（化学工程专业论文）米根霉3242发酵玉米淀粉制l（）乳酸的研究.pdf

摘要 乳酸是一种重要且应用广泛的有机酸，乳酸、乳酸盐及其衍生物，广泛应用 于食品、医药、饲料、环保和化工等领域。聚l 乳酸为无毒的生物降解塑料， 可以被微生物彻底分解成c 0 2 和h 2 0 ，因此聚乳酸消除了p v c 、p p 塑料造成的 “白色污染”，对于解决白色污染这样的环保问题有着重要意义。 本文以玉米淀粉为原料，研究了米根霉间歇发酵l - - 孚l 酸的最佳种子培养基 和最佳发酵培养基，确定了碳源浓度、氮源与不同氮源浓度、磷酸盐、温度以及 p h 值等的最优值，并且研究了搅拌速度和通气量对乳酸发酵的影响。确定的最 佳种子培养基( g 七。1 ) 为：葡萄糖5 0 0 ，( n h 4 ) 2 s 0 42 0 ，k h 2 p 0 40 3 0 ，z n s 0 40 5 0 ， m g s 0 40 5 0 ，最佳培养温度3 4 。c ，c a c 0 3 添加量为1 0 0g - l ，装液量7 0 m l ( 5 0 0 m l ) 三角瓶，培养时间为3 0 h ；最佳发酵培养基为：玉米淀粉1 0 8 0 9 l ， ( n h 4 ) 2 s 0 45 9 l 1 ，k h 2 p 0 40 3 0 9 l 一，z n c l 20 6 0 9 l _ 1 ，m g c l 20 3 0 9 l ，最佳发 酵温度为3 4 。c ，接种量为1 2 ，发酵的p h 值控制在5 5 - - 6 0 范围内，转速为 1 9 0 r m i n ，通气量为3 v v m 。 发酵动力学方程对优化生产条件、研究生化反应过程机理具有非常重要的意 义，本文对米根霉发酵l 乳酸的动力学模型进行了构建。通过经典的l o g i s t i c 模 型确定了米根霉细胞生长动力学方程，通l u e d e k i n g p i r e t 方程联系l o g i s t i c 方程 确定了l 乳酸产生动力学方程，通过葡萄糖质量守恒，联系l o g i s t i c 方程确定了 葡萄糖底物消耗动力学方程，这三个方程能准确的描述发酵过程中不同时间的菌 体生长情况、产酸情况和底物消耗情况，对优化发酵条件有一定的指导作用。 关键词：米根霉乳酸发酵动力学 a b s t r a c t l a c t i ca c i di sa l li m p o r t a n to r g a n i ca c i dw i t he x t e n s i v eu s e l a c t i ca c i d ，l a c t a t e a n dt h e i rd e r i v a n t sa r eu s e di nm a n yf i e l d ss u c ha sf o o di n d u s t r y , m e d i c i n ep r o d u c t i o n ， f o o di n d u s t r y , e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na n dc h e m i c a li n d u s t r y p o l y ( l - l a c t i ca c i d ) ，a 1 1 b i o d e g r a d a b l ep l a s t i cw i t h o u tt o x i c i t y , c a l lb et h o r o u g h l yd e c o m p o s e di n t oc a r b o n d i o x i d ea n dw a t e rb yo r g a n i s m s op o l y ( l - l a c t i ca c i d ) s l a k e s w h i t ep o l l u t i o n c a u s e d b yp v c ，p pp l a s t i ca n d h a s ag r e a tm e a n i n gt os e t t l ew h i t ep o l l u t i o np r o b l e m 1 1 1 eo p t i m u mc u l t u r ea n dp r o d u c t i o nc o n d i t i o no fl a c t i ca c i db a t c hf e r m e n t a t i o n f o rr h i z o p u so r y z a eb yc o r n s t a r c hi ss t u d i e di n t h i sp a p e r s e v e r a lf e r m e n t a t i o n o p t i m u mc o n d i t i o n si n c l u d i n gc a r b o ns o u r c ec o n c e n t r a t i o n ，n i t r o g e ns o u r c ea n di t s c o n c e n t r m i o n ，p h o s p h a t e ，t e m p e r a t u r ea n dp ha r ed e t e r m i n e di n t h ee x p e r i m e n t m e a n w h i l e ，e f f e c t so fr o t a t i o ns p e e da n da e r a t i o nq u a n t i t a t i v et of e r m e n t a t i o na r ea l s o s t u d i e d t h eo p t i m u ms e e dc u l t u r e ( g - l 1 ) i s ：g l u c o s e5 0 0 ，( n h 4 ) 2 s 0 42 0 ，k h 2 p 0 4 0 3 0 ，z n s 0 4o 5 0 ，m g s 0 40 5 0 a n dt h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o ni s ：3 4 ，7 0 m li n 5 0 0 m lf l a s kf o r3 0h o u r sw i t hc a c 0 310 0g l t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n i s ：c a r b o ns o u r c ec o n c e n t r a t i o n1 0 8 0g l 一，( n h 4 ) 2 s 0 45 9 - l ，k h 2 p 0 40 3 0 9 l 一， z n c l 20 6 0 9 l ，m g c l 20 3 0 9 l 一a n dt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ea n d i n o c u l u mc o n c e n t r a t i o na r e3 4 ca n d12 s e p a r a t e l y t h ep ho fz y m o t i cf l u i di s c o n f i n e dw i t ht h er a n g eo f5 5t o6 0 f i n a l l yt h eo b t a i n e da g i t a t i o nr a t ea n da e r a t i o n r a t ea r el9 0 r m i n a n d3 v v ms e p a r a t e l y d y n a m i c se q u a t i o no ff e r m e n t a t i o ni ss i g n i f i c a n tt oo p t i m i z et h ec o n d i t i o n so f p r o d u c t i o na n ds t u d yt h er e a c t i o nm e c h a n i c so fb i o c h e m i s t r y a m a t h e m a t i c a lm o d e l o fl 1 a c t i ca c i df e r m e n t a t i o ni se s t a b l i s h e di nt h i st h e s i s t h ed y n a m i c se q u a t i o no f r h i z o p u so r a z a ec e l lg r o w t hi so b t a i n e df r o mt h ec l a s s i c a ll o g i s t i cm o d e l m e a n w h i l e ， t h ed y n a m i c se q u a t i o n so fl a c t i ca c i dp r o d u c ea n do fg l u c o s ec o n s u m p t i o na r e e s t a b l i s h e df r o ml u e d e k i n g p i r e te q u a t i o na n dm a s sc o n s e r v a t i o nw i t hl o g i s t i c m o d e ls e p a r a t e l y t h e s et h r e ee q u a t i o n sc a na c c u r a t e l yf o r e c a s tt h em y c e l i u mg r o w t h ， l a c t i ca c i dp r o d u c eo ft h ez y m o t i cf l u i da n dg l u c o s ec o n s u m p t i o n ，w h i c hc a ng u i d e t h eo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n k e yw o r d s ：r h i z o p u so r y z a e ，l a c t i ca c i d ，f e r m e n t a t i o n ，m a t h e m a t i c a lm o d e l s 符号说明 意义 非结构型动力学模型参数 最大比生长速率 l 乳酸的生成系数 最大菌体浓度 菌体浓度 初始菌体浓度 饱和常数 维持系数 l 乳酸浓度 初始l 乳酸浓度 葡萄糖的浓度 初始葡萄糖的浓度 细胞生长得率系数 产物生成得率系数 计量单位 k 1 g l - 1 g l 一1 。g - l 一1 g l 一1 g l 一1 g l _ 1 g l 1 g l - 1 犄久ag岛k m p s & k 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其它人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼太堂或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：穆理强 签字日期： j 。7 年c 7 月驴日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丞洼太堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丞洼太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：税卫翠 导师签名： 签字日期：加叮年c 7 月de l 剖 签字同期：噼9 月f - d 同 签字同期：耻乃净p 月厂d 同 f 。 第一章文献综述 1 1 乳酸的结构与性质 第一章文献综述 乳酸是一种天然有机酸，是三大有机酸之一，1 8 8 1 年美国科学家首先将乳酸 中提取的乳酸菌用于大规模的乳酸生产i l j ，迄今已有一百多年的历史，之后乳酸 的提取和生产一直成为各国科研人员研究的课题。乳酸英文名为l a c t i ca c i d ，学 名为a 羟基丙酸( 2 羟基丙酸) ，其分子式为c h 3 c h ( o h ) c o o h ，它是一种简单 的羟基酸，乳酸的相对分子质量为9 0 0 8 ，相对密度在2 5 时约为1 2 0 6 。乳酸 分子中有一个不对称的碳原子，因此具有光学异构现象，具有l 型和d 型两种 构型，其结构式表示如下： c l o o h h o c h c h 3 l 一( + ) - 乳酸 c h 3 d ( 一) 哥l 酸 图1 - 1l 一( + ) 一乳酸和d - ( 一) - 乳酸结构式 f i g 1 - 1s t r u c t u r a lf o r m u l ao f l - ( + ) - l a c i t ca c i da n dd - ( 一1 - l a c i t ca c i d l 乳酸为右旋性，但l 乳酸盐或酯却是左旋的；d 一乳酸为左旋性，而d 乳 酸盐或酯是右旋的；当l 一乳酸和d 乳酸等比例混合时，即形成外消旋的d l 乳 酸。乳酸异构体的性质如表1 1 所示。 表1 - 1 乳酸异构体的性质 熔点 比旋光度沸点解离常数熔化热 构型 仅譬 ( 2 5 c ) ( k j m o l 。1 ) l 2 5 2 6 + 3 3 0 1 3 7 x 1 0 _ 41 6 8 7 d2 5 2 6 - 3 3 0 1 3 7 x 1 0 一1 6 8 7 d l1 8 0 1 2 2 ( 1 8 6 6 2 p a ) 1 3 7 x 1 0 _ 41 1 3 5 第一章文献综述 纯净的无水乳酸是白色的晶状固体，乳酸可与水完全互溶，很不容易结晶析 出，为无色或浅黄色粘稠状液体，无气味，味微酸，具有吸湿性，水溶液呈酸性 反应：它能与水、乙醇、甘油或乙醚任意混合，不溶于氯仿、二硫化碳和石油醚。 乳酸在常压下蒸馏即可分解，浓缩至5 0 时，部分变成乳酸酐；当乳酸浓度达 6 0 以上时，就有很高的吸湿性。在6 7 1 3 3 p a ( o 5 1 0 m m h g ) 的真空条件下 反复分馏，可以得到高纯度的乳酸进而获得单斜晶体的结晶乳酸。 乳酸可分为工业级、食品级和药典级。工业级乳酸是含量5 0 9 0 的乳酸 溶液，具有吸湿性，煮沸浓缩时，乳酸缩合为乳酰乳酸和2 一乳酰羟基丙酸，加热 稀释又转化为乳酸，食品级的乳酸含量为8 0 以上，药典级的乳酸含量为8 5 o 9 0 0 【2 l 。 在水溶液中，乳酸( 缩写为h l a 或l a h ) 解离为质子h + 及乳酸根阴离子l a 一， 解离平衡时的解离量与溶液p h 及乳酸的p k a 有关，当溶液的p h 等于乳酸的p k a 时，约有一半乳酸原料以解离的形式存在；当p h 值大于p k a 时，乳酸大部分呈 解离形式；当p h 值小于乳酸的p k a 时，将有大量乳酸呈非解离态( 也称为酸的 形式) 。乳酸原料的p k a 可变化，例如，在2 5 时，其p k a 为3 8 6 ，在5 c 时， p k a 约为3 8 9 。另外，当乳酸浓度增大时，p k a 将降低，反之将升高，但其值一 般在3 4 7 7 3 4 9 的范围内。 由于乳酸含有一个羟基和一个羧基，因此它可以参与多种反应，如氧化反应、 还原反应、缩合反应和酯化反应等1 3 j 。由于乳酸分子内有羟基和羧基，所以有自 动酯化能力，乳酸浓度越高，这种趋势就越强，一般浓乳酸溶液中2 0 或更多 的乳酸自动酯化生成直链形式的乳酰乳酸的聚合体，又称聚乳酸。其反应可表示 为： n c h 3c h o c o o h ；3 - - n 2 v 、 h o c ( c h3 ) c o 】。h + ( 力一1 ) h2o 所以乳酸通常是指乳酸和乳酰乳酸的混合物。这样，在表示乳酸浓度时，往 往用游离酸和总酸( 包括水解后方能滴定的聚合物形式的总酸度) 来表示。 1 2 乳酸的应用与供需状况 1 2 1 乳酸的应用 乳酸是一种古老而重要的有机酸，乳酸、乳酸盐及其衍生物，广泛应用于食 品、医药、饲料、环保和化工等领域。 由于人体只具有代谢l 乳酸的l 乳酸脱氢酶，因此只有l 乳酸能被人体完 全代谢，在体内分解为氨基酸和二羧酸物，且不产生任何有毒、副作用的代谢 第一章文献综述 产物：经机体实验证明：d l 一乳酸可以使机体中的肝里的肝糖增高，d 一乳酸会 使血中乳酸盐增高，由尿液排出体外，因此，若过量食用d 一乳酸或d l 乳酸， 会导致尿液中酸度升高，引起代谢紊乱甚至导致中毒，所以世界卫生组织提倡 使用l 乳酸作为食品添加剂和内服药品，取代目前普遍使用的d l 乳酸。因此 在食品、酿造和医药行业中应使用l 乳酸，而在其它行业中可任意使用三种构 型的乳酸。 、 1 2 1 1 乳酸在食品工业中的应用 一般食品工业用含量为5 0 的乳酸作酸味剂、防腐剂、p h 值调节剂和食品 强化剂，乳酸可用于清凉饮料、糖果、糕点的生产，也可用于鱼、肉、蔬菜的加 工和保藏。 表1 2 乳酸及其系列产品在食品工业中的应用 t a b 1 2u s eo fl a c t i ca c i da n di t ss e r i a lp r o d u c t si nf o o di n d u s t r y 名称用途 l 一( + ) - 乳酸 抗菌剂、熏制、腌菜、风味剂 d 一( 一) - 乳酸 抗菌剂、熏制、腌菜、风味剂 d l 乳酸 增强剂、配料、p h 控制、溶剂和载色体 碳酸钙风味增强剂、固化剂、蓬松剂、营养补充剂、稳定剂、增 稠剂 乳酸亚铁营养补充剂、配制婴儿食品 乳酸钾 风味增强剂、风味剂、保湿剂、p h 控制 乳酸钠风味增强剂、风味剂、保湿剂、乳化剂 硬脂酰2 哥l 酸钙烘烤食品用面团质量改进剂、蛋制品中起泡剂、脱水马铃 薯中的调节剂 硬脂酰2 乳酸钠面团质量改进剂、乳化剂、烘烤食品加工助剂、牛奶或冰 淇淋代用品生产稳定剂、加工助剂、休闲食品调味汁 脂肪酸的乳酸酯食品乳化剂、增塑剂、表面活性剂 乳酸脂肪酸丙二醇甘食品乳化剂、增塑剂、表面活性剂 油混合酯 。 脂肪酸的甘油乳酰酯 食品乳化剂、增塑剂、表面活性剂 目前世界乳酸总消费中，食品工业约占6 0 。与柠檬酸、苹果酸等食用酸相 比，乳酸具有很强的竞争力。在啤酒制造上，美国禁止使用磷酸等无机酸调节 p h ，而全部改用乳酸。世界上四分之一的乳酸用来生产硬脂酰乳脂酸，它的盐 类( 硬脂酰乳脂酸钙( c s l ) 和硬脂酰乳脂酸钠( s s l ) ) ，大量用于面包加工， 第一章文献综述 不但使面包质地松软、细腻，而且可延长其保存期。人食入含有乳酸的食物，可 解除疲劳、松弛肌肉。 此外，聚乳酸是一种对人体无毒的乳酸聚合物，如果用聚乳酸代替发泡聚苯 乙烯加工一次性快餐饭盒，可大大减轻“白色污染”，由于聚乳酸饭盒具有良好 ，的生物降解性，埋在地下在微生物作用下会很快自动分解，故聚乳酸在食品行业 有广泛的应用前景。 1 2 1 2 乳酸在农业中的应用 由发酵获得的粗乳酸铵溶液，可直接作为反刍动物的饲料添加剂，增加人类 所需要的蛋白质。乳酸菌的发酵液若用水稀释后，可以浇灌水稻等农作物，具有 改良土壤、增加产量的效果，也可以直接作为药剂，喷洒于人工养殖的对虾等水 养殖场所，用以防治水产品的病害。 l 乳酸经过聚合可以生成直链的或者环状的聚乳酸，聚乳酸的一个潜在应用 价值在于作为农药和药物的可控制释放体系，2 , - 一2 0 个l 乳酸分子的聚合体是良 好的生物调节剂，可以制成蔬菜和水果的混合覆盖降解地膜。 1 2 1 3 乳酸在化学工业中的应用 乳酸可用来处理纺织纤维，可使之易于着色，增加光泽，使触感柔软，并且 乳酸可用于制革工业中的脱石灰，它能使石灰变成可溶性的乳酸钙而除去，使皮 革柔软、细密，从而制成高级皮革。乳酸在工业中作为p h 值调节剂，在毛纺业 中用于预铬媒染，以降低羊毛的铬酸盐含量并防止纤维氧化，在丝绸和人造丝中 起增艳作用。乳酸还可添加于烟草中，能保持烟草的湿度，提高烟卷的品质。 在化妆品和清洁卫生用品方面，乳酸和乳酸钠、乳酸钙可以提供保湿方面的 性能。乳酸同癸酸至硬脂酸( 十八酸) 范围内的脂肪酸反应，制得的酰基乳酸酯 是化妆品中和个人保养用品中有效的乳化剂，物料填充和稳定剂，起到保护皮肤 的作用，可改进由于年龄而造成的皮肤结构和外表的老化。 1 2 1 4 乳酸在环保中的应用 聚l 乳酸与其它材料共聚制成的生物降解塑料，可用作生产缓释农药，此种 塑料能延长农药的使用时间，且对农作物和土壤无毒害作用，因此可以提高农药 的使用效率。聚l 乳酸具有良好的初期机械性能，熔点约为1 7 0 ，其膜材对氧、 水汽有良好的透过性，又有较好的透明性，另外还具有较好的抗菌、防霉性，使 用寿命可达2 - - - 3 年；聚l 乳酸为无毒的生物降解塑料，可以被微生物彻底分解 成c 0 2 和h 2 0 ，因此聚乳酸消除了p v c 、p p 塑料造成的“白色污染，对于解 4 第一章文献综述 决白色污染这样的环保问题也有着重要意义，作为原材料的乳酸，正成为一种重 要的绿色平台化合物【4 。 1 2 1 5 乳酸在医药卫生行业的应用 乳酸，特别是l 乳酸，对人体和牲畜无害，而且具有很强的杀菌作用，其杀 菌能力是柠檬酸、酒石酸、琥珀酸的几倍。在1 0 糖液中加入3 柠檬酸或者酒 石酸、琥珀酸，放置2 一3 d 就腐败了。但是同时加入同量3 乳酸时，经过一个 月尚未出现异状i 1 | 。在含有1 0 糖液中，分别加入大肠杆菌、霍乱菌、伤寒菌， 糖液中加入0 1 乳酸，3 h 后，这些病菌全部死亡，这是其它有机酸无法竞争的【1 i 。 因而乳酸可以直接用作手术室、病房、实验室、车间等场所的消毒剂。 聚l 乳酸系无毒的高分子化合物，具有生物兼容性( b i o c o m p a t i b i l i t y ) ，在人 体内能被分解为能被人体代谢的l 乳酸，不起变态反应，它具有优异的加工性 能和多种工业用途，可用于生产如下产品： ( 1 ) 缓释胶囊制剂，可使血液中药物浓度相对降低，提高疗效，降低副作 用，在用于治疗癌症方面取得可喜进展。 。( 2 ) 制成生物降解纤维，可用来制造手术缝合线，随伤口愈合而被机体分 解吸收，不需拆线。 ( 3 ) 制成生物植片，以修复骨折或者其它机体损伤。 1 2 2 国内外乳酸的供需状况 乳酸已经成为国际市场的畅销产品，是一种需求量仅次于柠檬酸的有机酸， 目前世界乳酸的总生产能力约为每年2 5 万吨，产量约为每年1 3 万吨，近8 0 的 厂家采用发酵法l5 | 。消费领域中，约6 0 以上的乳酸用于食品工业，仅小部分 用于其它方面，近年乳酸在生物降解材料的应用出现巨大增长态势。由于乳酸用 途不断扩大，用乳酸为原料生产的系列产品也逐年增加，所以世界上乳酸需求量 增长很快，年增长率高达1 5 l 引，主要生产厂家有荷兰的c c a 、美国的a d m 、 a e 、a es t a l e y 、c a r g i l l 、e c o h e m ，西班牙的a r a s o 公司及日本的武藏 野化学公司等。 由于乳酸产品显示出广泛的应用范围和巨大的市场潜力，尤其在生物可降解 材料方面显示的优越功能，引起世界上相关研究生产机构和应用单位的极大兴 趣。荷兰和美国相继分别和合作建立了相当规模的乳酸生产厂家，如美国a d m 公司建立了年产1 2 万吨的l 乳酸生产厂，荷兰p u r a c 公司除了在欧洲本土设 厂外，还在巴西和美国分别建立了l 乳酸生产厂。最近p u r a c 公司更同美国 g a r g i l l 公司合资建立在美国本土建立了年产3 4 万吨的l 乳酸生产厂。除此 第一章文献综述 之外，近年来，国外聚乳酸工业化生产取得了突破性进展。1 9 9 7 年，美国d o w 化学和g a r g i l l 公司各占5 0 股份组成的合资股份公司g 川隅i l ld o w p l o y l m e r ，开发和生产聚乳酸，商品名为n a t u r ew o r k 。m ，当时的生产能力仅为年 产1 6 万吨，2 0 0 1 年1 1 月，该公司投资3 亿美元，采用二步法聚合技术，在美 国内布拉斯加建成投产了一套1 3 6 万吨年的装置，这是迄今为止世界上最大的 聚乳酸生产装置。并且该公司计划到2 0 1 2 年之前再建三套装置，使聚乳酸总生 产能力达到4 5 万吨年。与此同时，该公司积极地进行许可证转让，其中包括在 亚洲建设聚乳酸生产装置，预计2 0 1 2 年之后全世界供应量将近百万吨1 7 j 。 日本是世界聚乳酸重要的应用开发地区地区和应用市场，主要用于包装容 器、农业、建筑业、纤维用运动服和被褥等，日本称生物可降解塑料为绿色塑料。 为了扩大市场份额，g a r g i l ld o wp l o y l m e r 公司已与三井化学品公司合作进 行聚乳酸的应用开发。日本东丽公司也g a r g i l ld o wp l o y l m e r 公司签订了引 进聚乳酸的技术合同。日本三井东压公司已开发出在溶剂存在下进行缩合脱水反 应，直接生成高分子量的聚乳酸的一步法工艺。 目前，采用生物发酵法制备生物降解材料的成本普遍偏高，尚不能完全替代 石化塑料，进一步降低作为聚乳酸原料的l 乳酸成本是关键。美国已在研究改 变乳酸发酵菌种，并采用发酵和分离同时进行的方法，有可能大大降低乳酸的生 产成本，为聚乳酸的推广应用创造条件。美国当前每年需用4 0 0 万吨可降解塑料， 乳酸取代其中的1 0 ，每年就需要4 0 万吨，其发展空间相当大l 引。因此，乳酸 的市场前景十分看好，一旦高质量的8 8 含量的l 乳酸价格降低至0 5 美元磅， 则其聚乳酸产品将大量取代现在广泛使用的热塑产品，在消除白色污染方面会做 出巨大贡献。 目前国内乳酸总生产能力约为每年2 万吨，实际产量约为每年1 5 万吨，约 4 0 的乳酸用于香料和香精的生产，此外在调酒、制药、皮革、烟草及印染业也 有广泛应用，乳酸聚合材料在我国还处于发展阶段1 4 j 。我国乳酸生产与国际先进 水平有较大的差距：乳酸生产规模较小，发酵罐仅3 0 吨台6 0 吨台，产酸率 较低；产品品种仍以d l 乳酸为主；规划中的l 乳酸项目产量也不大，规模效应 不明显；产品色度质量不高；另外提取方面更有较大差距，总体上生产成本较高。 这些都阻碍了我国乳酸行业的发展。 随着应用技术的突破和环境保护政策法规执行力度日益加大，今后我国乳酸 的需求量将逐年增长，为了消除泡沫塑料制品对环境的污染，估计国家要投入 5 0 0 亿元的资金，从这个角度考虑，乳酸产业的发展前景十分看好【9 j 。 6 第一章文献综述 1 3 乳酸的生产方法 乳酸的生产方法主要包括生物发酵法、化学合成法和酶法。 1 3 1 乳酸细菌发酵乳酸 乳酸细菌不能直接发酵淀粉质原料，必需经过糖化过程，将淀粉质转变为糖 质原料才能发酵。糖质原料( 葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、戊糖等) 和短链糊精可由不同的乳酸细菌直接发酵生产乳酸，乳酸细菌发酵机理主要有： 1 3 1 1 同型乳酸发酵 葡萄糖通过e m p 途径( 也称已糖双磷酸降解途径或糖酵解途径，e m b d e n m e v e r h e f - p a r n u sp a t h w a y ) 降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化作用下还 原为乳酸，乳酸是代谢的唯一产物，lm o l 葡萄糖转化生成2 m o l 乳酸，理论转换 率为1 0 0 ，但由于发酵过程中微生物有其它生理活动存在，实际转化率不可能 达到1 0 0 ，一般认为转化率在8 0 以上者即视为同型乳酸发酵。其反应式为： c 6 h 1 2 0 61 静2 c h3 c o c o o h 黼2 c h3 c h ( o h ) c o o h + 2 a t p 1 3 1 2 异型乳酸发酵 异型乳酸发酵是某些乳酸细菌利用h m p 途径( 也称己糖单磷降解途径或磷 酸戊糖循环，h e x o s e m o n o p h o s p h a t ep a t h w a y ) ，分解葡萄糖为5 磷酸核酮糖， 再经过差向异构酶作用变成5 磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶催化裂解反应，生 成3 磷酸甘油醛和乙酰磷酸。乙酰磷酸进一步还原为乙醇，同时放出磷酸。而 3 磷酸甘油醛经e m p 途径后一半转化为乳酸，同时产生两分子a t p ( 三磷酸腺 苷) 。扣除发酵时启动葡萄糖消耗的一分子a t p ，净得一分子a t p 。因此由葡萄 糖进行异型乳酸发酵，其产能水平比同型乳酸发酵低一半。其发酵总反应式为： c 6 h 1 2 0 6 + a d p + p i c h 3 c h ( o h ) c o o h + c h3 c h2 0 h + c 0 2 + a t p 此过程lt o o l 葡萄糖可以生成1 m o l 乙酸、l m o l 二氧化碳和l m o l 乳酸，乳酸对糖 的转化率只有5 0 。 1 3 1 3 双歧( b i f i d u s ) 乳酸发酵 双歧乳酸发酵是双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u mb 莎d u m ) 发酵葡萄糖产生乳酸的 一条途径，其发酵途径为： 第一章文献综述 b 葡萄糖 乙酰磷酸乙酸 磷酸果糖一4 一磷酸赤藓糖 6 一磷酸果糖 乙酰磷酸乙酸 磷酸戊糖竺二 3 一磷酸甘油醛丙酮酸匦：鲴 6 一磷酸果糖磷酸酮解酶5 一磷酸木酮糖磷酸酮解酶 图1 - 2 双歧乳酸发酵途径 f i g 1 - 2p a t h w a y so f b i f i d u sl a c t i ca c i df e r m e n t a t i o n 其发酵总反应式为： 2c 6 h 1 2 0 6 叫2 c h 3 c h ( o h ) c o o h + 3 c h 3 c o o h 此发酵过程中，2 m o l 的葡萄糖可生成2 m o l 乳酸和3 m o l 的乙酸，乳酸的转 化率理论上只有5 0 。 1 3 2 化学合成法 化学合成方法制备乳酸有乳腈法、丙稀腈法、丙酸法、丙稀法等，用于工业 生产的有乳腈法( 也叫乙醛氢氟酸法) 和丙稀腈法。 1 3 2 1 乙醛氢氰酸法( 乳腈法) 化学合成法中实现规模化生产的是乳腈法，乳腈可以由丙烯腈生产的副产物 而来，亦可由乙醛与氢氰酸反应得到，乳腈水解即可得到乳酸，并可通过酯化法 精制。其生产工艺如下： c h ，c h o 竖- c h ，c h ( o h ) c n c h 3 c h ( o h ) c n 导c h 3c h ( o h ) c o o h c h 3 c h ( o h ) c o o h 屿c h 3 c h ( o h ) c o o c 2h 5 + h 2 0 c h 3 c h ( o h ) c o o c 2 h 5 生- c h 3 c h ( o h ) c o o h + c 2 h 5 0 h 乳腈法的工业化生产由美国m o n s a n t o 公司于1 9 6 3 年实现。世界上采用化学 合成法生产乳酸的美国m o n s a n t o 、日本武藏野化学研究所等均采用该法。乳腈 法只能生产外消旋体乳酸，且其原料氢氰酸的剧毒性大大限制了生产和发展卜1 。 1 3 2 2 丙烯氧化法 e s c a m b i a 公司开发的这种方法是在1 5 , - - 2 0 。c 将丙烯与液体n ：o 。反应，得到 8 第一章文献综述 1 一硝基2 羟基丙烷，然后用盐酸或硫酸水解。 1 3 2 3 丙酸氯化水解法 丙酸氯化水解法是以丙酸为原料，经氯化生成一氯丙酸，用氢氧化钠将氯取 代即得粗乳酸，将粗乳酸酯化、精馏，再通过水解，即得精乳酸。 c h 3 c h ，c o o h l 专c h ，c h c l c o o h c h 3 c h c l c o o h 与c h 3 c h ( o h ) c o o h 1 3 2 4 生物质化学降解 糖类在酸和碱催化条件下可以发生降解，b r u i j n 等研究了单糖在碱溶液中的 降解情况并分析了降解机理，y a n g 等【1 o j 研究了不同的碱及反应物浓度等因素对 葡萄糖降解的影响，并发现碱种类和反应物浓度的控制易于乳酸的生成。日本 c a n o n 株式会社的专利1 1 1 j 提出了一种纤维素直接降解为乳酸的方法：他们将纤维 素和氢氧化钙等无机碱或铵类有机碱共混于水中，在2 5 0 、5 - 2 5 m p a 的条件 下使纤维素迅速降解为乳酸。b i c k e r 等i l2 j 研究了在亚临界水环境下催化降解碳 水化合物生产乳酸的方法，他们发现3 0 0 、2 5 m p a 的亚临界水环境中以蔗糖为 原料生产乳酸量很小，而在加入少量如c o 、n i 、z n 、c u 等的金属离子后，乳酸 收率可达到4 2 。 生物质化学降解的研究是生物质资源利用的重要途径，而乳酸作为降解的产 物之一具有很大的研究前景。生物质化学降解过程的复杂性是其发展主要障碍之 一，详细的降解机理探索和合适的催化剂选择是生物质降解方法未来的重要研究 方向【引。 1 3 2 5 其它化学合成方法 除以上方法外，还曾有乙酸乙烯酯羰基化法【1 3 】、乙醛一氧化碳合成法等化学 合成技术出现，除乙醛氢氰酸法外，其它的化学合成技术或因成本问题，或仅仅 在理论探索阶段，并未实现实际的规模化生产。 1 3 3 酶化法 1 3 3 1 氯丙酸酶法 东京大学的本崎【6 】等研究利用纯化了的l 2 卤代酸脱卤酶和d l 一2 卤代酸脱 卤酶分别作用于底物l 2 氯丙酸和d l 2 氯丙酸，脱卤制得l 乳酸或d 乳酸。 l 2 卤代酸脱卤酶催化l 2 氯丙酸，而d l 2 卤代酸脱卤酶既可催化l 2 氯丙酸， 又可催化l 2 氯丙酸生成相应的旋光体，催化同时发生构型转化。 9 第一章文献综述 1 3 3 2 丙酮酸酶法 h u m m e l 【l 】等从活力最高的乳酸脱氢酶的混乱乳杆菌d s m 2 0 1 9 6 菌体中得到 d 乳酸脱氢酶，以无旋光性的丙酮酸为底物可得到d 乳酸。 1 3 4 各种生产方法比较 生产乳酸的方法主要有上述的化学合成法、酶法和微生物发酵法三种方法。 化学合成法制得的乳酸为外消旋的d e 乳酸，但只有l 一型乳酸对人体有益，因此 此方法生产的乳酸产品常常需要构型的拆分；从原料方面考，化学合成法所需要 的原料乙烯需要从石油中获得，而石油是一种不可再生物质，且化学合成过程中 所用的氢氰酸为剧毒物质，若制得的乳酸用于食品领域，还要考虑其安全性，因 此，尽管美国食品和药物管理局( f d a ) 已将合成乳酸列为安全品，但许多人还 是对合成法生产的乳酸的安全性表示担心1 14 j ，所以合成法生产乳酸大大受到了 限制，此外其生产成本也较高。酶化法生产乳酸虽可以专一性的得到旋光乳酸， 但工艺过程比较复杂，目前还难以产业化，应用到工业上还有待于进一步研究。 微生物发酵法克服了化学合成法和酶法生产乳酸的缺点和不足，以其发酵工 艺成熟、生产原料丰富且可再生、合成的乳酸光学纯度高等优点而受到各生产厂 商的青睐，因此具有广阔的发展前景。 1 4 乳酸生产菌种与原料 乳酸菌( 1 a c t i ca c i db a c t e r i a ) 是指能发酵糖、且主要生成乳酸的细菌的总称。 乳酸菌从形态上可分为杆状和球状，绝大多数为革兰氏阳性菌，不运动，无芽孢， 不具有过氧化氢酶( 个别种属除外) ，在能量代谢中不需要供给氧，兼性厌氧或 专性厌氧，其营养类型为化能异氧型。 乳酸发酵的菌株在自然界中普遍存在，符合工业生产的菌株的标准如下【7 j ： 经济性能好，能高效生产乳酸； 同型发酵，即需要是只产生单一的乳酸分子而无其它有机酸副产物的乳 酸发酵菌种； 具有在较高浓度的乳酸环境中生存的能力，即耐菌种自身在发酵过程中 逐渐产生的乳酸，耐酸性p h 环境的能力，耐酸能力越强还越有利于抑制杂菌的 生长； 具有较高的耐热性，对乳酸细菌而言，要求菌种发酵温度超过4 2 ，既 可节省冷却水、节约能源，又可抑制杂菌的生长： 1 0 第一章文献综述 菌种的营养要求相对简单，要能够利用价格廉价、容易得到、就地利用、 无季节限制的原料，以及利用农副产品、食品加工及其它工业加工副产品和废物， 如锯木和废旧报纸等； 选择抗噬菌体菌株。 菌种选育方法除了最基本的突变和选择、筛选外，近年来，利用基因重组技 术和基因工程进行乳酸菌体选育成为研究的热点。 1 7 8 0 年瑞典化学家s c h e e l e 最早在酸牛奶中发现乳酸l “”j 。1 8 4 7 年b l o n d e a u l i j 确认了一种发酵过程的最终产物是乳酸。1 8 9 9 年b o u l l a n g e r t l 6 j 申请了由乳酸霉 即现在的根霉( r h i z o p u s ) 或毛霉( m u c o r ) 生产乳酸的专利，1 9 11 年斋藤1 1 7 j 确 认根霉所产乳酸为l 型。乳酸发酵于上世纪五六十年代在生物化学方面取得了 较大的进展，现在正着手在遗传工程方面改良乳酸生产菌。美国a r g o n n en a t i o n a l l a b o r a t o r yt s a i 的研究人员为工业乳酸发酵设计了一套相当周密的菌种筛选和选 育方案，他们运用该方案对3 4 株乳酸菌进行了筛选，最终得到了5 株最有希望 的菌株1 7 j 。在乳酸发酵中，产物( 乳酸) 抑制限制是乳酸发酵的主要因素，采用 常规诱变育种手段、提高菌种耐乳酸的能力是一条有效的途径l l 引。d e m i r c i 和 p o m e a o 1 9 j 采用化学诱变剂甲基硫酸乙酯( e m s ) 处理德氏乳杆菌细胞，得到耐 乳酸能力增强的突变型。s e r e r s o n 和b a r r e t t 报导了从外消旋d l 乳酸德氏乳杆菌 保加利亚亚种a t c c 5 5 1 6 3r 1 6 0 菌株诱变产生仅产l ( + ) 乳酸的突变菌，经酶 学分析，所产乳酸异构体中l 乳酸含量高达9 9 6 。 、 1 4 1 乳酸菌 工业上应用的乳酸菌包括杆状菌和球状菌，都是革兰氏阳性菌，不运动，无 芽抱，常排列成长短不同的链，厌氧或微好氧，表面生长弱或无，发酵糖类( 因 种而异) 产生乳酸。凡主产物是乳酸( 对糖转化率达8 0 以上者) 的菌称同型乳酸发 酵菌，否则为异型乳酸发酵菌，乳酸消旋酶阳性者产d l 乳酸，阴性者产d 或 l 乳酸，除生产发酵食品如干酪、香肠、腌泡菜等需要一些异型发酵菌外，单纯 生产乳酸都采用同型乳酸发酵菌。国内外乳酸生产中最常用的乳酸菌是德氏乳杆 菌( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i o ，其形态与生理特征为：细胞杆状，2 0 9 0 p mx 0 5 - - - 0 8 9 r n ，单个或短链，革兰氏阳性，不运动。能利用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、 果糖、半乳糖、糊精等，发酵产生d 乳酸，少数菌株产生d l 。乳酸。最适生长 温度为4 5 ，在5 0 仍能旺盛发育、产酸，最高能耐5 5 。据印度报导，硫胺 素( v b l ) 可抑制德氏乳杆菌发酵乳酸，而v b 2 、烟酸和叶酸对其有促进作用。在 琼脂单板上菌落小、扁平、呈锯齿状，在明胶平板上菌落灰色，环状，在琼脂斜 面上呈半透明灰色条纹。 第一章文献综述 在工业生产上，乳杆菌的应用最广，这是因为它具有生长速率快，产酸高， 耐酸能力强等优点，其中德氏乳杆菌的发酵产率最高，此外链球菌属中的某些 种以及凝结芽孢杆菌等也具有较高的乳酸转化率，日本、德国和我国也正在开 发嗜热芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌等耐高温产l 乳酸的菌种，可避免杂菌的混 入，而影响产物的旋光性的纯度1 2 0 。据报导1 2 1 j 利用b a c c i l l u ss p 在无氧条件下 发酵生产l 乳酸，3 3 。c 发酵2 0 9 l 1 葡萄糖可以得到1 6 4 9 - l 。1 的乳酸，光学纯度 9 9 。g a s s o n l l 7 j 第一个在乳酸乳球菌种使用该技术实现亚种7 1 2 质粒和染色体 编码基因融合。o k a m o t o 2 2 j 等报导利用原生质体融合技术，实现亚种问的营养缺 陷型突变株染色体基因的重组。 1 4 2 米根霉 米根霉菌落疏松或稠密，最初为白色，后变为灰褐色至黑褐色，匍匐枝爬行， 无色；指状或根状分枝为褐色；饱囊梗直立或稍弯曲，2 4 根群生，与假根对 生，有时膨大或分枝；囊托楔型，菌丝形成厚垣孢子，接合孢子未见。 米根霉能产生淀粉酶和糖化酶，它既能利用糖，也可以利用淀粉或淀粉质原 料直接发酵生成l 乳酸。由于根霉和乳酸菌相比，发酵过程很少发现消旋作用， 营养要求远比细菌简单，茵体大，易于分离，发酵速度快，有利于得到纯净的 l 乳酸。因此，目前国内全部采用此方法生产l 乳酸。 目前，人们认为，根霉发酵除产生l 哥l 酸以外，还产生乙醇、富马酸、琥珀 酸、苹果酸、乙酸等，它们之问的比例随菌种和培养条件的不同而变化很大i l