（纺织工程专业论文）丝素蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影响研究.pdf

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t u r ns t r u c t u r ew h e r er g d s e q u e n c ep e p t i d e sa r e ，e t c i nt h i sp a p e r , b yc u l t i v a t i n gn e u r a ls t e mc e l l sc1 7 2a n df i b r o b l a s tl 3 7 3i nm i c e ，w e f u l l i yp r o v e dt h a ti n f l u e n t i a lf a c t o r so fc e l la d h e s i o na n dg r o w t ho nt h en a t u r a lf i b r o i nf i b e r a n dt h er e g e n e r a t i v ef i b r o i nn a n o f i b e r b ya n a l y s i s ，w ec a l lg o tt h a t ，i nt h ev i e wo f m a t e r i a l o g y , t h ec e l la d h e s i o no fb i o m a t e r i a li sr e l a t e dt ot h ec o n t e n to fb a s i ca m i n oa c i d ， f - t u r ns t r u c t u r ea n dr g ds e q u e n c ep e p t i d e s w ec a na l s og o tt h a tt h et u s s a hf i b r o i nf i b e r c o n t a i n e dm o r eb a s i ca n l i n oa c i dt h a nt h eb o m b y xm o r if i b r o i nf i b e r , a n di th a sh i g hr a t eo f p - t u r ns 仃u c t u r e ，a n d ，a n de x i s t e dt h e r g ds e q u e n c ep e p t i d e s s o ，a tl a s t ，w eg o ta c o n c l u s i o nt h a tt h ec e l la d h e s i o no ft u s s a hf i b r o i nf i b e ri sb e t t e r ，a n dg o o df o rc e l lg r o w t h k e yw o r d s ：r g ds e q u e n c ep e p t i d e s ，p 咱姗s t r u c t u r e ，b a s i ca m i n oa c i d ，n e u r a ls t e mc e l l s c 1 7 2 ，f i b r o b l a s tl 3 7 3 w r i t t e n b y ：q i n g q i n gz h a o s u p e r v i s e db y ：p r o f b a o q iz u o 目录 第一章引言1 1 1 桑蚕、柞蚕丝素蛋白的基本性质和应用1 1 1 1 桑蚕、柞蚕丝素蛋白的组成、结构1 1 1 2 桑蚕、柞蚕丝素蛋白的理化性能4 1 1 3 丝素蛋白在组织工程上的应用现状5 1 2 短肽r g d 的作用与应用8 1 2 1 细胞粘附简介8 1 2 2 短肽r g d 序列与整合素9 1 2 3 短肽r g d 的研究现状1 l 1 3 静电纺丝的原理和应用1 5 1 3 1 静电纺丝简介1 5 1 3 2 静电纺制丝素纳米纤维1 8 1 4 本文的研究目的和主要内容1 9 第二章桑蚕和柞蚕丝素纤维及其各去表层蛋白纤维的组成、结构与性能2 0 2 1 材料与方法2 0 2 1 1 实验材料2 0 2 1 2 实验器械2 0 2 1 3 实验方法一2 0 2 2 结果与讨论2 3 2 2 1 电镜扫描2 3 2 2 2 氨基酸分析2 6 2 2 3 红外吸收光谱分析2 9 2 2 4 热分析3 4 2 2 5 亲水性能测试3 7 2 3 本章小结3 9 丝素材料的r g d 三肽生化检测的研究初探4 1 材料与方法4 1 3 1 1 实验材料4 1 3 1 2 实验仪器4 2 3 1 3 实验步骤4 2 结果与讨论4 3 3 2 1r g d 三肽序列检测原理4 3 3 2 2 天然原纤材料的r g d 生化检测结果4 6 3 2 3 再生纳米材料的r g d 生化检测结果4 7 3 3 本章小结4 8 第四章丝素材料细胞粘附性的体外实验研究4 9 4 1 材料与方法4 9 4 1 1 实验材料4 9 4 1 2 实验仪器5 0 4 1 3 实验步骤5 0 4 2 结果与讨论5 1 4 2 1 神经干细胞系c 1 7 2 细胞在丝素材料上的粘附增殖情况。5 1 4 2 2 成纤维细胞系l 3 7 3 细胞在丝素材料上的粘附增殖情况5 8 4 3 本章小结。6 5 第五章结论6 6 5 1 全文结论6 6 5 2 本文的主要研究成果6 7 5 3 论文欠缺与进一步研究设想6 8 参考文献6 9 发表论文目录8 0 致谢8 1 丝素蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影响研究 第一章 第一章引言 蚕丝的水解产物富含氨基酸和多肽，据此，人们广泛开展了蚕丝作为护肤保健品、 保健食品和医药原料的应用研究。而且蚕丝具有优良的柔韧性、吸湿性、透气性，对 人体细胞具有良好的亲和性，可以制成各种目的形状。随着生物化学和分子生物学向 生命科学各种领域的广泛渗透，蚕丝研究也逐渐向分子水平发展，由此产生了蚕丝丝 素在组织工程、生物医学材料等高技术领域的研究，并展示了广阔的应用前景。特别 是丝素纳米纤维作为良好的生物材料在组织工程、生物工程等领域里得到了广泛应 用，并具有更深更广的研究价值。 1 1 桑蚕、柞蚕丝素蛋白的基本性质和应用 1 1 1 桑蚕、柞蚕丝素蛋白的组成、结构 蚕( s i l k w o r m ) 分为家蚕( 桑蚕，b o m b y xm o r i ) 和野蚕( t u s s a h ) 两类。野蚕 有柞蚕、天蚕、蓖麻蚕、樟蚕和柳蚕等数种，其中柞蚕( a n t h e r a e ap e r n y i ) 是最常见 的野蚕品种。 蚕丝是蚕五龄后期合成并分泌的蛋白质，由绢丝腺内壁上的内皮细胞合成后分泌 进入后部丝腺，并贮藏在那里直到形成纤维。蚕丝主要由丝素( f i b r o i n ) 和丝胶 ( s e r i c i n ) 两种蛋白质组成。丝素蛋白是蚕丝中主要的组成部分，在家蚕丝中约占 7 0 ，在柞蚕丝中约占8 5 ；丝胶包裹在丝素蛋白的外围，在家蚕丝中约占2 5 ，在 柞蚕丝中约占1 5 。蚕丝丝素纤维由若干根微纤维和巨原纤维平行排列而成，截面呈 三角形，见图示意图1 1 ，这样的形态与构造是蚕丝具有优雅的光泽、柔软的手感和 良好悬垂性的重要原因之一。蚕丝丝素分子的凝聚能大，具有适度的结晶度，因此机 械性能优良，断裂强度可与铁丝匹敌【1 1 。 第一章丝素蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影响研究 鲢紊蚕熊 图1 1 蚕丝微细结构不意图 1 1 1 1 桑蚕、柞蚕丝素蛋白的氨基酸组成 桑蚕丝素是一种纤维状蛋白，一般有1 8 种氨基酸组成，丝素复合体的分子量约 为2 2 8 6k d a ，由重链( h 链，分子量3 5 0k d a ) 、轻链( l 链，分子量2 5 8k d a ) 及 糖蛋白p 2 5 ( 分子量2 8k d a ) 组成，三者比例为h ：l ：p 2 5 = 6 ：6 ：1 ，重链和轻链由各自 c 一末端的二硫键相互连接形成复合体，p 2 5 糖蛋白以非共价相互作用加入复合体中， 有助于形成稳定的轻重链复合1 2 。h 链包含1 5 1 个氨基酸残基长度的非重复n 一末端序 列( 信号肽) ；5 0 5 4 个氨基酸残基长度的核心区域，在此区域中1 1 个短的无定形区 ( 重复序列编码4 3 个氨基酸) 和1 2 个长的结晶区交替出现；以及5 8 个氨基酸残基 长度的c 一端序列。h 链大部分序列是低复杂度的，由2 3 7 7 个g l y - x ( g x ) 二肽重 复单元组成，是非常容易结晶的肽链【3 1 。l 链由2 6 2 个氨基酸残基组成，前1 8 个氨 基酸是信号肽。l 链中含有3 个半胱氨酸残基，其中2 个半胱氨酸形成分子内二硫键， 第三个胱氨酸残基位于c 一末端较亲水区域内，与丝素蛋白h 链第5 2 4 4 号氨基酸形 成链间二硫键，组装成丝素蛋白【4 1 。p 2 5 蛋白是一种糖蛋白，由p 2 5 链和3 个寡糖链 组成。p 2 5 链基因由2 2 0 个氨基酸残基组成，前1 7 个氨基酸是信号肽。p 2 5 链中含有 8 个半胱氨酸，形成4 个分子内二硫键。主要控制丝素蛋白的折叠，透过疏水作用、 氢键诱导丝素蛋白进行伊折叠，形成规整的结构，可能与蚕液晶纺丝机理有关【5 1 。 柞蚕丝素蛋白仅由h 链组成，h 链的总长度是2 6 3 9 个氨基酸残基，分子量2 1 6 k d a 。柞蚕丝素头部( n - 末端) 为1 5 5 个残基的氨基酸序列，最头部为1 4 个氨基酸 残基编码序列( m r v i a f v i l c c a l q ) 。头部的保守氨基末端序列将可能成为探索丝 2 丝素蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影响研究 第一章 素蛋白分泌的重要信号肽。在组成柞蚕丝素的所有氨基酸中，丙氨酸、甘氨酸和丝氨 酸这三种氨基酸的含量约占总量的8 1 ，含量分别为4 3 0 8 、2 7 2 8 和11 2 5 。 但是在头部这三种氨基酸的含量不是很丰富，因此头部区域的疏水性与其他区域显示 出不同的特性。除了头部1 5 5 个氨基酸，柞蚕丝素内部含有8 0 个富含丙氨酸的基序， 这部分是亲水区域与疏水区域交替排列。柞蚕丝素蛋白内部由高度的重复序列组成， 在1 5 6 - - 2 5 5 5 氨基酸之间，共有7 8 个重复，丰富的丙氨酸序列一( a l a ) n - 易形成0 c 一 螺旋结构。家蚕丝素的结晶区中主要含有重复序列一( g i y - x ) n 一，其中x 为丙氨酸、 丝氨酸或酪氨酸；而柞蚕丝素结晶区中含有大量的一( a l a ) 。- 重复序列。组成非晶区 的大部分是较大侧链和极性的氨基酸残基，这在柞蚕丝素蛋白的非晶区更为突出。结 晶区与非晶区氨基酸组成和结构的差异使得家蚕和柞蚕丝纤维的理化性质有较显著 差异【6 】。柞蚕丝素中的酸性氨基酸( 天门冬氨酸和谷氨酸) 和碱性氨基酸( 赖氨酸、 组氨酸和精氨酸) 残基的含量较高。同时，柞蚕丝素蛋白中含有大量带有极性和侧基 可电离的氨基酸残基，这些都是化学反应的潜在反应位点，因此柞蚕丝素的化学活性 较强1 7 - 9 1 。 同时，由柞蚕丝素的氨基酸序列可见，其中含有较多的精氨酸甘氨酸- 天门冬氨 酸( r g d ) 三肽序列，它是细胞的粘附识别点，它与哺乳动物细胞有特异相互作用，有 利于其用作生物医学材料时细胞在材料上的黏附和生长，这是其具备优良的生物学性 能的重要的结构原因之一，所以检测其上r g d 三肽序列对细胞在材料上的粘附生长 研究显得尤为必要。 1 1 1 2 桑蚕、柞蚕丝素蛋白的聚集态结构 一般认为：蚕吐丝的过程是丝素蛋白构象转变的过程。丝素蛋白的多肽链在稀水 溶液中呈无规线团；溶液变浓时，构象逐渐转变成一螺旋形式；在吐丝时受到应力 和脱水作用，变成不溶于水的1 3 一折叠构剩1 0 1 。 桑蚕丝素纤维中包含结晶区和非结晶区，两者交互排列，h 链交替穿过结晶区和 非结晶区。对于家蚕丝素的结晶形态，清水正德首先发现家蚕丝素的两种结晶形态： a 型和b 型。在其后，k r a t k y 证明了两种结晶形态的存在，并指出丝素仪型的分子结构 并非一般蛋白质中的0 c 螺旋结构。为避免混淆，通常把丝素的仅型和d 型称为s i l ki 和s i l ki i 。s i l ki 的晶体结构模型由b l o t s t l l l 提出，另外平林洁、小西孝等1 2 1 也对 第一章丝素蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影堕蔓壁壅 其进行过研究，其立体构象呈曲柄型，是介于o c 螺旋和d 哳叠之间的一种中间形态。 s i l ki i 的晶体结构模型由m a r s h t l 3 1 根据x 一射线衍射结果提出，是反平行p 哳叠层结 构，属斜方晶系，肽链链段排列整齐，抵抗外力拉伸的能力强，难溶于水。r e g i n a 等人【1 4 】在丝素溶液与空气界面上中发现了丝素i i i 结构，这种结晶内部丝素蛋白大分 子的构象比较特殊，呈d 哳叠螺旋结构。 柞蚕丝素蛋白分子的构象比较复杂，通常同时含有多种构象，目前证实的三种构 象为无规卷曲、a 螺旋和p 折叠( 主要为反平行d 哳叠) 结构。柞蚕丝素蛋白中的多 种构象在一定条件下可以互相转化。三种结构的示意图如图1 - 2 所示。天然柞蚕丝素 蛋白溶液可以从柞蚕熟蚕的后部丝腺( 吐丝前一天) 中获得。据报道，直接从柞蚕后 部丝腺取出的天然丝素蛋白质的分子量为2 1 6k d a l l 5 】。溶液状态下的天然柞蚕丝素蛋 白为0 c 螺旋结构，将天然丝素蛋白溶液延流成膜，该膜的分子构象主要为0 c 螺旋和无 规卷曲，经热或者甲醇等有机溶剂处理之后，分子构象发生了仅螺旋向p 哳叠结构的 转变【1 6 - 2 0 。 ”：i 、 吲h h ，- _ 气，1 ，o _p_ - p 岫 一_ 嘈- 。 一竹o - 一 一 - - o 一 一一砖- - - , 4 呻 p 心 t p “一j h 卜1 - i i - ， t q 一, - oh h - ， 气。，”。， 一- ，- 岫_ 一 ( a ) 无规卷曲( b ) 0 【螺旋( c ) p 新叠 图1 2 蛋白质二次构象示意图 1 1 2 桑蚕、柞蚕丝素蛋白的理化性能 从熟蚕体内后部绢丝腺收集的丝素蛋白只能满足实验室少量制备的需要，不能满 足大规模生产的要求。天然丝素纤维由于分子链中的疏水键以及结构中大量的p 哳叠 结构使得结晶度高，难被生物降解，不能直接用于制备组织工程支架、药物控制释放 载体等需要可被生物降解的生物材料。所以，需要采用化学溶解的方法将丝素纤维溶 解、纯化后获得再生丝素蛋白水溶液，再用此水溶液制备所需要的形态、结构和功能 的生物材料，例如纤维、多孔材料、凝胶、膜、粉末等。 4 丝素蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影响研究 第一章 目前已有研究者成功地完成了对家蚕和柞蚕丝素纤维的溶解。桑蚕丝素主要用 l i b r 、l i s c n 、c a c l 2 等盐的浓溶液溶解，经透析除盐后得到的丝素水溶液由于溶剂 的作用而使部分分子链断裂，其分子量比天然丝素的分子量有所降低。h a ey o n g k w e o n 等2 1 1 将脱胶后的柞蚕丝素纤维用熔融的四水合硝酸钙溶解，发现丝素纤维的 溶解性与硝酸钙的浓度、溶解温度和时间有很大关系。m i n g z h o n gl i 等【2 2 1 将脱胶后的 柞蚕丝素纤维用硫氰酸锂溶解，同样发现丝素纤维的溶解性与硫氰酸锂的浓度、溶解 温度和时间紧密相关。 柞蚕丝素纤维经化学溶解后，纯化得到再生丝素蛋白溶液，目前已有研究者利用 再生柞蚕丝素溶液制备了相关的材料，并研究了它们的结构和理化性质。h a ey o n g k w e o n 等 2 6 - 2 8 对硝酸钙溶解的再生柞蚕丝素溶液制备的丝素膜进行热或者有机溶剂 处理后性质变化的研究。m i n g z h o n gl i 等【2 明对硫氰酸锂溶解的再生柞蚕丝素溶液制备 的丝素膜进行了有机溶剂处理的研究。再生柞蚕丝素蛋白可以加工成多种生物材料。 但是直接用再生柞蚕丝素溶液制备的材料由于结晶度低，在水中稳定性及机械性能 差，难以实际应用。通过使用溶剂、热处理或物理拉伸的方法形成d 哳叠结构，能够 提高其耐水性及力学强度，但材料却变得很脆，韧性差。 1 1 3 丝素蛋白在组织工程上的应用现状 1 1 3 1 组织工程支架材料的性状要求 组织工程材料特征是在分子水平上模拟特定细胞和基因特异性反应，使材料具有 主动诱导、激发人体组织和器官的再生修复能力，使材料能参与人体物质交换并产生 相互结合。 理想的组织工程或组织诱导支架材料至少应具备以下几个条件划：( 1 ) 有良好 的生物相容性，其本身及降解产物对细胞和机体无毒性，不会或较少引起炎症和免疫 排斥反应；( 2 ) 适度的生物降解速率，降解速率需和组织再生的速率相匹配，最后 可完全吸收或安全地排出体外；( 3 ) 良好的表面相容性，即材料表面具有足够的细 胞粘附能力，有利于细胞的粘附、分化和增殖；( 4 ) 良好的结构相容性，具有一定 的力学强度和可塑性，能保持稳定的三维立体结构。海绵状或纤维网状三维支架应具 有互相连通的孔结构与高的孔隙率，孔径大小适当，可以为种子细胞的均匀分布和生 长提供足够的空间，同时也有利于营养物质和代谢产物的扩散。此外，制作支架的原 料应来源充足，易于加工成型并重复制作。因此，理想的细胞支架应是具有一定的生 气 第一章丝素蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影响研究 物降解速度、良好的生物相容性和细胞亲和性、有一定的力学性能、能灭菌消毒、具 有特定三维多孔结构，且包含可以控制释放的生长因子的超分子集合体。 1 1 3 2 丝素蛋白在组织工程上的应用 细胞外基质是由细胞分泌到细胞外空间的蛋白和多糖等构成的精密有序的网络 结构。细胞与细胞的信息传递以及细胞的功能完成与胞外的基质环境是密不可分的。 在体内细胞的生长环境是三维的，细胞外基质的也是由非常复杂的纳米级纤维网络构 成的。传统细胞培养的包被方式主要集中在膜状形式，这与真正的细胞外环境差异很 大。模拟细胞外基质纳米结构进行仿生材料设计与制备及相关研究，无疑对生物材料 在再生医学中的应用至关重要。而再生型丝素蛋白( 均含有利于细胞生长的蛋白结构 序列，且柞蚕含有r g d 序列) 在静电下喷涂形成直径为纳米级的纤维状结构就是部 分模拟了细胞在体内的三维生长环境以及细胞外网络状基质错综复杂的蛋白网络结 构，为细胞生长提供粘附点，使其更好完成细胞自我生命活动和细胞间的信息传递。 以往国内外已对家蚕丝素材料的生物性能进行了较全面的研究，家蚕丝素蛋白是 性能优良的生物材料，湿态下具备很好的力学性能、抵抗酶解能力。再生的家蚕丝素 材料具备良好的透氧性【3 1 1 、无毒性、无刺激性，良好的生物相容性。国内外许多研究 已经从生物整体、细胞、分子生物学三个水平上证明了丝素蛋白的这些特性。 江莹【3 2 】等人在脱胶后的s f 纤维上种植了大鼠骨髓间充质干细胞，通过扫描电镜 ( s e m ) 、荧光显微镜检测了丝素上细胞的生长情况，结果显示蚕丝具有良好的生物相 容性，细胞亲和力，为蚕丝在韧带组织工程方面的进一步应用奠定了基础。p a n i l a i t i s b1 3 3 将r a w2 6 4 7 鼠的巨噬细胞接种到家蚕丝素纤维材料上，结果显示不论是长期 还是短期培养，巨噬细胞都表现出免疫惰性。m i n o u r a l 3 4 等人认为丝素膜可以作为细 胞培养基质。s g h o s h 、d a v i dl k a p l a n 【3 5 】等人制备了直径为5 微米的再生丝素三 维支架，这种支架可以支持骨髓间充质干细胞的粘附和生长，结果研究表明由于具有 优异的支架结构及其生物相容性，这种三维丝素支架在组织工程方面有很大的应用潜 力。a n d r e as g o b i n 3 6 1 等人利用丝素壳聚糖制成了三维支架。刘琳【3 7 】等人应用共 混法制备了纳米羟基磷灰石丝素蛋白复合支架材料，通过体外降解和细胞培养实验 研究了复合支架材料的降解特性和生物相容性。体外降解实验结果显示了复合支架材 料具有稳定的降解能力及纳米羟基磷灰石丝素蛋白复合支架作为骨组织工程的支架 6 丝素蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影响研究 第一章 材料具有良好的应用前景。王静【3 8 】等人采用来自胎鼠颅盖骨成骨细胞为种子细胞，冷 冻干燥技术制备羟基磷灰石( h a ) 壳聚糖( c s ) 丝素( s f ) e 药淫羊藿( e p ) 多元混构 支架材料。三种材料对细胞活性的影响规律为h a c s s f e p 优于h a c s s f 优于 h a c s ，h a c s - s f - e p 材料有望成为具有发展潜力的新型骨组织工程支架材料。许波p 9 l 等人将丝素蛋白与异体松质骨共同培养构建组织工程化软骨复合体，结果表明骨髓基 质干细胞( b m s c s ) 能在丝素蛋白和松质骨支架上较好的黏附、生长，共培养后成功 地构建了组织工程化骨软骨复合体，体内移植后生成了透明软骨样组织并修复了骨软 骨缺损。尹航 4 0 i 等人体外培养兔骨髓间充质干细胞分别在丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰 石胶原骨基质上进行体外复合培养，兔骨髓间充质干细胞在丝素蛋白和纳米晶羟基磷 灰石胶原骨上具有良好的黏附、增殖和生长性能，两种材料相比较其细胞相容性没有 明显的差异。结果显示了丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原骨均具有良好的生物相 容性，可以作为组织工程理想的载体材料。张亚【4 1 1 等观察兔骨髓间充质干细胞在复 合多孔丝素蛋白支架上进行体外培养情况，探讨多孔丝素蛋白适合细胞生长的孔径及 作为支架材料的意义。李明忠1 4 2 等人采用冷冻干燥法制得多孔丝素膜，其内部丝素的 结构以无定形为主，含少量丝素i i ，平均孔径可在1 0 3 0 0i li l l 范围内调节。这种多 孔丝素膜具有良好的生物相容性，人表皮细胞、毛细血管和成纤维细胞等能够长入其 内而成活。n a r i a 等【4 3 】在鼠的皮下植入家蚕丝素多孔材料，六个月后发现，丝素多孔 材料不仅具有良好的生物相容性，而且还能诱导网状结缔组织血管物质的再生。 k a p l a n 等 4 4 , 4 5 】对丝素蛋白支架材料用于骨组织工程方面进行了研究，研究结果指出， 丝素蛋白材料支持h m s c s ( 人骨髓间充质细胞) 的生长和分化，有利于骨的生成。 他们还把种植了h m s c s 的丝素蛋白支架材料用于体内和体外培养，实验证明经过体 外培养的h m s c s 丝素蛋白复合支架材料具有良好的成骨能力，能够治愈临界尺寸的 骨缺损。q f a n g l 4 6 1 等人用肌腱细胞和动物模型研究了柞蚕丝素纤维作为组织工程肌腱 支架体外培养和体内修复的可行性。在新西兰白兔的跟骨腱两侧造成1 5 m m 的缺损， 在后足一侧的跟骨腱缺损用编织的柞蚕丝素纤维支架修复，另一侧不处理作为对照 组。缺损肌腱的修复情况在手术后第2 、6 、1 2 、1 6 周用组织学、免疫组化、扫描电 镜和生物力学测试等手段进行评价。体外细胞培养的结果通过扫描电镜观察，表明柞 蚕丝素促进了肌腱细胞的粘附和增殖。在体内实验中，形态学结果表明术后1 6 周有 新生肌腱生成，在新生肌腱中胶原纤维束排列均匀且取向良好。免疫组化结果表明再 7 第一章丝素蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影响研究 生肌腱中的胶原主要是胶原i 型。术后1 6 周，再生肌腱的最大负荷值达到正常肌腱 的5 5 4 6 。总的来说，柞蚕丝素促进了兔跟骨腱缺损的修复，柞蚕丝素作为组织工 程肌腱支架是可行的。h w a n gj s m 等人报道接种在家蚕丝素基质上的成纤维细胞 l 9 2 9 的粘附和生长状况与胶原基质上的一样；而柞蚕丝素基质比家蚕丝素基质有更 高的细胞粘率附和生长率。 柞蚕丝素氨基酸序列中含有较多的精氨酸甘氨酸- 天门冬氨酸( r g d ) 三肽序列， 虽然三肽序列只有1 2 k b 长，但是它作为一个合适的受体能与哺乳动物细胞表面形成 特异性相互作用，能与细胞表面黏附家族中的整合素配体( i n t e g r i nr e c e p t o r s ) 键合， 作为细胞黏附座而有利于其用作生物医学材料时细胞在材料上的黏附和生长，所以在 柞蚕丝素基质上表现出较高的细胞粘附和生长。这是柞蚕丝素具备优于家蚕丝素的生 物学性能的重要的结构原因之一。 1 2 短肽r g d 的作用与应用 1 2 1 细胞粘附简介 细胞粘附可发生在组织结构的维持、伤口愈合、免疫反应、肿瘤转移以及生物 材料与组织的整合( t i s s u ei n t e g r a t i o no fb i o m a t e r i a l ) 等。组织工程学是用工程学和生命 科学的原理和方法来研究正常和病理哺乳类动物组织的结构功能关系，以及研制生物 代用品，以恢复、维持或改善其功能的- l - 交叉学科。其内容包括种子细胞规模扩增、 可降解材料构造设计及制备、在支架上接种种子细胞、细胞支架复合体三维培养、植 入体内、与组织器官整合使组织器官的功能恢复、维持或提高。细胞与材料的相互作 用是组织工程学研究的主要领域之一，细胞必须与材料粘附，才能进行迁移、分化和 增殖。无论在体外，还是体内，直接也是最先与组织细胞相接触并发生作用的是材料 表面，因此细胞与材料表面的粘附相当重要，而且粘附特性的差异还将影响细胞的增 殖、分化等一系列反应。细胞与材料的粘附也是组织工程学必须研究的基本问题。它 不仅可以为组织工程研究筛选出适于细胞发挥生理功能的细胞支架材料，而且为研究 细胞与细胞外基质相互作用的分子机制提供了重要的手段。细胞与材料表面的粘附对 于植物的生物整合以及培养细胞的生长都有着深刻的影响。所以细胞粘附性也成为评 价支架材料生物相容性的重要指标之一【4 叼。 细胞粘附过程包括以下四个阶段：细胞附着( c e l la t t a c h m e n t ) 、细胞铺展( c e l l 丝素蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影响研究 第一章 s p r e a d i n g ) 、细胞骨架( c y t o s k e l e t o n ) 调整、黏着瓒t ( f o c a la d h e s i o n s ) 的形成。细胞附着是 细胞粘附过程中的最初阶段，仅仅是指细胞贴附在底物上。它可以在几秒或几分种内 完成，涉及细胞材料间物理化学联系诸如离子力、范德华力等短期事件 ( s h o r t - t e r m e v e n t ) ；附着的细胞与基质蛋白结合紧密，不易被冲走，很快进入细胞伸展 相，附着的细胞变平，细胞膜在基质表面伸展，呈现各种细胞本身特有的形态；接着， 肌动蛋白进入微丝束，形成肌动蛋白细胞骨架；黏着斑，它首先被用来描述成纤维细 胞的粘附，后来发现在各种细胞的粘附过程中均存在这种现象。 由此可见，细胞粘附涉及多种生物分子，包括细胞外基质蛋白、细胞膜蛋白以及 细胞骨架蛋白的相互联系和相互作用。不仅如此细胞和材料的粘附应是一个包括多因 素的复杂过程，受多种因素的影响。细胞( 如细胞代谢状态、细胞表面电荷、细胞表 面膜分子的侧向运动及其柔韧性) 、材料及其二者所处的环境( 如酸碱度、温度、机 械负荷及作用的时间) ，都不同程度地影响细胞与材料的粘附。 从材料方面来说，材料表面的理化特性、几何形状及表面能以及材料的降解活性， 都对细胞粘附起关键性作用。材料表面的亲水性和疏水性对细胞的粘附也有重要影 响。通常情况下，在亲水性材料表面上，细胞的粘附能力优于疏水性材料表面；降解 活性好的材料利于细胞粘附，p l a ( 聚乳酸) ，p g a ( 聚磷酸甘油酸) 和p l g a ( 聚 乳酸掘基乙酸) 聚酯材料具有良好的生物相容性、可降解吸收性，在组织工程学研 究中被广泛应用；但是，这类材料还存在一些不足，如：材料的亲水性不够理想、细 胞粘附性较弱以及分子链中缺乏活性基团等。为解决如上问题，物理和化学方法改性 成为研究热点。物理方法主要是通过改变材料表面的微观结构( 如表面粗糙程度、电 荷或者几何形状等) 。化学方法包括材料的本体化学改性和表面化学改性。表面化学 改性主要是在材料表面接枝不同的生物活性分子，如：氨基酸、多肽和细胞生长因子 等。本体化学改性主要是通过将l a ，ga 与其他单体共聚来控制材料的物理形态，调 节材料的亲水性、降解性以及其他特性。 1 2 2 短肽r g d 序列与整合素 1 9 8 4 年，p i e r s c h b a c h e r 等人【4 9 】首次报道了趣毛l y a s p ( r g d ) 三肽( 即精氨酸- 甘 氨酸- 天门冬氨酸三肽) 是纤粘连蛋白( f n ) 与其受体的特异性结合位点，1 9 8 7 由e r k k i r u o s l a s h 等人在s c i e n c e 发表的文章中进一步确认t r g d 序列是细胞体系的基本单位， 9 第一章丝素蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影响研究 介导细胞对细胞外基质的粘附作用，为细胞间质蛋白与其受体结合的功能部位。其后， 随着对细胞外基质构效关系研究的不断深入，人们相继发现细胞外基质( e c m ) q a 很多 糖蛋白如纤粘连蛋白( f i b r o n e c t i n ，f n ) 、纤维蛋白原( f i b r i n o g e n ，f b ) 、胶原蛋白 ( c o l l a g e n ) 和骨桥蛋i 刍( o s t e o p o n t i n ，o p n ) 等均含高度保守的r g d 序列蛋白，并证实了 r g d 在介导细胞与细胞、细胞与胞外基质蛋白的相互作用中发挥重要作用。 r g d ( a r g - g l y - a s p ) 肽是由三个氨基酸组成的短肽序列，是多种细胞表面整合素 ( 如a 31 31 、a 51 31 、a v l 31 ) 的特异配体之一，是目前应用最广泛、且被证明最有效的促 黏附多肽，像纤维蛋白的a 链9 5 2 9 8 和5 7 2 2 5 7 5 分别为r g d f 和r g d s ，可称为隐义 r g d 序y j j t 5 0 5 1 1 。r g d 序列在体内6 7 种蛋白质中发现，包括粘连蛋白( f 、层粘连 蛋白( l m ) 、玻连蛋白( v i t r o n e c t i n ) 、胶原、纤维蛋白原、( c o nw i l l e b r a n d ) 因子等。 整合素( i n t e g r i n ) 是哺乳动物细胞膜与e c m 成分结合的主要受体，是一大类依赖 c a 2 + 的黏附分子，由a 、1 3 两个跨膜糖蛋白通过非共价键连接形成异二聚体，两者胞 外部分共同构成配体结合区。迄今发现1 8 种a 亚单位和8 种1 3 亚单位，构成2 4 种整 合素，这1 6 个a 亚单位和8 个1 3 亚单位，每个亚单位包含3 个节段：一个长的细胞外 节段、跨膜节段和一个短的细胞内节段，每个整合素分子由一个a 亚单位和一个1 3 亚 单位组成异二聚体。a 和1 3 链亚单位不同，它们结合的配体亦不尽相同，如a 31 31 是 胶原受体，a 51 31 是f n 受体，a 6 1 31 是l m 受体，a l1 3l 、a 2b1 是胶原及l m 受体， a 4bl 是f n 及血管细胞黏附分子( v c a m ) 一1 受体。，每一种整合素分子可有几种细胞 外基质做配体，而每个细胞外基质中的配体也可能被不同的整合素识别；但是，整合 素均识别含r g d 的序列多肽。在细胞粘附过程中，整合素主要参与细胞附着和跨膜 信号转导。一般而言，整合素在细胞表面分布数量较大，有利细胞和e c m 可逆性黏 附，继而活化信号通路，调节细胞骨架，促进黏着斑相关基因表达或蛋白活性改变， 引起细胞的形态变化、铺展、迁移、增殖、分化、存活等效应。研究发现，整合素有 两种信号转导途径：胞内信号外传( i n s i d e - o u ts i g n a l i n g ) 和胞外信号内传( o u t s i d e - i n s i g n a l i n g ) ，前者使整合素受体和配体亲和性增高，后者导致细胞内部效应，即细胞通 过整合素及其辅助受体，结合e c m 成分，随后受体在细胞表面丛集成簇，诱导黏着 斑形成。其中黏着斑激酶( f a k ) 是组成黏着斑蛋白复合物的枢纽，磷酸化后募集踝蛋 白、辅肌动蛋白、纽带蛋白等，激活信号传导，调节骨架张力纤维，促进细胞增殖、， 抑制凋亡。研究发现，体外细胞培养时，若r g d 肽未固定于材料，游离肽可竞争性 l o 丝索蛋白纤维表层氨基酸对细胞粘附与生长的影响研究 第一章 抑制细胞与材料的正常黏附，导致细胞凋亡和组织无血管生成。 1 2 3 短肽r g d 的研究现状 1 2 3 1 短肽r g d 的构象与检测手段 为了能够更好的