（环境科学专业论文）辽河口湿地氨氧化菌群群落特征及影响因素的研究.pdf

构存在较大差别，s i o 的盐度为1 0 o ，各个时期样品种群多样性指数均大于其他 盐度梯度，氨氧化细菌的生物多样性与氨氮、总氮及p h 存在显著相关性，聚类 结果为：s i o 和s 1 5 在第9 0 天以及s 1 0 的第1 2 0 天和s 1 5 的第3 0 天之间相似性较大， 为9 7 ，s i o 的d 0 1 天和第3 0 之间相似性也很大，为8 5 ，其他则没有表现出明显 的盐度梯度和时间规律。 关键词辽河口湿地；氨氧化茵( a o b ) ；盐度；总氮；相关性 r e s e a r c ho nt h ec o m m u n i t yc h a r a c t e r i s t i c so fa m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i aa n di t sm a i ne f f e c t i n gf a c t o r si nl i a o h e e s t u a r yw e t l a n d a b s t r a c t l i a o h ee s t u a r yw e t l a n di st h el a r g e s tc o a s t a le s t u a r yw e t l a n di nc h i n a , w h i c hh a s ag r e a te c o s y s t e ms e r v i c ef u n c t i o n i tc o u l dc o n s e r v e 咖矽d r i n k i n gw a t e r , r e m o v e a m m o m an i t r a t ea n do t h e ro r g a n i cp o l l u t a n t s ，a f f o r dw i l d l i f eh a b i t a t sa n da d j u s tt h e a t m o s p h e r i cc o m p o n e n t sa n ds oo n t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d yi st of i g u r eo u tt h e i m p o r t a n tl i n k i nw e t l a n dn i t r o g e nc y c l e - d i s t r i b u t i o na n dm i g r a t i o nc h a n g e so f a m m o n i u mo x i d a t i o nb a c t e r i ac o m m u n i t ys t m c t u r e ，a n n o u n c i n gt h em e c h a n i s mo f b a c t e r i ap o p u l a t i o no fa m m o n i u mo x i d a t i o ni nt h ep r e s s u r eo fs a l i n i t ye n v i r o n m e n t a l t h er e s u l t sw i l lo f f e rr e f e r e n c ea n db a s i sf o rl i a o h ee s t u a r yd e g r a d a t i o nw e t l a n d b i o r e m e d i a t i o n r e c e n t l yt h er e s e a r c h e sf o rn i t r o g e nc y c l i n go nb a c t e r i ac o n c e n t r a t e d o nt h ea c t i v a t e ds l u d g ea n ds e w a g ep r o c e s s o r , e t c ，r a r e l yc o n c e r n e dw i t ha n a l y z i n gt h e c o m m u n i t ys t r u c t u r eo fw e t l a n ds o i l i nt h i sp a p e r , l i a o h ee s t u a yw e t l a n du n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s ，d i f f e r e n t v e g e t a t i o nt y p e s ，d i f f e r e n ts a l i n i t y 伊a d i e n k d i f f e r e n tc nr a t i o ，d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fo i la m m o n i u mo x i d a t i o nf l o r aa m o u n to fd i s t r i b u t i o na n d i n f l u e n c i n gf a c c o 璐a n dt h es p a t i o - t e m p o r a lc h a n g e so fa m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i a ( a o b ) c o m m u n i t yw e r ed i s c u s s e d o i lt h et r a d i t i o n a lm e t h o d so fm i c r o o r g a n i s m c u l t i v a t i o nm p n l a r g e s tc o n t i n g e n tn u m b e rm e t h o da n dm o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d p c r d g g em e t h o d t h er e s u l t ss h o wt h a tl i a o h ee s t u a r yr e e dw e t l a n dp e r f o r m e dd i f f e r e n t c h a r a c t e r i z a t i o ni nd i f f e r e n ts t a t e s t h ea b u n d a n c eo fa o b ( a m m o n i ao x i d i z i n g b a c t e r i a ) i nn o td e g e n e r a t ea r e a sw a sm u c hm o r et h a nt h eo t h e ra r e a s t h e r ea r en o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sa m o n g s od e g r a d e da r e a , n ov e g e t a t i o na n da r t i f i c i a lr e s t o r a t i o n a r o a a n dc o m p l e t er e c o v e r yo ft h ee s t u a r yw e t l a n de c o l o g i c a lf u n c t i o nl a gt h e e c o l o g i c a ls t r u c t u r er e c o v e r y v e g e t a t i o ns t a t e ，s o i l s o l u b l es a l t , o r g a n i cm a t t e ra n d t o t a ln i t r o g e nc o n t e n ta l et h em a i nf a c t o r so nt h ea b u n d a n c eo f a o bi nl i a o h ee s t u a r y r e e dw e t l a n d t h e r ei so b v i o u sd i f f e r e n c ei na o bc o m m u n i t yd i v e r s i t yi n d e xo n s p a t i o t e m p o r a lc h a n g e s t h eb i o d i v e r s i t yo f t h en o td e g e n e r a t e dr e e da r e ai sb i g g e r o na u g u s tw i m1 5 2t h a no c t o b e rt i m e si n d e x ，a n di t st h el o w e s to nj u n e ，h o w e v e r t h e r ei sn o tv e r yo b v i o u s l yt e m p l ev a r i a t i o nr e g u l a r i t y o nt h es a n es i t et h e r ea r e o b v i o u sd i f f e r e n c e sb e t w e e na o bc o m m u n i t i e s s i m i l a r i t i e si n t h e t i m e ，b u t s i m i l a r i t i e sa l el o wb e t w e e nd i f f e r e n tm o n t h s i nt h es a m em o n t ht h e r ei sh i g h s i m i l a r i t yb e t w e e nd i f f e r e n ts i t e s ，b u t i nd i f f e r e n tm o n t h sa o bh a sd i f f e r e n t e c o l o g i c a lf u n c t i o n s u n d e rd i f f e r e n tv e g e t a t i o ns o i la m m o n i u mo x i d a t i o nb a c t e r i a n u m b e ri sg r e a t e rd i f f e r e n c e n a k e db e a c hh a st h em i n i m u ma b u n d a n c ei nc o n t r a s to f t h er e e d ，t h ea o ba b u n d a n c ew a s2 716c e l l s g - 1i nr e e d ，w h i l et h ea b u n d a n c ew a s9 0 8 c e l l s g 1 ；t h es t r u c t u l e so fa m m o n i ao x i d a t i o nb a c t e r i a lc o m m u n i t yu n d e rd i f f e r e n t v e g e t a t i o nt y p e sa r ed i f f e r e n t t h eb i o l o g i c a ld i v e r s i t yi nn a k e d b e a c hi sh i g h e rt h a n o t h e ra r e a s t h er h i z o s p h e r em i e r o e n v i r o n m e n tp e r f o r m sg r e a ti n f l u e n c ef o r t h e e c o l o g i c a l d i s t r i b u t i o no fa m m o n i ao x i d a t i o nb a c t e r i a t w od i f f e r e n t f o r m s o f i n o r g a n i cn i t r o g e na n dt o t a ln i t r o g e nc o n t e n td i s t r i b u t i o nw i t ht i m es h o w e ds i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e si nd i f f e r e n ts a l i n i t yg r a d i e n ts o i li nl i a o h ee s t u a r yr e e dw e t l a n d ；l o w s a l i n i t yo a np r o m o t et h eg r o w t ho fa m m o n i ao x i d i z i n gb a c t e r i a , b u th i 曲s a l i n i t yc a l l i n h i b i tt h ea c t i v i t yo fa m m o n i ao x i d i z i n gb a c t e r i a ；t h e r ei ss i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o n b 咖黜n i - 1 4 + - na n dt h ea b u n d a n c eo f a m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i a ( r - - - o 6 3 5 ”o 0 1 ) ； c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ea b u n d a n c eo fa m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i aa n dn i t r a t e n i t r o g e na n dt o t a ln i t r o g e nw a s n o ts i g n i f i c a n t , s a l i n i t yl i m i t st h ei m p a c tw h i c ht o t a l m t r o g e no nt h ea b u n d a n c eo fa m m o n i ao x i d i z i n gb a c t e r i a ；t h e r ei sab i gd i f f e r e n c ei n a m m o n i ao x i d i z i n gb a c t e r i ac o m m u n i t ys t r u c t u r ei nd i f f e r e n ts a l i n i t yg r a d i e n t , d i v e r s i t yi n d e xo fs ios a m p l e si nd i f f e r e n tp e n o d sl a r g e rt h a no fo t h e rs a l i n i t y g r a d i e n t , t h eb i o l o g i c a ld i v e r s i t yo fa m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i aw a ss i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t e dw i t h n h 4 + - n ，t o t a ln i t r o g e na n dp h ，c l u s t e r i n gr e s u l t ss h o wt h a tt h e s i m i l a r i t i e sa r e9 7 b e t w e e ns 1 0a n ds 1 5i nd 9 0 ，a n ds 1 0i nd 1 2 0a n ds 1 5i nd 3 0 ； t h e r ea l s oi sh i g hs i m i l a r i t yb e t w e c ns10i nd o1a n dd 3 0 ，w h i c hi s8 5 ，b u to t h e r sn o t s h o ws i g n i f i c a n ts i m i l a r i t yr e g u l a r i t y0 fs a l i n i t yg r a d i e n t sa n dt e m p o r a l k e y w o r d sl i a o h ee s t u a r yw e t l a n d ；a m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i a ( h o b ) ；s a l i n i t y ； t o t a ln i t r o g e n ；c o r r e l a t i o n 辽河口氨氧化菌群落特征及影响因素研究 o 前言 辽河三角洲湿地是我国最大的滨海河口湿地，具有丰富的生物多样性，对维 持区域生态平衡、促进区域经济发展具有重要作用。然而，近年来工业含氮废水 排放、局地污染与上游污染叠加等人为因素，导致湿地污染物增加、生态退化和 近岸水质恶化，这已成为辽河口湿地和近岸水域面临的主要环境问趔1 1 。 氮是维持湿地生态系统基本的营养物质，成为限制湿地生态系统生物生产力 的元素之一，湿地中氮的生物地球化学循环对湿地生态系统生产力和可持续性乃 至全球环境变化都有影响。氮循环是指空气中氮、有机及无机氮类化合物在自然 环境中相互转化的系列过程的总和，包括氨化过程、硝化、反硝化过程和固氮 过程等；氮循环过程不同，需要的条件也不相同，进而又导致不同氮转化反应空 间分布不同【2 1 。 硝化作用是氮素生物地球化学过程的重要环节，是生态系统中氮素损失的潜 在途径【3 1 深入理解该过程对于探讨湿地氮源污染的去除、湿地生态系统生产力 以及氮素界面过程具有重要意义【4 1 。氨氧化菌( a m m o n i ao x i d i z i n gb a c t e r i a , a o b ) 参与氨氮到亚硝酸盐的好氧氧化过程，能够降低n h 4 + 的毒性，是硝化作 用的起始阶段，也是硝化作用的限速步骤，同时，在湿地土壤环境中，氨氧化菌 生产的亚硝酸盐能够被亚硝酸盐氧化菌氧化，使这些区域的亚硝酸盐浓度保持较 低水平嗍。环境因子对氨氧化菌群的影响能够通过氨氧化菌的数量及群落迁移变 化反映出来，影响因子众多，主要有p h 、有机氮含量，盐度，植物以及辽河口 典型环境因子石油浓度等，辽河口湿地土壤盐渍化比较严重，国际环境科学与生 态学重大领域联合报告把含盐量作为9 个影响湿地痕量物质地球化学循环的重 要基本参数之一；此地区拥有辽河油田，石油开采和加工业比较发达，由此造成 石油污染比较严重；近年来在湿地中发展河蟹养殖，芦苇的收割等，致使土壤的 养分变化较大，部分地区退化比较严重，出现了裸滩区。在这些因子单独或联合 的作用下氨氧化菌群的变化规律存在不同程度的差异。目前，人们对辽河河口湿 地的相关研究主要集中在植物、动物特别是鸟类研究方面以及对土地利用和资源 保护的探讨，但对该地区土壤微生物方面的研究工作很少，缺乏相应的研究和资 辽河口氨氧化菌群落特征及影响因素研究 料【6 ，7 】，尤其是硝化细菌群落结构方面目前尚未见报道。 本文以辽河口退化湿地壤为研究对象，运用传统微生物培养方法和分子生 物学方法，研究a o b 群落结构和a o b 数量在不同月份和不同地理区域的分布 特征和变化规律，以及通过现场模拟，重点研究探讨盐度等典型环境因子对a o b 群落结构和a o b 数量的影响。以期进一步探索辽河口湿地氮循环中的关键环节， 增加对氮循环相关微生物氨氧化菌群多样性的了解，丰富了环境与氨氧化微生物 之间关系的理论研究，为进一步合理开发辽河口湿地的微生物资源，保障和恢复 河口湿地的生态健康提供理论依据。 2 辽河口氨氧化菌群落特征及影响因素研究 1 综述 1 1 湿地涵义及功能 1 1 1 湿地和滨海湿地 1 9 7 1 年，全球政府间的湿地保护公约关于特别是作为水禽栖息地的国际 重要湿地公约( 简称湿地公约) 中给湿地下了一个广泛的定义，即：“湿地 是指天然的或人工的、长久的或暂时性的沼泽地、湿原、泥炭地或水域地带，带 有静止的或流动、或为淡水、半成的、咸水水体者，包括低潮时水深不超过6 m 的海域，”它是一种处于陆地生态系统与水生生态系统之间的重要生态系统，是 水、陆生态系统之间的生态交错带，兼具二者属性，但又具有不同于二者的独特 特性【8 】。天然湿地能够涵养水源、储存径流，改善相邻水体水质状况，可以通过 物质循环，即受污水体中发生的微生物硝化、反硝化作用，生物量吸收以及沉积 物得吸附等作用，有效减少水体中氮浓度【9 , 1 0 1 ，成为地球表层最重要的生态系统 之一。滨海湿地是指低潮时水深6 m 以内的海域及其沿岸海水浸湿地带，是重要 的湿地类型和海洋中重要的地理单元，在海洋环境与海洋资源中的地位显著，具 有很高的综合价值和广阔的开发前景h l 】： ( 1 ) 滨海湿地作为一种空间区域，宜于多种鱼类、贝类、底栖动物等水生生物 和鸟类等的栖息繁衍。生物资源量高、生物多样性丰富，且有不少珍稀、濒危物 种的分布，是天然的基因库，是科学研究的理想场所；为海水养殖、盐业生产、 围垦造地等能够创造巨大经济价值的活动提供场所；且以其独特景观和美学价 值，成为旅游观光和娱乐活动的场所。 ( 2 ) 滨海湿地是高生产力的生态系统，能够提供丰富的动植物产品。由于特殊 的自然地理条件，使得天然湿地具有很高生产力，我国的滨海湿地每年为沿海地 区提供数十万吨水产品，还提供数量可观的用作造纸原料和建材的芦苇，以及用 作饲料的海草等。并以其独特的地理位置及植被，减轻和防止海浪对海岸线的侵 蚀，使建筑物、农作物及其他植被免遭强风和盐风等的破坏。 ( 3 ) 湿地的重要生态功能之一就是去除污染物，工农业生产带来的大量工业污 3 辽河口氨氧化菌群落特征及影响因素研究 染物、农药、营养盐及有毒物质等，随地表径流进入湿地，通过湿地的生化作用 使污染物得到降解和转化【1 2 】。 1 1 2 研究背景和研究意义 河口湿地位于河流入海的三角洲地区，河口湿地具有巨大的生态系统服务功 能，涵养净化水源，去除污染物、为野生动物提供栖息地以及调节大气组分等， 其它生态系统无法替代，因此湿地被称为“地球之肾”【1 3 】，并且河口湿地往往具备 优越的区位、丰富的水资源、油气资源、港口资源以及多样的湿地资源，具有非 常重要的经济地位，因此受到人类活动影响较大【1 4 】。这个地区汇集了来自上游的 所有物质，是上游水体环境变化的放大体现。有研究表明，来自人为向海洋的氮 的输入已经大大超过了它的天然输入，这些高负荷的氮素大多滞留在河口与近岸 地带【”】；辽河1 ：3 湿地位于辽河下游入海1 2 1 ，1 2 1 0 3 4 一1 2 2 0 2 97 e 和4 0 0 4 l 4 1 0 2 7 n ， 地貌上属冲洪积、海积三角洲。该地属温带半湿润的季风气候，年平均温度8 5 ， 年平均降水量为6 0 6 m m 。区域内双台河口自然保护区是全国最大的湿地自然保 护区，区内以苇田、沼泽草地、滩涂为主，因为此区域是东亚至澳大利亚水禽迁 徙路线上的中转站和目的地，所以区域内生活着大量的野生动物，如丹项鹤、黑 嘴鸥、白鹳及白鹤等多种珍稀水禽；区域内滩涂辽阔，饵料丰富，为野生动物提 供了生活、栖息、繁殖的好地方；双台河口湿地在国际湿地及湿地生物多样性保 护中居于重要位置，维系着生态平衡，是重要的野生生物物种基因库【1 6 1 。然而， 近年来，辽河口湿地在自然，主要是人为因素的影响下，生态功能正在退化，主 要表现在： ( 1 ) 辽河口湿地面积发生了变化。近年来，河口自然湿地遭到耗竭和破坏， 转换成农耕地、工业用地以及用于城镇发展。 ( 2 ) 湿地生态功能改变。随着自然湿地面积的不断减少，湿地调洪蓄水能 力不断下降：随着人类行为的不断介入，湿地自然景观斑块出现破碎化，生态环 境的多样性逐渐降低，依赖于湿地生存的生物多样性大大减少：人类活动也导致 湿地水禽栖息地面积急剧缩小【1 1 。 ( 3 ) 湿地生物产量发生变化。近年来由于连年干旱，灌溉供水不足，以及 石油污染的影响，苇田沼泽退化严重；辽河口滩涂湿地上的翅碱蓬因海水盐度增 4 辽河口氨氧化菌群落特征及影响因素研究 高的影响，出现大面积减少；近年来农业的扩展和石油开采强度的增强，对在此 处停歇和栖息繁殖的野生动植物产生了巨大的影响。 高强度的人为干扰，是河口区域生态环境的重要特征，特别是氮、磷营养盐 过剩、围垦等已成为河口地区日益突出的问题。工业生产过程中产生的有毒有害 物质，农业中化肥和农药的过量使用，致使水体中含有过量的污染物的营养物质， 引起水体污染和富营养化，目前辽河区域水体处于劣v 类水平。河口湿地为解 决这一问题提供了广阔的前景。 在国家经济快速发展的基础上对中国滨海湿地的研究应该保持同步快速发 展，使其成为今后经济发展、环境保护和人地协调进步研究中必不可少的重要组 成部分。本研究的目的是弄清湿地氮循环中重要环节一氨氧化菌群落结构的分布 和迁移变化，以及盐度等环境因子对其群落数量和结构的影响机制，结合氨氧化 速率的研究，对减少湿地有机氮污染、缓解环境压力、了解和预测氨氮变化趋势 等具有重要意义，并进一步丰富了湿地氮循环理论：氨氧化菌群比高等动植物更 易于指示环境状况变化，通过了解其再不同盐度下的生长状况，对节省修复湿地 过程中所需淡水资源方面有重要参考价值。 1 2 湿地生态系统氮循环 氮是构成蛋白质、核酸等生命基础物质的重要元素，被称之为生命元素，它 是氨氧化菌存在的保证，是决定氨氧化菌种群结构的主要因素之一。氮在自然界 中以多种形式存在，这些形态处于不断的循环转化之中，这些不同形态的转化， 除了一些物理和化学的因素之外，微生物起着重要的促进和推动作用。尽管n 元素在大气圈中含量最高，但在大多数生态系统中，是植物光合作用和初级生产 过程中最受限制的元素之一【埔】，大除c 、h 、o 外，大多数植物和其他有机体对 n 元素的需求是最大的【1 9 1 ，因此研究n 元素在生态系统中的循环具有重要的意 义。自然界中的n 循环包括五个过程： ( 1 ) 同化作用：植物或微生物通过吸收氨盐、氨或硝酸盐等无机盐，把它 们同化为有机体内的蛋白质、核酸等有机含氮化物的过程； ( 2 ) 矿化作用：微生物降解含氮有机物并释放出氨的过程： ( 3 ) 硝化作用：硝化细菌将氨氧化为硝酸的过程； 辽河口氨氧化菌群落特征及影响因素研究 ( 4 ) 反硝化作用：在厌氧条件下，硝酸盐被微生物还原成气态氮( n 2 或 n x o ) 的过程； ( 5 ) 固氮作用：固氮微生物将大气中的氮还原成氨的过程。 1 3 硝化作用 图i - i 湿地氮循环过程图刚 硝化作用在自然界的n 素生物地球化学循环中具有重要的意义【2 1 矧，它可 以减轻环境中氨态氮的生态毒性。硝化作用一般分为两个阶段，分别由两种不同 的微生物类群来完成【2 3 】：先由a o b 把n i - h + n 氧化为n 0 2 - n ，再由n 0 2 - n 氧 化细菌( n i t r i t e - o x i d i z i n gb a c t e r i a n o b ，硝化细菌) 把n 0 2 - n 氧化为n 0 3 - n ， 生成的n 0 3 n 可以进一步通过反硝化作用生成n 2 0 n 2 而去除环境中的氮。 n i - h + - n 氧化细菌和n 0 2 - n 氧化细菌有自养和异养之分，在不同的环境中它们所 占的比率不一样。 硝化和反硝化作用是自然界氮素循环的重要环节，在其生物化学作用过程中 能够产生n 0 2 一、n 2 0 、n o 和n 0 2 等氮氧化物及含氮化合物，不仅导致氮肥损 失，而且是水和大气污染的重要来源【2 4 】，所以对硝化和反硝化作用的研究成为自 然界氮循环领域的研究热点。 6 辽河口氨氧化菌群落特征及影响因素研究 1 4 氨氧化菌概述及其研究方法 1 4 1 氨氧化细菌概述 氨氧化微生物在促进生态系统的氮循环、缓解环境压力、保持生态环境健康 中发挥着巨大作用。并且，氨氧化细菌作为单细胞微生物，是环境变化的敏感指 标，比大型动植物更易于指示环境状况的变化【2 5 1 。h o r z 等在贾斯珀嵴全球变化 实验( g r g c e ) 的研究中发现氨氧化细菌的群落结构和丰度对模拟的全球变化如 温度、c 0 2 浓度、降水量和氮肥等的变化有明显的响应【2 6 1 。硝化作用的微生物代 谢包括氨氧化作用和亚硝化作用两个过程，分别由氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化菌 两类微生物催化进行。氨氧化作用是硝化作用的第一步，也是限速步骤，涉及到 的微生物类群主要为自养氨氧化细菌b - p r o t e o b a c t e r i a 和 t - p r o t e o b a c t e r i a 两个纲 t 2 7 1 。大多数可培养的氨氧化细菌属于b - p r o t e o b a e t e r i a 纲，且在大多数环境中占 主导。氨氧化菌存在于土壤、淡水、海水、河口区和沉积物等一系列多样环境中， 因此受到广泛关注，但是只占细菌的极少部分。生长的最适p h 值为7 0 8 5 ，生 长的最适温度为2 4 - - 2 8 c 1 2 趴。 1 4 2 氨氧化菌的研究方法 传统的硝化细菌生态学研究方法，主要是根据细胞的形态构造和生理生化特 点对细菌进行富集、筛选和分离，且硝化细菌的生长非常缓慢，并且许多物种难 以培养或分离，因此难以对其进行深入的研究：又因为分离培养的菌种不能代表 环境中细菌的真实多样性【2 9 1 ，因此，用传统方法研究硝化细菌往往不能反映自然 环境样品的真实情况。分子生物学手段能够从分子水平上揭示微生物的多样性和 群落结构，能够认识生物物种分化的内在原因和物质基础，因此使氨氧化细菌生 态学的研究进入了一个崭新的阶段。 1 4 2 1 氨氧化菌数量的研究方法 环境中氨氧化细菌的数量的确定方法，目前主要有传统培养法最大或然法 ( m p n ) ，以及分子生物学方法。m p n 广泛用于计算氨氧化细菌的数量，由于氨 7 辽河口氨氧化菌群落特征及影响因素研究 氧化细菌在琼脂平板培养基上一般不生长，而在液体培养基中则很容易检测到， 因此可以通过将样品稀释成一定浓度后接种于液体培养基里，用统计学方法计算 样品的含菌量；接种后的培养基在一定温度下培养一定天数后用g r i e s s 试剂检测 氨氧化细菌，出现红色管者为亚硝化菌阳性管，根据出现的阳性管数，查m p n 指数表，再换算成样品中含氨氧化细菌的菌数：m p n g r i e s s 法是测定氨氧化细 菌的经典方法，采用这种方法可以准确地定性定量氨氧化细菌的丰度【3 0 1 。 分子生物学方法中目前有基于p c r 技术的方法，包括竞争p c r 和实时p c r ， 但容易受到p c r 扩增过程的影响：也可以利用1 6 sr d n a 或者a m o a 核酸序列 设计特异性探针，然后结合特殊荧光标记在荧光显微镜下进行计数，但容易受到 样品自身荧光以及探针特异性的影响【3 1 1 。 1 4 2 2 氨氧化菌群落结构的分子生物学研究方法 ( 1 ) 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i th y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 技术是用标记有荧 光分子的一小段d n a 或r n a 序列为探针，在合适的温度和盐离子浓度条件下， 原位与组织细胞内染色体上的互补序列特异性地退火结合而不破坏染色体的整 体形态，以便在显微镜下观察到此特异的核酸序列及其在染色体上的位置的一种 基因定位方法【3 2 1 。其基本原理是用已知标记单链核酸为探针，按照碱基互补原则， 与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由 于d n a 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可用探针直接与染 色体进行杂交从而将特定的基因定位在染色体上【3 3 1 。与传统放射性标记原位杂交 相比，荧光原位杂交具有安全、快速、灵敏度高、检测信号强、杂交特异性高、 能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示间期核【蚓。应用 f i s h 技术，结合相差显微镜和共聚焦显微镜的图像叠加，s c h r a m m 等【3 5 1 对硝化流 化床反应器中活性污泥内硝化细菌的空间分布进行原位分析。实验结果显示了氨 氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌紧密结合在一起的形态特征。s l i e k e r s 等【3 6 】采用 f i s h 技术对c a n o n 工艺调试过程中的优势菌种变化进行研究的结果表明：在厌 氧运试阶段，以亚硝化菌或硝化茵的核酸探针检测，没有在污泥中检出亚硝化细 菌和硝化细菌( 检测限l ) ，以厌氧氨氧化细菌的核酸探针检测，大部分细胞呈阳 性反应，污泥中的厌氧氨氧化菌占8 0 左右：在限氧运行7 周后，同等测试结果 8 辽河口氨氧化菌群落特征及影响因素研究 显示活性污泥中的亚硝化菌与厌氧氨氧化菌所占的百分率分别为4 5 和4 0 ，而 硝化茵则未被检出。由此推断：在限氧条件下，硝化细菌不能与亚硝化细菌竞争 氧，也不能与厌氧氨氧化菌竞争亚硝化盐。当然f i s h 技术也存在一些缺点：f i s h 检测的假阳性和假阴性两种状况；荧光信号弱、分辨率不高；对某些细胞壁的穿 透性差、生长缓慢的微生物细胞难以检测到等。 ( 2 ) 单链构象多态性分析技术 单链构象多态性分析( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m s ，s s c p ) 技术为检测基因的单个碱基置换和某一片段d n a 突变的筛查提供了有效而快 速的手段。其基本原理是单链d n a 片段中碱基的改变，进而使其构象发生改 变，而空间构象有差异的单链d n a 分子会在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈 现不同的带型，从而非常敏锐地区分大小相同但二级结构不同的p c r 产物【3 7 1 。 s a b i n e 等 3 8 】人用该法研究微生物群落的演替和菌种的多样性，并同传统的培养 方法比较，指出s s c p 方法避免了传统培养的费时费力以及误差大的于扰，适 合对微生物群落结构和演替的分析。同样，这种方法也使用于湿地硝化细菌种 类和群落结构和演替的动态分析。生物滤器中最丰富的微生物是异氧菌。借助 生物作用处理石化废水，x i e b 等【3 明采用p c r s s c p 分析技术证实了b a c i l l u s 和p s e u d o m o n a s 种是生物滤器中的优势菌，其s h a n n o n - w i e n e r 多样性指数指标 的增加表明在滤器中的微生物群落相对于污染物的迁移变的更加稳定：随着处 理进展，通过电子观测资料发现生物群系中的生物量和生物膜增加。该技术存 在的缺点是：不能对d n a 序列变异进行精确的定位，而只能对其进行初筛， 需要结合序列分析才能确定变异的位置及内容；对大于3 0 0 b p 的d n a 片段， 随着d n a 片段长度的增加其检测的敏感性逐渐降低；实际应用中可能会遇到 相当比例的假阴性结果，有些突变在通常条件下可能不被检出；p c r s s c p 分 析结果易受多种因素如电泳温度、离子强度、凝胶浓度、甘油的浓度和交联剂 亚甲基双丙烯酰胺的浓度等的影响：在室温、通风冷却条件下的电泳，少量片 段的条带难以分离等。 ( 3 ) 变性梯度凝胶电泳技术 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i 锄tg e le l c c t r o p h o r c s i s ，d g g e ) 目前是 研究微生物群落遗传多样性及种群动态性的有效手段。m u z y e r 等【删首次将d g g 9 辽河口氨氧化菌群落特征及影响因素研究 e 技术应用于微生物生态学研究，并证实这种技术在研究自然界微生物群落遗传 多样性和种群差异方面具有明显的优越性。其基本原理是利用梯度变性胶来分离 d n a 片段，d n a 在胶中的迁移速率与分子大小有关；不同序列的d n a 片段在 相应的变性剂浓度位置解链、变性、停滞，经过染料染色后在凝胶上呈现一定的 条带。b e a t r i z 等分别采用d g g e 技术和克隆文库r f l p 技术对地中海东南海域 不同深度和不同位点海洋微生物群落多样性进行研究，发现两者对相同样品分析 结果基本一致，说明d g g e 技术是一种相当有效的研究自然环境中微型真核生 物群落多样性的分子生物学方法【4 。曾薇、杨庆等嗽1 采用p c r - d g g e 对s b r 大型中试反应器、u a s b a o 小型反应器和a o 中试反应器的污泥样品中的a o b 做初步定性分析，结果显示3 种短程脱氮系统中的a o b 均以n i t r o s o m o n a s 1 i l ( e 为主，与p c rc l o n i n gs e q u e n c i n g 分析结果相似。苏俊峰等 4 3 】利用p c r - d g g e 指纹图谱对从污水处理系统中筛选的6 株异样硝化细菌进行分析，在反应器 运行的不同时期，微生物群落结构发生动态演替：第2 天与第1 5 天的相似性为 4 7 6 2 ，第1 5 天与第3 0 天的相似性最高为7 2 ，第2 天与第3 0 天的相似性最 低为4 2 8 6 ；测序结果显示反应器稳定运行期间，筛选的异氧硝化细菌w g y 5 和w g y 2 1 是系统的优势菌群。 d g g e 检测方法的优点是：突变检出率高；检出片段可达l k b ，尤其适用 1 0 0 5 0 0 b p 的片段；加样量小，仅需1 5 n g 的d n a ；操作简便，快速；重复性好 等【6 】。缺点是：分离较小的片段效果好，而大片段的分离效率下降，增加引物设 计和系统发育分析的难度；d g g e 图谱中同一的条带有时候并非只是代表同一种 菌株，或者同一位置不同泳道的条带可能代表不同的细菌，s e k i g u e h i 等在实验中 发现d g g e 图谱中的单一条带不能被测序，对带中d n a 进行克隆和基因文库研究 发现，此条带中包含多条不同的d n a 序列【删；d g g e 通常只能检测到占整个细菌 群落数量1 或以上的优势种群的1 6 sr d n a 片段 4 s l ；某些菌种的1 6 sr d n a 不同 拷贝之间存在多态性问题，可能造成自然群落中细菌数量比实际要多m ；由于 d g g e 技术对基因数据库的依赖性，限翻j t d g g e 的发展和使用【4 7 1 。实验中，可 通过对d g g e 的每一个环节进行优化和改进，提高d g g e 技术的可靠性和应用范 围。 ( 4 ) 末端限制性片段长度多态性 1 0 辽河口氮氧化菌群落特征及影响因素研究 t l 强l p ( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，t r f l p ) 技 术以分子系统学的原理为基础，综合运用- j p c r 技术、d n a 限制性酶切技术、荧 光标记技术和d n a 序列自动分析技术，在d n a 水平上通过对特定核酸片段长度 多态性的测定来分析比较微生物群落结构和功能【3 2 】。张丽娜等对红壤荒草地中的 氨氧化细菌进行富集，通过d n a 提取、p c r 扩增后建立特异性1 6 sr d n a 文库， 用酶h h a1 和r s a1 对该文库特异性片段进行了l 强l p 分析，其中优势克隆片段类 型占所有分析克隆子的9 4 ，测序后发现该氨氧化菌富集液文库中存在大量亚硝 化单胞菌属( n i t r o s o m o n a s ) 细菌，由此推测红壤荒草地中该属细菌在富集条件下 成为优势菌【4 鲫。p e t e r s e n 等比较正常土壤中和受铜污染的土壤中真细菌和特殊类 群微生物的t r f s 后，发现土壤中的铜能够对整个真细菌、根瘤菌、土壤农杆菌 类群微生物的结构产生很强的影响【4 9 1 。与其它指纹图谱技术相比：t 1 心l p 的分 辨率和精确度较高，通过快速产生产生大量重复、精确的数据获得高通量；预装 于d n a 测序仪中的片段分析软件能够自动将电泳结果数字化并以表格方式输 出，不需要将指纹图谱再数字化的的复杂程序，就能对大量信息进行快速分析； 将获得的末端限制性片段的长度与现有数据库进行比对，可能直接鉴定群落的单 个菌种【矧。 但同时它又有自身的局限性：t r f l p 技术无法摆脱实验进程中p c r 扩增这 一程序中的技术缺陷，例如微生物群落中不同菌种d n a 的差异性扩增，目标d n a 在菌种间拷贝数的差异等，使分析结果很难准确反映微生物群落的多样性以及物 种间的相对丰度的信息5 1 , 5 2 1 ；实验过程中影响因素较多，每个因素或者因子联合 都可能直接或间接对t r f l p 图谱产生影响；该指纹图谱技术只能检测到带有荧 光标记的末端限制性片段以及酶切后t r f 的长度分布，容易低估环境中微生物 群落的多样性：测序仪对5 0 0b p 以上的t i 强的检测精度达不到，造成检测分辨率 明显下降【5