（环境工程专业论文）稀土铽对辣根过氧化物酶生态毒理效应.pdf

摘要 摘要 稀土农用给中国农业带来丰厚回报，但稀土的环境安全问题也引发了中外科学家的 关注。本课题以大田辣根( a r m o r a c i ar u s t i c a n al ) 为试材，利用植物生理学、生物化学 和化学生物学等实验手段，探讨了喷施铽( t b ) 对辣根叶片若干生理指标的影响，研究 n 对辣根的生态毒理效应，并从t b 处理的辣根体内分离得到辣根过氧化物酶与铽的结 合酶( t b h r p ) ，并对h r p 和t b h r p 的结构与性质进行了比较研究，为丰富稀土对植 物保护酶的生态毒理理论，科学评价稀土对经济植物辣根的危害及稀土农用的环境风险 等提供依据和参考。本论文主要结果如下： ( 1 ) 证明稀土t b 对辣根各个生理指标的影响存在剂量和时间效应关系。t b 虽在低浓度 范围短期内能刺激辣根叶片合成叶绿素、蛋白质，诱导h r p 活性提高，降低质膜透 性和膜脂过氧化程度，但后期均呈现出不同程度的毒害作用，高浓度毒害作用明显， t b 对植物的作用主要表现为伤害作用。 ( 2 ) 发现h r p 对n 胁迫的敏感性比其他指标高，表现在处理的h r p 与对照相比，存在 极显著差异。在t b 胁迫下诱导了一种新的过氧化物酶产生。 ( 3 ) 从t b 处理的辣根分离纯化得到铽结合过氧化物酶( t b h r p ) ，相比较于h r p ，t b h r p 配合物中每分子t b h r p 含有一个钙原子、一个铁原子和三个铽原子，其分子量为 4 3 6 5 0 d a 。 ( 4 ) 与h r p 相比，t b h r p 对p h 值和温度的变化敏感，偏离其最适值时t b h r p 的活性 变化较大，对p h 值和温度的适应范围窄。t b h r p 对底物愈创木酚和h 2 0 2 的亲合 力及反应能力都较弱，同时t b h r p 的生物电催化活性较低。 ( 5 ) t b 可与h r p 肽链上o 或n 发生配位作用，并替代一个钙原子，生成t b - h r p 配合 物，改变了h r p 的蛋白构象。血红素微环境的改变导致了其铁卟啉平面性的增加， 引起活性中心f e 的自旋状态的改变，使得t b h r p 活性中心电子传递更加困难，因 此对t b h r p 催化活性降低。 关键词：铽，辣根过氧化物酶，生态毒理效应，活性 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ee x t e n s i v ea p p l i c a t i o no fr a r ee a r t h si nt h ec h i n aa g r i c u l t u r eh a sb e e nb r o u g h t r e m a r k a b l ee c o n o m i cb e n e f i t s h o w e v e r , e n v i r o n m e n t a ls e c u r i t yo fr a r ee a r t h si sc o n c e m e d t r e m e n d o u s l yb yc h i n e s ea n df o r e i g ns c i e n t i s t s i nt h i sp a p e r , u s i n gm e a s u r e so fp l a n t p h y s i o l o g y , b i o c h e m i s t r ya n dc h e m i c o b i o l o g y , t h ei n f l u e n c eo ft e r b i u r n ( t b ) o ns o m e p h y s i o l o g i c a li n d e x e si nh o r s e r a d i s hw e r ed i s c u s s e d ，e c o t o x i c o l o g i c a je f f e c t so ft bo n h o r s e r a d i s hw e r es t u d i e d an e wp e r o x i d a s e c o n t a i n i n gt bc o m p l e x ( t b n a e ) w a so b t a i n e d f r o mh o r s e r a d i s ha f t e rt r e a t m e n tw i t ht b t h e n ，t h ee n z y m a t i cm o l e c u l es t r u c t u r ea n d c h a r a c t e ro fh r pa n dt b h r pw e r ei n v e s t i g a t e d i tc a np r o v i d et h ee x p e r i m e n tg i s tf o rh e a v y r a r ee a r t he c o t o x i c o l o g i c a lt h e o r yt ot h ep r o t e c t i v ee n z y m e ，a n ds c i e n t i f i ce v a l u a t i o nf o r e c o n o m i ch a r ma n de n v i r o n m e n t a lr i s k t h em a i nr e s u l t so b t a i n e da r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ee f f e c t so ft bo nt h ep h y s i o l o g i c a li n d e x e so fh o r s e r a d i s hw a ss h o w nd o s e e f f e c ta n d t i m e - e f f e c tr e l a t i o n s h i p t h ep h y s i o l o g i c a li n d e x e so fh o r s e r a d i s hc o u l db ei m p r o v e db y t h el o wc o n c e n t r a t i o no ft bi ns h o r tp e r i o d ，i n c r e a s i n gt h ec o n t e n t so fc h l o r o p h y l l ，s o l u b l e p r o t e i na n dh l 冲a c t i v i t y , d e c r e a s i n gm e m b r a n ep e r m e a b i l i t ya n dm d ac o n t e n t c o m p a r e d 、) r i mc o n t r o l s ，w h i l ep r e s e n t e dt o x i ce f f e c t si n l o n gp e r i o d u n d e rt h eh i 曲t b c o n c e n t r a t i o n , t h et o x i ce f f e c t sw e r es i g n i f i c a n t l y ( 2 ) c o m p a r e d 埘mo t h e rp h y s i o l o g i c a li n d e x e s ，h i 冲w a st h em o s ts e n s i t i v et ot bs t r e s s ， h r pw a sm o r es i g n i f i c a n t l yt ot bs t r e s s w h a t sm o r e an e wp e r o x i d a s ew a si n d u c e d u n d e rt bs t r e s s ( 3 ) an e wp e r o x i d a s ew a so b t a i n e df r o mh o r s e r a d i s ha f t e rt r e a t m e n tw i t ht b ，w h i c hc o n t a i n e d t h et be l e m e n t c o m p a r e dw i t hh 胜m e t a lc a t i o n sc o n t e n t si ne a c hm o l e c u l eo ft b h r p c o m p l e x ，w a so n ec a l c i u m ，o n ei r o na n dt h r e et e r b i u m ，m o l e c u l a rw e i g h tw a s4 3 6 5 0 d a ( 4 ) c o m p a r e d 淅t hh r - pt b h r pw a ss e n s i t i v et oc h a n g e so fp hv a l u ea n dt e m p e r a t u r e w h e na p a r tf r o mo p t i m u mv a l u eo fp hv a l u ea n dt e m p e r a t u r e ，t b h r pa c t i v i t y s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d t h ea f f i n i t yt os u b s t r a t e so fg u a i a c o la n dh 2 0 2w a sl o w e rt h a n h r pa sw e l la sr e a c t i v ec a p a c i t y f u r t h e rm o r e ，t b h r pt h ee l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o na n d c a t a l y t i ca c t i v i t yw a si n h i b i t e d ( 5 ) t bc o u l db i n dt on o r0a t o m so fa m i d ei nt h ea m i n og r o u p si nt h ep e p t i d ec h a i no fh l 冲 a n dr e p l a c eo n ec a l c i u mb yf o r m i n gt h et b h i 冲c o m p l e x t h ec o n f o r m a t i o no fp r o t e i n w a sc h a n g e d ，l e a d i n gt ot h ei n c r e a s ei nt h ep l a n a r i t yo ft h ep o r p h y r i nc y c l ei nt h eh e m e g r o u p ，a n dt h e nt h ed e c r e a s ei nt h ee x t e n to fe x p o s u r eo ft h ee l e c 仃o c h e m i c a l l ya c t i v e c e n t e r - f ei nt h ep o r p h y r i nc y c l eo ft h eh e m eg r o u p i nt b h i 心m o l e c u l e a n df es p i ns t a t e w a sc h a n g e d ，h e n c ei n h i b i t i n gt h eb i o a c t i v i t yo ft b h i m k e yw o r d s ：t e r b i u m ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，e c o t o x i c o l o g i c a le f f e c t s ，a c t i v i t y i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： ：塑望 日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： e l 期： 第一章绪论 1 1 稀土植物生态毒理学研究 1 1 1 稀土植物生态毒理效应 第一章绪论 稀土( r a r ee a r t h s ，r e ) 是镧系及钪、钇共1 7 种元素的总称。因其性质上的微小差异， 又划分为轻稀土( 铈组元素) 和重稀土( 钇组元素) 两个部分。我国稀土储备量占世界的 7 6 ，是稀土资源最多的国家。1 9 1 7 年中国钱崇澍与美国o s t e n h o u t 发表了钡、锶、铈对 水绵( s p i r o g y r ac o m m u n i s ) 生理作用的研究结果，开创了稀土的生物活性研究。尤其近 3 0 年来稀土在农业领域中的广泛研究表明，适宜浓度的稀土元素对植物生根、生长、产 量和品质等具有促进作用，并已得到科学界肯定。植物对稀土吸收有一个临界含量，当 外源稀土施用量达到一定适宜浓度时，才表现出促进植物生长发育的作用，达不到这一 浓度则对植物生长没有明显的影响，而当稀土浓度超过临界含量，植物生长将受到抑制 甚至毒害1 1 。 ( 1 ) 稀土对植物根系发育的影响 d i a t l o f f l 2 j 等研究镧和铈对玉米( 乙口m a y s ) 和绿豆( p h a s e o l u sr a d i a t u s ) 根系生长的影 响，发现镧浓度为0 6 3 “r n o l l 以时，玉米根系伸长可增加3 6 ，镧浓度为0 1 m o l l 以 时增加绿豆根系生物量2 1 ，而当镧浓度超过0 1 9 1 a m o l l 。1 时，将导致两种植物根系减 少3 0 以上。镧浓度为3 1 i _ t m o l l 一时，对绿豆产生毒害作用；镧浓度为4 8 i t m o l l 。1 时， 对玉米产生毒害作用。还发现用0 - 5 1 x m o l l 以镧处理玉米幼苗，除硫和镁外，其它元素 含量都随镧浓度的增加而降低【3 】。) ( i e 等【4 j 研究表明，低浓度镧( 0 0 5 0 7 5 m g l 。1 ) 可增加 水稻( o r y z as a t i v a ) 根系干重并促进根系对c u 、f e 、m g 等金属离子的吸收；而高浓度镧 ( 9 3 0 m g l 。1 ) 将抑制玉米根系生长并影响根系对养分汲取。对椰子树( c o c o sn u c i f e r a ) 施用 稀土后发现，稀土在低浓度促进椰子树根系生长，但在高浓度抑制其根系生长并使根系 对营养元素p 和z n 的吸收明显减少【5 1 。 ( 2 ) 稀土对植物生长的影响 x i e 等【4 j 发现低浓度镧能促进水稻生长( o 0 5 1 5 m g l 以) 、根系干重( o 0 5 0 7 5 m g l 。1 ) 和穗粒数( 0 0 5 6 m g l 。1 ) 增加，而高浓度镧抑制穗粒形成( 9 3 0 m g l 以) 和根系延长生长 ( 1 5 - 3 0 m g l 1 ) 。曾青等【6 】研究了红壤中镧对水稻的生长发育和产量的影响表明，镧浓度 为7 5 r a g k g 1 时水稻的生育期明显滞后，且随镧浓度的增加，水稻生育期的滞后现象也 越来越严重；镧浓度为3 0 0 m g k g 1 时水稻的生长显著受到抑制，产量显著降低，水稻生 物量降低一半的e c s o ( 半效应浓度) = 3 2 3 0 2 m g k g 。水稻移栽到镧浓度为6 0 0 m g k g - 1 的 红壤中3 0 d 后生长停止，至6 8 d 时死亡。对油菜( b r a s s i c aj u n c e al ) 研究表明，喷施或 根施0 0 3 3 0 r a g l 以镧对油菜生长起定的促进作用，而高于3 0 m g l o 油菜生物量显著 下降，并得出镧对油菜的临界浓度为3 0 r a g l j 【7 1 。张自立等【8 】研究了在不同土壤中混合 稀土( 0 - 5 0 9 k g 。1 ) 对水稻、油菜、大_ 豆( g l y c i n em a x ) 生长量的影响，根据e c 5 0 推断，混合 江南人字硕十学位论文 稀土对红壤上水稻和油菜以及黄潮土上大豆生长量的抑制作用较大，毒性相对较强。 ( 3 ) 稀土对植物过氧化物酶活性及其同工酶的影响 低于1 5 m g k g “的镧加入红壤后，过氧化物酶( p o d ) 活性降低，油菜的生长受到促 进；高于1 5 m g k g - 1 时过氧化物酶( p o d ) 活性逐渐上升，油菜的生长受到抑制【9 】。研究不 同土壤中镧对水稻的植物毒性，当镧浓度大于1 5 0 m g k g ，红壤、水稻土分别在分蘖期、 抽穗期p o d 活性显著增加，p o d 活性指标反映土壤中镧积累对水稻生长的影响比生物 量和产量指标更为敏感，并得出镧安全临界浓度在红壤、水稻土分别4 2 0 3 m g k g _ 和 8 3 3 3 m g k g “【lu j 。镧浓度达到0 2 m m o l l 以时黄瓜( c u c u m i ss a t i v u sl ) 幼苗叶的p o d 活性 却明显的下降，使得叶中h 2 0 2 累积，导致叶片发黄，植物生长受到抑制【l l 】。w a n g 等 研究镧、铈、铬、锌对竹叶眼子菜( p o t a m o g e t o nm a l a i a n u s ) 的毒害作用表明，4 种离子 均能诱导p o d 活性升高，而当处理浓度过高时，p o d 活性下降；得出镧、铈对植物的 毒害机制与重金属相似，其致死浓度分别为7 1 0 m g l 。1 和3 - 5 m g l 一。储慧君等【13 】研究 铈对花生( a r a c h i sh y p o g a c a l ) 生长初期过氧化物酶活性影响。结果表明，2 0 - 8 0 p g l 。1 的 铈使叶片的p o d 活性升高，1 0 0 “g l 。和2 0 0 p g l 1 使p o d 活性下降，后者较前者更加 显著。 马林等【1 4 】在甘蔗( 勋c c 五口r 甜聊o f f i c i n a r u ml ) 分蘖中期稀土喷施对叶片过氧化物酶同 工酶电泳分析表明，3 0 0 m g l d 处理结果最为明显，多条酶带的染色加深，1 0 0 m g l 1 次 之。稀土处理后酶带数变化不是很明显，但氯化铈处理是在一些酶带区域出现了酶带的 增加或减少。刘江燕等【l5 j 以薇菜( o s m u n d ac i n n a m o m e al ) 为对象，p o d 同工酶检测到 7 条明显谱带，不同稀土浓度对p o d 酶带数量均未发生明显变化，但一些谱带的相对 强度却有所不同，高浓度稀土明显抑制植株的生长，过氧化物酶同工酶发生明显变化， 均有1 2 种同工酶的活性增强或减弱。利用不同浓度的镧处理水稻种子，观察根、芽组 织中过氧化物同工酶酶谱图发现，经1 0 0 x 1 0 m o l l 。1 镧处理后酶带的相对迁移率发生 变化，且酶带颜色变浅，条数减少；1 o o x l 0 - 3 1 o o x l 0 。1 m o l l 。1 处理的酶带颜色加深， 同时也有新的酶带产生，而1 0 0 x 1 0 - 91 0 0 x 1 0 1 5 m o l l 以处理的酶带颜色变浅，这些均与 p o d 活性改变有关i l 6 | 。 1 1 2 稀土作用机理探讨 ( 1 ) 稀土在植物体内的细胞定位 李齐等【1 7 】采用透射电镜能量分散型x 射线微区分析法对铈在i 6 9 杨树( p o p u l u s d e l t o i d s ) 根亚细胞微区间的分布和含量进行测定，发现铈不但进入植物细胞，且在细胞 核内有明显富集。荧光光谱法研究铕在小麦( t r i t i c u ma e s t i v u ml ) 根和叶片细胞膜及细胞 内的分布定位结果显示，铕只在细胞膜与线粒体内富集和积累，且线粒体比质膜具有更 高的亲合性【1 8 】。g a o 掣1 9 1 采用x 射线能谱分析法发现，铕和镧能进入植物细胞中，且 与原生质膜、叶绿体、线粒体、细胞质和细胞核相结合。镧在红盖鳞毛蕨( d r y o p t e r i s e r y t h r o s o r a ) 叶肉细胞中的分布为：叶绿体( 占细胞总量的6 0 7 0 ) 细胞核及未破碎的 细胞( 2 0 3 0 ) 线粒体、微粒体、上清液( 细胞器 ( 2 1 6 ) 上清液( 1 7 3 ) 细胞膜( 4 7 ) 。这些为我们解释稀土对植物细胞生理学和生物 化学的作用提供了事实依据。 ( 2 ) 稀土对细胞膜的影响 细胞膜由脂质双分子和镶嵌膜蛋白构成，是细胞与外界的一层界膜，承担着物质转 运、能量转换和信息传递三大功能。稀土进入细胞或细胞器，首先通过细胞膜，故细胞 膜也就成为稀土对细胞发生作用的原初部位。郜红建等【2 3 】研究镧对水稻根质膜透性的影 响表明，水稻根系电解质外渗率与细胞膜透性随镧胁迫时间延长和浓度增加而增大，根 系大量富集镧，导致细胞膜上镧的大量沉积，质膜完整性受到破坏，根丧失正常生理功 能，致使根细胞内k + 、c a 2 + 、p 和h + 的大量流失。1 m m o l l 。铈可致红豆杉( t a x u sc u s p i d a t a ) 细胞膜损伤，细胞膜上及紧贴膜内侧有小囊泡产生，靠近胞膜内表面有一些较深的着色 颗粒，膜结构改变，细胞膜透性增大，进一步影响细胞正常生理功能1 2 引。2 m m o l l 1 镧 对黄瓜幼苗叶片细胞膜造成了一定伤害，通透性显著增大，原因可能为高浓度镧从细胞 中大量移出c a 2 + 。镧可以竞争性地结合质膜上钙结合位点从而改变膜上钙结合位点的构 型，或改变膜内带电粒子分布，或影响膜完整性所需要的某些物质合成，从而改变了膜 性质和结构，导致膜透性增加，甚至细胞膜破坏；叶片膜脂脂肪酸组分的配比发生变化， 而影响膜流动性和膜结合酶的活性【2 5 1 。稀土还可降低细胞膜电位和h + 梯度，并使k + 、 c a 2 十等大量外流，引发细胞内生理生化变化而产生毒性【2 6 1 。c a 2 + m 9 2 + a t p a s e 是生物体 内c a 2 + 的一个重要调节剂，它将c a 2 + 离子由胞内泵到胞外，维持了一个细胞内外的c a z + 离子梯度。张金红等【2 7 】研究稀土对蚕豆( 阮肠f e b a ) 叶片原生质膜上c a z + m 9 2 + _ a t p a s e 活 性的影响，结果表明，镨和钕对c a 2 + m 9 2 + _ a t p a s e 活性有抑制作用，且随着稀土浓度的 提高而抑制作用增强，这为镨或钕离子与c a 2 + 竞争占据了钙泵分子上的钙结合位点所 致。随着稀土浓度的增高，错或钕离子较多地占据钙调素或c a 2 + m 矿a t p a s e 上的钙结 合位点后，又占据了膜上的其它位点，从而改变了膜脂环境的物理状态，进而影响酶的 活性，使抑制作用增强。 ( 3 ) 稀土对钙的竞争取代机制 c 矛+ 作为细胞信号传递的第二信使，参与细胞分裂，连接稳定膜结构中磷脂与蛋白 质，还调控一些酶的活性，可作为生物膜的稳定剂，延缓细胞的衰老。稀土离子与钙离 子具有许多共同的性质，如稀土离子半径( o 9 6 1 1 5 a ) 与钙离子的半径( 0 9 9 a ) 相近，稀 土离子比钙离子多一个正电荷，与含氧配体的结合能力比较强，使得稀土离子可置换出 许多酶中的c a 2 + ，从而参与各种酶促反应并影响酶活性【2 8 1 。因而在生物体内稀土常作 为钙的拮抗剂或发生取代作用，干扰钙的正常生理功能【2 9 1 ，通过与膜上特殊通道受体结 合位点结合，阻碍c a 2 + 在膜上的整合，影响c a 2 + 跨膜运输的g t p 蛋白活性，降低原生 质体c a 2 + 通道的流量，导致c a 2 + 外流量增加【3 0 】。稀土离子可竞争c a 2 + 在膜磷脂上的结 合位点，改变膜上c a 2 + 转运机制，导致c a 2 + 在细胞内分布改变 3 1 】。安宜【3 2 】对小麦根细 江南人学硕十学位论文 胞研究表明铕离子可取代c a 2 + 在信号传递中的作用，影响钙调素的活性和含量变化，从 而引起钙调素调控酶( n a d 激酶) 的活性改变，使稀土得以通过调控c a z 十来完成细胞内 信使分子介导的一系列生理生化反应过程的调节。 ( 4 ) 稀土对叶绿体的影响 叶绿体是植物细胞光合作用的重要场所。镧对金鱼藻( c e r a t o p h y l l u md e m e r s u m ) 叶绿 体结构影响表明，5 0 m g l j 镧处理的叶绿体片层结构松散、破坏，叶绿体膜皱折、内容 物外渗，嗜锇颗粒增大，叶绿体濒于解体。可能是镧直接与叶绿体蛋白结合或取代m g 而改变叶绿体形态结构；较高浓度的镧可与细胞质膜上某些酶结合位点( 如c a 2 + 结合位 点) 发生竞争配位；亦可直接与a t p 形成络合物，使膜透性增大甚至破裂，而造成细胞 内容物流失，叶绿体结构破坏，金鱼藻失绿枯死【3 3 1 。高浓度钕处理油菜后的叶绿体片层 结构变薄且模糊不清，细胞壁薄、质壁分离严重，钕对叶绿体结构及叶绿体膜上 m 9 2 + _ a t p a s e 作用导致光合作用减弱1 34 | 。在核酮糖1 ，5 二磷酸羧化酶( r u b p c a s e ) 催化 c 0 2 固定的反应体系中，高浓度稀土可抑制由m g 激活的r u b p c a s e 活性，占据m g 作 用位点表现为竞争性抑制，影响植物净光合效率【3 引。c h e n 等【3 6 】研究表明高浓度镧对黄 瓜幼苗的抑制作用表现在对类囊体膜结构破坏，进而导致光系统i i 光合活性下降并抑制 r u b p c a s e 活性，最终抑制黄瓜生长。 1 2 辣根过氧化物酶概述 1 2 1 植物过氧化物酶生理功能与重金属胁迫的关系 过氧化物酶( p e r o x i d a s e ，p o d ，e c l 1 1 1 7 ) 是一族能利用h 2 0 2 氧化氢供体的酶，含有 血红素辅基的金属酶，广泛分布在各种动物、植物和微生物体内的一类重要的氧化还原 酶类，具有把生物体有害的过氧化物转化成无害氧化物的能力，因此可有效地清除生物 体内的过氧化物，是细胞内抗脂质过氧化作用保护系统的主要成分之一，同时p o d 还 参与植物正常代谢和应激条件下的许多生理生化过程。过氧化物酶在植物体内主要有两 方面的作用，一方面与植物正常的形态发生和形态建成有关，在植物的生长、发育过程 中起作用；另一方面与植物的抗逆性有关，包括抗旱、抗寒、抗盐、抗病等，是植物保 护酶系的重要保护酶之一。p o d 通常作为检测植物对环境胁迫响应的一个重要生理指 标【3 7 1 。 p o d 在植物中的生理功能有：参与活性氧代谢过程，在细胞壁中p o d 催化n a d h 或n a d p h 氧化产生0 2 。，0 2 。进一步歧化为h 2 0 2 和分子剥3 8 】，重金属胁迫可导致植物 体内产生大量的活性氧自由基，可诱导p o d 活性的增加，加速清除h 2 0 2 ，但高水平的 自由基能导致p o d 断裂，从而抑制植物过氧化酶活性【3 9 】；参与木质素和木栓质的合成， 细胞壁结合的p o d 可参与次生细胞木质素积累的加厚过程【4 0 1 ，在镉胁迫下p o d 可促进 植物细胞壁中半纤维素、果胶质等发生交链，形成木质素，增加细胞壁木质化程度，致 使细胞壁僵化阻止细胞伸长，从而抑制幼苗的生长，同时也建立了生理屏障阻止了镉进 入细胞【4 l 】；参与生长素的降解，p o d 具有催化吲哚乙酸( i a a ) 氧化脱羧，从而形成 4 第一章绪论 i n d o l e 3 y 1 m e t h a n o l 或3 - m e t h y l e o xi n d o l e 的能力【4 2 | ，重金属诱导p o d 活性的增加可导 致i a a 含量下降，这加速了细胞的衰老【4 3 】；参与其它物质的氧化过程，p o d 可参与催 化谷胱甘肽、n a d h 、d t t 、草酰乙酸等酚类化合物的氧化m j 。 1 2 2 辣根过氧化物酶的分子结构特征 辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h r p ) 是从辣根植物中提取的一种过氧化 物酶，属于胞外分泌型糖蛋白。h r p 是应用最广泛的一种酶试剂，它既可以用于定位 测定，又可用于定量测定，广泛用于临床化学、环境化学、生物分析和食品工业等领域。 h r p 为结合了血红素的糖蛋白，分子量约为4 3 k d ，其中同工酶c ( h r p c ) 的肽链 由3 0 8 个氨基酸组成，肽链n 末端为一个吡咯烷酮羧基所封闭，c 末端为丝氨酸。它 能与碳水化合物结合成为糖基化蛋白，糖基化有避免蛋白酶降解和稳定酶蛋白构象的作 用。8 个糖基分布在分子表面，其含量约占分子质量的1 8 。含有4 个由半胱氨酸配对 的二硫键，在天冬氨酸9 9 和精氨酸1 2 3 之间还有一个包埋的盐桥。二硫键的存在对于 稳定临近螺旋结构有重要作用，如果移走二硫键将大大降低酶的稳定性【4 5 。 g a j h e d e t 4 6 j 报道的h r p c 的三维x 射线晶体结构表明，m 心c 结构中大部分是a 螺旋，含有少量的b 折叠( 图1 1 ) 。h r p c 分子是由一个血红素和一个肽链组成，血红 素是其活性中心，其结构示意图如图1 2 所示。h r p c 分子中含有两个c a 2 + 结合位点( 图 l 一3 ) ，它们都是七配位的，其中一个结合位点定位于近端结构域内，该位点为溶剂不可 及的，此处的c a 2 + 结合是非常紧密的。另一个c a 2 + 结合位点定位于远端结构域内，其 位置靠近分子表面且是溶剂可及的，此处的c a 2 + 结合较为疏松 4 7 j 。虽h r p c 分子中结 合的两个c a 2 + 不是酶活性所必需，但它们对硼 冲一c 的生物活性有很大影响，移去c a 2 + 可使酶活性下降6 0 ，尤其是对c o m ( i i ) 还原效率的影响更大【4 引。分子力学模拟显示， 移去c 2 + 使远端位点结构发生较大改变，尤其是远端组氨酸残基会发生较大的位移，其 结果导致了c o m ( i ) 形成过程中远端组氨酸残基不能与外面的h 2 0 2 直接作用，因而不能 稳定f e = o 结构。相反，若将c a 2 + 重新引入到c a 2 + 结合位点，则活性位点及远端组氨 酸残基均恢复至正常结构态。其中一个c a 2 + 对维持酶活性中心的构象起很大作用1 4 9 ，5 0 j 。 h r p c 存在远端和近端两个结构域，两者之间是h r p 的活性中心血红素基团，血 红素和两个钙原子都对酶的结构和功能完整起重要的作用。血红素基团定位在远端a 螺旋b ( 血红素辅基上方) 和近端a 螺旋f ( 血红素辅基下方) 之间，活性中心除血红素通 过f e 原子与组氨酸1 7 0 上的n 原子配位，第二轴向位置通常是空的，通常c o ，c n 。， 氟化物，叠氮化物等可占据此位置形成六配位的配合物。其中一些只以质子化的形式配 位，通过远端的精氨酸3 8 和组氨酸4 2 肽链形成氢键而稳定( 图1 2 ) 【” 5 z j 。血红素的远 端空穴是h 2 0 2 的作用位点，该位点包括组氨酸4 2 ，精氨酸3 8 ，它们共同构成一个亲 水1 2 袋。组氨酸4 2 和精氨酸3 8 对于中间体复合物c o m ( i ) 的形成和稳定以及键合和稳 定芳香底物与配体起着重要作用。苯丙氨酸4 l 主要是阻止底物到达c o r n ( i ) 的f e - - - o 位 置。天冬酰胺的存在有利于维持组氨酸4 2 的碱性【5 3 】。其中铁的疏水性五配位态是由远 端空穴的特殊性质和近端组氨酸1 7 0 的强配位性共同决定的，尤其是组氨酸1 7 0 使铁 t i 南人 砸i 。1 论文 偏离血红索平【n 1 ，从而防止了水分f 从5 3侧轴向位置与铁月e 位。另外，远端空穴的索 水性【1 袋结构可借助氧键刚和f e n 键的共同作用，稳定周围的水分子，使其小能与铁 腺予结台配位。近端组氨酸上的氮原子1 j 临近包埋的天冬氨酸边链有氢键作用，致使近 端组氨酸- 17 0 以荷负电形式出现，与铁配位后赋予铁一个较低的负还原电势，从而稳定 了铁的高氧化态，这对于稳定酶活性中问体复合物c o m ( 1 ) 和c o m ( 1 1 ) 也有重要作用p 。 图l 一2 血红素活性中，o 示意图 f i g i - 2s k e t c h m a po fa c t i v ec e n t e r i nh e m e c o r n p o u n di i ，。 ，w ；! 竖，“谚，“二竺 “1 “1 “ nn ，f 扩7 c o m p o u n d 图13 血红素附近c f 结合位点及残基围i 4 底物与h r p 的催化循环 i 3 a m i n oa c i dr e s i d u e s i nh e i n ea n d c a “r e g i o nf i gi - 4 t h ec a m l y t i cc y c l eo f h r p w i t hs u b s t r a t e 1 23 辣根过氧化物酶的催化机制 d u n f o r d 等瞰岍究了h r p 的催化机制，反应过程可简单描述为： h e m c f e ( 1 1 ) ( h r p ) + h 2 0 2 _ h e m c o = f e ( i vr + ) 】( c o mi ) + h 1 0( 1 h e m e o = f e ( i v - - r + ) 】( c o m i ) + s h 一+ h e m e 0 2 f e ( i v 】( c o m i i ) + s( 2 h e m e o = f e ( 1 v ) ( c o m1 1 1 + s i t _ h e m e f e ( 1 l i ) ( p o d ) + s f 3 于一 洲、 忡 y 第章绪论 2s 。一s 2 ( 或在底物为s h 2 时歧化生成s 2 + s 2 h 4 ) ( 4 ) 图1 4 所示首先由h r p 与h 2 0 2 反应生成复合物i ( c o mi ) ，这相当于失去2 个电子， c o r ni 含有一个f e ( i v ) = o 中心和一个有机阳离子自由基( r + 。) ，随后，c o r ni 氧化一分子 外源底物( s h ) ，得一氢原子和一电子，产生底物自由基( s ) 和c o r ni i ，而有机阳离子自 由基( r + ) 则被还原为初态，接着c o r ni i 被另一分子外源底物还原为初始态形式f e ( i i i ) ， 但又形成一个s 。最后，两个s 。或结合形成s2 或歧化为s 2 + s 2 h 2 。 1 2 4 辣根过氧化物酶的分离、纯化和鉴定 对于过氧化物酶可以用常规酶抽提和纯化方法加以分离和纯化。包括硫酸铵分级沉 淀、丙酮分级沉淀、透析、离子交换层析、凝胶过滤、萃取、以及各种电泳技术分离和 鉴定。 r e g a l a d o 等【5 6 】利用阴离子型表面活性剂a o t 制备反胶团溶液，采用两步反胶团萃 取，第一步在h r p 的最佳溶解度的p h 范围内萃取除去杂蛋白，第二步在水相和有机 相体积比为1 0 时h r p 被选择性的溶解和浓缩，获得h r p 的比活力为8 6 u m g ，h r p 的回收率为4 6 。范军等1 57 j 通过硫酸铵分级沉淀、丙酮分级沉淀、加热和c m 2 3 阳离 子交换层析，纯化的h r p 的k 值为2 5 x 1 0 5 ，r z 值是3 o o ，比活力4 0 6 u m g 。m i r a n d a 等1 5 8 】采用伴刀豆球蛋白a 琼脂糖亲合层析柱分离h r p ，最佳吸附条件为p h 7 0 ，5 m m 离子强度和0 7 5 mn a c l ，0 1m 旺m e t h y l ，d - m e t h y l m a n n o p y r a n o s i d e 梯度洗脱，h r p 的 回收率为7 5 。w e ig u o 和e l ir u c k e n s t e i n 5 9 1 采用膜亲合层析法，将伴刀豆球蛋白a 固 定在中空纤维膜作为配基纯化h r p ，得到2 4 5 回收率和1 4 2 纯化倍数。m i r a n d a 等唧j 采用聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 聚合物和p v p 盐双水相系统萃取纯化h r p ，得到7 5 回收 率和7 3 纯化因子。 h r p 鉴定可依据h r p 具有4 0 3 n m 和2 8 0 n m2 个吸收峰的特性，可用r z 值 ( o d 4 0 3 n m o d 2 8 0 n m ) 来判断h r p 的纯度，高纯度的酶r z 值应在2 0 以上。s d s p a g e 则可测定纯化酶的分子量和鉴定纯度。h r p 底物范围较宽，能与多种底物反应，常被 用来测定酶活性的底物有愈创木酚、2 ，2 连氮双( 3 乙基苯并噻唑啉6 一磺酸) 、联苯胺、 联大茴香胺等。 1 3 立题依据及主要研究内容 1 3 1 立题依据 稀土农用的广泛应用，势必加速了稀土在环境中的迁移和累积。稀土进入环境并沿 食物链传递已是不争的现实。中外有关科学家在赞叹我国稀土农用取得经济效益的同 时，也为稀土生态毒理尚不清楚等应用基础理论研究滞后而忧虑，并为此进行了多学科、 广角度的研究。其研究重点之是，稀土进入植物体后的生态毒理效应，研究显示，植 物保护酶对稀土离子的诱变反应最为敏感，且多存在“低促高抑 现象( h o r m e s i se f f e c t ) 。 在我国，辣根是种重要的出口创汇经济作物，富含过氧化物酶( h r p ) 。h r p 是一种应 用广泛的过氧化物酶，其结构和催化机制研究的较为透彻。但是，重稀土与植物过氧化 7 江南人学硕十学位论文 物酶的剂量效应关系；重稀土对植物保护酶的生态毒理效应及其作用机制研究尚不多 见。本课题以辣根为研究试材，研究重稀土铽对辣根及辣根过氧化物酶的生态毒理效应， 旨在揭示铽对植物过氧化物酶的生态毒理效应和酶学机理。为丰富重稀土对植物保护酶 的生态毒理理论，开展重稀土植物生态毒理作用的细胞学与化学生物学研究，科学评价 重稀土对经济作物辣根的危害及稀土农用的环境风险等提供依据和参考。 1 3 2 主要研究内容 本课题以大田辣根为试材，研究铽对辣根叶片若干生理指标的影响，从辣根体内分 离得到铽与辣根过氧化物酶的结合酶( t b h r p ) ，利用生物化学、化学生物学等实验手段 对h r p 和t b h r p 的结构与性质进行了比较研究，以便揭示铽对辣根过氧化物酶生态 毒理效应的酶学机理及其化学作用方式，为进一步揭示稀土与植物保护酶的相互作用机 理提供参考。 第二章稀十铽对辣根的生态生理效应 第二章稀土铽对辣根的生态生理效应 稀土农用是中国科学家首创、居世界领先水平并享有自主知识产权的一项科研成 果。自2 0 世纪7 0 年代应用以来，给中国创造了2 0 0 多亿的经济价值。但是随着稀土使 用范围和强度的加大，稀土不可避免的在环境中富集，威胁环境安全。稀土对植物的作 用遵循h o m e s i s 效应，即低剂量促进高剂量抑制。一般而言，该剂量同作物品种、作物 的生长发育阶段有关。大量实验证明，稀土元素对动物、植物及微生物均存在h o r m e s i s 现象。有关稀土元素产生h o r m e s i s 的微观机理未作深入研究，缺乏系统的剂量一效应和 时间效应曲线【6 。 辣根因其重要的食用和药用价值而出口于日本、韩国、英国和匈牙利等国，且其中 的h r p 也广泛应用于食品、医疗等领域。在稀土生态毒理学研究中，首先需要解决稀 土与植物间的剂量效应与时间效应问题( 即研究稀土与植物特定生理生化代谢的剂量、 时间效应关系) ，这既是科学设计实验，获取稀土环境植物学效应信息、探究其机理的 基础，也是指导稀土在农业上优质高产实践的重要依据。鉴于此，本试验以辣根为试验 材料，以铽为探针，分析了稀土对辣根叶绿素、质膜透性、丙二醛、可溶性蛋白、游离 脯氨酸、h r p 活性及