（发酵工程专业论文）新型免疫活性肽的筛选及其免疫活性的研究.pdf

新型兔疫活性肽的筛选及其免疫活性的研究 摘要 巍一疆以来技入 认为是一萃孛营葵蛋自，它为掰生儿或成年人提供极为丰富的 髂养和均衡的氨基酸。另外它含有a l a 、0 - l g 、酪蛋白、免疫球蛋白、乳铁嚣白 秘少量豹霉l 清蛋囱等生戆活洼浆蔟。孚0 在体态经黉强遂溺纯拳熬逐蜀髦王产生多秘生 物活性肽，这些活性肽，以无活性的状态存在于乳蛋白前体物中。乳中的主要蛋白 一酪蛋岛虢可产生多静生理功能镌活经戆。其中免疫活瞧获笼为整要，它可隘裁激 机体增强免疫功能，对机体具有保护功能，还可以促进樱幼儿免疫系统的分化和成 熟，以帮助婴幼儿以不成熟的免疫系统抵抗各种矫来瘸留、毒素而健康圭l 蠹生长发育。 凫疫矮技肢熊够增强机体免疫力，刺激机体淋巴缨胞的增殖，增强巨嗜细胞的器噬 功能，掇高机体抵御外界病原物质感染的能力，降低机体发病率。本研究在4 5 条 件下，爝簇蛋自港蘧酪甏皇瘩熬2 小时，熬螽通过等电感沉淀、乙醇沉淀和羲聚耀 凝胶层析等方法，从酪缀白中分离纯化出电泳纯的免疫活性肽，通过m t t 比色法测 定了萁兔疫健避作用，掰s d s 聚嚣浠酸羧凝获魄泳( s s p 矗g ) 分耩了英缝凌，鬻 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳检测了其等电点。结果表明，通过：等电点沉淀 两次乙醇沉淀s e p h a d e xg 1 5 柱层析分离褥蓟电泳纯度的免疫活佼膝。湃善魄 色法显示凌默县有显著则激淋熙细胞增赋的作用。此外，在本研究的基础上，还可 进一步扩大实验，寻找聪好的、熙有效的适合大邀制各免疫活性肤的分离纯化方法， 袭受疫瀵淫获实嚣工业纯生产夔定基爨。 关键词：生物活性肽牛乳酪蛋白免疫活性肽 分麓缝纯受疫刺激活性 s e p a r a t i o n o f i m m u n o p e p t i d e f r o mb o v i n ec a s e i na n d s t u d i e so ni t si m m u n o s t i m u l a t i n ga c t i v i t i e s a b s t r a c t m i l k ，m a yb ec o n s i d e r e da s n u t r i t i o nf o rt h en e w b o r n sa n da d u l t s ，a si tc o m a i n s c o m p o n e n t s t h a t p r o v i d e c r i t i c a ln u t r i t i v ee l e m e n t s 。i n g e n e r a l ，t h ei 硅a j o rp r o t e i n f r a c t i o n si nb o v i n em i l ki n c l u d ec 【- l a ，6 - l gc a s e i n s ，i m m u n o g l o b u l i n s ，l a c t o f e r r i n ，a n d m i n o rw h e yp r o t e i n ss u c ha st r a n s f e r r i n ga n ds e r u ma l b u m i n 。f r o mt h e s e ，b i o a c f i v e p e p f i d e sm a y b eg e n e r a t e di nv i v ot h r o u g hg a s t r o i n t e s t i n a lp r o c e s s e s t h e s ep e p t i d e s ，o f e n c o d e dw i t h i nt h es e q u e n c e so fn a t i v ep r o t e i n sp r e c u r s o r s ，m a ya l s ob eg e n e r a t e di n v i t r ob ye n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，t h ec a s e i n s ，m a i np r o t e i n so fm i l k ，g e n e r a t e ag r e a t n u m b e ro fb i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p f i d e sd u r i n gt h ed i g e s t i v ep r o c e s s m o r ep a r t i c u l a r l y , h u m a na n db o v i n ec a s e i n sa r ea b l et od e l i v e ri m m u n o s t i m u l a t i n gp e p t i d e st h a tm i g h t b e f a v o r a b l et ot h es e l f - d e v e l o p m e n to fi m m a t u r ei m m a n o c o m p e t e n tc e l l so ft h en e o n a t e w h os t i l ld e p e n d so nm a t e r n a lm i l kp r o t e c t i n gf a c t o r sf o rh i sd e f e n s ea g a i n s ti n f e c t i o n s i m m u n o p e p t i d e s a f f e c tb o t ht h ei m m u n es y s t e ma n dc e l lp r o l i f e r a t i o n i nt h i sp a p e r , c a s e i n sf r o mb o v i n em i l k w a s p r e p a r e d a n d t r y p s i n i z e d a t4 5 。cf o r1 2 0 r a i n i m m m n o s t i m u t a t i n ga c t i v i t y w a sf o u n df r o m t h e p r o t e o l y t i c s o l u a t i o n i m m u n o p e p t i d e w a s s e p a r a t e d a n d p t w i f i e db y i s o e l e e t r i c p r e c i p i t a t i o n ，e t h a n o l p r e c i p i t a t i o na n dg e l c h r o m a t o g r a p h y i n m m n o s t i m u l a t i n g a c f i v i t i yw a sa s s a y e db ym t t c o l o r i m e t r y , p u r i t i e sw e r em e a s u r e db ys o d i u md o d e c y ls u l p h a t ep o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( s d s - p a g e ) ，a n d i s o e l e c t r i c p o i n t w a sm o n i t o r e d b y i s o e l e c t r i c f o c u s i n g ( i e f ) t h e f o l l o w i n g s w e r et h er e s u l t s ： f i r s t l y , i m m u n o p e p t i d ew a ss e p a r a t e db yt h ep r o c e s s o fi s o e l e c t r c ip r e c i p i t a t i o n , t w oe t h a n o lp r e c i p i t a t i o na n ds e p h a d e x o 一15c h r o m a t o g r a p h y ； s e c o n d l y , t h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo f t h ep e p t i d ew a st e s t e db ym t t r e s u l t ss h o w e d t h a tt h i sp e p t i d e se n h a n c el y m p h o c y t ep r o l i n r a t i v er e s p o n s e s “ o nt h eb a s i co ft h e s ew o r k m o r cs t u d i e so nm i l kd e r i v e d i m m u n o p e p t i d e sa r eb e i n g c a r r i e do u t ，m o r ee f f i c i e n tm e t h o d st op r e p a r ei m m u n o p e p t i d e sa r ea l s ob e i n gt r i e ds o t h a tam e t h o dt h a ts u i t sf o r l a r g e - s c a l ep r e p a r a t i o n s o f i m m t m o p e p t i d e s c a nb e e s t a b l i s h e di nt h en e a rf u t u r e 。t h i sf i e l do fr e s e a r c hp r o m i s e st oc o n t r i b u t en o v e l i m m u n o p e p t i d e sd e r i v e df r o mc a s e i n st h a ts i g n i f i c a n t l yi m p a c tb o t ht h ef o o da n dh e a l t h c a r ei n d u s t r i e s 。 k e y w o r d s ：b i o a c t i v e p e p t i d e s b o v i n ec a s e i n s i m m t m o p e p t i d e s s e p a r a t i o n a n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d s i m m u n o s t i m u l a t i n ga c t i v i t y 天津商举院硕士学位论文 前言 第一章前言 。 霉l 言 泌乳和哺乳，是哺乳动物独有的特征，这是物种进化、物党天择的杰作。乳汁 中含有最优质和全面盼营养物质，是新生哺乳劫物的第一重食晶，也蹙成年人饮食 的一个重要组成部分。但长期以来，乳蛋白仅仅被人们视为一转营养鬃白，为新生 哺乳动物提供充足的能量和各种氨基酸，然而，近年来的研究结果表明，乳礞白除 其营莽傍篷辨，还是舆育重要豹生理功姥。娶，l 出生聪，免疫缨照功# 低下，捌抛， 多形核白细胞数量降低，其吞噬活性、趋化能和杀伤活性均裔所减弱，t 淋巴细胞 静活魏下降，转湃邑缁缒藏有丝分裂驻活注洚酝，健i g m 酌分泌受到彰嚷5 ”。在婴 儿出生3 个月后才开始合成i g g ，五岁时方能达到成年人水平；出生4 6 个月开始 合成i g a ，1 2 岁时才达到成人水平；l 酶是娶，l 合成娥罩的筑体，毽嶷蜀一多对才 达到成人的9 0 s 。在这种自身免疫系统功能较差的情7 兄下，新生儿依赖于母乳的保 护，疑抗病和免疫的能力主蘩来源予母乳。 爨兹茨磷究结果袈明，垛乳对婴幼j l 兹保护季# 周是多重熬f ”1 。母乳提供可以 直接抵抗病菌的物质，包括兔疫球蛋白( i g a ，i g m 和i g g ) 、酶、激索、生长因子 帮丰牵经内分泌获等多耪生秘溪惶魏浚，对壤魏动躲瓣生长稻发弯起棼豢重黉熬终 用。乳源性球蛋白能增强初生动物的抵抗力，乳中的各类水解酶能促进其胃肠道营 养物质的消化等。同时母乳中含有多功能静、广谱的保护物艨( 季l 铰蛋自帮簿膀酸 等) ，它们可以对病藏产生抑制作用，如乳铁蛋白可与一些需要铁的细菌竞争结合 铁，从而抑制细菌生长，另外还可促进肠粘膜细胞增精，调节肠粘髓叵噬细胞功能 潮。这些保护功能豹姻互配合，馊婴幼儿以不成熟她免疫系绕抵抗备糖外来瘸菌、 毒素而健康她生长发育阿。 襞蛋鑫溪或分嫒究豹最攀，也最号l 天洼瓣，霆努建蘩豹磷究主要爨孛予承解对 产品风味、质构、色泽及储藏稳定性等，也包括对礞白质理化和功能特性的研究。 当今这一领域荐度弓l 超人稍关注，鬣因为从审发袋了多种其眷生秘潦经豹臻辘敖， 乳源生物活姓肽的磷究逐濒成为近年来乳品领域研究的焦点。 1 2 生物活性肽研究的现状 2 生物灞性蕊豹辩类 天津商学院硕士学位论文 前言 乳中的生物活性肽，或自然存在于乳中，或以无活性的状态存在于乳蛋白前体 物中1 4 。乳中自然存在的活性肽包括：e g f 、t g f 、n g f 、i g f i 、i g f i i 、t g f 一 1 3 、胰岛素、生长激素释放因子等，这些内源的生物活性肽在生物体内作为载体和 运输工具，不仅可以将人们平常所食的营养输送到人体各个部位，充分发挥其功能， 而且还可以作为神经递质，传递信息，肽具有极强的活性和多样性，可全面调节人 体生理功能，增强人体生理活性1 6 2 ，6 3 1 。这类生物活性肽能够刺激新生哺乳动物胃肠 道的成熟和发育，对婴幼儿正常的生长发育和正常生理功能的发挥起着非常重要的 作用，而且对调节成年人的生理功能、预防疾病和感染也具有重要意义1 6 , 3 0 。 乳中的第二类生物活性肽源于乳蛋白水解后的产物，它们均以无活性的形式存 在于乳蛋白前体物中，只有在胃肠道蛋白酶的作用下水解成较小的短肽后，它们的 活性才被释放出来，从而才能发挥其生理功能。近年来的研究表明，乳蛋白不仅在 胃肠道中，在蛋白酶的作用下能够产生具有重要生理功能的生物活性肽，在体外条 件下，调节适当的p h 值、温度、底物浓度和酶解时间，用适当的蛋白酶或蛋白酶 的组合水解乳蛋白特别是牛乳酪蛋白，也可获得具有与体内生理功能和活性相同的 生物活性肽。1 9 7 9 年b r a n t 从牛乳b 一酪蛋白的酶解物中分离得到了两个类吗啡活 性肽( o p i o i d p e p t i d e s ) ，据报道这两个肽对豚鼠回肠纵肌神经节具吗啡样活性，并 证实与内源性类吗啡活性肽具有相同的活性，这是源于食品蛋白活性肽的最早例 子。类吗啡活性肽，具有类吗啡受体配体活性，能与机体内的类吗啡受体结合，可 起到镇痛、止泻、抑制胃肠蠕动的功能f 4 ”，可调节人体情绪、呼吸、脉搏、体温的 作用，增强机体对氨基酸和其它营养物质的吸收的功能，与普通镇痛剂不同的是， 它经过消化器官进入人体后无任何副作用n 8 】；到目前为止，人们已经发现了多种 生物活性肽，如：免疫活性肽( 1 m m u n o p e p t i d e s ) ，能够增强机体免疫力，刺激机体 淋巴细胞的增殖，增强巨嗜细胞的吞噬功能，提高机体抵御外界病原物质感染的能 力，降低机体发病率，并具有抗肿瘤功能 9 q o ；酪蛋白糖肽( & s e i n o g l y c o p e p t i t l e s ) ， 它能够抑制胃酸分泌，并影响肠道激素的释放 1 1 1 ；酪蛋白磷酸肽 r c a s e i n p h o s p h o p e p t i d e s ，简称c p v ) ，能与多种矿质元素结合形成可溶性的有机磷酸 盐，充当许多矿质元素特别是钙离子在体内运输的载体，促进小肠对钙离子和其他 矿质元素的吸收 1 2 , 7 7 l ；抗菌肽( a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s ) ，是近年来发现并开始研究的一 类生物活性肽，体外条件下能抑制细菌的生长，在体内具有类似抗生素的活性，能 哭津商学院瑚士学位论文 前言 抑翩小鬣感染致病的金黄色赣蔼球菌泌 ；挠矗裣转亿酶季荦涮裁( i n h i b i t o t 苫o f a n t i g f o t e n s i n - c o n v e r t i n ge n z y m e ，簿称c e d ，是静多功毹敬，具有谰节赢压、免疫防 御和调节章审经系统功能的活j 陡州。“。此外，近几年还商抗高血压肽秘n t i h y p e r t e n s i v e p e p t i d e s ) 、抗遗忘骏测n t i a m n e s t i cp e p t i d e s ) 、抗斑捻滔蛙获( a n t i t h r o m b o t i c p e p t i d e s ) 引l 、拭氧化默、抗爱滋痪、酶l 鹭肽、减8 肽、降糖肽、激素肢等多弛生物 黎淫羹蠡静擐道【3 3 , 3 5 , 3 9 a 0 。 许多繇突袭鞭，螓巍瓣初垒魏蘩，冀霉麓遂缝够魏遴戆淡旁戏熬，不骧襞转韵 物翊没有上述交佬，可能与飘中竞其怒裙嚣审台商多种凝深凌弱患褥活性簌帮芙。 嚣虽舀生秘滔往款在食晶、绦链潞雾耩医药方溺其霄氍大稳瘟溺潜力。铡妇，( i ) 巍蛋瞄生物活往肷可掰子低过敏健反应的蔡，0 配方食黼中，也可籍予觞邋的临床嚣 券方蕊；2 ) 剩镄徽生物及其蛋鑫麓在食鼓翔王过程中产生辑需翻生物活瞧敢，秘褥 特殊的酪强囱分勰酶( 如嚣酸菌) 用予予酪键成熬过程，可垒产禽有潞嘴脓的干酪 裁品；( 3 ) 食残或承瓣懿蹩秘澄瞧弑添热到食翕孛，熟魏鬟是磷酸雾歇，可翔搏藿游 强亿裁；霹属予裁嚣，热用予治疗藏滋( 熬曦默) ，雾秘瘸彝餐黪瘸( 酪爨鑫磷 酸多蕊) ，淤赦免疫缺乏( 兔菠懑健款) 镣。 ，2 2 垒物活性簸瑷浚鹬特煮 谶几年来的研究认为，人体吸收蛋囱质的主蘩形式不愚淤氨基酸的澎式缀收 懿，磷是以短簸的形式完整吸收， 三i 黢煎形式啜收的氮蘩酸强发蒙魄驭游离氮基驻 混合物的强度商嫩7 0 8 0 ，这是人体吸收髅囱质机制的熏大突破。舆亳生理溪 燧款冀数戳乎爨鸯抵揍激宣懿拳勰的熬力，袭黉麓遂内蚕会被承鼷必游离氨麓酸， 遮秘特点对发撑英生毽懑煌缀考豢。瀵位薅黪髯燃切割巍使褥生物潘瞧物质褥以袅 产，这耱自然选箨鹣结栗，侵入餐更深鹣试谖鍪l 食燕绦键佟瓒浆凝理，魄舞黉二发凝 熬操键食磊撬镶了垒鬻翡愚鼹。 科学试验诞囔，短歉的啜收枫箭爨宥大特熹；( 1 ) 不浠漓德，毫接缀收。遴常， 救是入钵蠡身合成鹃遗裰，建入体将掰藏弱鬣鑫矮进行酶程隶瓣变成氯蒸酸，熬蘑 合成躲，最终通j 建小肠进行吸收。丽体外制舔的短肽以究整的形式蠹接进入小肠， 羧小躲瓣吸故，多数农缁瞧孛铰避一参静翻越，肖些戴纛接邀入a 体褥繇系绕，发 撂生貔警功熊。吸收快速。短默侠遮黪穿过人靛口腔、霉，童接邀入小肠，被夺 怒蔽竣，最终滋入久髂搬滚弦琴聚绞、瓣富投缨藤缓缀，逛速赘发箨箕蹩理髂爰裙 天津商学院硕士学位论文 前言 生物学功能。( 3 ) 短肽具有1 0 0 被人体吸收的特点。吸收后，不会有任何排泄物， 而是全部被人体吸收和利用。( 4 ) 短肽具有主动吸收的特点。对于因消化系统缺陷、 障碍、损伤，而不能吸收营养者，短肽具有主动让人体吸收或迫使人体吸收的特点。 这对于那些消化能力差，营养缺乏，身体虚弱，体弱多病者，有着重要的意义。( 5 ) 人体对肽的吸收，具有不需耗费人体能量，增加消化道，特别是胃肠功能负担的特 点。短肽自身具有极强的活性和能量，它的主动吸收、迫使吸收，就是自身的活性 和能量在起作用。因此，它在被人体吸收时，不是人体要耗费自身的能量去吸收它， 而是短肽以自身的能量让人体吸收。由此看来，它的这一显著特点对消化系统未发 育成熟的婴幼儿，对消化系统开始退化的老年人以及因过度运动而急需氮源，而又 不能增加胃肠功能负担的运动员、体力劳动者有着重要意义。( 6 ) 短肽在人体表现出 载体作用，可将平常人所食的营养物质，特别是钙等对人体有益的微量元素，吸附、 粘贴、装载在本体上，然后运载输送到人体各个细胞、器官、组织，同本体一起被 人体吸收和利用，发挥各自不同的功能作用。这就是目前世界上人们把短肽原料中 间体作为药品和食品配方，其目的是要加强药效，增强吸收率。( 7 ) 短肽被人体吸收 后，可在人体中起信使作用。 科学界和医学界可利用其吸收的特点为一些特殊状况下的人群补充营养，如术 后伤口愈合期、康复期、身体复原期；精神压力大，过度劳累，食欲不振；食物中 化学物质，残留农药，长服化学药物、中药，消化系统损害引起的肠胃功能失调者； 运输量大、体力劳动强度大须及时补充氮源，又不能增加肠胃功能负担者；消化系 统因疾患障碍不能进食者；消化器官未发育成熟的婴幼儿，消化吸收功能开始衰退 的老人。 j 2 3 生物活性肽的生产方法 目前，体外生产生物活性肽的方法主要有如下几种：一，天然活性肽的分离提 取：存在于细菌、真菌、动植物等生物体内的激素、酶抑制剂等天然活性肽，经分 离提取获得。但天然存在的生物活性肽含量低，结合机制复杂，难以分离纯化，目 前只有谷胱甘肽的酵母发酵、绿藻培养提取取得了成功并应用于工业化生产；二， 化学合成法生产生物活性肽：采用液相或固相化学合成法制取生物活性肽，随意性 大，可以制取任意需要的活性肽，但成本高、副反应物及残留化合物等因素制约其 4 天津商学院硕士学位论文前言 发展和广泛的应用，同时考虑到安全问题，通常不被采用；三，基因工程方法生产 生物活性肽：采用d n a 重组技术生产生物活性肽，其试验研究尚在进行中，但其成 本高，投资大，实验条件要求严格，缺少完善的表达和操作系统及安全性尚需进一 步研究等不利条件，是基因工程方法生产生物活性肽的最主要的限制因素；四，蛋 白酶法生产生物活性肽：该制备的实质是在体外模拟乳蛋白在体内酶解的过程。运 用蛋白质工程的分离技术，将乳分离成纯度较高的高纯蛋白，以此为原料，运用生 物工程的酶解技术，在体外条件下，用不同的蛋白酶或蛋白酶的组合水解乳蛋白， 从酶解液中获取生物活性肽，它同时也是食品科学的二度高科技深加工产品，是三 门科学交际的结晶，以其安全性极高，生产条件温和，生产条件易于控制及成本低 的极大优势，这种酶法生产的肽与化学制备的相比，具有极强的生物活性，且不会 产生有害的副产品，因此在世界范围内引起关注。酶法制各己成为目前生产生物活 性肽的最主要的方式之一【l “。 1 3 免疫活性肽的研究动态及趋势 免疫活性肽是继类吗啡活性肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一 类生物活性肽，免疫活性肽的研究始于1 9 8 1 年。1 9 8 1 年，j o l l e s 等首次报导，用 胰蛋白酶水解人乳蛋白，从水解物中分离得到一种具有免疫活性的肽段，它的氨基 酸序列是v a l - g l u - p r o i l e p r o t y r ，对应于人乳b 一酪蛋白5 4 5 9 的氨基酸残基 序列。这个短肽，在体外试验中能增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用， 静脉注射，则能增强小鼠对肺炎克氏杆( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 感染的抵抗能力 【5 6 1 1 3 1 乳蛋白来源兔疫活性肽 a 酪蛋白来源 研究表明，从。酪蛋白的胰蛋白酶酶解液中分离得到的肽段 t h r - t h r - m e t - p r o l e u - t y r ，相当于。1 酪蛋白c 末端1 9 4 - 1 9 9 序列，该肽具有促进 小鼠巨噬细胞的吞噬活性，增强小鼠对k l e b s i e l l a p n e u m o n i a 感染的抵抗能力【l ”。 在p h 值为6 7 条件下，经凝乳酶处理的a 。l 一酪蛋白水解物中分离纯化得n - 个具有免疫增强作用的短肽片断，氨基酸排列顺序与n 。1 - 酪蛋白n 末端1 2 3 残基 天津商学院硕士学位论文 前言 序列相同，并命名为拟杀细胞粒体( i s r a c i d i n ) 。体外条件下能抑制葡萄球菌、枯草 杆菌、肺炎克氏杆菌、八叠球菌、肺炎链球菌等。在体内条件下，具有类似抗生素 活性，能够保护小鼠免受致死性的金黄葡萄球菌感染 7 0 1 。该肽既有预防感染的作用， 又能通过刺激胞吞作用和免疫反应使动物产生长效的免疫抵抗能力。另外还发现， 将该肽注射入牛或羊的乳腺，可保护小鼠免受c a n d i d aa l b i c a n s 感染，也可预防乳 腺炎【】。 a r g t y r - l e u g l y t y r l e u g l u ( 9 0 - 9 6 ) 和a r g t y r - l e u - g l y t y r l e u ( 9 0 - 9 5 ) 是 经胃蛋白酶处理分离纯化得到的。该两短肽，具有阿片样活性，且五肽的类吗啡活 性较强。研究证明，两短肽也具有免疫调节活性，可增强淋巴细胞增殖，提高自然 杀伤细胞( n k ) 活性，促进嗜中性白细胞的移动。自从发现t 淋巴细胞上具有 阿片受体以来，阿片受体及其不同亚型已在许多免疫细胞中被分离提取出，研究发 现除t 、b 淋巴细胞外，人类外周血n k 细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞和 多形核白细胞等细胞表面都具有阿片受体或受点，这些存在于免疫细胞上的阿片受 体同阿片样活性物质结合后，具有增强t 、b 淋巴细胞的功能、提高n k 细胞的细 胞毒作用等功效 5 0 。 p h e p h e v a i a l a p r o p h e p r o g l u p h e o l y l y s ( 2 3 3 4 ) 具有增强巨噬细胞吞噬 作用，静脉注射具有抵抗k l e b s i e l l ap n e u m o n i a 感染的能力。该肽也是血管紧张素 转换酶抑制剂( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r ，简称c e i ) ，c e i 具有抗高 血压的生理功能，另外，血管紧张素转换酶i ( a c e i ) ，能起到活化血管紧张素 转换酶一i i ( a c e i i ) 及钝化舒缓激肽( b r a d y k i n i n ) 的作用，而舒缓激肽是急性炎 症反应的调节因子，能够刺激吞噬作用，增强淋巴细胞向炎症部位迁移，诱导淋巴 细胞分泌淋巴因子1 8 】【5 1 。 o ，酪蛋白中免疫活性肽及其功能见表1 。 表1a 。1 酪蛋白源免疫活性肤及其功能 肽免疫功能 t h r - t h r - m e t - p r o - l e u - t y r ( 1 9 4 1 9 9 ) 促进巨噬细胞吞噬活性 增强鼠抗k l e b s i e l l an e u m o n i a 感染能力 天津商学院硕士学位论文 前言 a r g - t y r - l e u - o l y - t y r - l e u - g l u ( 9 0 9 6 ) 增强淋巴细胞增殖，提高自然 杀伤细胞活性，促进嗜中性白 细胞移动 a r g - t y r - l e u - g l y t y r - l e u ( 9 0 9 5 ) 同上 m v a l - a l a - p r o - p h e - p r o - g l u - p h e - g l y - h s 蒜景黧烹篡篓二鬻 ( 2 3 - 3 4 ) “磊西忑i b 酪蛋白来源 从胃凝乳酶的b 一酪蛋白酶解物中分离纯化得到一个短肽，它位于0 酪蛋白c 末端1 9 3 2 0 9 残基，该肽在分裂原和抗体均不存在的情况下，也可明显的直接刺激 鼠淋巴细胞增殖嗍。研究还发现，b 酪蛋白( 1 9 3 2 0 9 残基) 可刺激巨噬细胞增强 对绵羊红细胞( s r b c ) 吞噬功能，注射2 4 小时后，能增强小鼠对k l e b s i e l l a p n e u m o n i a 的抗感染能力，还可促进主要的促炎和免疫调节细胞因子( 如i l 一1 、t n f q 和i l 一6 等) 产生【3 2 1 。 六肽p r o g l y p r o i l e p r o a s n ( 6 3 6 8 ) 和三肽l e u l e u t y r ( 1 91 19 3 ) 都具有 明显促进抗体形成，增强鼠巨噬细胞吞噬作用，增强小鼠对k l e b s i e l l a p n e u m o n i a 的 抵抗能力。另外，三肽还可增强抗体依赖型t 细胞增殖口”。 b 酪啡肽是人或牛b 酪蛋白经胰蛋白酶酶解处理的产物，其氨基酸组成与b - 酪蛋白6 0 7 0 片断的残基序列相同，该肽具有类吗啡活性，也具有调节免疫系统的 功能 3 6 , 4 9 , 6 1 3 。这种肽被认为可能直接作用于消化道中的阿片肽受体以影响胃肠道的 运动，也可能在小肠刷状缘降解成更小的疏水性阿片肽，穿过肠粘膜进入外周血液 再透过血脑屏障与脑中的阿片肽受体结合，即使是成年人在大量饮用牛奶后，在其 小肠中也能检测到显著量的该种阿片肽的免疫反应物h 外。牛b 酪啡肽在低于1 0 u m 剂量情况下，就具有明显抑制人淋巴细胞增殖的作用1 4 9 1 。另外还发现，该肽具 有增强鼠抵抗日e 6 s 缸刀d p 口“研。厅妇感染的能力h 9 】 5 2 】。 0 一酪蛋白也具有c e i 片断，这些短肽具有刺激增强鼠巨噬细胞吞噬功能，对静 脉注射k l e b s i e l l a p n e u m o n i a 的小鼠产生保护作用。b 一酪新肽1 0 ( 相当于1 9 3 - 2 0 2 氨基酸残基序列) 和七肽a l a - v a l p r o t y r - p r o g l n - a r g ( 相当于1 7 7 1 8 3 氨基酸残基 序列) 也具有抑制a c e 的功能【5 “。 0 酪蛋白中免疫活性肽及其功能见表2 。 天津商学院硕士学位论文 前言 表2- 酪蛋臼源免疫滔性肢及獒功能 肷免疫功能 譬g 1 n 婴。p ”。、雠也。”g 1 y 岁”v 础- a 毽 刺激淋巴细胞增豫 * g 1 v p r o p h e - p r o i l e - i l e v a l ( 1 9 3 2 0 9 ) 一一 p r o g l y - p r o - i l e - p r o a s n ( 6 3 - 6 8 )德透抗体形成，穗遴匿噬鲴熬器噬活穗 促进抗体形成，促谶臣噬细胞吞噬活性 毒毽激藏髂依鼓型下缨穗港臻 v y r - p r o p h e p r o g l y p r o - l l e - p r o - a s n s e r - l e u ( 6 0 7 0 ) 抑制淋巴细胞增礅 增强鼠抗k l e b s i e l l ap n e u m o n i a 感染能力 t y r - g l n g i n - p r o - v a l * l e u - g l y - p r o - v a l a r g ( 1 9 3 2 0 2 ) a l a - p r o - t y r - p r o - g l n - a r g ( 1 7 7 - 1 8 3 ) k 酪蛋自来源 k 酪蛋自滋胃一胰蛋白酶酶解物其有明显刺激分裂原处理的人淋熙细胞增殖作 用的缀肽。k 。酪蛋白胰蛋白酶酶解得到p h e p h e s e t a s p l y s ，它相当于k 酪蛋白 1 7 - 2 1 氨基酸残基，该歉具套促进抗体形藏，趱强太霸鼠巨噬细胞吞噬活牲。冀努， t y r - g l y ( 相当于3 8 3 9 氨基酸残基序列) 是另个免疫调节肽，该肽可直接通过小 弱壁鬟达港邑缡腿，霹裁激入耱蠲盘漤罂缨艟( p b l ) 壤獾，功熊类毅予c o n a ：2 4 0 1 。 k 酪蛋白中免疫活性肽及其功能见表3 。 表3k 酪蛋白源免痰活性蘸及其功能 肽免疫功能 p h e - p h e - s e t - a s p l y s ( 1 7 2 1 ) 促进抗体形成，促进巨噬细胞吞噬活性 t y r - g t y ( 3 8 - 3 9 ) 测激漤e 缨腿增殖 瓣季l 清蛋鑫来漾 经水解的n 。乳白强白可增强鼠对筚或人筑细胞的体液免疫应答，这种影响包括 调节b 淋巴细胞和t 辅助细聪活性豫。肽t y r - g l y 萃【1 t y r - g l y - g l y 当浓度在l 矿辩1 酽 就可明显增强人终周游巴细腿( p b l ) 增殖，t y r - g l y 在1 0 - 9 m o l 1 就w 表现出最大 刺激的9 3 ，而t y r - g l y g 1 y 在1 0 豫t o o l 1 可袭现出最大刺激的7 4 【5 孙。 飘铁蛋是必毳中微量存恣豹一耱繁碳农健会麴铡镳豹含铁蛋自质，其碳承他合 物包括甘露糖、半乳糖、岩藻糖、n + 己酰半乳糖胺和唾液酸等【6 引。与铁具有强烈亲 s 天津商学院硕士学位论文 前青 耧怪的魏铰蛋白默铁不绝骊态存在，可以与一些需要铁盼缓蘸竞争结合後，献丽獬 粼鲴蓠弱生长。 研究还发现，乳铁豢自以及巍铁蛩白的臀蛋岛酶水解物髓键进人自血瘸 ( h l 一6 0 ) 纲藏熬勰亡。飘转铁蛋鑫b ( 穰当予1 7 4 1 氨基酸残蘩序刭) 囟季l 挟兹 自霹臻自酶水螭褥到，黢铁蛋白靼乳转铁蛋自b 都可测激人多形梭自细胞( p m n ) 产生噻中瞧自继魏活化趋纯嚣予一自绸魏舟素。8 ( i l 8 ) 3 1 1 ，这个发骥蹬示，魏镣 蛋塞嚣摹l 转铁攫鑫b 霹黢兵枣溪纯寝主爨鬻系绞麴免疫奔导剡懿终是，这耱俸鼹霹 畿是食震孛羲爨囱霞霹辩潮瘗维藏生长魏藤嚣之f 鞫l 。攀0 清蛋垒中凳痰滔怪黢及荬 功髓冤表4 。 袭4乳清蛋南游免疫滔毪膝及冀功髓 聩免疫功畿 t y r - g l y t y r - g l y - g l y 增强人辨周游巴缨腿增楚 增强a 黔周游罄甥熬增建 嚣转铁簧鑫b ( 1 7 - 4 i )粼暇p 秣产生i l - 8 藏辨，一魏葵它来渫盼免疫溺佳魏邋年来谗宥一燕磷究。 ，3 。2 髭疫活靛熬豹鸯骥功麓 受疫活性肽其有极其燕要嬲生理功能，对于瓤生，b 尤力羹爨。雕琏l 生黔嚣，k 霹 冀它穗攀l 韵貔熬貔惠，蔡兔疫系绫爨来发弯宠垒，免疫系统弱功驻龟不键全，? 缀 藏秘器缁您爨处予葵溪犍状态，艨以，它逐不鸯效蟪l 璇搬羚器器耱瘸爨微生臻瓣 入侵，免疫麓力低下。搿巍鬣囱佟为耨奎崤巍凌耪豹主螫食物来源，菇谂钛滋纯黥 义还麓麸个蟀发搿的纛义上采谤，餐费无务贷圭| 盘受掇麓弥李 薪叟j l 免疫系统靛戆的 资任f 3 4 l 。氍中除禽有免疫球餮自鞠各种缨胞西予井，动物蕊蛋白缀胃肠遴的鬻自酶 承解纛释放出鹣多静生物活瞧软，茏冀怒免疫滔魏齄魄奁很大程浚豫替了蓊生儿豹 免疫功& 缺曦，提高了其兔痰系统的抵拣力。 最送，香游大学溪学院徽生骢学舔冠姨瘸毒臻究小缝霸嚣爱鞠疆业艾滋痪毒涟 羧戆“鹪是溅疗法” l 露麓名熬美蕤警鬻鞑学褰、荧黧艾谂t 戴蒙德艾滋疯觋究中心 主任侮大一潜，5 鸢l1 强程骜港联会举行熬记裾会主鼗毒，霹露篓艾游瘸浚疗疑 9 天津商学院硕士学位论文前言 验，利用合成的多个氨基酸链即“多肽”，阻止非典型肺炎病毒入侵人体细胞。多 肽防“非典”的主要作用机理是：诱导和促进t 细胞分化、成熟：调节t 细胞亚群比 例，使c d 4 c d 8 趋于正常；增强巨噬细胞的吞噬能力；增强红细胞免疫功能；提 高自然杀伤细胞( n k ) 活力；提高白介素2 ( i l 2 ) 的产生水平和受体表达水平；增强 外周血单核细胞y 干扰素的产生；增强血清中s o d 活性；可显著增加淋巴细胞功 能；能有效地防止辐射和放化疗及其它污染中毒后白细胞数量的减少：能有效地抑 制肿瘤细胞生长；可以防止恶性肿瘤放化疗引起的c d 4 + 降低，起到改善免疫功能 的作用。 总体上说，免疫活性肽具有以下几个生理功能：促进肠粘膜的免疫反应，维持 肠道健康和抑制肠道感染；能够增强机体免疫力，刺激淋巴细胞增殖、提高巨噬细 胞吞噬能力；提高机体抵御外界病原物质感染的能力，降低机体发病率，并具有抗 病毒、抗肿瘤的功能。另据有关报道，免疫活性肽还具有阻止h i v - 1 的功能1 2 。 1 3 3 免疫活性肽发挥生理功能的剂量 免疫活性肽发挥其生理功能的浓度极低。例如，从人乳酪蛋白的消化物中获得 了二种免疫活性肽，位于人1 3 酪蛋白的5 4 5 9 残基上的六肽 ( v a l g l u p r o i l e p r o t y r ) ，和位于乳清蛋白5 1 5 3 残基上的三肽( g l y l e u - p h e ) ， 这二种肽以极低的剂量( 如o 1 肛m o l l ) 就可通过注射，激活鼠腹腔巨噬细胞吞噬绵羊 红血细胞( s h e e p r e d b l o o d e e l l s ，s r b c ) 的作用；六肽以0 5 m g k g 的剂量、三肽以l m g & g 的剂量腹腔或皮下注射可使老鼠免受肺炎克氏杆菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 的感染 口7 1 。这些肽对人体巨噬细胞的吞噬能力有刺激作用，可促进人体血液单核细胞和巨 噬细胞对衰老红血细胞的附着和内吞，这种活性当达到0 2 1 a m o l l 的剂量时，即开 始起作用，且具有显著的剂量效应。从牛酪蛋白中分离出的免疫活性肽：三肽 l e u l e u t y r ( 位于b 酪蛋白的1 9 1 1 9 3 残基上) 、六肽t h r - t h r - m e t p r o l e u t y r ( a s1 酪蛋白的c 末端) ，在与人乳酪蛋白的三肽( g l y l e u p h e ) 相似的剂量时，即 o 1 u m 0 1 l 时，就能激活巨噬细胞的吞噬作用，六肽只要以o 0 5 p m o l l 的剂量即可 达显著活性。此外，二肽t y r g l y ，在1 0 1 1 m o l l 的浓度下，就能显著增强小鼠腹 腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用，刺激淋巴细胞的增殖，提高小鼠抵抗肺炎克 氏杆菌( k l e b s i 8 l l a p n e u m o n i a e ) 感染的能力；t y r g l y g l y 作用的浓度更低，仅为1 0 天津商学院硕士学位论文 刖茜 1 3 4 免疫活性肽作用机理 到目前为止，免疫活性肽的作用机理还不清楚。有研究认为，富含疏水氨基酸 的肽段与免疫活性有关，较强的疏水作用可能使它们能够与细胞膜相互作用而增强 其免疫活性。长畦慎一等【2 ”研究了牛乳蛋白质对细胞增殖的影响，用胰蛋白酶对k 一酪蛋白水解3 小时，用高压液相色谱( h p l c ) 分离肽片段时发现，一部分水解物 有促进免疫细胞增殖的作用，而这种作用随浓度的增加而增强。由此推测其可能的 机理是：免疫活性肽与其受体结合后，活化细胞内存在的酪氨酸激酶活性，通过g 蛋白的介导，活化第二信使，进而活化一系列信号传导系统，最终传递至细胞核内， 启动d n a 复制。肽是涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质，生物体内已发现 几百种肽，是机体完成各种复杂的生理活性必不可少的参与者0 7 3 , 7 4 1 。所有细胞都能 合成多肽物质，其功能活动也受多肽的调节。它涉及激素、神经、细胞生长和生殖 各领域，其重要性在于调节体内各个系统器官和细胞。肽的生理和药理作用可能是 激活体内有关酶系，促进中间代谢和膜的通透性，或通过控制d n a 转录或翻译而影 响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应或发挥其药理作用。但是，这也只是 一种假说，免疫活性肽的作用机理还需要进一步的深入研究。 虽然从1 9 8 1 年开始研究到现在，免疫活性肽的研究已经有二十多年的历史了， 人们也发现了多种不同序列的免疫活性肽，但免疫活性肽的研究进展与其它种类的 生物活性肽相比，发展速度是比较缓慢的，主要的原因是纯品免疫活性肽制备困难， 同时活性检测方法比较麻烦，需要做大量的动物试验才能得出结论。而到目前为止， 免疫活性肽的研究仍然处于实验水平，还没有套较为有效的制备方法，所以进行 动物实验就有很大的困难。就目前我们所掌握的资料来看，德国以h a n s m e l c e l 为 首的联邦乳品研究中心( f e d e r a l d a i r y r e s e a r c hc e n t e r ) 物化研究所( i n s t i t u t e f o ， c h e m i s t r y a n d p h y s i c s ) 在这方面做了大量工作，发现了多种免疫活性肽并对其部分 生物活性做了一定的检测，目前，正在进行深入研究。国内，有关乳蛋白来源的免 疫活性肽的研究尚未见其它报道。 天津商学院硕士学位论文前言 1 4 开展此课题的依据 从生物进化的角度来看，营养蛋白应该从功能蛋白进化而来，当生物进化到需 要为后代发育提供营养时，他不可能凭空制造出一种营养蛋白，只能通过若干d n a 功能区“组装”出营养蛋白来。因此我们认为，在不同的营养蛋白多肽链中可能广 泛存在着不同的功能区，只要用适当的蛋白酶水解并从营养蛋白中释放出来后，就 可还原其生理功能特性。另外，2 0 种氨基酸不同长度的排序，决定