通过自主筛选得到优良菌株丑c e p a c i aa t c c 2 5 4 1 6 ，其全细胞催化不对 称水解以乙酸薄荷酯制备厶薄荷醇( 如图1 5 ) ，转化率为4 5 左右时，p e 值达到9 5 以上。并通过反应产物和底物的分离纯化，纯化得率为8 5 ，- 薄荷醇单次循环总收率 为6 6 ，高于德国h a a r m a n n r e i m e r 公司的厶薄荷醇收率( 4 l ) 和南非c s i rb i o c h e m t e k 公司的厶薄荷醇收率( 4 7 ) 。这充分说明先对讲薄荷醇进行化学酯化再通过ac e p a c i a a t c c2 5 4 1 6 全细胞催化的不对称拆分制备厶薄荷醇是完全可行的 4 7 , 4 8 j 。 二 n 。 图1 - 5 且c e p a c i aa t c c 2 5 4 1 6 水解办乙酸薄荷酯的方法拆分办薄荷醇 f i g 1 5c h i r a lr e s o l u t i o no f d l - m e n t h o lb ye s t e r a s e sf r o mac e p a c i aa t c c 2 5 4 16 但是本研究体系目前研究停留在小体系水平，当前发酵体系为5 0m l ，水解拆分体 系为1m l ，并没有在更大的规模实现办薄荷醇的拆分反应。并且本研究也存在一定的 特殊性，丑c e p a c i aa t c c 2 5 4 1 6 全细胞催化不对称水解以乙酸薄荷酯制备，- 薄荷醇反应 8 第一章前言 存在比较严重产物抑制作用，从而导致存在底物浓度无法提高，催化剂利用率低，产物 提取困难，体系放大困难等问题。 针对以上问题，本研究计划从发酵出发，重点在反应过程中探索出一种能够提高反 应过程初始底物浓度的方法，对催化剂稳定性进行研究，也对发酵体系以及催化反应的 扩大进行初步研究，同时，对产物的提取纯化进行研究，以期达到高浓度、高效、经济 提取纯化获得乒薄荷醇的目的。这有助于推动生物法不对称水解拆分生产，薄荷醇工业 化的发展。 由以上研究思路，确定本课题的主要研究内容包括以下几个部分 ( 1 ) 在7l 罐上实现丑c e p a c i aa t c c2 5 4 1 6 的发酵产酶，通过对发酵放大过程中进 行培养及产酶条件优化，以得到菌种的最佳培养条件。 ( 2 ) 利用原位吸附技术提高反应的初始底物浓度，解弱产物对反应的抑制作用。首 先筛选出能较快吸附产物和有较大吸附量的树脂。利用树脂对底物和产物的吸附平衡， 控制溶液中底物和产物含量，从而减少产物对反应抑制和对菌体的毒害，以达到提高初 始反应底物浓度提高的目的。 ( 3 ) 在1l 反应体系中实现最c e p a c i aa t c c 2 5 4 1 6 全细胞催化不对称水解办乙酸薄 荷酯制备，- 薄荷醇反应，探索催化反应在罐中的反应情况，为反应的进一步放大提供依 据。 ( 4 ) 对厶薄荷醇提取和纯化进行研究。以期达到用一种经济、简单、快速的方法获得 高质量扣薄荷醇的目的，为乒薄荷醇的提取纯化提供一条途径。 9 第二章实验材料与方法 2 1 试剂和仪器 第二章实验材料与方法 洋葱布克氏菌( 丑c e p a c i aa t c c 2 5 4 1 6 ) 为本实验室分离保藏；1 0 0 目尼龙网购自 河北弘亚丝网有限公司：大孔吸附树脂d a 2 0 1 由江苏苏青污水处理有限公司提供；大 孔吸附树脂n k a i i 和d 4 0 0 6 由天津海光化工有限公司提供；大孔吸附树脂h z 8 0 1 、 i l l 8 1 6 和h z - 8 4 5 由华东理工大学上海华震科技有限公司提供，其主要参数见表2 1 表2 - 1 各种树脂主要参数 t a b l e2 1t h em a i np a r a m e t e r so fr e s i n s - _ _ _ _ o l _ _ l i _ l l l _ _ _ _ _ - _ _ _ i _ _ _ _ _ _ _ 一1 o i _ l i l i l _ _ _ l - - _ _ l _ l _ _ _ _ i _ _ - _ _ o ! _ _ l _ _ - _ _ _ _ _ _ o _ _ _ l _ _ l l _ l _ _ l _ i _ 一 树脂型号极性 比表面积m 2 g平均孔径a o 所用试剂的名称、纯度和出产单位列于表2 2 ，所用设备列于表2 3 。 表2 - 2 实验试剂一览表 t a b l e2 - 2e x p e r i m e n t a lt a b 江南大学硕士学位论文 表2 - 3 实验设备一览表 t a b l e2 - 3e x p e r i m e n t a li n s t r u m e n t s 仪器名称及型号 出产单位 无菌超净工作台 回转式恒温调速摇瓶柜 7l 发酵罐 生化培养箱 电子天平 p h 计 台式离心机 冷冻干燥机 涡旋震荡仪 气相色谱1 气相色谱2 色谱柱 苏州安泰空气技术有限公司 上海新星自动化控制设备成套厂 美国n b s 公司 h x 9 0 8 0 b 2 ，上海福码实验设备有限公司 梅特勒一特利多仪器( 上海) 有限公司 梅特勒一特利多仪器( 上海) 有限公司 t g l 1 6 g 型，上海安亭科学仪器厂 f l 也e z e4 5 ，l a b c o n c o ，u s a 梅特勒一特利多仪器( 上海) 有限公司 安捷伦6 8 2 0 ，美国安捷伦公司 瓦里安g c 3 9 0 0 ，美国v a r i a n 公司 s g ep e g - 2 0 m ( 3 0m x o 2 2r a m x 0 2 5g n ) s u p e l c o b - d e x - 12 0 ( 3 0m x o 2 5m m x 0 2 5w n ) 2 2 实验方法 2 2 1b u r k h o l d e r i ac e p a c i aa t c c 2 5 4 1 6 培养基 种子培养基( ) ：葡萄糖1 0 ，牛肉膏o 5 ，蛋白胨0 5 ，k 2 h p 0 4o 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0 o 0 2 ，c a c l 20 0 1 ，n a c l0 5 ，p h7 2 ，1 2 1 灭菌2 0m i n 。 发酵基本培养基( ) ：葡萄糖2 2 7 ，牛肉膏1 5 8 ，蛋白胨1 8 3 ，k 2 h p 0 40 4 2 ， m g s 0 4 7 h 2 0o 0 2 ，c a c l 20 0 1 ，n a c lo 5 。 2 2 2 菌体培养方法 种子培养：将菌种由培养斜面接种到5 0m l ( 2 5 0m l 三角瓶) 液体培养基中，于3 0 c 、 15 0r m i n 条件下恒温振荡培养2 4h ，制成液体菌种。 产酶培养：按1 0 ( w ) 的接种量将液体菌种接入到5 0m l ( 2 5 0m l 三角瓶) 液体发 酵产酶培养基中，置于3 0 c 、1 5 0r m i n 条件下恒温振荡培养4 8h ，发酵结束，将发酵 液在8 0 0 0r r a i n 下离心1 0r a i n ，用生理盐水洗涤菌体2 次，菌体冷冻干燥后4 保藏备 用。 2 2 3 树脂的预处理 将6 种大孔树脂分别用无水乙醇浸泡2 4h ，放净洗涤液，按同样方法处理，直至一 份洗涤液在试管中加3 倍体积去离子水不显混浊为止，然后用蒸馏水充分淋洗至大孔树 脂无残留乙醇，抽滤，室温下保藏备用。 第二章实验材料与方法 2 2 4 树脂对底物吸附量的测定 在5m l 、浓度为1 1 5m o l l 的n a 2 h p 0 4 一k h 2 p 0 4 缓冲溶液d p (