（环境工程专业论文）异恶草酮的水环境毒理学及其水解动力学研究.pdf

异恶草酮的水环境毒理学及水解动力学研究 摘要 本文选用三叶浮萍和蝌蚪为对象，评价了异恶草酮在水环境中的毒性作 用，并研究了其水解规律及其影响因素。主要研究结果如下： 以三叶浮萍为对象，研究了异恶草酮对其生长及体内色素的影响作用。结 果表明：异恶草酮对浮萍生长抑制的2 4 h l c 5 0 为8 8 6 m g l 、4 8 h l c 5 0 为5 2 1 m g l 、7 2 hl c s o 为1 9 2 m g l 、9 6 hl c s o 为1 6 6m g l 。异恶革酮对浮萍体内 色素的影响作用呈良好的“浓度、时间一效应”关系。随着处理浓度的增大， 浮萍体内的叶绿素和胡萝h 素含量明显减少，且叶绿素a b 值也随处理浓度的 增大而减小。 研究了水环境中异恶草酮与镉共存时对蝌蚪的联合毒性。在常温2 0 下， 异恶草酮对蝌蚪的2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 hl c s o 分别为1 5 6 2 m g l 、1 4 2 7m g l 、 1 3 3 5 m g l 、1 3 3 0 m g l ；镉对蝌蚪的2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 h l c s o 分别为5 6 3 m g l 、 3 5 4m g l 、2 6 1m g l 、2 0 6m g l 异恶草酮与镉共存对蝌蚪联合毒性的2 4 h 、 4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 的相加指数a 1 分别为0 2 5 、o 2 1 、0 1 9 、0 1 4 ，均大于0 ，两 者的联合毒性表现为协同作用。另随着水环境温度的升高，异恶草酮对蝌蚪的 毒性减弱，而镉对蝌蚪的毒性增强，两者的联合毒性仍表现为协同作用。 采用h p 一1 1 0 0 液相色谱分析和室内模拟的方法研究了异恶革酮在不同温度和 p h 值条件下的水解动力学情况，以及在三种实际环境水样中的水解情况。结果表明， p h 的变化值对异恶草酮的水解速率影响较小，异恶草酮水解速率随温度升高而加 快，而且异恶草酮在环境水样中的水解速率较慢。 关键词：异恶草酮三叶浮萍蝌蚪毒性水解 s t u d i e so nt h et o x i c i t yo fc l o m a z o n e i nw a t e ra n di t sh y d r o l y s is a b s t r a c t r e g a r dt h el e m n am i n o rla n d r a n al i m n o c h a r i sa st h et a r g e t ，r e s e a r c h e dt h e t o x i c i t yo ft h ec l o m a z o n e ，a n ds t u d i e dt h eh y d r o l y s i sd y n a m i c so fc l o m a z o n ea n d i t sf a c t o r t h em a i nr e s u l t ss u m m a r i z e da sf o l l o w i n g ： r e g a r dt h el e m n am i n o rl a st h et a r g e t ，s t u d i e dt h ei n f l u e n c eo ft h ec l o m a z o 。 - u et oi t sg r o w t ha n di t sp i g m e n t t h er e s u l ti n d i c a tt h a tt h et o x i c i t yo ft h ec l o m a z 一 一o n et ol e m n am i n o rl s2 4 hi c 5 0i s8 8 6m g l 4 8 hi c 5 0i s5 2 1m g l 、7 2 hi c 5 0i s 1 9 2 m g l 、9 6 hi c 5 0i s1 6 6m g l t h ei n f l u e n c eo fc l o m a z o n et ot h ep i g m e n ti n l e m n am i n o rla c c o r d sw i t ht h ed o s a g e e f f e c tc o n n e c t i o n w i t ht h ed o s a g e si n c r 一 一e a s e ，t h ec h l o r o p h y l la n dt h ec a r o t e n ei nl e m n am i n o rl r e d u c eo b v i o u s l y , a n dt h e v a l u eo fc h l o r o p h y l la br e d u c e st o o j o i n t t o x i c i t yo fc l o m a z o n ea n dc a d m i u mo nr a n al i m n o c h a r i s w a ss t u d i e d i nt h ep r e s e n ti n v e s t i g a t i o n i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tl c s oo fc l o m a z o n e o nr a n a l i m n o c h a r i sw e r e1 5 6 2 m g l 、1 4 2 7m g l 、1 3 3 5m g l 、1 3 3 0m g l ，w h i l et h a to f c a d m i u mw e r e5 6 3 m g l 、3 5 4m g l 、2 6 1m g l 、2 0 6m g l 。r e s p e c t i v e l y a c c o r d 一 一i n gt ot h ea d d i c t i v ei n d e xm e t h o do fm a r k i n g ，i th a sb e e n f o u n dt h a tt h ea d d i c t i v e i n d e x ( a 1 ) w e r e0 2 5 、0 2 1 、0 1 9a n do 1 4i n2 4h ，4 8h7 2 h a n d9 6hr e s p e c t i v e l y r e v e a l i n gt h a tt h e r ei sac l e a rs y n e r g i s ma c t i o n a n d w i t ht h et e m p e r a t u r e si n c r e 一 一a s c ，t h et o x i c i t yo f c l o m a z o n e o nr a n al i m n o c h a r i sw a sw e a k e n e d ，w h i l et h a t o fc a d m i u mo nr a n al i m n o c h a r i sw a ss t r e n g t h e n e d ，a n dt h ej o i n t t o x i c i t yo ft h e t w oi ss t i l las y n e r g i s ma c t i o n t h eh y d r o l y s i sd y n a m i c so fc l o m a z o n ew a ss t u d i e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s 、 p hv a l u e sa n di nt h r e ek i n d so fn a t u r a lw a t e r t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a td i f f e r e n tp h v a l u e sa f f e c tt h eh y d r o l y s i so fc l o m a z o n e ，w h i l et h eh y d r o l y s i sr a t ea c c e l e r a t e d w i t ht h er i s eo ft h et e m p e r a t u r e m o r e o v e r ，t h eh y d r o l y s i s o fc l o m z o n ei n n a t u r a l w a t e rw a sal i t t l es l o w e r a u t h o r ：h ew e n ( d e p a r t m e n to fe n v i r o n m e n t a ls c i e n c e ，h n a u ) d i r e c t e db y ：a ss o c i a t e dp r o f e ss o rg u oz h e n g y u a n k e y w o r d s ：c l o m a z o n e ；l e m n a m i n o rl ；r a n al i m n o c h a r i s ； t o x i c i t y ；h y d r o l y s i s 独创性声明 本文声明所呈交的论文是我个人在指导老师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：何文 2 0 0 6 年5 月2 0日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩放或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部内容或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：何文2 0 0 6 年5 月2 0 日 护l ，年占月f 扣 。 汐 、唧 名签师导 湖南农业大学硕十学位论文异恶草酮的水环境毒理学及水解动力学研究 第一章绪论 1 研究目的和意义 我国是一个农业大国，对农药的需求量很大，农药施用面积在2 8 1 0 8 h m 2 以上，全国年平均用量为2 3 4k g h m 2 。农药作为一种不可替代的农用化学品在 我国已被广泛地使用。从1 9 4 6 年开始生产少量滴滴涕，1 9 4 9 年开始生产六六六， 经过几十年的发展，目前农药原药生产企业近4 0 0 家，可生产农药3 5 0 多个品种， 农药年产量已稳定在2 5 万t 左右，农药生产能力已达n 5 5 5 万t ，其中杀虫剂约 占总产量的7 0 ；杀菌剂占总产量的1 3 ；除草剂占总产量的1 5 ，尚有少量的植 物生长调节剂和杀鼠剂等，年产量仅次于美国，居世界第二位【l j 。 随着农药品种的增加和普遍使用，病虫草害的抗性亦加剧并复杂化。据统 计，新型农药的开发费用愈来愈高，据称近年来创制一种新技术农药国外需耗 时l o 年，费用达上亿美元，而同时农害抗性产生的时间却在缩短。5 0 年代为8 1 0 年，8 0 年代只需5 6 年，有的甚至2 3 年。有时很有效的药剂突然会对病害束手 无策，致使厂家销售十分被动，以为是假冒农药，生产厂家和用户产生误会， 使农民蒙受损失。如果加量用药，不仅增加成本，而且给环境带来广泛的损害， 破坏生态平衡、造成恶性循环。有时抗性倍数高达几百上千，根本到了极为严 重无法用药的程度。据国外统计，由于农药抗性而增加农药使用量，增加害虫 防治成本约1 0 。我国自大量使用农药以来，已经发生多次害虫抗性危害，如 1 9 9 2 年我国由于棉铃虫对拟除虫菊酯农药的严重抗药性，致使棉铃虫特大发 生，4 3 3 3 万顷棉田严重受害，大面积减产甚至绝收，全国棉产减3 0 ，直接经 济损失百亿元，其中农药使用开支损失有4 亿多元。据环境部门监测，目前我 国稻田使用丁草胺和禾草丹历史超过5 年以上者均产生抗性稗草，占我国水稻 总种植面积6 ，约2 0 0 万h m 2 的水稻稗草产生了不同程度的抗性，且还有不断 扩大的趋势。近年来，大力提倡并已得到较大进展的生物农药苏云金杆菌( b t ) 也面临着害虫的抗性适应，特别是因为含b t 杀虫蛋白的转基因植物的持续高强 度的选择，使b t 的抗性面临提升和扩大的危险。农害抗药性的产生是农药大量 使用而导致的必然结果，由药剂对生物群的选择压力而致。由于使用药剂，敏 湖南农业大学硕士学位论文异恶草酮的水环境毒理学及水解动力学研究 感个体大量消失，而具抗性的个体则生存下来并繁殖后代，借助遗传筛选，繁 殖具抗体药基因的后代。根据孟德尔的遗传定律，抗性纯合子的比率在选择压 力下逐代增加，最后形成植物个体对农药的抗药性。而这些抗性个体在没有药 剂选择压力时，生存能力本不及敏感个体。撤去药剂选择的外力，经过一定的 时空条件，敏感个体又重新占生存优势，表现为抗性的回落，所以说抗性和敏 感又是不断变化的【”。 随着农药种类的增多和使用量的不断增加，加上农药品种老化、结构单一， 过量施用、盲目施用；施用技术落后以及对农药污染生态环境问题重视不够， 特别是一些高毒农药产品结构不合理，比如杀虫剂比重较大，而且高毒农药品种 过多，乳油比例过大等等原因，造成高毒、高残留农药的大量生产和使用，严重 污染了土壤、水体、大气等农业生态环境，致使近年来发生了一系列的环境污 染，农药中毒事件。鉴于农药在食品中的残留和对环境质量及人类健康的影响 日益突出，以及出口农产品农药含量超标、防治新的重大病虫草害的要求，农 业部综合考虑了高毒农药的环境影响，出台了一系列禁用、限用措施，比如在 2 0 0 0 年对甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、久效磷、磷胺5 种高毒有机磷农药加 强登记管理的基础上，于2 0 0 2 年4 月停止受理甲拌磷、氧乐果、水胺硫磷、特丁 硫磷、甲基硫环磷、治螟磷、甲基异柳磷、内吸磷、涕灭威、克百威、灭多威 1 1 种高毒农药的登记申请，撤销了一批高毒农药在果树、蔬菜上的登记：2 0 0 2 年5 月农业部发出第1 9 9 号公告，明令禁止六六六、滴滴涕等1 8 种农药的使用，规 定了1 9 种高毒农药不得用于蔬菜、果树、茶叶和中草药上，三氯杀螨醇和氰戊菊 酯不得用于茶树上；2 0 0 4 年4 f l ，农业部农药检定所发布了农药检( 药政) 2 0 0 4 】 2 2 号文件：自2 0 0 4 年6 月3 0 日起，禁止在国内销售和使用含有甲胺磷等5 种高毒有 机磷农药的复配制剂产品，2 0 0 7 年1 月1 日起，撤销这5 种高毒农药的登记，全面禁 止在农业上使用。 除草剂的应用是以消灭农田杂草为主要目的，在作物与杂草共存的生态 环境中，除草剂使用稍有不当，就会危及作物的安全。特别是近年来高效除草 剂的不断出现，虽然用量少，但因其生物活性很高，又无专一选择性，不同作 物对它的敏感性又有很大的差异，加上我国的作物品种繁多，各地的耕作制度 又十分复杂，这些高效除草剂在使用中，常因土壤中的残留农药，对后茬作物 湖南农业大学硕士学位论文 异恶草酮的水环境毒理学及水解动力学研究 造成危害和影响。因此在农药开发过程中，必须要加强对一些高效除草剂在环 境和作物上的消解规律、环境行为的研究，搞清楚这些除草剂对各种作物的敏 感性与危害剂量， 再结合各地的耕作制度 3 1 ，研究其对各类非靶标作物的危 害影响及安全使用条件，才能充分发挥其除草的功效，并将其对生态环境的危 害抑制到最小程度。 农药在使用过程中还可通过各种途径挥发、扩散、迁移而转入大气、水体、 土壤和生物体内，造成农药污染环境问题，其主要表现为：有些农药不仅对害 虫有杀伤作用，同时对害虫的“天敌”及传粉昆虫等益虫益鸟也有毒害作用。 由于农药的使用，消灭了一些捕食性、寄生性害虫的天敌，使自然界害虫与天 敌间失去了平衡，造成害虫猖獗；也消灭了传粉的昆虫，使作物产量受到了影 响，同时还使生物栖息场所发生了改变。因而破坏了自然界的生态平衡。有些 化学农药本身或与其他物质反应后具有“三致”( 致癌、致畸、致突变) 作用， 一旦进入动植物及人体内，就会对其产生危害作用。长期施用同类型农药，会 使害虫产生抗药性，因而增加了农药的用量和防治的次数，也大大增加了防治 的费用和成本，对环境的污染也越严重，造成恶性循环。有些化学农药性质稳 定，难于降解，若持续大量使用，很容易在环境中残留、累积起来。喷洒在植 物上的农药，一部分被植物吸收，一部分挥发进入大气，大部分进入土壤，造 成土壤污染，土壤质量下降，反而影响作物的产量和质量，而且通过污染农副 产品而损害人体健康。另外，除地表水域以外，地下水源也普遍受到了农药的 污染。美国在地下水中已发现1 3 0 多种农药或其降解产物有残留检出。在我国 江苏、江西以及河北等地的地下水中已发现有六六六、阿特拉津、乙草胺、杀 虫单等农药的残留【4 】。食品中农药的残留问题已是引人注目的大问题，防治农 药污染势在必行。农药施用后，还会因为降雨、土壤转运、大气传输等原因最 终污染水体，从而给生活在水环境中的生物带来各种影响。尤其是生活在其中 的浮萍，作为初级和次级消费者，其对环境的微小改变是很灵敏的，可以表现 出各种生物反应，因此我们可以通过观察农药对浮萍的生理生化影响得出农药 对水生生物的影响作用，为其外推至人类自身的作用提供参考 5 】，并为制定含 农药废水的水质排放标准以及安全浓度提供参考数据。 据统计我国每年使用农药量达5 0 一6 0 万t ，其中约有8 0 的农药直接进入环境中。 湖南农业大学硕士学位论文 异恶革酮的水环境毒理学及水解动力学研究 进入环境中的这8 0 的农药绝大部分经生物圈物质循环后汇集到水体中，从而降低 了水生生态环境质量，打破了水生生态系统的平衡。残留在水环境中的农药受到各 种生物和非生物因素的影响，会发生复杂的蓄积和降解行为，从而对水体造成污 染。农药对水体的污染主要来源是：农药生产、加工企业废水的排放及水体施药； 施用于农田的农药随雨水或灌溉水向水体的迁移；大气中残留农药和农药使用过程 中的飘移沉降及施药工具和器械的清洗等等，其中农田农药流失为最主要来源。农 药除污染地表水体以外，还使地下水源遭受严重污染。一般情况下，水体中农药污 染范围较小，但随着农药的迁移扩散，污染范围逐渐扩大。不同水体遭受农药污染 的程度依次为：农田水 河流水 自来水 深层地下水 海水。据1 9 9 8 年对全国 1 0 97 0 0k m 河流进行的评价中有7 0 6 被农药所污染；黄河水资源保护研究所在 1 9 8 6 - 1 9 8 8 年连续3 年对黄河三门峡到花园口河段的农药污染现状进行调查鼎示， 六六六的检出率为1 0 0 t 6 1 。水体被农药污染后，水生态环境恶化，势必会使其中 的水生生物大量减少，水体生态系统的结构和功能以及水生生物的多样性遭到破坏； 特别是地下水受到农药污染后极难降解，易造成持久性污染，若被当作饮用水源， 将会影响到人们日常生活中饮用水水质，严重危害人体健康。研究结果表明用，化 学降解使农药的结构发生很大的变化，其中最主要的是水解、光解和生物降解 过程。水解反应是许多水溶性较大农药降解的主要过程，因此，这类农药的水 解特性是评价该农药在环境中稳定性的一个重要指标，它对于预测农药在水体 中的残留特性以及迁移转化规律有蓿重要的意义。 2 国内外研究进展 2 1 水生毒理学研究进展 2 1 1 国外水环境毒理学研究现状 国外在污染化学物质对环境生物和人体的危害性方面极为关注。过去的2 0 年间，欧、美、日等一些发达国家相继制定了化学物质的审查与管理法规，列 出了各自优先控制的化学物质名录，如美国在水清洁法中列出了1 2 9 种优先控 制的污染物质，饮用水中需重要控制的痕量有害有机物达5 0 多种，并在环境 调查、毒性鉴别与分析方法、曝露剂量一响应等环境风险评价方法、污染机理、 风险特性以及污染控制等方面进行了一系列深入的基础研究。一些发达国家和 湖南农业大学硕士学位论文 异恶草酮的水环境毒理学擞水解动力学研究 国际组织，如0 e c d ，e e c ，美国，日本等，已建立或正在建立水体有害化学 物质的环境安全性研究技术体系，并致力于化学品的分子毒理学和生态效应机 制的研究j ，如近年国际上从分子水平上应用定量分子结构活性相关( q s a r ) 的方法来筛选大量化合物已取得一定成果，目前美国e p a 的有毒化学品控制法 规t s c a 中已承认可用q s a r 结果进行化学品的生态与健康毒理学预测、筛选， 进而更准确她控制现有化学品和筛选开发新的安全性替代化学品，以尽快提高 环境质量【9 l 。农药对水生生物的毒性大小主要与农药自身物理化学性质和水生 生物种类、基因型、生命周期、出生时的大小有关，其次还受自然界如食物的贮 存、氧气的消耗和捕食者的气味等因子的影响。因此评价农药对水生生物的影 响只根据农药登记环境标准准则中规定( l c s o 1 0 m g k g 为低毒农药，l c s o i 0 - 1 0 m g k g 为中毒农药，l c s o 1 8 0d 【1 5 ，l ”。异恶草酮毒理反应特性为雄大鼠急性经口l d 5 0 为 2 0 7 7m g k g ，雌大鼠l d 5 0 为1 3 6 9m g k g ，兔急性经皮l c s o ( 4 h ) 为4 8m g k g ， 狗1 年饲喂试验的无作用饲料剂量为5 0 0m g k g ，鹌鹑和野鸭急性经口l d s o 2 1 5 0m g & g ，虹鳟鱼毒l c s o ( 9 6 h ) 1 9m g k g ，蓝鳃太阳鱼l c s o ( 9 6 h ) 3 4m g k g 。 对眼睛、皮肤有轻微刺激，对试验动物无三致作用d s 。按我国农药毒性分级标 准【1 ”，广灭灵属低毒除草剂。其结构式、分子式、分子量和化学名称分别如下： 结构式 c i 鸭c j o 忧心轴 也c ，1 吲 分子式：c 1 2 h 1 4 c i n 0 2 相对分子量：2 3 9 7 化学名：( i u p a c ) ：2 一( 2 c h l o m p h e n y l ) 一4 ，4 - d i m e t h y l i s o x a z o l i d i n 一3 一o n e ，2 - ( 2 一氯笨 基) _ 4 4 一二甲异唑一3 酮。 3 1 2 异恶草酮的研究进展 3 1 2 1 异恶草酮防治效果方面的研究进展 研究表明：异恶草酮能有效地防除田间多种一年生禾本科杂草及阔叶杂 草，并对油菜、大豆、胡椒、等作物出苗、生育无不良影响 1 8 ，1 92 0 1 。该药一 般用于芽前或植前混土处理，用量仅为1 1 9 l ，因此药效很高。美国医药食品 联邦法规规定，广灭灵在冬瓜中的最大允许浓度为o 1 m g k g ，甜马铃薯为o 0 5 m g k g ，棉籽为o 0 5m g k g ，胡椒为o 0 5m g k g ，西瓜为0 1m g k g ，辣椒为o 0 5 湖南农业大学硕士学位论文 异恶草酮的水环境毒理学及水解动力学研究 m g k g ，南瓜为0 1m g k g l 2 ”。目前国内仍以进口为主，正将其推广应用于大豆、 甘蔗、油菜、花生、烟草和棉花等作物田，而且现在国内己成功进行了广灭灵 的合成 2 m 4 1 。 3 1 2 2 异恶草酮生理学机制方面的研究进展 国内外学者对其防治效果、生理学机制、在环境中的降解代谢规律以及分 析测定方法等方面进行了不少的研究。研究结果显示：异恶草酮是通过抑制异 戊二烯化合物合成，阻碍敏感植物胡萝b 素和叶绿素生物合成2 5 ，矧，导致植物 变白、变黄或失绿，且能选择性地抑制杂草中双萜的合成，从而使敏感植物短 期内死亡【2 7 捌。同时它还破坏棉花子叶白色质体亚显微结构，使细胞内呈现不 规则的质体膜，并有形态各异的基质泡；还能减缓棉花脱植基叶绿素向叶绿素 转化，影响叶绿醇合成，在抑制类胡萝b 素合成的同时，造成倍半萜烯半棉酚 和二聚倍半萜烯棉子酚的大量累积，在焦磷酸法尼基酯形成后，抑制萜类化合 物的合成。目前认为异恶草酮通过植物根和幼苗吸收，木质部传导，在抗性作 物体内通过氧化、羟基化与缀和作用而丧失活性：认为异恶草酮对敏感植物通 过抑制类异戊二烯合成途径中甲羟戊酸与栊牛儿基二磷之间一种或多种酶的 活性，阻碍叶绿素的生成与质体色素的积累，产生白化现象p l 。还有研究表明， 植物对异恶草酮的吸收、降解以及异恶草酮在植物体内的分布与异恶革酮的选 择性机制无关，s c o t t j 3 0 研究异恶草酮对异戊烯基二磷酸异构酶和异戊二烯基 转移酶活性无直接影响；并有学者提出引起异恶草酮在植物体内行为的酶的作 用位点差异可能导致异恶草酮对植物的选择性机制假说，认为异恶草酮的抑制 作用位点可能是异戊烯基二磷酸( i p p ) 异构酶p ”。有人通过测定土壤的呼吸 作用、矿化作用以c 、n 变化及酶活性测定微生物多样性的变化，来判断异恶 草酮对环境的安全性【3 2 l 。目前关于异恶草酮对浮萍等水生生物的毒性的研究还 未见报道。总的来说，异恶草酮的生理作用机理及其环境毒理学方面尚待进一 步研究。 3 1 2 _ 3 异恶草酮在环境中的降解代谢规律的研究进展 l i e b l 等对异恶草酮在环境中的降解代谢规律进行了研究。研究结果表明： 异恶草酮在大豆体内的代谢最后得到5 一酮基异恶草酮、5 一羟基异恶草酮、二氯 苯甲醇、5 - 羟基异恶草酮和羟甲基异恶草酮5 种代谢体，其中以二氯苯甲醇为 1 0 湖南农业大学硕士学位论文 异恶草酮的水环境毒理学驶水解动力学研究 主要代谢体。还有学者研究了异恶草酮的微生物降解作用，得到1 3 种代谢体， 且其主要微生物转化作用在于异恶哔烷酮5 一亚甲基碳原子的羟基化作用。其 他降解途径包括芳香环的二羟基化作用以及异恶唑烷酮c n 键的断裂或异嗯 唑烷酮彻底支解成二氯苯甲醇。研究还发现降解异恶草酮的主要微生物包括曲 霉菌属、芽孢杆菌属、念珠菌属、链霉菌属、假单孢菌属、诺卡氏菌属、根霉 菌属等多种类型。异恶草酮在土壤中的降解受土壤温度、湿度以及微生物活动 多种因素的影响，一般不易发生光化学降解或热分解 3 3 - 3 4 】。目前国内外对异恶 草酮在环境中的降解研究多集中在微生物降解上，对异恶草酮在水体中的降解 研究较少1 3 5 。 3 1 2 4 异恶草酮分析测定方法的研究进展 迄今为止，国内外学者对异恶草酮的分析测定方法进行了一些研究。文献 报道对异恶草酮的测定主要是液相色谱法和气相色谱法。例如：李莲芳等用惠 普1 1 0 0 高效液相色谱仪，o d sh y p e r s i l ( 5um ) 色谱柱，1 2 5 4 5i t l m 的不锈钢 柱，甲醇水( 7 5 2 5 ) 为流动相，流速0 8 m l m i n ，桂温3 0 。c ，紫外检测器检 测异恶草酮在水稻土中的残副3 6 】：赵雪蓉p 刀等以邻苯二甲酸二乙酯为内标物， 用h p 一5 色谱拄，氢火焰检测器，内标法定量气相色谱测定异恶草酮。方法标 准偏差为o 0 7 ，变异系数0 1 5 ，回收率在9 9 3 一1 0 0 7 之间；王淑芳 等用带可变波长紫外检测器的w a t e r a l c g p c 2 4 4 型高效液相色谱仪对异恶草 酮进行检测，检测条件如下：检测波长为2 5 4n m ，固定相为u b a u n d p a k c l 4 ， 色谱操作条件洗脱剂为甲醇：水= 7 5 ：2 5 ( 体积比) ，淋洗速度为1 0 0m l m i n ，进 样量为l o 微升，柱压为2 0 0 0 磅英寸，其测定结果的标准偏差为o 1 7 7 8 ，变 异系数o 3 7 ；杨长志【3 印等采用气相色谱法使用0 v 一1 0 1 色谱拄和氢火焰 离子化检测器，以邻苯二甲酸二丁酯为内标物，对异恶草酮进行分离和测定。 方法的变异系数为0 4 2 ，线性相关系数为0 9 9 9 7 。回收率为9 9 0 8 一1 0 0 1 2 之间。 3 2 主要研究内容 ( 1 ) 在不同浓度的异恶草酮水溶液中放入健康的、形状和火小都相近的浮 萍，纪录浮萍的生长指标，并以此计算浮萍的生长速率、生长抑制率和l c s o 1 1 湖南农业大学硕士学位论文 异恶草酮的水环境毒理学及水解动力学研究 值；同时测定在各个不同浓度的异恶草酮水溶液中生长的浮萍的色素含量，以此 判断异恶革酮对浮萍体内色素的影响作用。 ( 2 ) 采用静态实验法，在每个5 l 玻璃缸中放入驯化好的蝌蚪，分别加入不 同浓度异恶草酮母液，对蝌蚪进行了单因子毒性和c d 2 + 的联合毒性实验，并在 单因子毒性实验和联合毒性实验的基础上，计算共评价其联合毒性效应。 ( 3 ) 采用室内模拟法研究了不同的p h 值、温度、水质条件对异恶草酮的水 解速率的影响研究。 3 3 预期目标 ( 1 ) 研究出异恶草酮对水体环境( 一定p h 值和环境温度下) 中浮萍的l c 5 0 值、生长抑制率以及对浮萍叶绿素含量的影响。 ( 2 ) 研究出异恶草酮与重金属镉对蝌蚪的联合毒性作用。 ( 3 ) 研究出异恶草酮在几种实际环境水体中的水解动态规律，得出异恶草酮 在各种水体中的水解动力学方程和水解特性，并研究水体p h 值、环境温度对 异恶草酮水解规律的影响。 ( 4 ) 初步评价异恶草酮的环境安全性，提出异恶草酮的安全使用技术，探索 防治其环境污染的措施。 湖南农业大学硕士学位论文 异恶草酮的水环境毒理学及水解动力学研究 第二章异恶草酮对三叶浮萍的毒性研究 三叶浮萍是湖南分布极广的一个品种，分布于稻田、池沼、水塘、湖泊等 水体中。5 0 年代，鉴于浮萍毒理实验的简便、敏感、经济和可操作性，毒理学 家指出浮萍可以用来作为毒性检测指示植物；但直到8 0 年代初，随着需进行 植物毒性检测的化学品的大量增加和对环境污染物毒性了解的需要，浮萍生长 抑制试验才得到广泛的关注，而实验证明浮萍是一种有效的环境监测植物。随 着工农业生产的发展，水体中蓄积的农药越来越多，造成的中毒事件也时有发 生，国内外学者已对农药对水生动物和藻类的毒性效应做过一些研究 4 m “1 ，但 关于异恶草酮对三叶浮萍的毒性研究还未见相关报道。因此，以三叶浮萍为对 象研究异恶草酮对其生长的影响，为利用三叶浮萍监测水体污染提供科学的依 据，同时也为异恶草酮对水生植物的毒性效应作出科学的评价。 l 材料与方法 1 1 药品和试剂： 异恶草酮纯品( 9 9 9 7 农业部药检所) ，使用前配成4 8 2m g l 的甲醇溶液，保 存在0 4 c 冰箱中，使用时用培养液稀释至相应浓度，培养液( 按文献4 5 配制) ， 丙酮( 分析纯) 1 2 仪器设备 7 2 1 分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) k e g 一2 5 0 一g 生化培养箱( 广东省医疗器械厂) t g 3 3 2 a 型电子分析天平( 湘仪天平仪器厂) c e d x 一2 8 0 型便携式高压灭菌锅( 上海申安医疗器械厂) 1 3 三叶浮萍的采集和培养 从实验基地的水稻田周边的小水塘中采集纯种的三叶浮萍( l e m n a m i n o r l ) ，将其放入曝气的自来水中驯养3d ，然后再放在搪瓷盘中，加入约2 5c m 高的 培养液进行驯化培养，在2 5 2 ，40 0 0 1 0 0 1 u x 照度+ f 进行光照，每隔两天 湖南农业大学硕士学位论文 异恶草酮的水环境毒理学及水解动力学研究 向盘内添加培养液以保持水面高度。于试验前取外形完好，具有3 个植物体f 每 株浮萍有3 片叶状体，称为植物体) 的、形状和大小都相近的三叶浮萍进行毒性 试验。 1 4 培养液的组成4 5 】 培养液选用美国e p a 推荐的绿藻培养液配方，并参考有关文献4 5 5 0 1 进了 小部分的修改：m g s 0 4 7 h 2 00 。6 2 9 l ，c a c l 2 2 h 2 0o 5 4 9 l ，k n 0 3o 4 9 l ， k h 2 p 0 40 2 9 l ，m n c l 2 4 h 2 0o 4 7 m g l ，h 3 8 0 30 5 m g l ，n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 0 1 2 m g l ，z n s 0 4 7 h 2 05 0pg l ，c u s 0 4 5 h 2 02 51 , 1g l ，c o c l 2 6 h 2 02 5ug l 。 配制好的培养液于1 1 0 高压灭菌3 0m i n 。 1 5 实验设计 1 5 1 预实验 参照有关文献报道( 4 6 q o i 进行试验设计，在直径为1 2 5c l n 的培养皿中加入 一定量的异恶草酮的标准溶液，再用经曝气处理的蒸馏水将异恶草酮稀释至有 效质量浓度分别为0m g l ，o 2 4m g l ，1 9 3m g l ，1 9 3m g l ，9 6 5m g l ，每 个培养皿内盛供试溶液7 0 0m l ，并加盖培养。每个浓度处理组设3 个重复， 每个重复在容器内盛放1 5 个植株体( 即5 株具有3 片叶状体的三叶浮萍) 进行实 验。 1 5 2 毒性实验 在预实验的基础上，以培养液为稀释液，设5 0m g l ，o 2 4m g l ，o 4 8m g l ， o 。9 6m g l ，4 8 3m g l ，9 6 5m g l ，1 9 3m g l7 个异恶草酮浓度处理组，一个 对照组。每个处理放入1 5 个植株体( 5 株具有3 片叶状体的三叶浮萍) ，并设3 个重复。在光照培养箱中连续光照进行培养，控制温度在2 5 2 ，连续9 6h ( 即4 d ) 观察并记录浮萍的生长情况，计算其生长速率和生长抑制率，并测定 其色素的含量。 1 6 浮萍生长指标的记录与计算5 3 , 5 4 l 每日记录浮萍的植物体数，为避免主观判断，只要新的植物体伸出母体的 边缘，就将其计算在内。对于老化而死亡及失去色素，变白变黄的个体不记录， 并绘制生长曲线。浮萍植物体数的增加表示浮萍的生长，各浓度组与对照组的 1 4 湖南农业大学硕士学位论文 异恶草酮的水环境毒理学及水解动力学研究 差值表示异恶草酮对浮萍的毒性效应 5 1 , 5 2 】。采用美 蛩e p a 推荐的统计方法，将 记录的浮萍生长情况数据根据以下公式求出各浓度组的生长速率( v ) 和生长抑 制率( i ) ： 生长速率v = l n ( n t n 。) t 生长抑制率i = ( v 。一v 。) v 。x1 0 0 式中：n t 是时间t 时的植物体数；n 。是初始植物体数；v 。是对照组生长速 度；v 。是浓度组n 的生长速度。将i 与浓度的对数值( 1 n c ) 作图，用图解法求得异 恶草酮对浮萍的半数抑制浓度( 1 c 5 0 ) 。 1 7 色素含量的测定5 5 5 7 】 实验结束时，在每个容器中随机选择一定数量的浮萍叶片，称重并洗净， 加入少量的c a c 0 3 粉末和8 0 丙酮进行研磨，充分匀浆。然后加1 0m l 丙酮进 行提取。上清液过滤到5 0m l 容量瓶中，再磨碎余渣，再用8 0 丙酮提取，如 此提取两次至残渣不呈绿色，用少量丙酮洗净研钵和滤纸上的色素。滤于容量 瓶中，定容至5 0 m l ，以丙酮为参比，光程为1c m ，在7 2 1 分光光度计上于4 4 0n m 、 6 4 5n m 、6 6 3n m 处测定消光度，按以下公式计算叶绿素a ( c 。) 、叶绿素b ( c b ) 、 叶绿素总量( c 。+ b ) 和胡萝h 素( c k ) 在溶液中的浓度。 c a ；1 2 7d 6 6 3 2 6 9d “5 c b = 2 2 9d 6 4 5 4 6 8d 6 6 3 c a + b 22 0 2 d 6 4 5 十8 0 2 d 6 6 3c k 2 4 7d 4 4 0 一0 2 7c a + b 式中：c 。为叶绿素a 含量，c b 为叶绿素b 含量，c 。+ b 为叶绿素总含量，c k 为 胡萝h 素含量；0 4 4 0 为4 4 0n m 处光密度，d 6 4 5 为6 4 5n m 处光密度，d 6 6 3 为6 6 3n m 处光密度。然后按下式计算其组织色素含量： 色素含量( m g g ) = c ( m g l ) 提取液总量( m l ) 稀释倍数样品鲜重( m g ) 2 结果分析 2 1 异恶草酮对三叶浮萍生长的影晌 浮萍在9 6 h ( 目0 4 d ) 的实验中各处理组的植物体数及每个处理各平行之间 的s d 2 和偏差见表1 1 1 4 。异恶草酮对三叶浮萍生长速率和生长抑制率的影响 情况见表1 5 1 6 和图1 1 。 兰堕型些堡主堂垡堡奎墨垩芏墅塑查堕堡兰幽垫查堂堕 表1 1 异恶草酮l d 对浮萍植物体个数的影响 表1 2 异恶草酮2 d 对浮萍植物体个数的影响 t a b l e1 1e f f e c to fc l o m a z o n eo nl e m m a ! ! ! ! ! ! ：! ! ! ! ：竺! 坐! ! ! ：! ! 未羹薹平行l 平行2 平行，s d 2 偏差酮浓度 ”一 ( m g l ) ( 个) ( 个)( 个) ( ) 0 0 2 4 0 4 8 0 9 6 19 3 48 3 9 6 5 62 21 1 7 8 2 2l l3 1 4 8 91 7 1 2 6 97 9 1 5 66 5 08 95 1 20 078 竺! ! ! ! ! ：! ! ! ：! 表1 | 3 异恶革酮3 d 对浮萍植物体个数的影响 t a b l e13e f f e c to fc l o m a z o n eo nl e m m a p a u c i e o s t a t a sg r o w t ha f t e r3 d 兰要! 平行1平行2 平行3 ， 偏差 酮浓度s d 2 ” ( m g ，l ) ( 个)( 个)( 个) ( ) t a b l e1 2e f f e c to fc l o m a z o n eo nl e m m a p a u c i c o s t a t a sg r o w t h a f t e r2 d 兰苎量 平行1平行2 平行3 ， 偏差 酮浓度s d 2 ( m g ，l ) ( 个)( 个)( 个】 ( ) 表1 4 异恶草酮4 d 对浮萍植物体个数的影响 t a b l e1 4e f f e c to fc l o m a z o n eo l ll e m m a p a u c i c o s t a t a sg r o w t ha f t e r4 d 量登苎 平行1平行2平行3 s d 2 偏差 酮浓度 ”。一 ( r a g l ) ( 个)( 个) ( 个)( 个) ( ) 1 6 墙 四 嬲 孔 墙 旧 m 拍 坶 伸 螺 埔 坫 船 舱 坶 均 湖南农业大学硕士学位论文 异恶草酮的水环境毒理学及水解动力学研究 实验结果表明：异恶草酮处理浓度在0 2 4m g l 时，三叶浮萍的生长情况与 对照组浮萍生长情况相似，只是在第1 d 和第2 d 浮萍的生长情况略微的高于对照 组，表现出一定的促进浮萍生长的作用。而其它浓度组与对照组比较对三叶浮 萍的生长情况都表现出不同程度的抑制作用。如处理浓度为1 9 3m g l ，其第1 d 的浮萍植物体个数平均为1 7 3 个，比对照组平均浮萍植物体个数2 1 3 个减少了 1 8 7 ；其第2 d 的浮萍植物体个数平均为1 5 6 个，比对照组平均浮萍植物体个 数3 1 0 个减少了4 9 6 ；其第3 d 的浮萍植物体个数平均为1 0 0 个，比对照组平均 浮萍植物体个数4 2 4 个减少了7 6 4 ；其第4 d 的浮萍植物体个数平均为7 6 个， 比对照组平均浮萍植物体个数4 7 4 个减少了8 3 6 ，对浮萍的生长表现出明显 的抑制作用，且这种抑制作用随这处理时间的增长也明显的增大。 图1 1 异恶草酮对三叶浮萍生长的影响 f i 9 1 1e f f e c to fc l o m a z o n eo nl e m m a p a u c i e o s t a t a sg r o w t h 异恶草酮对三叶浮萍的毒性影响实验结果见表1 5 - 1 6 。结果表明：低浓度的 异恶草酮( o 9 6m g l ) 对三叶浮萍的生长则具有明显的抑制作 用，而且这种抑制作用随着浓度和时间的增加而增大，且表现出良好的“浓度、 时间一效应”关系。如在处理浓度为o 9 6m # l 时，异恶草酮对三叶浮萍的生长 抑制率在6 3 4 到1 7 9 6 的范围，4 d 的平均抑制率为3 5 9 1 ；在处理浓度为 1 9 3 m g l 时，异恶草酮对三叶浮萍的生长抑制率在7 7 7 到2 6 6 9 的范围， 4 d 的平均抑制率为3 5 9 1 ；在处理浓度为4 8 3 m g l 时，异恶草酮对三叶浮萍 的生长抑制率在9 9 2 到6 1 7 2 的范围，4 d 的平均抑制率为3 5 9 1 ；在处理 浓度为9 6 5m g l 时，异恶草酮对三叶浮萍的生长抑制率在4 8