（纺织化学与染整工程专业论文）光催化和酶法制备低聚壳聚糖的研究.pdf

擒要 摘簧 巍黎藉是种其有睇境友好特蛀的天然高分予材辩，它怒从来源j 。泛的 甲党索髓乙酰化获得的，艇降解产物一低擀壳聚糖具有许多优异的性能。目 前，低聚壳聚糖的制替方法有很多种。本定以壳聚糖为原料，通过光催化法 帮纾绻素簿法亲磷究其降解情况。主要包戆以下磷突工毒# ： 光催化法降解壳帮糖在国内外鲜青报邀。本文酋次对其进行了详细的探 究，实验袭列：只有在光能化剂和紫辨光照射i i 毒时作用下，嚣聚糖才能发生 光催化降解反廊生成低浆瓷聚糖。在弱酸性反应体系。p ，产物的分子量随蓑 镬纯翻独径鳇躐少、催纯剂用量薛矮加、紫辨光照时闻熬延长舔黪低；就井， 催化粼的趣型、光源及反应体系的翊傻等均有对反沲有影响。加入微量的 h , oz 确利于一o i j 的形成从而提高光催化降解反应的效果而过量的心0 。会与 壳聚糖在麓纯裁表面发生觉争，减少0 h 的生成或俘获光皴空欠。 f 纾避索酶对壳聚糖哭有明显的降簿作羟l 。零论文详绸磅究了酶楚理滠 瘦、p h 值、酶翡用莹瓤爱应时闾谱匿豢对纤维素酶簿瓣壳黧耱的影确，研 究认为，在弱酸性反应体系中，随着反应潞度的7 t - 高，反应时例的延k 和纤 维紊簿用量的增加，晦解产物的榴对分子燃明显降低。四章孛蹋索对纤维素酶 鼹簿壳聚籍瓣影囔程蹙为：反应簿系酶p h 傻 夏疲滠瘦 爱应秘瞄) 纾维 素酶的用最；实验结果表明，纤维索酶降解壳聚糖的优化祭件为：反应体系 静p 壬 蘸为5o ，反应澄鹰为5 0 ，反应时涮为5 h ，纤维素黼的厣鼙为t 2 。 关鹱淘：酶聚嘉聚糖；编寒二蠢证钛；巍键纯；纤维素酶；跨簿 垒! ! 望型 s t u d yo np r e p a r a t i o no fc h i t o o l i g o s a c c h a r i d eb y p h o t o c a t a l y s i sa n dc e l l u l a s e a b s t r a c t c h i t o s a ni sa ne n v i r o n m e n t a lf r i e n d l yc r u d em a c r o m o l e c u l em a t e r i a l i ti s m a d ef r o mc h i t i n b yd e a c y l a t i o nt h a ti sd i s t r i b u t e d w i d e l y i n n a t u r e c h i t o o l i g o s a c c h a r i d et h a tist h ed e g r a d a t i o np r o d u c to fc h i t o s a nh a s m a n y e x c e l l e n tc a p a b i l i t i e si nt h i sp a p e r ，t h ed e g r a d a t i o nc o n d i t i o no fc h i t o s a nh a s b e e ns t u d i e d b yp h o t o c a t a l y s i sa n dc e l l u l a s e d e g r a d a t i o n t h ef o l l o w i n g r e s e a r c hw o r kh a sm a i n l yb e e nd o n ei nt h es u b j e c t t h e r ea r eh a r d l ya n yr e p o r t sa b o u tp h o t o c a t a l y s i sd e g r a d a t i o no fc h i t o s a n i nt h i sp a p e r ，i th a sb e e nf i r s t l ys t u d i e di nd e t a i l s t h ee x p e r j m e n ts h o w e dt h a t c h i t o s a nc a nb ed e g r a d e dn o n eb u tp h o t o c a t a l y s ta n du l t r a v i o l e tr a d i a t i o nw e r e o c 。“r e da tt h es a m et i m et h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to fd e g r a d a t i o np r o d u c t d e c r e a s e dw i t ht h eu l t r a v i o l e tr a d i a t i o ni r r a d i a t e dt i m e p r o l o n g e d ，c a t a l y z e r d i m e n s i o nr e d u c e da n da m o u n ta d d e df u r t h e r m o r e ，c a t a l y z e rg e n r e ，l a m p - h o u s e a n dp hc a na l s oh a v et h e i n f l u e n c e a d d i n gal i t t l eo fh 2 0 2w a si nf a v o ro f c r e a t i n gh y d r o x y lt h a t c a l le n h a n c et h ee f f e c t o fp h o t o c a t a l y s i s d e g r a d a t i o n r e a c t i o n h o w e v e r ，s u p e r f l u o u sh 2 0 2c a nd e c r e a s eh y d r o x y l c e l l u l a s eh a so b v i o u sd e g r a d a t i o na c t i o n o fc h i t o s a n t h ei n f l u e n c j n g t j 吼o r so nt h ed e g r a d a t i o nr e a c t i o n ，i n c l u d i n gr e a c t i o n t i m e ，p h ，t e m p e r a t u r e a n dc e l l u l a s ea m o u n t ，w e r es t u d i e di nd e t a i l s t h er e s u l t so b t a i n e di n d i c a t e dt h a t t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to fd e g r a d a t i o np r o d u c td e c r e a s e dm a r k e d l vw i t h t h er e a c t i o nt i m e ，t e m p e r a t u r ea n dc e l l u l a s ea m o u n ti n c r e a s e d d i f f e r e n tf a c t o r s h a v ed i f f e r e n ti n f l u e n c i n gd e g r e e t h e r ew a sa s e q u e n c ea sf o l l o w i n g ：p h a b s t r a c t t e m p e r a t u r e t i m e c e l l u l a s ea m o u n t t h eb e s td e g r a d a t i o nc o n d i t i o no f c h i t o s a nb yc e l l u l a s et h a tw a sg i v e nf r o mt h ee x p e r i m e n tr e s u l t si s ：t h ep hi s 50 ，t h et e m p e r a t u r ei s5 0 ，t h et i m ei s5 h ，t h ec e l l u l a s ea m o u n ti s12 k e y w o r d s ：c h i t o o l i g o s a c c h a r i d c ； n a n o t i t a n i u md i o x i d e ； p h o t o c a t a i y s i s ； c e l l u l a s e ；d e g r a d a t i o n 第一章前言 第一章前言 1 1 甲壳素和壳聚糖 甲壳素( c h n in ) 又叫几丁质、甲壳质、聚乙酰氨基葡萄糖等，大量存 在于节肢动物，如虾、蟹的甲壳之中，也存在于菌类、昆虫类、藻类细胞膜 和高等植物的细胞壁中，分布及其广泛”。”。它是种丰富的自然资源，是 地球上产量仅次于纤维素的第二大可再生资源，每年的生物合成量近1 0 0 亿 吨，在蟹、虾、龙虾等水产品加工过的甲壳废弃物中甲壳素的含量为l 0 3 0 。由于甲壳素不溶于一般溶剂，所以食用以后的蟹虾壳等大多按废品 处理，结果造成了自然资源的大量浪费和生活环境的污染。近年来，由于化 学及其它工业的发展及对甲壳素研究的深入，发现甲壳素资源具有许多优异 的特性，愈来愈受到人们的重视。 甲壳素是一种天然的高分子化合物，属于碳水化合物中的多糖，其化学 结构和植物纤维素非常相似，都是六碳糖的聚合体。它的化学名称是b 一( 1 ，4 ) 一2 一乙酰胺基一2 一脱氧一d 一葡萄糖，是由n 乙酰氨基葡萄糖以b 一( 1 ，4 ) 糖苷键缩合而成的，所以又称为聚( n 一乙酰基一d 一葡糖胺) ，分子量为1 0 0 万 2 0 0 j j ，氮含量约为6 3 6 7 ，是自然界中罕见的带正电荷的纤维结构 化合物”1 。甲壳素的化学结构式如图】 所示： 图l ，1 甲壳素的化学结构式 f i g i 1c h e m ic a ls t r u c t u r a lf o m u l a0 fc h i t i n 【 青岛大学硕士学位论文 壳聚糖( c h i t o s a n ) 又名可溶性甲壳素、脱乙酰甲壳素、甲壳胺和聚氨 基葡萄糖，是迄今为止发现的唯一天然碱性多糖，1 9 9 1 年被欧美学术界誉为 继蛋白质、脂肪、糖类、维生素和无机盐之后的第六生命要素”、。壳聚糖 是甲壳素结构式中糖基上的n 一乙酰基被大部分脱乙酰化得到的产物，是由 b 一( l ，4 ) 一2 一脱氧一口一d 一葡萄糖单元和b 一( 1 ，4 ) 一2 一乙酰氨基一日一d 葡萄糖 单元组成的线性共聚物”、“”，化学名称为0 一( 1 ，4 ) 2 一氢基一2 一脱氧一d 一葡萄 糖，分子量通常在几十万至上百万。一般而言，脱乙酰度超过5 5 的甲壳素 即i t j 称为壳聚糖1 。壳聚糖的化学结构式如图1 2 所示： n h c o c 图1 2 壳聚糖的化学结构式 壳聚糖大分子的分子量通常在几十万左右，因其分子中内外氢键的相互 作用，只能溶于少数的稀酸溶液中，而不能直接溶于水中。若通过适当的方法 将其分子量降低，则可得到能直接溶于水的低聚壳聚糖产品。分子量小于 1 0 0 0 0 的低聚壳聚糖具有许多优于壳聚糖大分子的功能性质，是壳聚糖及其 产品开发研究的热点之一”。 1 2 低聚壳聚糖的性质 甲壳素和壳聚糖作为一种生物相容性良好的生物材料，具有广阔的应用 移 0 h 札 ，ll梅 第一章前言 前景。随着对甲壳素、壳聚糖研究的深入，人们发现壳聚糖经水解生成的降 解产物一低聚壳聚糖( c h i t o o l ig o s a c c h a r i d e s ) ，由于其具有水可溶性，很 容易被机体吸收利用，具有独特的生理活性和功能性质。 从广义上说，低聚壳聚糖是指分子量大约小于10 0 0 0 ，水溶性好的低分 子量壳聚糖。从狭义上而言，低聚壳聚糖是指聚合度为2 1 0 的壳寡糖 ( c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e s ) 。同壳聚糖大分子相比，低聚壳聚糖具有一 些独特的功能性质。这些性质包括水溶性、吸温保湿性、抗菌抑菌性、抗肿 瘤、降胆固醇和提高动植物的生理活性等。 1 21 水溶。 生 壳聚糖是含氮多糖类天然生物活性物质，在其大分子链结构中含有大量 的一n h ：和一o h 基团。当壳聚糖降解时，分子量降低，壳聚糖分子内的氢键作 用随之减弱，使壳聚糖分子在溶液中具有更大的扩展趋势，从而引起壳聚糖 分子构象发生一定的变化。而分子链长度的减短和分子构象的变化，使得壳 聚糖在水溶液中各分子链间运动的无序程度增加，分子链上游离一n h ：水合作 用增强，从而使得壳聚糖的水溶性大为改善“。特别是平均分子量低于15 0 0 的低聚壳聚糖，水溶性高达9 88 8 ，而分子量达几十万壳聚糖其水溶性仅为 6 8 4 ，壳聚糖分子量的大小是决定其水溶性高低的主要因素“。 12 2 吸湿保湿性 低聚壳聚糖分子中大量的一n h 。和一o h 等强极性基团的存在，不仅使低聚 壳聚糖的水溶性大为改观，吐i 使其具有良好的吸湿保湿功能。夏文水等“” 研究表明，平均分子量一定的低聚壳聚糖具有优于甘油和透明质酸的吸湿保 湿功能，且在一定的分子量范围内，随低聚壳聚糖分子量的降低，吸湿保湿 性能逐渐增强；分予量为1 5 0 0 时吸湿和保湿能力最大；当分子量上升到3 0 0 0 时，吸湿和保湿能力基本不变：然而当分子量达到5 0 0 0 吲，吸湿和保湿能 青岛大学硕士学位论文 力明显下降，各项指标仅为分子量3 0 0 0 时的一半。 1 2 3 抗菌抑菌性 低聚壳聚糖具有明显的抗菌抑菌作用。夏文水等通过对大肠杆菌的抗菌 抑菌活性的试验，证明壳聚糖的抗菌抑菌作用电是随着壳聚糖分子量的降低 而逐渐增强的，其中尤以均分子量为1 5 0 0 的低聚壳聚糖的抗菌抑菌效果最 好。而且通过比较试验，还汪明了游离氨基的存在是壳聚糖抑菌抗菌作用的 基础。郑连英等”研究发现对革兰氏阴性菌，随壳聚糖分子量的降低，抗菌 性逐渐增强，分子量为5 0 0 0 以下抗菌作用最强，其原因主要是分子量越小， 越容易进入细胞壁的孔隙结构内，干扰细胞的新陈代谢，从而达到杀死细菌 的目的。k e is u k e “”对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行抑菌试验，发现分子 量低于2 2 0 0 的低聚壳聚糖很难抑制微生物生长；分子量大约在5 5 0 0 的低聚 壳聚糖能否抑制微生物繁殖，则视其浓度而定；当分子量达到9 3 0 0 的低聚 壳聚糖时，微生物的繁殖能完全被抑制。 1 24 抗肿瘤 甲壳素和壳聚糖具有抗肿瘤的生理活性“”2 “，低聚壳聚糖也具有这样的 活性，而且活性更高，特别是聚合度为6 - - 8 的壳聚糖。1 9 8 5 年，s u z u k i 等 ”就壳六糖的抗肿瘤作用作了报道。他们在移植了s 1 8 0 的d d y 鼠上静脉注 射壳六糖，结果七天后发现产生明显的肿瘤细胞抑制作用，而且多次注射能 完全抑制肿瘤的生长。1 9 9 0 年，o u c h it 等。”研究发现3 个壳寡糖通过六亚 甲基空间通道与5 一氟尿嘧啶( 5 - f u ) 共轭结合后，其抗肿瘤作用强于5 一f u 。 文镜等”采用体外肿瘤细胞培养法进行了整体观察，实验发现，低聚壳聚糖 能够抑制体外培养肿瘤细胞d n a 的合成。 12 5 降胆固醇2 ” 第一章前言 壳聚糖在2 0 世纪7 0 年代末被发现有降血脂、降血压和降胆固醇的作用， 其作用机理与消胆胺( 治疗胆固醇药剂) 相似，低分子量的壳聚糖具有吸收 胆汁酸和促进胆汁酸排出体外的作用，小肠内胆汁酸的减少促进肠内胆固醇 向胆汁酸转化，从而降低肝脏中胆固醇的含量。 1 26 提高动植物生理活性 s h i g e h i r o 等”7 1 将低聚壳聚糖注射到兔子的静脉中，发现可以使血浆中 溶菌酶的活性提高2 3 倍，大大增强了兔子对致病菌的免疫力。日本有关 学者通过对大豆、南瓜等实验发现低聚壳聚糖可以诱导植物抗毒素的产生， 激活植物的抗病系统，提高其抗病力“。另外，低聚壳聚糖还能促进蛋白质 的合成，促进植物细胞的活化，从而刺激植物的快速生长。 1 3 低聚壳聚糖的应用研究现状 低聚壳聚糖所特有的各种功能性质和生理活性，使其在轻纺工业、生物 医药、保健食品、日用化：恢品和农业等方面具有独特的应用价值。 1 3 1 在轻纺工业方面的应用 在印染方面，由于壳聚糖与纤维素有相似的结构，很容易吸附到织物表 面上，并且在稀酸溶液中，壳聚糖带有正电荷，可以提高阴离子染料的上染 速率和固色率，对日晒牢度及水洗牢度也有所改善。用壳聚糖处理棉织物可 以提高活性染料和直接染料的上染率，特别对于活性染料，可采用低盐或无 赫染色工艺，既有利于保护环境，还可以掩盖染色过程中由于不成熟棉引起 的疵布。羊毛织物经壳聚糖酸性溶液处理后，羊毛纤维上所带的负电荷量减 少，从而减少染色过程中纤维上的负电荷对染色剂阴离子的库仑斥力，使染 料的上染速率提高，显著提高了羊毛表面相对于内部的染料浓度梯度，使染 青岛大学硕士学位论文 料更易向纤维内部扩散，同时可降低染色温度，缩短染色时间。真丝织物经 壳聚糖处理后，上染率大大提高，与未经壳聚糖处理的相比，可节省3 0 的 染料。 在纺织方面，可作为抗菌纤维中的抑菌剂，也可制成抗菌纤维。细菌表 面通常带有负电荷，在酸性条件下，壳聚糖有聚阳离子性质，它能与细菌细 胞表面带负电荷的大分予基团作用，从而附着于细菌细胞表面，破坏其细胞 壁，使细菌的呼吸功能受抑制而致死。利用其抗菌抑菌作用，可将低聚壳聚 糖单独或与其它试剂混合制成溶液或乳液形式，通过浸轧或涂层手段对织物 进行后整理，赋予织物抗茁消臭功能。低聚壳聚糖的分子结构与人体内存在 的氨基葡萄糖结构相同，即具有类似于人体骨胶原组织的结构，这赋予了低 聚壳聚糖极好的生物医药特性，使其具有理想的生物相容性和生物活性，具 有抑菌、止血、消炎、镇痛、促进伤口愈合等作用，其纤维可做成手术缝合 线、止血棉、纱布、绷带、创可贴等各种医用敷料。还可用混合纺丝法将其 制成无纺布的人造皮肤或抗菌纤维。日本富士纺织株式会社于1 9 9 6 年首次 将这种抗菌纤维和棉混纺制成布料，制成了商品化的婴儿内衣产品”。 在废水处理方面，印染工业产生的大量废水通常含有盐类、有机表面活 。i f 剂和染料，不仅造成环境污染，也危害人体健康，而壳聚糖因其独特的分 子结构，对许多类型的染料有极高的亲和力；同时，壳聚糖又是一种天然高 分子螯合剂，因此它既可凝集废水中的染料，又可捕集铜、铬、锌等重金属 离子，是一种很好的废水处理剂。“3 。 132 在生物医药方面的应用 低聚壳聚糖在生物医药方面应用广泛。低聚壳聚糖具有促进脾脏抗体生 成、抑制肿瘤生长的生理功能，特别是低聚6 8 糖可通过活化人体中的淋 巴细胞、抑制癌细胞的繁殖和扩散来达到抗癌抑癌作用。”3 。据报道，均分子 量在15 0 0 左右的低聚壳聚糖对治疗骨病也极有疗效。低聚壳聚糖还可用作 6 第一章前言 诊断试剂。溶菌酶存在于人的血、尿中，当有某种疾患时病人则显示出高于 e 常值。利用这一特性，低聚壳聚糖被用于溶菌酶活性的临床诊断或医药、 食品的质量控验部门。此外，低聚壳聚糖可有效地降低肝脏和血清中的胆固 醇，增强免疫力和抗疾病能力，强化肝脏功能，防止痛风和胃溃疡等”“。还 可用于制造手术缝合线、医用敷布、人工皮肤以及制造免疫促进剂、抗肿瘤 剂、药物缓释胶囊、人工肾膜、抗凝血剂等。 1 33 在保健食品方面的应用 在保健食品方面，由于低聚壳聚糖是一种具有生物活性的天然高分子化 合物，具有低甜度、低热值、降血脂、降血糖等功效，而且无毒、无副作用， 因此，以低聚壳聚糖为主要原料生产的生物保健品，不仅有利于人体肠内双 歧杆菌的增殖，同时可抑制肠内有毒菌和腐败物质的生成，增加人体内纤维 素的质和量，提高机体的免疫力。此外，还可作为酒类和各种饮料的除浊剂、 食醋的防沉淀剂、原料糖汁的纯化剂”“，以及食品的防腐剂、保鲜剂、添加 剂、增稠剂和稳定剂等。 134 在日用化妆品方面的应用 在日用化妆品方面，低聚壳聚糖的应用主要是利用其优良的保湿增湿 性、成膜性、抗静电性，以及对皮肤无刺激、无毒等特性。低聚壳聚糖本身 具有成膜功能，又具有良好的透气性能，是一种强的吸湿剂和保湿剂，与传 统的保湿增湿剂相比，低聚壳聚糖的保湿增湿效果更佳，在洗发、护发、洗 面奶及各类护肤液、护肤霜、面膜中使用更显其优越性。”一”1 。 135 在农业方面的应用 在农业方面，低聚壳聚糖对植物生长、分化及生物体抗御方面具有信息 传达活性，可用于制备液体复合肥料的添加剂，还可用作种子包衣，防止有 7 青岛大学硕士学位论文 害物质及病毒对种子的损害。除此之外，还可作降解性地膜，用作农药、土 壤改良剂和植物生长调节剂等。 综上所述，低聚壳聚糖以其独特的各种功能性质，在医药、食品、化妆 品、纺织和农业等方面具有广泛的用途。尽管目前的技术限制还没有使其形 成一个规模产业，但伴随着越来越多的国家和研究机构在低聚壳聚糖应用方 面的大力研究，必将使低聚壳聚糖产品的开发与应用得到迅速的发展。 1 4 低聚壳聚糖的制备研究进展 一般而苦，由甲壳素脱乙酰化制得的壳聚糖分子量很大，分子量通常在 j l 十万到上百万，并且有紧密的晶体结构，虽然能溶于醋酸、稀盐酸、氯乙 酸等多种酸性介质中，但不能溶于水等普通溶剂，这使壳聚糖的应用受到极 大限制：另外，研究表明分子量剥壳聚糖的性质有很大影响，不同分子量的 壳聚糖性质差异很大，有时甚至表现出截然相反的特性，而壳聚糖的许多独 特功能只有在分子量降低到一定程度时才表现出来。因此，选择适当的方法 对壳聚糖进行降解就显得尤为重要。 目前，通过降解反应得到低聚水溶性壳聚糖的制备方法，主要有氧化降 解法、酸降解法、酶降解法和物理降解法四大类。 1 4 1 氧化降解法 氧化降解是目前研究得比较多的一种壳聚糖的降解方法，其中h ：o ：氧化 法更是有大量的文献报道，而且该法已经用于壳聚糖产品的工业化生产( 如 “鲟之宝”胶囊一上海伟康生物制品公司生产) 。较有代表性的几种氧化 降解法如下。 1 411h 。0 。法 第一章前言 将壳聚糖溶于1 的乙酸溶液中，在催化剂存在下，加入适量的h ：o z 溶 液，调节溶液的p h 值为3 5 进行降解反应；也可以在碱性溶液中反应，调 节壳聚糖溶液的p h 值为1 1 5 ，温度7 0 。c 左右，分批加入定量3 5 的h z o ： 溶液进行降解反应。据文献报道，h ：o ：氧化法制各的低聚壳聚糖的均分子量 可达到2 6 0 0 。 14 1 2h , o2 一n a 0 10 ：法 在0 0 0 4 1 0 的n a c l 0 ：及0 0 1 3 5 0 的h 。0 。溶液中加入适量盐 酸进行降解反应，反应在8 0 进行lh 后，用n a o h 中和，再经n a l 3 h 处理后 可得到均分子量为6 0 0 的低聚水溶性壳聚糖。 1 413h2 0 。一h c l 法 将壳聚糖溶解在稀h c i 溶液中，加入适量n a o h 溶液使其形成悬浊液， 然后加入一定量的i - 1 。0 。溶液在7 0 进行氧化降解反应；也可以在壳聚糖的稀 酸溶液中，直接加入h ：0 ，和浓h c l 溶液在8 0 进行蛑解反应，得到低聚水溶 性壳聚糖产物。 14 14 其他氧化降解法 除了上面所述的几种h ：o 。氧化法外，其他的一些氧化法还有( 1 ) n a t b o ， 法。该法是将壳聚糖与n a 。b o 。在水溶液中进行非均相降解反应，得到无色或 略带微黄色的低聚水溶性壳聚糖产品。这种降解方法的最大优点是降解反应 是通过开裂壳聚糖的b 一( 1 ，4 ) 糖苷键来进行的，反应前后的n h ! 一含量无任 何变化。( 2 ) c 1 0 ：法。将0 0 5 的c i o 。溶液加入酸性壳聚糖溶液中，在6 ( ) 进行降解反应，得到无色低聚壳聚糖产品。( 3 ) c 1 ：氧化法。将壳聚糖溶于 稀酸溶液中，然后通入一定量的c 1 ：进行降解反应，反应结束后，加入n a b i 和n a o h 处理得到降解产物。这几种氧化降解方法，从目前研究进展来看， 0 青岛大学硕士学位论文 还只能得到分子量较高的降解产物，其均分子量大约为2 5 万。 14 2 酸降解法 壳聚糖很容易溶于稀酸溶液中，而要用酸对壳聚糖进行降解反应以制备 低聚水溶性壳聚糖，必须强化其反应条件。早在本世纪5 0 年代就有人用酸 对壳聚糖进行降解，得到了低聚水溶性壳聚糖。目前，已有多种以酸为主要 反应试剂的降解壳聚糖的方法。 1 42 1 酸一亚硝酸盐法” 将壳聚糖溶于一定质量分数的乙酸或盐酸稀溶液中，然后在搅拌下缓慢 滴入一定量的亚硝酸盐溶液( 如n a n o 。) ，于4 下静置一段时间，使一n h ：发生 重氮化反应，脱去一分子n 。，引起分子内重排使大分子链断裂，再用n a b h 。 还原端基，完成降解反应；或是先将壳聚糖分散于亚硝酸盐的水溶液中，然 后在室温下慢慢将一定浓度的酸加入进行反应。反应2 4 h 后，用碱调溶液 的p h 值为5 6 ，经净化分离得到降解产物。利用该法可制备均分子量为 2 0 0 0 3 0 0 0 、分子量分布相对狭窄的低聚水溶性壳聚糖“。1 。其反应机理被认 为是：h ：n o 。+ 选择性的进攻壳聚糖分子中的氨基，使得聚合物的p 一( 1 ，4 ) 糖 苷键断裂“。 这是传统的化学降解方法，降解产物的分子量可以通过改变n a n o ：的加人 量和反应时问来控制，国内常用此法降解壳聚糖并提取产物中的单糖组分。 该法的主要缺陷在于：( 1 ) 产品的分子量分布太宽，均一性差；( 2 ) 降解过程 中破坏了氨基，理论上加入l 摩尔n a n o 。就要消耗1 摩尔氨基。而壳聚糖良好的 生物相容性主要由氨基提供，同时分子链上存在足够数量的氨基也是壳聚糖 进行进一步改性的重要前提，氨基数量的减少将会使壳聚糖的应用受到限 制：( 3 ) 生产的三废污染严重。 第一章前言 用酸和碱将壳聚糖纯化后，加入浓盐酸溶液进行降解反应。反应4 8 h 后 溶液在真空瓶中冷却，然后用乙醇洗涤，浓硫酸真空干燥，制得聚合度小于 1 0 的产品壳聚糖一盐酸盐；若反应时间达到7 2 h ，则可得到其单糖一盐酸盐。 用这种方法得到的低聚水溶性壳聚糖一盐酸盐的分子量分布比较宽。 1423 过醋酸法 以商品过醋酸或以浓硫酸为催化剂，用h2 0 。先将醋酸酐( a c 。o ) 氧化成过 醋酸( c h ，c 0 0 0 h ) ，加入到壳聚糖的乙酸溶液中进行降解反应。利用这种方法 制备的低聚水溶性壳聚糖产品具有可以长期保存的优点，特别适合于食品及 化妆品所用的低聚水溶性壳聚糖的生产。 1424 其他酸解法 除了上面几种酸解法外，其他的酸解法还有浓硫酸法和氢氟酸法。浓硫 酸法是在某些无机酸( 如h c l ) 中加入6 5 的浓硫酸对壳聚糖进行降解反应， 反应一定时间后再用体积比为( 5 7 ) ：1 的m e 。c o h 。s o 。混合液进行处理， 得到较高产率的低聚水溶性壳聚糖产品。氢氟酸法是将壳聚糖溶于稀酸中， 加入h f 溶液进行降解反应。反应l5 h 后，以适量c a c o 。中和未反应掉的h f ， 过滤，将滤液冷冻干燥、分离，盯得到聚合度为2 6 的壳聚糖寡糖。 酸降解法是壳聚糖降解制备低聚水溶性壳聚糖的一种较好的方法，利用 这种方法可分离得到低至单糖的各种低聚壳聚糖。其降解反应所用试剂廉价 易得，易于实现产业化。 143 酶降解法 酶法降解是用专一性酶或非专一性酶对壳聚糖进行生物降解而得到均 分子量较低的低聚壳聚糖。酶法降解过程通常优于化学反应降解过程。这是 1 1 青岛大学硕士学位论文 由于酶法降解过程和降解产物的分子量分布更容易被控制，从而可以便利地 对降解过程进行监控，得到所需一定分子量范围的低聚壳聚糖。而且，酶法 降解是在较温和的条件下进行的，相对于其他两种方法，酶法降解不需要加 入大量的反应试剂，对环境污染较少。目前，已发现有3 0 种左右的专一性 或非专一性酶可用于壳聚糖的降解反应，从而生成各种分子量的低聚壳聚 糖。这些酶包括专一性降解酶如壳聚糖酶；非专一性降解酶如脂肪酶、溶菌 酶、蛋白酶、元酶、聚糖酶等。“2 1 1 4 3 ，1 壳聚糖酶 壳聚糖酶( c h i t o s a n a s e ) 主要存在于真菌细胞中。自然界中真菌和无脊 椎动物( 主要结构成分为甲壳素) 的年产量估计高达数十亿吨，它们的降解主 要就是由细菌和真菌分泌的甲壳素酶来完成，或是通过脱乙酰化作用形成壳 聚糖，再由壳聚糖酶来降解的。若控制定的条件，利用壳聚糖酶对壳聚糖 大分子进行降解，则可方便地得到低至二至七糖的水溶性壳聚糖，甚至单糖。 p e r k i l 7 s 等利用芽孢杆菌属壳聚糖酶对其降解壳聚糖的水解性能进行了研 究，得到了低分子量的降解产物；t a k i g u c h i 使用芽孢杆菌属于s p 7 一m 株得 到的壳聚糖酶进行降解反应，成功地得到了二至五糖的低聚壳聚糖：m i y a k e 利用芽孢杆菌属l c c l 株得到的脱乙酰基壳聚糖酶在p | 值5 0 下降解i o h ， 获得了平均分子量为15 0 0 的低聚壳聚糖。由此可见，壳聚糖酶是降解壳聚 糖的很好的方法，特别是在制备聚合度比较小的低聚壳聚糖时，更显出其优 越性。 1 4 3 2 脂肪酶 脂肪酶( 1 ip a s e ) 是作用于水一有机界而上不溶性物的脂酶。最近几年， 脂肪酶对于壳聚糖的降解反应已引起一些研究者的兴趣。夏文水等使用麦胚 脂肪酶对壳聚糖及其衍生物的水解作用进行了研究。麦胚脂肪酶在微酸性条 12 第一章前言 件下能非常有效地使壳聚糖及其衍生物降解，这种酶能在几分钟内快速降低 壳聚糖粘度，使壳聚糖的平均分子量降低，形成无任何偏向的分子量组分。 p a n t a le o n e 等人亦利用来自猪胰腺的脂肪酶( l i p a s ea i e ) 对壳聚糖的非专 一性水解作用进行了研究。通过对降解产物的粘度分析可知：在一定的蛋白 质与壳聚糖比率下，粘度降解百分率v d p 可达到10 0 。这些研究结果表明， 脂肪酶对壳聚糖的降解效率很高，有必要对其产业化的可能性进行进一步的 研究。 14 33 溶菌酶 溶菌酶( 1y s o z y m e ) 广泛存在于鸡蛋蛋白及人的唾液中，其中从鸡蛋蛋 白中提取的溶菌酶的转糖苷化能力较强，而从人的唾液中提取的溶菌酶裂解 一l ，4 糖苷键的能力较强。傅民等利用溶菌酶( h 海丽珠东方生物技术有限公 司生产) 对壳聚糖的降解作用进行了研究。结果表明，溶菌酶在一定条件下 可有效地降解壳聚糖且初始速度很快，反应l o m i n v d p 即可达5 5 。若先对 壳聚糖的乙酸溶液进行适当的处理，再由溶菌酶在3 7 进行较长时间( 6 天 左右) 的降解，则经分离可得到较高收率的二至四糖产物。 溶菌酶在一定条件下对壳聚糖的降解为低聚壳聚糖作为口服保健品提 供了有力的保证，人体口腔唾液中所含有的大量溶菌酶，可使壳聚糖口服液 很快发生生物降解，有利于人体的吸收。 1 4 ，3 4 其他非专一性水解酶 壳聚糖和纤维素都是由d 一葡萄糖经聚合形成的以糖苷键连接起来的同 多糖化合物，由于结构上的相似性，它们对于壳聚糖的降解作用应该也是相 似的。p a n t a ic o n e 等人就纤维素酶和些其他酶在一定条件下对不同均分子 量壳聚糖溶液的降解作用的研究证明了这点：( 1 ) 对于较低粘度的壳聚糖溶 液，些聚糖酶( g l y c a n a s e ) 对壳聚糖有显著的降解作用，其中纤维素酶 13 青岛大学硕士学位论文 ( c e l l u l a s et v 、c e l l u l a s ea p ) 和果胶酶( p e c t i n a s e ) 的v d p 可达9 9 ，半 纤维素酶( h e m i c e l l u l a s e ) 的v d p 为9 3 ，淀粉酶( a m y l a s e ) 和葡聚糖酶 ( d e x t r a n a s e ) 的v d p 为7 0 8 0 。( 2 ) 对于较高粘度的壳聚糖溶液，试验 所用的3 8 种酶中v d p 在6 0 1 0 0 的有1 7 种，v d p 在2 0 6 0 的有1 2 种，还有9 种酶只有轻微的降解作用或完全没有降解作用( v d p 为o 15 ) 。 其中仍以聚糖酶的降解效率最高，木瓜蛋白酶( p a p a i n ) 和单宁酶( t a n n a s e ) 也显示了较强的降解能力。m u r a k i 等人进行的研究得到了与p a n t a l e o n e 的 研究成果相似的结论。y a l p a n i 等人的研究结果表明：在一定的酶与底物比 率下，半纤维素酶具有比甲壳素酶( c h i t in a s e ) 及溶菌酶更好的降解能力； 各种酶降解所适宜的p h 值是不同的，纤维素酶为4 5 ，木瓜蛋白酶为3 ，0 4 0 ，半纤维素酶为3 5 ：各种酶适宜的降解温度亦有差别，一般为3 0 6 0 。 总之，酶降解法制备低聚水溶性壳聚糖的研究是非常有意义和有前途 的，特别是由此能得到较高收率的六至八糖更是在食品及医药方面( 抗癌药 物) 有着广泛的用途。但要以经济成本进行大规模工业化生产，还需要进行 更深入的研究。 1 4 4 物理降解法 除了上面介绍的氧化降解法、酸降解法以及酶降解法外，还有一些物理 方法也可以用于壳聚糖的降解，如微波法、超声波法、辐射法等。超声波法 降解壳聚糖，产物的n h 。一含量不随降解时间而变化，但用超声波处理过的壳 聚糖溶液的粘度会随存放时间的增加而减小。微波降解壳聚糖可以使甲壳素 脱乙酰化反应与壳聚糖降解反应同时进行，这样降低了甲壳素脱乙酰化过程 的碱用量，缩短了反应时间，可有效地降低生产的成本。不过，用这些方法 来制各低聚水溶性壳聚糖，还有待进一步研究。 第一章前言 15 现有研究方法的不足之处 利用上述降解方法对壳聚糖进行降解处理，都可以得到低聚水溶性壳聚 糖。但是，究竟哪一种方法更适合用于壳聚糖的降解，现在还不能断定。 氧化降解法目前发展得比较快，不断有新的氧化降解方法见诸报道，特 别是在日本，把这种方法应用于工业化生产，已有多种壳聚糖保健食品上市。 不过，氧化降解法普遍采用了多种试剂进行降解反应或降解产物的后处理， 这给产品的分离、纯化增添了困难。相对而言，氧化降解方法在制备较高分 子量范围( 1 万左右) 的壳聚糖产品时更为有利。酸解法是非特异性的降解过 程，降解过程较难控制，所得降解产物的分子量范围很宽。虽然这种方法早 已用于工业化生产，各种分子量范围的壳聚糖产品都能得到，但要得到特定 分子量范围且具有较高收率的低聚壳聚糖产品还是比较困难的；酸解过程引 入了强酸，还会造成一定的环境污染。酶降解法可特异地、选择性地切断壳 聚糖的b ( 1 ，4 ) 糖营键，降解条件温和，反应过程易于控制，易于得到所 需分子量范围的壳聚糖产品。但是，在选择合适的酶种以适合工业化大规模 生产上，尚存在困难。 总之，利用降解反应制各低聚水溶性壳聚糖以用于保健食品、药物、化 妆品等方面的生产是非常有前途的一个研究课题。目前，大多数的降解方法 还只是处于实验室研究阶段，要最终实现产业化大生产、产生显著的社会经 济效益，还必须在其降解机理、降解效率、降解产物的分子量分布、降解产 物的分离、纯化等方面进行更深入的研究，并探索新的经济可行的降解方法， 开发新的生产工艺。 1 6 本论文的主要研究内容和目的意义 基于上述介绍，壳聚糖的研究具有一定的理论价值和实际意义。由于在 青岛大学硕士学位论文 进行壳聚糖的有关应用研究时，不能回避壳聚糖的降解和分子量问题，因此 对壳聚糖的降解研究不但有助于加深对壳聚糖的认识，还可以为我国的壳聚 糖产业发展提供技术支持。 鉴于降解涉及到很多方面，并且现有的壳聚糖降解方法还需要进一步完 善，因此本论文的研究目的是寻找一种新型环保的壳聚糖降解方法，并研究 了纤维素酶降解壳聚糖的工艺。 主要研究内容包括： 1 ) 光催化法降解壳聚糖的研究 对纳米t j 0 。光催化降解制各低聚壳聚糖进行初步研究，比较催化剂用 量、紫外光照时间、t i 0 。的晶形和粒径、不同光源、反应初始p h 值以及外 加h ：o 。等因素对光催化降解反应的影响。 研究出理想的光催化降解条件，既能有效地降解壳聚糖，同时又能减少 污染，反应易于控制。 2 ) 纤维素酶降解壳聚糖的研究 研究纤维素酶降解壳聚糖的最佳工艺条件，包括反应温度、p h 值、纤 维素酶的用量、反应时间这四个因素对壳聚糖降解效果的影响。 3 ) 低聚壳聚糖的性能测定 用双突跃电位滴定法和粘度法测定降解产物的脱乙酰度和粘度，从而得 到产物的相对分子质量。 第二章壳聚糖的性能 第二章壳聚糖的性能 2 ，1 壳聚糖的性能及测试方法 不同来源的原料、不同的制各条件及反应条件所制得的壳聚糖性能不 同。除了原料本身的因素以外，其中最为重要的是脱乙酰化反应，这是影响 壳聚糖性能的关键因素。因为甲壳素在浓碱高温或酶解反应条件下，除发生 脱乙酰化反应外，还伴随着分子主链的降解反应，致使分子量降低。而分子 量的大小和游离氨基的多少是反映壳聚糖性能的两个重要指标1 。一般用 n 一脱乙酰度来反映游离氨基的含量，用粘度来反映壳聚糖的平均分子量。 壳聚糖的脱乙酰度( d e g r e eo fd e a c e t y l a t i o n ，缩写为d d ) 可定义 为壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百 分数，也就是壳聚糖分子链上自由氨基的含量。壳聚糖脱乙酰度的高低，直 接关系到它在稀酸中的溶解能力、粘度、离子交换能力、絮凝性能和与氨基 有关的化学反应能力，以及许多方面的应用。根据n 一脱乙酰度的不同，壳聚 糖分为低脱乙酰度壳聚糖( n - 脱乙酰度在5 5 7 0 ) 、中脱乙酰度壳聚糖( n 一 脱乙酰度在7 0 8 5 ) 、高脱乙酰度壳聚糖( n - 脱乙酰度在8 5 9 5 ) 和超 高脱乙酰度壳聚糖( n - 脱乙酰度在9 5 1 0 0 ) 。n - 脱乙酰度1 0 0 的壳聚糖 极难制备。作为： 业品的壳聚糖，n 一脱乙酰度在7 0 以上。 典型的脱乙酰化处理过程是将甲壳素粉末或甲壳素片放入4 0 5 0 的氢 氧化钠溶液，在l o o 12 0 反应数小时，发生n 乙酰基链水解，如图2 1 所示： 青岛大学硕士学位论文 撂 篁 娇 迎萌 图2 1 壳聚糖的形成 重复此过程可以将脱乙酰度提高到9 8 ，但是如果不经过改性，这种异 相脱乙酰化处理过程不能得到完全脱乙酰化的甲壳素”“。完全脱乙酰化( 接 近1 0 0 ) 的壳聚糖可以通过用凝胶状的而不是粉末状的壳聚糖碱处理后得到 【, 14 1 目前，可以用来测定壳聚糖脱乙酰度的方法有很多，文献中提到的主要 有减量法( 包括酸碱滴定法“”川、电位滴定法“”1 、氢溴酸盐法拍23 等) 、红 外光谱法”5 、折光指数法“、胶体滴定法”“5 “、热分析法“、气相色谱法 ”3 1 、元素分析法”“”1 、紫外光谱一阶导数法“、紫外光谱法”。”。、苦味 酸分光光度法”、平衡染料吸附法“、“n 固体核磁共振法”、凝胶色谱法 等。常用的是酸碱滴定法，其次是红外光谱法和电位滴定法。其中最简单的 o u逸 移 o 第二章壳聚糖的性能 方法是酸碱滴定法，即取一定量的壳聚糖溶解于过量的稀酸( 如盐酸) 中， 用标准的氢氧化钠溶液滴定，通过测量p h 值确定等电点。采用双突跃电位 滴定法测定壳聚糖原料的p h 值，能有效地避免因壳聚糖吸附过量的酸或碱 而引起的滴定误差。 壳聚糖溶液的粘度与壳聚糖的相刺分子量有关，即一定浓度的壳聚糖溶 液，它的特性粘度反映了壳聚糖的分子量，在其他因素固定不变的情况下， 壳聚糖分子量越高，其溶液的特性粘度就越大；反之亦然。通常粘度在1 0 0 0 1 0 p a s 咀上的( 1 壳聚糖乙酸溶液) 被定为高粘度壳聚糖，( 1 0 0 0 1 0 0 ) 1 0 一“p a s 的被定为中粘度壳聚糖，1 0 0 o p a s 以下的被定为低粘度壳 聚糖。国外将大于10 0 0 1 0 1 p a s 的定为高粘度壳聚糖，( 2 0 0 1 0 0 ) 1 0 一。p a s 的被定为中粘度壳聚糖，( 5 0 2 5 ) 1 0 p a s 的被定为低粘度 壳聚糖。 壳聚糖的分子量可用数种方法测得，如粘度法”、光扫描光谱法”、凝 胶渗透色谱法“、光散射法、质谱法、端基分析法、渗透压法、蒸汽压法和 超过滤法等。其中，粘度法测定壳聚糖分子量操作简单、迅速，是最为常用 的方法，其次是光散射法和凝胶色谱法。 本文采用双突跃电位滴定法和粘度法测定了原料壳聚糖和降解产物的 脱乙酰度和粘均分子量。 2 2 壳聚糖脱乙酰度的测定 22 1 双突跃电位滴定法原理“。1 用过量的h e l 溶液溶解准确称量的壳聚糖样品，h c i 与壳聚糖中的一n h ： 等摩尔反应后，溶液中含有过量的h c l 。用标准n a o h 溶液滴定。滴定时，n a o h 标准溶液首先中和溶液中过量的h c l ，p i t 值出现急剧上升，即第一突跃点： l9 青岛大学硕士学位论文 然后，n a o h 标准溶液再中和与壳聚糖一n h ：结合的h c l ，达到滴定等当点时， p h 出现第二个突跃点。两个突跃点之间消耗的n a o