HLA-B27的检测及应用PPT课件.ppt

绿色含羞草,HLA-B27的检测及应用,1,特性分布,临床应用,检测方法,2,一、特性及分布,什么是HLA?HLA，H代表人(Human)，L代表白细胞(Leucocyte)，A代表抗原(Antigen)，即人类白细胞抗原。HLA是组织细胞上受遗传控制的个体特异性抗原，最早是在白细胞和血小板上发现的，现在发现该抗原广泛分布于皮肤、肾、脾、肺、肠和心等组织器官有核细胞的细胞膜上。,3,一、特性及分布,第8次国际组织相容性会议确定HLA有92个，分属于A、B、C、D和DR5个位点，分别称为HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-D和HLA-DR。,4,一、特性及分布,HLA-B位点有42个，B27为其中之一。HLA-B27基因属于型MHC基因，基本上表达在机体中所有有核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰富的含量。,5,6,二、检测方法,1、微量细胞毒法（microlymphocytotoxictest，MLCT）原理：如果受试者淋巴细胞表面表达有相应的HLA-B27抗原，就可以与B27抗体结合，形成Ag-Ab复合物激活补体，发生对细胞膜的破坏及细胞杀伤作用，通过染色法观察，死细胞的细胞膜通透性改变，染料能够进入使之着色，而活细胞细胞膜完整不被染色。根据死细胞占全部细胞的百分比，可以判断受试者淋巴细胞表面是否存在HLA-B27抗原及其与抗体的反应强度。,7,二、检测方法,优点：不需特殊仪器设备，易于操作，一般的实验室都可开展。缺点：标本存放不能超过8小时；感染可以使细胞膜表面的B27分子的数量或结构改变，影响MLCT的结果，易出现假阴性。,8,二、检测方法,2、ELISA原理：应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中HLA-B27水平。用纯化的B27抗体包被微孔板，依次加入HLA-B27抗原（待检标本）、生物素化的抗HLA-B27抗体、HRP标记的亲和素，形成双抗体夹心反应，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HLA-B27含量呈正相关。,9,二、检测方法,ELISA结果与MLCT法符合率为99，且不受感染因素的影响，重复性好。,10,二、检测方法,3、磁珠酶联免疫分析（IMS-ELISA）,磁珠分离与ELISA结合B27单抗标记磁珠HRP标记CD45单抗通过磁场分离游离相优点：反应时间短（1小时完成）对标本新鲜度要求不高28静置4d之内可用,11,二、检测方法,4、PCR-SSP原理：通过设计基因序列特异的引物SSP，特异性的扩增出标本中的HLA-B27基因片段，以琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，若出现目的条带则表示HLA-B27为阳性。,12,二、检测方法,优点：基因水平的检测，直接对HLA-B27原基因进行扩增分型，灵敏度高，特异性强。缺点：耗时长，需要跑电泳，需要特定的实验仪器及严格的实验条件，在临床上普遍开展此项检查有一定的难处。,13,二、检测方法,5、流式细胞术原理：利用荧光标记的HLA-B27单克隆抗体，与细胞表面的B27抗原结合，使结合后的淋巴细胞具有一定的荧光强度，这种荧光强度可由流式细胞仪测得的通道值来反映，以其值的高低判断HLA-B27抗原表达百分比，从而判断HLA-B27是否阳性。,14,二、检测方法,优点：全自动仪器检测，减少了人为因素的影响，重复性高，结果判断准确，快速，为目前较为理想的方法，国外已将FCM法检测HLA-B27作为AS诊断的常规检测方法。缺点：仪器昂贵，目前只在较大医院应用，且荧光易淬灭。,15,二、检测方法,鞘液600ul标准微球一滴,100ulEDTA-K2抗凝血荧光标记抗体30ul,混匀避光15分钟,1：10溶血素2ml,混匀避光8-10分钟,离心，弃上清加鞘液2ml,离心，弃上清加鞘液600ul,混匀,混匀,上机检测,16,二、检测方法,报告方式：定性,17,三、临床意义,强直性脊柱炎瑞特氏综合征急性前葡萄膜炎。其中强直性脊柱炎与HLA-B27关联性最强。然而带有HLA-B27抗原并不一定意味着会发生相关疾病在普通人群中也能发现约10为HLA-B27阳性因此HLA-B27阳性不能作为相关疾病的筛选标准但进行相关的检测能有助于疾病的确诊和治疗,18,三、临床意义,1、强直性脊柱炎强直性脊柱炎（ankylosingspondylitis，AS）以中轴关节慢性炎症为主，也可累及内脏及其他组织的一种慢性进展性炎性疾病，主要侵犯骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织及外周关节，并可伴发关节外表现。临床主要表现为腰、背、颈、臀、髋部疼痛以及关节肿痛，严重者可发生脊柱畸形和关节强直。,19,三、临床意义,临床表现：起病隐袭。患者逐渐出现臀髋部或腰背部疼痛和/或发僵，尤以卧久（夜间）或坐久时明显，翻身困难，晨起或久坐起立时腰部发僵明显，但活动后减轻。有的患者感臀髋部剧痛，偶尔向周边放射。疾病早期疼痛多在一侧呈间断性，数月后疼痛多在双侧呈持续性。随病情进展病变由骶髂关节向腰椎、胸颈椎发展，则出现相应部位疼痛、活动受限或脊柱畸形。,20,三、临床意义,HLA-B27检测可辅助AS诊断，患者HLA-B27阳性率90，人群AS的HLA-B27阳性预示值为0.95-9.5，阴性预示值为99.9。如症状和体征提示AS，HLA-B27阳性会显著增加正确诊断的机会，B27阴性则排除AS诊断的可能性增加。对疑为AS患者进行淋巴细胞表面HLA-B27抗原的检测有助于提高早期诊断AS的可能性，为此类患者的诊断和鉴别诊断提供线索，可弥补线不能早期诊断AS的不足。,21,三、临床意义,HLA-B27检测还可预测幼年特发性关节炎患儿的转归，如患者HLA-B27阳性，则发展为AS的可能性大。同时HLA-B27抗原检测对AS的预防亦具有一定意义，如HLA-B27阳性患者的一级亲属可检测B27，对AS进行早期诊断，及早进行干预治疗。,22,2、反应性关节炎(reactivearthritis，ReA)是一种发生于某些特定部位(如肠道和泌尿生殖道)感染之后而出现的关节炎。反应性关节炎是一种继发于身体其它部位感染后出现的急性非化脓性关节炎。除关节表现外，反应性关节炎常伴一种或多种关节外表现。,三、临床意义,23,三、临床意义,临床表现：（1）.全身症状发热、体重下降、倦怠无力和大汗（2）.关节炎多为单一或少关节炎，非对称性分布急性关节炎（3）.泌尿生殖道炎症无菌性尿道炎无症状或症状轻微的膀胱炎和官颈炎（4）.皮肤黏膜表现溢脓性皮肤角化症常出现于足底和手掌（5）.眼部症状结膜炎，通常症状较轻（6）.心脏表现主动脉病变和传导异常（7）.其他蛋白尿、镜下血尿或无菌性脓尿系统性坏死性血管炎、血栓性浅表性静脉炎、紫癜、淀粉样变性、颅神经和周围神经病。,24,三、临床意义,反应性关节炎患者的HLA-B27阳性率达65%96%，HLA-B27携带者发生反应性关节炎的机会增加50倍，HLA-B27阳性患者的临床症状明显重于该基因阴性者。而且，HLA-B27阳性者易发展成慢性反应性关节炎HLA-B27阳性者的反应性关节炎易感性与致病菌的种类有关。如在沙门菌引起者的HLA-B27阳性率为20%33%，在支原体引起者为40%50%，耶尔森菌引起者为70%80%，而在志贺菌引起者则达80%97%。,25,三、临床意义,3、急性前葡萄膜炎常有突发眼痛、眼红、畏光、流泪等症状，检查时可见睫状充血，尘状KP（角膜后沉着物），前房闪辉明显，大量房水细胞，或伴有纤维蛋白渗出，甚至前房积脓，此外还有瞳孔缩小、虹膜后粘连等改变。起病急，有的视力明显下降，有反复发作的特点。,26,三、临床