（细胞生物学专业论文）adam10条件性基因打靶载体的构建和鉴定.pdf

厦门大学硕士学位论文a d a m l 0 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 a d a m i o 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 研究生：林熠华 导师：王义权教授 周常文教授 【摘要】 【目的】构建a d a m l 0 条件性基因打靶载体，为制备a d a m l 0 条件性基因敲除 的小鼠模型和研究a d a m l 0 基因的功能奠定基础。 【方法】运用长片段p c r 技术，从1 2 9 s v j 小鼠基因组中分步扩增a d a m l 0 基因第- - # f 显子及其两端作为同源臂的侧翼序列，长度分别为6 2 k b 和6 k b 。经 测序鉴定后，将外显子以及上下游同源臂片段分别连接于基因打靶骨架载体 p l 4 5 1 上，构建了基因打靶中间载体p e f u d 。再从p s s c 9 载体上酶切下h s v t k 基因，连接于p e f u d ，最终构建成a d a m l 0 条件性基因打靶载体p e f u d - t k 。 为了验证载体上正负双向选择基因的功能，分别以环状和线性p e f u d - t k 为 实验组，p s s c 9 、p l 4 5 1 和空转为对照组，采用脂质体2 0 0 0 ( l p 2 0 0 0 ) 转染人神 经母细胞瘤细胞( s h _ s y 5 y ) ，研究n e o 基因和h s v - t k 基因的表达活性。 【结果】：克隆的a d a m l 0 基因第二外显子及侧翼序列的酶切图谱与公布 的1 2 9 s v j 小鼠相应序列的酶切图谱相一致。测定的序列与数据库公布的小鼠 相应序列基本相同( 9 9 8 ) 。其中，第- - # b 显子序列与公布的小鼠序列完全一致。 外显子与上、下游同源臂序列均正确地连接于p l 4 5 1 载体，来源于p s s c 9 的 h s v t k 基因经过测序均与报道的h s v - t k 基因序列完全相同，因此成功构建了 a d a m l 0 条件性基因打靶载体。用l p 2 0 0 0 转染s h - s y 5 y 细胞，g 4 1 8 ( 8 5 0 n g m 1 ) 筛选l o 天后，空转对照组细胞全部死亡，p e f u d - t k 环状实验组、p e f u d - t k 线 性化实验组、p l 4 5 1 和p s s c 9 对照组均有少量细胞存活，并形成小的细胞集落； 细胞再经g c v ( 1 0 n g m 1 ) 筛选，7 2 小时后，环状和线性p e f u d t k 实验组以及 p s s c 9 对照组均有大量细胞死亡，g 4 1 8 筛选后形成的细胞集落大部分消失， p l 4 5 1 对照组基本无细胞死亡，原有的小细胞集落继续生长。 【结论】：成功构建并鉴定了a d a m l 0 基因条件性基因敲除打靶载体 ( p e f u d t k ) ，载体中正负双向选择基因能够发挥正常的功能。 【关键词】条件性基因打靶载体构建a d a m l 0 基因 c o n s t r u c t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa d a m l 0 c o n d i t i o n a lg e n et a r g e t i n gv e c t o r p o s t g r a d u a t e ：l i nz h a o h u a s u p e r v i s o r ：w a n gy i q u a n z h o uc h a n g w e n a b st r a c t o b j e c t ：c o n s t r u c t i o no fa d a m i oc o n d i t i o n a lg e n et a r g e t i n gv e c t o ri s t ol a yt h ef o u n d a t i o no fp r e p a r i n gt h ea d a m i oc o n d i t i o n a lk n o c k o u tm i c e a n dt os t u d yt h ef u n c t i o no fa d a m i og e n e m a t e r i a la n dm e t h o d ：g e n o m i cd n af r a g m e n t ss u r r o u n d i n ge x o n2o fa d a m i o g e n ew e r ea m p l i f i e df r o m1 2 9 s v jm i c eb yp c r p a r t i a lf r a g m e n t so fw h i c h w e r es e q u e n c e d t h e2 5 k bs h o r ta r m 、4 9 k bl o n ga r ma n dt h ee x o n 2w e r e l i g a t e dt ot h et a r g e t i n gs k e l e t o nv e c t o rp l 4 5 1 ，r e s p e c t i v e l y ，t of o r mt h e i n t e r m e d i a t ev e c t o rp e f u d t h ef i n a l t a r g e ti n gv e c t o rp e f u d - t kw a s c o n s t r u c t e db y l i g a t i n gt h eh s v t k g e n ef r a g m e n ti s o l a t e d f r o mt h e p s s c 9 p la s m idt ot h ev e c t o rp e f u d i no r d e rt ou n d e r s t a n dw h e t h e rt h en e oa n dh s v 。t kg e n eint h ef in a l c o n s t r u c tp l a yan o r m a lr o l ei nv i t o r ，t h ep l a s m i dp e f u d t k 、p l 4 5 1a n d p s s c 9w e r es e p a r a t e l yt r a n s f e c t e di n t oh u m a nn e u r o b l a s t o m ac e lls ( s h s y 5 y ) b yl i p i d e 2 0 0 0 ( c o n t r o lg r o u p ：p s s c 9 、p l 4 5 1a n dz e r o ；t e s tg r o u p ： c i r c u l a rp e f u d t ka n dli n e a rp e f u d - t k ) 【r e s u l t 】：r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t i o ns h o w e dt h a tt h e r e s t r i c t i o nm a p p i n go fl o n ga r ma n ds h o r ta r mi si d e n t i c a lw it ht h a to f t h er e p o r t e ds e q u e n c e sf r o m1 2 9 s v jm o u s e s e q u e n c i n gr e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h ed e t e r m i n e ds e q u e n c e sa r en e a r l yt h es a m ea st h o s eo ft h er e p o r t e d s e q u e n c e s ( 9 9 8 ) ，e s p e c i a l l y ，t h ee x o n 2s e q u e n c ei sc o m p l e t e l yi d e n t i c a l w i t ht h er e p o r t e d e x o n2 、l o n ga r ma n ds h o r ta r mw e r ee x a c t l yi n s e r t e d i np l 4 5 1 t h eh s v t kg e n es e q u e n c ef r o mp s s c 9i sa l s ot h es a m ea st h e r e p o r t e d t h et a r g e t i n gc o n s t r u c tv e c t o r sw e r ef i n a l l yc o m p l e t e l y a f t e r t h ef o l l o w i n g p l a s m ida n dc o n s t r u c t sw e r et r a n s f e c t e di n t oi ns h s y 5 y c e l l sb yl p 2 0 0 0 ，s m a l lc o l o n y sw e r ed e t e c t e di nt e s tg r o u pp s s c 9 、p l 4 5 1 、 8 厦门犬学硕- 上学位论文m ) a m i o 条件性基因打靶裁律的构建和签定 c i r c u l a rp e f u d t ka n dl i n e a rp e f u d t k ，w h i l en o ti nc o n t r o lg r o u pz e r o ， b yu s i n gg 4 1 8 ( 8 5 0 n g p 1 ) s c r e e n i n go f1 0d a y s 。s u b s e q u e n t l y ，s m a llc o l o n y s w e r ea l m o s td is a p p e a r e di ng r o u pp s s c 9 、c i r c u l a rp e f u d t ka n dli n e a r p e f u d - t k ，b u ts u r v i v e d e da n dg r e wi ng r o u pp l 4 5 1 ，b yu s i n gg c v ( 1 0 n g p 1 ) s c r e e n i n gf o r7 2h o u r sa f t e rg 4 1 8s e l e c t i o n 。 【c o n c l u s i o n 】：t h ea d a m i oc o n d i t i o n a lg e n et a r g e t i n gv e c t o r ( p e f u d t k ) w a ss u c c e s s f u ll yc o n s t r u c t e da n di d e n t i f i e d t h en e o a n dh s v - t kg e n ei n t h ef i n a lc o n s t r u c tc a np e r f o r man o r m a lf u n c t i o ni nt h ec e l l 。 【k e yw o r d s 】：c o n d i t i o n a lg e n et a r g e t i n g ；v e c t o rc o n s t r u c t i o n ；o a m i o g e n e 。9 。 英文缩写英文全称 a d a m l o a m p b s a d d h ：0 d m s o d n a e b e g f p f b s g c v h s v - t k l b m c s n e o p b s p c r r n a s e r p m s d s 英文缩略词表 ad is i n t e g r i na n dm e t a l l o p r o t e a s e 1 0 a m p i c i l l i n b o v i n es e r u ma l b u m i n d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d i m e t h y ls u l f o x i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e t h i d i u mb r o m i d e e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n c e p r o t e i n f e t a lb o v i n es e r u m g a n c i c l o v i r 中文全称 解聚素与金属蛋白酶1 0 氨苄青霉素 牛血清白蛋白 双蒸水 二甲基亚砜 脱氧核糖核酸 溴化乙锭 增强型绿色荧光蛋白 胎牛血清 更昔洛韦 h e r p e ss i m p l ev i r e s t h y m i d i n e k i n a s e 单纯疱疹病毒胸苷激酶 l u r i a - - b e r t a n ic u l t u r em e d i u m m u l t i p l ec l o n es i t e n e o m y c i n p h o s p h a t eb u f f e r e ds a lin e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c ti o n r i b o n u c l e a s e r e v o l u ti o n sp e rm i n u t e s o d i u ml d o d e c a n e s u l f o n a t e t a e t r i s - - a c e t a t ee d t a t et r i s e d t a 6 l b 培养基 多克隆位点 新霉素 磷酸缓冲盐溶液液 聚合酶链反应 核糖核酸酶 每分钟转速 十二烷基磺酸钠 三羟甲基氨基甲烷一乙酸一 乙二胺四乙酸 三羟甲基氨基甲烷一乙二胺 四乙酸 厦门大学硕士学位论文 a d a m i o 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 槠冀鼍篡：为滤彬舯绅彩缎组)另外，该学位论文为施如厶错甜小p 冽彳比懈闱用n s 谏题( 组) 的研究成果，获得( 仫i 易 ) 课崴( 组) 经费或实验室的 资助，在( 钒阶如肌i 毁锄移毒验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 声明人( 签名) 年7 月) 多日 厦门大学硕士学位论文a d a w i o 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 千 j ( 日解密，解密后适用上述授权。 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人 年7 照九大学硕士学位论文a i ) ，6 i o 篆件性基因t r 氍孰俺的构建和塞定 前言 a d a m l 0 ( ad i s i n t e g r i na n dm e t a ll o p r o t e a s e1 0 ) 是解聚素与金属蛋白酶家 族的成员之一，最早发现于1 9 8 9 年。a d a m i o 基因定位于1 5 q 2 2 ，基因全长约1 5 3 k b 。 a d a m i o 基因有1 6 个外显子和1 5 个内含子。相比较而言，外显子和内含子的大小差 比z 芝 二二删：k 卜卜 * 目m “ h * 自目目 * 目# 。髻臀8 鞘淼* b 篇毳 图ia d a m l 0 蚩白结构模式图 f i gis m m * o f a d a m l 0 p r o t e i n 异较大，外显子的长度仅有9 3 7 6 4 b p ，而内含子的长度则是4 8 2 3 5 2 6 2 b p 。 a d a m l 0 分子是一种跨膜的蛋白质分子，主要的结构域有：信号肽序列前序 列，盒属蛋白酶结构域，解聚素结构域。富含半胱氨酸结构域，表皮生长因子样 序列，跨膜区和胞内段以及位于胞内段内的一个特异的分选信号”1 ( 图1 ) 。其中 a d a m i o 的金属蛋白酶结构域是水解底物的主要区域。另外，a d a m i o 的前序列可以 特异性的抑$ o a d a m i o 的蛋白水解酶活性，而a d a m l 7 和a d a m 8 的前序列则无此活性 “。位于胞内段的分选信号具有指导a d a m i o 亚_ 细胞定位和选择底物的功能”1 。 表l ： o a m l 0 的底物 i 底物种类分子类型作用方式作用结果 a p p 家族脱落蛋白水解 蛋白 a p 只a p l p 2神经保护 作用 l 黼 n o t c h c d 2 3 脱落蛋白水解 e g f b t c 作用 受体激活 e p h r i n - a 2 i 细胞粘附c d 4 4 ，e c a d h e r i n n c a d h e n n ，脱落蛋白水解 调节细胞 分子 y - p m t o c a d h e r i n 作用粘附 l 跨膜诱导脱落蛋白水解诱导趋化 因子 c x 3 c l l c x c l l 6 作用作用 作为一种重要的膜表面分子，a d a m i o 主要发挥它的蛋白水解酶功能。 a d a m l 0 的底物主要是i 型和i i 型跨膜分子。a d a m l 0 水解这些分子的胞外功能 区，释放出一段可溶性胞外肽段，这一过程称为脱落作用。这种作用主要表 现在两个方面：1 a d a n i o 水解膜表面分子后形成的胞外可涪性肚段本身具有 一定的功能，如s a p pa 、e g f 、b t c 等，这些可溶性片段可以直接影响细胞的 生存和细胞间的信号传导。2 a d a m l 0 水解膜表面分子并不直接导致细胞功能 厦门大学硕士学位论文a d a m i o 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 的变化，而是作为一个刺激信号，引起膜内y 一分泌酶对膜表面分子的进一步 水解，并形成细胞内的信号级联反应从而影响细胞的功能，如n 一e 一钙粘蛋白 等。因此，a d a m i o 实际上是一种重要的调节分子，它通过水解细胞表面的各 种跨膜分子来参与许多细胞内外的生理过程，比如神经细胞的生长和发育、 蛋白水解作用、细胞间的信息传递、分泌作用、粘附作用等乜一一1 。 已有的研究表明，a d a m i o 在神经系统的发育、生长和成体中枢神经系统 的更新中发挥重要的作用。k u z ( k u z b a n i a n ，果蝇体内的a d a m l 0 ) 可以诱导 果蝇的神经前体细胞周围的细胞产生神经促进信号，从而促进神经的发育口1 。 在含有显负性k u z 突变体的果蝇胚胎中，失活的k u z 可以导致轴突通路的缺 陷，如果突变体中野生型k u zm r n a 均被转录，突变体胚胎就可以得到挽救并 继续发育，这一结果证实了k u z 在轴突通路中的重要性徊一1 。另外，a d a m i o 也 参与了非洲爪蟾视网膜神经节细胞( r g c ) 轴突形成视觉投影的过程。a d a m i o 在背侧神经上皮表达并通过r g c 轴突向外扩散。用药物或分子抑制脑内a d a m i o 活性均可导致r g c 轴突不能识别靶部位，而抑制r g c 轴突内源性的a d a m i o 分 子则没有任何影响。说明大脑背侧的a d a m i o 起到细胞非自主性调节r g c 轴突 方向的作用n 帕。此外，a d a m i o 还可通过切割神经细胞粘附分子( n c a m ) 来影 响神经细胞的发育和成熟，特别是小脑神经元神经轴突向外的生长1 。 阿尔茨海默病( a l z h e i m e r ，sd i s e a s e ，a d ) 是以记忆和认知功能障碍为主 要表现的一种神经退行性疾病，是老年人痴呆中最常见的病因。老年斑 ( s e n il ep l a q u e ) ，是a d 的主要病理特征之一。其主要成分是一种称为b 淀 粉样蛋白( ba m y l o i d ，ad ) 的肽类物质在细胞外沉积，从而对细胞造成毒性， 导致患者脑功能障碍。脑内ao 来源于其前体物质淀粉样前体蛋白 ( a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ，a p p ) 。a p p 是一跨膜蛋白质，在体内各种组 织广泛存在，而在脑组织的表达最高。a p p 在体内有两种代谢途径：ab 代谢 途径和非ab 代谢途径，而a d a m i o 是非ab 代谢途径中q 一分泌酶的候选分 子之一。 也有研究证实a d a m l 0 在a d 病理机制中的作用具有多重效应，其含量和功能变 化除参与a p p 代谢外，还可通过活化n o t c h 分子或加工邻近细胞n o t c h 配体，直接或 间接调节n o t c h 通路，参与学习记忆密切相关的细胞定向分化及突触可塑性调节， 厦门大学硕士学位论文a i ) a i i i o 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 从而参与a d 记忆障碍发生机制n 幻。n o t c h 受体分子及其配体6l 是神经上皮发育的 必需分子，也在神经元干细胞的维持和成体中枢神经系统的自我更新中发挥重要 作用。当n o t c h 分子与配体相结合后，a d a m i o 可以水解n o t c h 分子的s 2 位点，引起 n o t c h 分子的胞外肽段脱落，并导致n o t c h 分子胞内的剩余部分被y 一分泌酶水解， 水解后形成一段胞内肽段，这一肽段可以作为转录因子进入细胞核调节基因的表 达n 朝，而a d a m i o 是水解n o t c h 分子并释放胞外肽段的关键酶之一。 e p h r i n 是另一类神经元导向分子，它可以与e p h 家族的酪氨酸激酶的受体相 结合。当e p h r i n 配体与e p h 受体结合后，可以调节神经细胞的粘附、突触的导向 以及神经元的可塑性。a d a m i o 能够通过水解e p h r i na 5 和e p h a 3 的结合体来阻断细 胞间的相互识别n 钆1 5 m 1 。在果蝇体内，k u z 可以通过水解e p h r i na 2 和e p h a 3 的结合 体，并与e p h r i na 2 形成复合体来调节轴突的导向n 7 1 。因此，a d a m i o 可以通过特 异性的阻断e p h r i n 与e p h 受体的结合，来诱导中枢神经系统的突触定向和延伸。 n 一钙粘蛋白( n - c a d h e r i n ) 不仅是发育过程中神经上皮粘附节点的关键粘附 分子，也在成体大脑的神经元细胞相互作用和轴突延伸中起重要作用。在a d a m i o 缺乏的胚胎中，没有n 一钙粘蛋白的c 端片段，只有全长蛋白的累积。a d a m i o 诱导 的n 一钙粘蛋白的水解同时下调神经元细胞的粘附。此外，n 一钙粘蛋白胞外肽段 的脱落触发了其膜内肽段被y 一分泌酶水解，释放与之衔接的b 一连环蛋白，并启 动下游信号通路n8 1 。因此，a d a m l 0 水解n 一钙粘蛋白后不仅引起细胞之间的粘附力 降低，还通过后续y 一分泌酶释放的可溶性胞内段和b 一连环蛋白进一步影响细胞 的其他功能。一方面，可溶性胞内段可以与转录因子c b p 相结合，导致c b p 被蛋白 酶小体水解。另一方面，b 一连环蛋白的释放会导致其下游的各种信号通路的开 启或关闭，并最终引起细胞的各种生理功能的改变n 吼驯。 然而，由于a d a m i o 作用的底物不同，上调或下调a d a m i o 的表达在神经 系统的不同部位产生的结果也不同。因此，阐明a d a m i o 在体内神经系统的不 同部位的功能将是下一步研究的主要方向。为了能够更好的在神经系统尤其 是中枢神经系统中确切的了解a d a m i o 的功能，建立一种与a d a m i o 基因相关 的模式动物是对a d a m l 0 基因功能进行精细研究的必要手段。基于胚胎干细胞 和同源重组原理的基因打靶技术是当代基因功能研究的重要手段之一，该技 1 2 厦门火学硕士学位论文a d a m i o 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 术的广泛应用和发展使众多基因的功能得以阐明。在神经科学领域，运用基 因打靶技术制备出的基因敲除小鼠为神经细胞相关基因的功能研究提供了非 常有价值的信息。 传统的基因打靶技术可以敲除动物所有体细胞中的目的基因而使其丧失 活性，但是，这给某些重要基因的功能研究带来困难：一、对于动物发育必 需的基因而言，基因敲除后可能导致严重的发育缺陷或胚胎期死亡。二、若 多个基因在正常发育过程中共同发挥作用，因功能代偿，目的基因敲除后动 物表型轻微异常或者正常，致使无法准确阐明目的基因的功能。三、某些基 因在神经系统和外周组织广泛表达，基因敲除后无法解释该基因在大脑中究 竟发挥何种作用乜。四、由于神经系统在解剖学上的复杂性，某些基因在大 脑中的表达部位不同而功能各异，阻碍了进一步分析。鉴于上述原因，传统 的基因打靶对大脑功能的精细研究往往效果不尽理想。在此基础上，另一项 基因打靶策略即条件性基因打靶技术应运而生，使得基因敲除局限于神经系 统的某一亚区或发育过程的某一时期成为可能。 因为直接剔除a d a m l o 基因的小鼠在胚胎发育的9 5 天死于中枢神经系统 缺陷和心脏缺损乜羽，所以制备a d m a i o 基因条件性基因打靶的小鼠是目前在神 经系统中进一步研究a d a m l 0 基因功能的最佳选择。 现阶段条件性基因打靶主要使用的c r e - - l o x p 系统。其策略主要包括三 个方面：( 1 ) 制备基因打靶小鼠。在目的基因必需外显子两侧的内含子中各 插入一个l o x p 位点，通过胚胎干细胞的同源重组制备基因打靶小鼠。( 2 ) 制 备c r e 转基因小鼠。这一鼠系中c r e 重组酶的表达受控于一个特异性启动子， 该启动子决定了c r e 表达的组织或细胞类型。( 3 ) 制备目的基因敲除的小鼠。 基因打靶小鼠和c r e 转基因小鼠杂交，产生的双重转基因小鼠因c r e 的组织 特异性表达，而使两侧具有同向l o x p 位点的基因片段被敲除，导致基因功能 的丧失。 在本研究中，我们选择了a d a m i o 基因第二外显子作为条件性敲除的目的 片段，通过在其两侧插入l o x p 位点，来构建条件性基因打靶载体，为制备基 因打靶小鼠奠定基础。 1 3 厦门大学硕士学位论文 a d a m i o 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 材料 ( 一) 主要仪器及设备 材料与方法 1 小型高速离心机( 5 4 1 5 d ，e p p e n d o r f 公司) 2 恒温摇床( 4 2 0 型，美国热电集团) 3 水浴恒温振荡器( s h a c ，常州国华电器有限公司) 4 电泳仪( d y y 一6 c ，北京市六一仪器厂) 5 紫外分析仪( w d 一9 4 0 3 c ，北京市六一仪器厂) 6 凝胶成像分析系统( g d s - - 8 0 0 0 ，u v p 公司) 7 紫外可见分光光度计( n d - 1 0 0 0 ，n a n o d r o p o 公司) 8 培养箱( 1 5 4 5 ，s h e l d o n $ i j 造有限公司) 9 梯度p c r 仪( p t c 一2 0 0 ，b i o - r a d 公司) l o 水平层流洁净工作台( c b 卜1 0 0 0 a ，上海瑞仰净化装备公司) 1 1 高速冷冻离心机( k d c - 2 2 0 h r ，科大创新股份有限公司中佳分公司) 1 2 超低温冰箱( u 4 1 0 8 6 ，n b s 公司) 1 3 电热恒温水槽( d k - 8 d ，上海精宏实验设备有限公司) 1 4 p h 计( d e l t a 3 2 0 - s ，梅特勒一托利多仪器有限公司) 1 5 恒温磁力搅拌器( 9 0 - 2 ，上海亚荣生化仪器厂) 1 6 台式灭菌器( t m q c - 3 2 5 0 ，山东新华医疗器械股份有限公司) 1 7 反渗透纯水仪( r od i ，上海和泰仪器有限公司) 1 8 超纯水仪( d 7 4 1 1 ，b a r n s t e a d 公司) 1 9 超声波清洗机( k q - 3 2 0 0 e ，昆山市超声波仪器有限公司) 2 0 电热恒温鼓风干燥箱( d g g - 9 0 7 0 a ，上海森信实验仪器公司) 2 1 显微数码摄影系统( d p 7 0 ，奥林巴斯公司) 2 2 二氧化碳培养箱( 2 3 2 3 2 ，s h e l l a b 公司) 2 3 生物净化工作台( b c m - 1 0 0 0 ，苏州净化设备有限公司) 2 4 微型漩涡混合仪( w h - 2 ，上海泸西分析仪器有限公司) 2 5 微量移液器( g i l s o n 公司) 2 6 体视显微镜( 奥林巴斯公司) 2 7 杂交仪( h b - 1 0 0 0 ，u v p 公司) 1 4 厦门大学硕上学位论文 a d a m i o 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 ( 二) 主要试剂及配制 1 小鼠( 1 2 9 s v j )( 南方转基因动物实验中心杨晓教授惠赠) 2 p l - 4 5 1 ( 南方转基因动物实验中心杨晓教授惠赠) 3 p d n r - l r ( 福建医科大学刘合煜教授惠赠) 4 p s s c 9 ( 福州军区总医院兰风华教授惠赠) 5 大肠杆菌丁m 1 0 9 ，d h 5a ( 本实验室保存) 6 人神经母细胞瘤细胞s h - s y 5 y ( 本实验室保存) 7 p c r 和测序引物( 由上海生工生物工程技术服务有限公司和t a r a k a 公司合 成) 8 l i p o f e c t a m i n e 憎2 0 0 0 ( i n v i t r o g e n 公司) 9 l ap c rk i t ( t a k a r a 公司) 1 0 p m d l 8 - t 载体( t a k a r a 公司) 1 1 限制性内切酶x h o l 、s m a i 、b a m h i 、s a l i 、e c o r l 、e c o r v 、n a e l 、s a c i 、 a f l i i 、k p n i 、x b a i 等( t a k a r a 公司、上海生工生物工程技术服务有限公 司) 1 2 a g a r o s eg e ld n af r a g m e n t r e c o v e r yk i t ( t a k a r a 公司) 1 3 d n ab l u n t i n gk i t ( t a k a r a 公司) 1 4 b l u n t i n gk i n a t i o nl i g a t i o nk i t ( t a k a r a 公司) 1 5 d i gd n al a b e l i n ga n dd e t e c t i o nk i t ( r o c h e 公司) 1 6 d n a 分子量标记物( f e r m e n t a s 公司) 1 7 d n a 测序( 上海生工生物工程技术服务有限公司完成) 1 8 基因组小量抽提试剂盒( 上海生工生物工程技术服务有限公司) 1 9 d n t p ( t a k a r a 公司) 2 0 i p t g ( 上海生工生物工程技术服务有限公司) ： i p t g 储液( 2 0 0 m g m 1 ) ，称取2 0 0 m g i p t g 溶于l m l d d h ：0 中，过滤除菌，一2 0 。c 保 存。使用时9 0 r a m 平皿加7 p l 。 2 1 x g a l ( t a k a r a 公司) ： x - g a l 储液( 2 0 m g m 1 ) ，称取2 0 m g x g a l 溶于i m l - 甲基甲酰胺中，一2 0 。c 避光保 存。使用时9 0 m m 平皿加4 0 p l 。 1 5 厦门大学硕士学位论文 a d a m i o 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 2 2 l bb r o t h ( 上海生工生物工程技术服务有限公司) ： 取1 2 5 9 粉剂，溶于5 0 0 m l d d h ：0 ，高压灭菌后4 保存备用。 2 3 d n af r a g m e n tp u r i f i c a t i o nk i t ( t a k a r a 公司) 2 4 d m e m ( 高糖) ( g i b c o 公司) ： 取一包d m e m 粉剂，溶于8 5 0 m l 超纯水中，充分溶解后加3 7 9 n a ：c 晚，用盐酸将 p h 值调至7 2 0 ，定容至1 0 0 0 m l ，0 2 2i lm 滤器过滤除菌后4 保存备用。 2 5 胎牛血清( h y c l o n e 公司) 2 6 胰蛋白酶( g i b c o 公司) 2 7 d m s o ( a m r e s c o 公司) 2 8 无内毒素质粒小量抽提试剂盒( t i a n g e n 公司) 2 9 a g r o s e ( 上海生工生物工程技术服务有限公司) 3 0 l b 平板的制备： l o o m l 双蒸水中加入2 5 9l b 粉剂和1 5 9 琼脂粉，高压灭菌，待温度冷却至5 0 - - 一 6 0 c 时( 若需抗性则在此时加入抗生素) 倒入9 0 m m 玻璃培养皿内，约3 0 m l 皿，凝固后直接使用或封口倒置4 c 保存备用。 3 1 氨苄青霉素母液：灭菌双蒸水配成l o o m g m l 储存液，- 2 0o c 保存备用。 3 2 t r i s 一乙酸电泳缓冲液( t a e ) 贮存液：5 0x t r i s 碱 2 4 2 9 冰乙酸5 7 1 m l 0 5 m o l le d t al o o m l 将以上各组分依次溶于7 0 0 m l d d h ：0 ，定容至1 0 0 0 m l 。使用时，取5 0 m l 贮存液溶于9 5 0 m l d d h ：0 中，充分混匀。 3 3 质粒小量抽提所需溶液： ( 1 ) 溶液i ：2 5 m m o l lt r i s h c l ，l o m m o l le d t a ，2 0 m m o l lg l u c o s e ( 2 ) 溶液i i ：2 0 0 m m o l ln a o h ，1 s d s ( w v ) ( 3 ) 溶液i i i 3 o m o l lk o a c ，5 m o l lc h 。c o o h 3 4 磷酸盐缓冲液( p b s ) ： 在9 0 0 m l 超纯水中加入8 o gn a c i ，0 2 9k c i ，2 1 6 9n a 2 p 0 4 1 2 h ：0 ，0 2 9 k h 2 p 0 4 ， 1 6 厦门大学硕士学位论文 a d a m l 0 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 充分溶解后，调p h 至7 4 ，定容至l l ，高压灭菌后，4 c 保存备用。 3 5 细胞冻存液：7 0 d m e m ，2 0 f b s ，1 0 d m s o 3 6 2 0 s s c - 用8 0 0 m lh , o 溶解1 7 5 3 9n a c l 和8 8 2 9 柠檬酸钠，用几滴浓盐酸调p h 值至7 0 ， 用d dh ：o 定容至1 0 0 0 m l 。分装后高压灭菌。 3 7 杂交预杂交液( c h u r c hb u f f e r ) ： ( 1 ) 磷酸缓冲液 s o l u t i o nh ： n a 2 h p 0 4 ，2 h 2 0 ： 1 7 7 9g d d h 2 0 ： 1 0 0 0 m l s o l u t i o nb ： n a h 2 p 0 4 ，h 2 0 ： 1 3 7 9 9g d d h ：0 ： 1 0 0 0 m l 按下列配方将s o l u t i o na 和b 混合成磷酸盐缓冲液 s o l u t i o na ：3 4 2m l s o l u t i o nb ： 1 5 8m l d d h 2 0 ： 5 0 0m l ( 2 ) c h u r c hb u f f e r 的配制 磷酸盐缓冲液( o ，5 mp h7 2 ) ： 5 0 0m l e d t a ( o ，5 m ) ： 2m l b s a ：1 0g s d s ：7 0g 1 ) 先将b s a 溶于小体积的d d h 。0 ( 1 0 9 5 0 m 1 ) 。 2 ) 将7 0 9 s d s 溶于4 0 0 m ld d h ：0 ，搅拌轻度加热。 3 ) 将5 0 0 m l 磷酸盐缓冲液转移j ! l j l 0 0 0 m l 容量瓶，顺序加入b s a 溶液，s d s 溶液和2 m l e d t a ，搅拌均匀。 4 ) 过滤，分装( 5 0 m l 份) ，一2 0 保存。 3 8 碱性转移缓冲液： 0 4 m o l ln a o h 1 7 厦门大学硕士学位论文 a d a m i o 条件性基因打靶载体的构建和鉴定 l m o l ln a c l 3 9 中和缓冲液i i ： 0 5 m o l lt r is c 1 ( p h 7 2 ) l m o l ln a c l 4 0 洗涤缓冲液( w a s h i n gb u f f e r ) ：0 1 m o l l 马来酸，0 1 5 m o l ln a c i ；用固 体n a o h 调p h 为7 5 ( 2 0 ) ；按0 3 ( v v ) 加入吐温2 0 ；1 5 - - 2 5 ( 2 保 存。 4 1 马来酸缓冲液( m a l e i ca c i db u f f e r ) ：0 1 m o l l 马来酸，0 1 5 m o l ln a c l ； 用固体n a o h 调p h 为7 5 ( 2 0 ) ；1 5 2 5 保存。 4 2 检测缓冲液( d e t e c t i o nb u f f e r ) ：o 1 m o l lt r i s c l ，0 1 m o l ln a c l ，p h 9 5 ( 2 0 ) ；1 5 2 5 保存。 4 3 t e 缓冲液：l o m m o l lt r i s c l ，l m m o l le d t a ，p h 8 0 1 5 - - 2 5 c 保存。 4 4 封闭液原液( b l o c k i n gs t o c ks o l u t i o n ) ( i o x ) ：按1 0 ( w v ) 的比例将试 剂盒水中所带的封闭试剂溶解在马来酸缓冲液中，微波炉加热，旋转使试 剂溶解，高压灭菌，4 c 、不透光保存。 4 5 封闭液( b l o c k i n gs o l u t i o n ) ：按1 ：1 0 的比例将1 0 x 封闭液原液用马来酸 缓冲液稀释后配成1 工作液。该溶液应在使用时再配制。 4 6 抗体溶液( a n t i b o d ys o l u t i o n ) ：将试剂盒宰中所带的偶联有碱性磷酸酶的 抗地高辛抗体，1 0 0 0 0 r p m ，离心5 m i n ，后从表面吸出所需的量，用封闭液 按l ：5 0 0 0 ( 1 5 0 m u m 1 ) 稀释。使用时新鲜配制。 4 7 显色液：在1 0 m l 检测缓冲液内加入2 0 0 u ln b t b c i p ( 试剂盒 i 自带) 。使 用时新鲜配制，避光保存。 木：试剂盒为d i gd n al a b e l i n ga n dd e t e c t i o nk i t ( r o c h e 公司) 4 8 g a n c i c l o v i r ( s i g m a 公司) 1 0 0 m g g c v 用1 0 m l 的0 1 m o l lh c l 溶解，4 保存。