（农产品加工及贮藏工程专业论文）大豆糖蜜中皂苷的提取纯化及生物活性的研究.pdf

摘要 皇皇! ! 詈詈皇| ,i ri m , | 1 | 鼍詈詈詈曼詈皇鲁詈鲁量皇詈皇皇曼詈詈詈喜置鼍皇詈鼍鼍 摘要 大豆糖蜜是醇法大豆浓缩蛋白生产过程中的副产物，是伴随着大豆浓缩蛋白的发展而发 展起来的。1 9 4 6 年，s m i l e y 和s m i t h 报道称，用乙醇来提取大豆蛋白的过程中，会产生一种 棕色粘稠的浆状物质。1 9 6 3 年，d a n i e lc h a j u s s 将其命名为“大豆糖蜜”，以区别于生产大 豆分离蛋白过程中产生的大豆乳清液。大豆糖蜜中含有低聚糖、异黄酮、皂苷等生物活性物 质。本文在国内首次以大豆糖蜜为原料进行提取、纯化大豆皂苷的研究，并对由实验室得到 的大豆皂苷样品进行了抗氧化活性的测定。 回流加热溶剂浸提法提取大豆皂苷的最佳工艺条件为：乙醇浓度8 0 、浸提温度6 0 、 浸提时间7 h 、料液比l ：8 ，浸提物中大豆皂苷的得率为1 5 8m g g - 1 。超声辅助溶剂浸提法的 最佳工艺条件为：乙醇浓度8 0 、浸提温度6 0 、超声时间4 0 m i n 、料液比l ：8 ，超声功率 3 5 0 w ，超声频率4 0 k h z ，提取物中大豆皂苷的得率为1 8 7m g g - 1 。超声辅助溶剂浸提法与传 统的回流加热溶剂浸提法相比较，超声辅助溶剂浸提法不但大大缩短了浸提的时间，同时也 提高了大豆皂苷的得率。 丙酮萃取法纯化大豆皂苷的最佳工艺条件为：液固比5 0 ：1 、萃取时间3 h 、萃取温度6 5 。 将丙酮萃取后的残余物真空干燥，得到纯度为3 6 1 的大豆皂苷样品。 采用柱层析分离的方法对得到的大豆皂苷样品做了进一步的纯化试验。利用静态吸附试 验分别考察了a b 8 、d - 1 3 0 、d a - 2 0 1 、h p d 1 0 0 、h p d 3 0 0 等不同型号的树脂对大豆皂苷样 液的分离纯化效果，优选出h p d 3 0 0 树脂为层析吸附剂。通过h p d 3 0 0 树脂吸附等温线的 试验，发现树脂对大豆皂苷的吸附量随温度的升高而减小，室温2 0 时树脂的饱和吸附量最 大。大孔吸附树脂柱层析法纯化大豆皂苷试验时，上样浓度1 0 m g m l 1 ，单位体积树脂的样 品用量( 上样量) 1 8m g m l 一，上样温度为室温2 0 ，采用梯度浓度的乙醇溶液为洗脱剂， 以2 b v h 以的流速，柱温为6 0 的条件下对树脂柱进行洗脱。先用蒸馏水洗去少量可溶性蛋 白和糖类，再依次使用2 0 、4 0 、6 0 的乙醇溶液除去样品中的非皂苷成分，最后用8 0 和9 5 的乙醇溶液洗脱大豆皂苷。合并8 0 和9 5 乙醇溶液洗脱下来的高含量皂苷部分收集 液，减压浓缩后真空干燥，得到纯度为8 0 6 的大豆皂苷。 通过对大豆皂苷初提纯样品和柱层析纯化后皂苷试样的抗氧化活性测定试验，比较出高 纯度的大豆皂苷对于超氧自由基的清除能力要明显高于初提纯的皂苷样品，说明大豆皂苷纯 度的提高可以显著增强单位质量大豆皂苷样品的生物活性。 关键词大豆糖蜜；大豆皂苷；提取；大孔吸附树脂；柱层析；梯度洗脱；抗氧化活性 i x a b s t r a c t s t u d yo ne x t r a c t i o np u r i f i c a t i o na n d a c t i v e e x a m i n a t i o ns o y a s a p o n i n si ns o ym o l a s s e s a b s t r a c t s o ym o l a s s e sw a st h eo u t g r o w t ho fp r o d u c i n gs o y b e a nc o n c e n t r a t i o np r o t e i nw i t he t h a n o l e x t r a c t i o n i tg r e ww i t ht h ed e v e l o p m e n to fs o y b c a nc o n c e n t r a t i o np r o t e i n i n19 4 6 ，s m i l e ya n d s m i t hr e p o r t e di nt h ep r o c e s so fe x t r a c t i n gs o y b e a np r o t e i nw i t he t h a n o lt h e yo b t a i n e dar o p y b r o w ns l u r r y d a n i e lc h a j u s sn a m e di ts o ym o l a s s e si n19 6 3 t h i sn a m ew a sd i f f e r e n tf r o mt h e s o y b e a nw h e yl i q u i dw h i c hp r o d u c e di nt h ep r o c e s so fp r o d u c i n gs o y b c a ns e p a r a t i o np r o t e i n s o y m o l a s s e sc o n t a i n e dm a n yb i o l o g i c a la c t i v ei n g r e d i e n t ss u c ha ss o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e s ， i s o f l a v o n e sa n ds o y a s a p o n i n s ，s o y a s a p o n i n sw a st h ef i r s tt i m ee x t r a c t e da n dp u r i f i e df r o ms o y m o l a s s e si nc h i n a 劢ep a p e rr e s e a r c h e dt h ea n t i o x y g e n i cp r o p e r t yo ft h es a m p l eo fs o y a s a p o n i n s t h eo p t i m a le o n d i t i o no fh o ts o l v e n tc i r c u m f l u e n c ee x t r a c t i n gs o y a s a p o n i n sw a se t h a n e l8 0 ， t e m p e r a t u r e6 0 ，t i m e7 ha n dt h er a t i oo fm a t e r i a la n de t h a n o l1 ：8 t h er e c o v e r yo fs o y a s a p o n i n s w a s1 5 8m g g - 1 r n l eo p t i m a lc o n d i t i o no fu l t r a s o n i ce x t r a c t i n gs o y a s a p o n i n sw a se t h a n o l8 0 ， t e m p e r a t u r e6 0 ，t i m e4 h ，t h er a t i oo fm a t e r i a la n de t h a n o ll ：8 ，u l t r a s o n i cp o w e r3 5 0 wa n d u l t r a s o n i cf r e q u e n c y4 0 k h z t h er e c o v e r yo fs o y a s a p o n i n sw a s1 8 7m g g - 1 c o m p a r e dw i t h t r a d i t i o n a lh o ts o l v e n tc i r c u m f l u e n c ee x t r a c t i o n , u l t r a s o n i ce x t r a c t i o nc a i ln o to n l ys h o r t e nt i m eb u t a l s oi m p r o v et h er e c o v e r yo fs o y a s a p o n i n s t h eb e s tc o n d i t i o n si ne x t r a c t i o nw i t ha c e t o n ei st h a tt h em a t e r i a lr a t ei s5 0 ：1 ，t h ee x t r a c tt i m ei s 4 h , t h ee x t r a c tt e m p e r a t u r ei s6 5 a f i e rd e c o m p r e s s i o nc o n c e n t r a t i o na n dv a c u u md r y n e s sc a n c o n t a i np u r i f i c a t i o nd e g r e e3 6 1 o fs o y a s a p o n i n s t h ee x t r a c t i o nw a sp u r i f i e dw i t hc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y t l l l ea b i l i t yo fp u r i f i c a t i o no f s o y a s a p o n i n se x t r a c t i o nw a st e s t e db yr e s i na b - 8 ，d - 1 3 0 ，d a - 2 0 1 ，h p d - 1 0 0a n dh p d 一3 0 0 q u i e s c e n c ea d s o r p t i o n , t h e ns e l e c t e dr e s i nh p d 3 0 0a st h es o r b e n t t h er e s i nq u a n t i t yo fa d s o r b i n g s o y a s a p o n i n sw a sl e s sw h e nt e m p e r a t u r eg r e wb yr e s i nh p d 一3 0 0a d s o r p t i o ni s o t h e r m 1 1 他r e s i n s a t u r a t i o na d s o r p t i o nq u a n t i t yw a sm o s tw h e nt e m p e r a t u r ew a s2 0d e g r e e t h ec o n d i t i o no f p u r i f i c a t i o no fs o y a s a p o n i n sw i t hr e s i nw a ss a m p l ec o n c e n t r a t i o n10m g m l 1 ，s a m p l eq u a n t i t yo f u n i t sr e s i n18m g m l 1 ，s a m p l et e m p e r a t u r e2 0 c ，e l u t e db yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fe t h a n o l ， v e l o c i t yo ff l o w2 b v h - i ，c o l u m nt e m p e r a t u r e6 0 s o l u b l ep r o t e i na n ds u g a rw a sr e m o v e db y p u r i f i e dw a t e re l u t i n g ，t h e nn o n - s o y a s a p o n i n sw e r er e m o v e db yg r a d sc o n c e n t r a t i o n o fe t h a n o l2 0 4 0 ，6 0 s o y a s a p o n i n sw e r ee l u t e db yg r a d sc o n c e n t r a t i o no fe t h a n o l8 0 ，9 5 g a t h e rt h e s o y a s a p o n i n s e l u t e d b yg r a d s c o n c e n t r a t i o no fe t h a n o l8 0 ，9 5 a f t e rd e c o m p r e s s i o n c o n c e n t r a t i o na n dv a c u u md r y n e s sc a i lc o n t a i np u r i f i c a t i o nd e g r e e8 0 6 o fs o y a s a p o n i n s x i 东北农业大学工学硕士学位论文 c o m p a r e da n t i o x y g e n i cp r o p e r t y t e s tw i t ht h ee x t r a c t i o no fs o y a s a p o n i n sa n d p u r i f i e d s o y a s a p o n i n sb yc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , t h ea b i l i t yo fs u p e ro x y g e nf r e eg r o u pe l i m i n a t i n gw a s h i g h e rt op u r i f i e ds o y a s a p o n i n s t h ei m p r o v e m e n to f t h ep u r i f i c a t i o no fs o y a s a p o n i n sc o u l dh i g h l y i n c r e a s et h eb i o l o g i ca c t i v i t i e so fu n i t so fs o y a s a p o n i n ss a m p l e s k e yw o r d s ：s o ym o l a s s e s ；s o y a s a p o n i n s ；e x t r a c t i o n ；r e s i n ；c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ；g r a d s c o n c e n t r a t i o ne l u t i n g ；a n t i o x y g e n i cp r o p e r t y c a n d i d a t e ：l ic h e n g g a n g s p e c i a l i t y ：t h ea g r i c u l t u r a lp r o d u c t sp r o c e s s i n ga n ds t o r e s s u p e r v i s o r ：p r o f z h a n gy o n g z h o n g 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特另, j j j n 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼；翅遗查墓丝盂要挂剔直明趁! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位做储躲雩“t 叶期潲多月弦日 学位论文版权使用授权书 ，本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 父。 学位论文作者签名：彬“f 飞日期a 前舌月加日 导师签名：豸匕象建- 日棚年z 月弦日 引言 1 引言 大豆蛋白根据生产方式的不同可以将其分为大豆分离蛋白和大豆浓缩蛋白。生产大豆分 离蛋白所得到的副产物是大豆乳清，而大豆糖蜜是醇法大豆浓缩蛋白生产过程中的副产品， 是伴随着大豆浓缩蛋白的发展而发展起来的。 一直以来，大量的报道已经明确了大豆制品中异黄酮在人体健康中的有益作用，所以大 豆异黄酮倍受国内外科研学者的关注，并且，前些年正在进行的研究表明异黄酮可能对于降 低冠心病和各种癌症的发病率有一定的作用。但是，随着研究的不断深入，近年来有些研究 结果表明这些功能可能与大豆中的另外一些化合物起协同作用或起媒介作用。实际上，大豆 中含有各种复杂的具有潜在生物活性的植物化学物质，如植物荷尔蒙、大豆皂苷和胰蛋白酶 抑制剂等，而对于它们所进行的研究却远远少于大豆异黄酮( j a n eh u b e r t , 2 0 0 5 ) 。 大豆皂苷通常被称为大豆皂甙。全国自然科学名词审定委员会1 9 9 1 年公布的化学名词 中指出：“审定中经再三考虑，多方征求意见，最后决定与生物化学取得一致，推荐使用“苷” 字”。科学出版社2 0 0 0 年出版的英汉化学化工词汇第四版，也以全国科学技术名词审定 委员会公布的化学化工标准名词为依据，将“甙”改成了“苷”。已有研究结果表明，大豆皂 苷具有多种生理活性和良好的药理作用，如调节免疫功能、降低血清中胆固醇含量、防治心 血管疾病、抗癌、抗菌、抗病毒、护肝、减肥等多重生理功效，并且，除用作药物以外，皂 苷还可以作为高级化妆品、食品添加剂和表面活性剂应用于化学工业( 唐传核等，2 0 0 1 ) 。 1 1 大豆糖蜜研究概况 我国是大豆的原产地，远在黄帝时期就有种植菽的记载，因此，我国大豆栽培的历史至 今已有五千余年。美国是1 8 0 4 年从我国引进的大豆物种，直至1 8 8 2 年才正式种植；巴西是 在二战后才引种大豆。然而我国大豆产量在世界上的排行却在美国、巴西和阿根廷之后。随 着我国市场经济的不断发展，国内的大豆需求量逐年攀升，到2 0 0 5 2 0 0 6 年度国产大豆为1 8 0 0 万吨，进口大豆为2 6 0 0 万吨，2 0 0 5 2 0 0 6 年度大豆消费总量为4 1 4 0 万吨( 王新，2 0 0 5 ) ，但 在如此之多的进口大豆中9 0 为转基因大豆，主要消费在我国的沿海经济地带。黑龙江省地 域的大豆产量占全国产量的三分之一强，2 0 0 5 2 0 0 6 年度达7 1 8 万吨。由于黑龙江省具有原 生态的种植环境，因此，这些大豆均被称为无污染绿色的非转基因大豆。近些年来人类对自 身健康逐渐关注，一些发达国家顾虑转基因作物及食品会给人们带来潜在的健康危害，所以 愈加关注非转基因作物及食品。黑龙江省的非转基因大豆及制品在国际市场上具有明显的竞 争优势，利用高新技术产业化开发本省非转基因优质大豆生产大豆浓缩蛋白和从大豆糖蜜中 提取大豆活性功能因子将会强有力地推动地域经济的发展( 白志明等，2 0 0 7 ) 。 1 9 4 6 年，s m i l e y 和s i i l i m 报道称，用乙醇来提取大豆蛋白质的过程中，产生一种棕色粘 稠的浆状物质。1 9 6 3 年，d a n i e lc h a j u s s 将其命名为“大豆糖蜜”，以区别于生产大豆分离蛋 东北农业大学工学硕士学位论文 皇曼暑! 鼍曼! 曼量皇量曼鼍曼曼曼葛! 皇量詈皇曼詈i i 一h - - 一 j ! i 曼蔓曼暑! 皇皇暑曼曼皇鼍 白过程中产生的大豆乳清液。a m n a s h 等人接着研究了大豆糖蜜中的非蛋白成分，确定了 大豆异黄酮、大豆皂苷等生理活性成分的存在。脱水后大豆糖蜜的成分及含量为：低聚糖 5 9 一6 2 、粗蛋白6 8 ( 脂蛋白、糖蛋白、胰蛋白酶抑制剂) 、脂类物质( 包括甘油酯、 磷脂和植物甾醇) 5 8 、灰分7 9 、大豆皂苷6 1 5 、大豆异黄酮1 5 - 2 5 、酚 酸4 6 以及果胶质、阿拉伯半乳糖等多种糖类。大豆糖蜜的成分如此复杂，表现出的性状 极为粘稠，色泽深，难于处理，过去多是作饲料或者生物发酵用。近年来，人们对大豆糖蜜 的利用日益关注，许多专家和科研单位对于从大豆糖蜜中提取和分离大豆功能性物质方面作 了大量的努力和研究工作。大豆糖蜜中的非糖物质主要为大豆异黄酮、皂苷、大豆甾醇类、 肌醇六磷酸、磷脂、低分子量肽、蛋白酶抑制剂和酚酸类物质等。这些物质在大豆中的含量 不高，但是在糖蜜中却被浓缩了。近年来人们认识到过去被认为是对人体有害的物质，实际 上能防治和改善多种疾病，像癌症、骨质疏松症、前列腺增生、高胆固醇等疾病，对于人体 具有显著的医疗和保健功能。所以这些物质又被称为“大豆功能性物质”，以区别于大豆中含 有的蛋白、脂肪等营养物质。 国外有关糖蜜的产品很多，其使用价值也在不断上升，用途也很广，包括饲料、食品、 医药、化工原料、能源等。按主要用途可以分为以下几类：第一是作为动物饲料，第二是深 加工成保健食品，第三才是能源及化工原料等。美国大量利用大豆糖蜜喂养家畜，原因是糖 蜜的营养价值很高，用糖蜜来做配合饲料的成分可以节省谷物，提高饲料的能量价值，使饲 料中能量和蛋白质的比例平衡。 据统计国内的大豆加工企业平均每生产三吨醇法大豆浓缩蛋白就会有一吨大豆糖蜜生 成，全国每年大约会产生三至五万吨大豆浓缩蛋白的副产物大豆糖蜜，由于其性状黏稠、 色泽深、非常难处理，大多作为废液排放或以低廉的价格( 每吨约几百元) 出售作为饲料或 发酵工业的原料( 王伟辉等，2 0 0 4 ) 。 近些年来，从大豆分离蛋白乳清中提取植物功能性成分的研究报道日益增多，而有关大 豆糖蜜的报道却依然很少。若能将大豆糖蜜加以开发利用，不仅能够改善当前大豆皂苷、异 黄酮等生物活性物质提取工艺中原料成本高、预处理工艺繁琐等弊端，从而降低生产成本， 又能“变废为宝”，为众多大豆蛋白、油脂生产厂家解决废液排放难题，减少环境污染。采 用高新技术深度加工大豆糖蜜，在一条生产线上生产出各种功能特性的大豆浓缩蛋白、大豆 异黄酮、大豆皂苷、大豆低聚糖和饲料级的大豆糖蜜，这是对大豆的合理开发，是对大豆糖 蜜的科学利用，是一项绿色环保技术，是大豆加工的新途径( 白志明等，2 0 0 7 ) 。 1 。2 大豆皂苷研究概况 大豆皂苷( s o y a s a p o n i n s ) 是大豆中存在的一类具有较强生理活性的物质。是具有重要研 究价值和广泛应用价值的皂苷之一。它主要来源于豆科植物大豆，是一类由低聚糖和齐 墩果烯三萜连接而成的五环三萜类皂苷。大豆皂苷分子是亲水亲油两性分子，因其水溶液振 荡时能产生大量持久的蜂窝状泡沫与肥皂相似而得名。 2 引言 1 2 1 化学结构与分类 大豆皂苷是一种齐墩果烯三萜与低聚糖的缩合物，依据其皂苷元的结构可分a 族、b 族、 e 族和d d m p 族。因为所有的大豆皂苷水解后只生成两种苷元，即a 族和b 族，所以也有 学者将大豆皂昔分为a 、b 两族，认为e 族是b 族的酰氧化形式，而d d m p 族则是b 族与 d d m p 结合的形式( 唐传核等，2 0 0 1 ) 。 在大豆皂苷分子中的低聚糖链有六种单糖：p - d 葡萄糖醛酸( g l c - u a ) 、p d 葡萄糖( g l e ) 、 9 d 半乳糖( g a l ) 、p d 木糖( x y l ) 、a - l 阿拉伯糖( a r a ) 、a - l 鼠李糖( r i m ) ，其糖链部分含 量一般在2 4 2 7 之间( 黄进等，2 0 0 3 ) ， 表1 1 大豆皂苷的皂苷元分类 t a b 1 一lt h ev a r i e t yo f s o y a s a p o g e n o l 图1 1 大豆皂苷的化学结构 f i g 。1 - 1t h ev a r i f yo fs o y a s a p o g e n o l a 族大豆皂苷是一类结合有二糖链( b i s d e m o s i d e ) 的皂苷，它以o l e a n 1 2 - e n 3 p ，2 1 p ，2 2 p ， 2 4 一t e t r a o l ( 1 l 口s o y a s a p o g e n o l a ) 为配基( a g l y c o n ) ，配基的c 3 和c - 2 2 位通过酯键结合糖链。 乙酰基饱和的大豆皂苷根据c 2 2 末端糖不同大体分为木糖系列( 主要成分为a a ) 和葡萄糖系 列( 主要成分为a b ) ，两族存在遗传上的相互关系。s h r a i w i a 等从大豆种子中分离并鉴定到7 种a 族乙酰化大豆皂苷，分别为a a 、a b 、a e 、a d 、a e 、虹以及a g 。之后，大久保等也成功 地分离到两种乙酰化a 族大豆皂苷。总之，目前已分离到八种乙酰化a 族大豆皂苷以及六种脱 乙酰化大豆皂苷。 3 东北农业大学工学硕士学位论文 表i - 2a 族大豆皂苷结构组成 t a b i - 2t h es t m c t l l r e so f s o y a s a p o g e n o l a 图1 2 乙酰化的大豆皂苷a 的化学结构 f i g 1 - 2c h e m i c a ls 仃u c n l r e so fs o y a s a p o g e n o l a b 和e 族大豆皂苷是分别以o l e a n 1 2 e n - 3 ， 3 2 2 3 ，2 4 t r i o l ( s o y a s a p o g e n o lb ) 和o l e a n 1 2 e r l - 3 p ，2 4 p ，d i o l - 2 2 0 n e ( s o y a p o g e n o le ) 为配基的单链( m o n o - d e s m o s i d e ) 大豆皂苷。北川等分 离到五种b 族大豆皂苷，分别命名为大豆皂苷i 、i i i 、i v 以及v ，而大久保等也分离到两 种e 族大豆皂苷，分别为大豆皂苷b d 和b e 。大久保等对b 族大豆皂苷的命名方法与：i l ) i i 不同， 主要根据配基c 一3 位的糖链不同而命名的，分别命名为大豆皂苷b a 、b b 、b c 、b b 以及b c ( 两者对应关系见表l - 3 ) 。k u d o u 等在温和条件下首次从大豆中分离到类真正的大豆皂苷， 4 引言 命名为d d m p 皂苷。d d m p 皂苷是以大豆皂苷原b 作为配基，c 2 2 位上通过酯键结合有2 ，3 d i l l v d r o 2 。5 - d i h y d r o x y 部位和品种而异。己知的五种d d m p 皂苷按其在h p l c 的流出顺序和 c 3 位糖链的不同命名为大豆皂苷唱、p g 、p a 、鸺、丫a 。在乙醇等醇溶剂中，由于皂苷的糖链 含有羧基结构，长期保存后会发生酯化反应，生成相应的酯，因而皂苷的醇提取物不宜在醇 中保存过长时间。l h c n g 等发现d d m p 族皂苷在水溶液状态中，在碱性和酸性下均不稳定， 在p h = 7 0 下最稳定，在3 0 下开始分解，乙醇具有稳定效应，当水溶液中乙醇含量达至t j 3 0 以上，d d m 在6 5 的分解可以完全停止。 表1 3b 、e 、d d m p 族大豆皂苷结构组成 t a b 1 - 3t h es t r u c t u r e so fs o y a s a p o g e n o l b 、e 、d d m p 图1 - 3 大豆皂苷b 、e 、d d m p 的化学结构 f i g 1 - 3c h e m i c a ls t r u c t u r e so fs o y a s a p o g e n o l b 、e 、d d m p 5 东北农、l k 大学工学硕十学位论文 1 2 2 基本理化性质 高纯度的大豆皂苷是一种白色粉末，味微苦，余味甜，是大豆制品苦涩昧的主要来源之 一( 李里特，2 0 0 2 ) 。大豆皂苷中最苦的是乙酰化的a 族皂苷，a 族皂苷脱乙酰后苦涩味降 低，b 族皂苷的苦涩味小于a 族皂苷。化学分子式及分子量见表l - 4 ( a l d ot a v ae ta l ，2 0 0 3 ) 。 大豆皂苷的分子极性较大，易溶于热水、含水稀醇、热甲醇和热乙醇中，难溶于乙醚、苯、 乙酸乙酯等极性较小的有机溶剂中，在含水丁醇和戊醇中溶解度较好，且能与水分成两相。 故可利用此性质从水溶液中用正丁醇或戊醇萃取，借此与极性较大的糖和蛋白质分开。 大豆皂苷溶液加入硫酸铵、醋酸铅等中性盐类可产生沉淀，与苯胺反应生成红棕色沉淀， 与五氯化锑反应呈蓝紫色，在冰醋酸一乙酰氯溶液中呈红色，于氯仿一硫酸中呈现绿色荧光 ( s 。g 。s p a r ge ta l ，2 0 0 4 ) 。所以，可根据以上特性来对大豆皂苷进行定性、定量的研究。 表l _ 4 大豆皂苷的分子式及分子量 t a b 1 - 4t h em o l e c u l a rf o r m u l aa n dw e i g h to fs o y a s a p o n i n s 6 引言 1 2 3 含量分布 影响大豆中的皂苷含量的因素主要有环境、遗传等。日本的s h i r a i w a l l 较了日本、加拿 大、美国以及中国大豆，发现中国大豆中的皂苷含量最高( 约0 3 ) 。t s u l 盟m o t o 等( 1 9 9 2 ) 研究了不同品种大豆的胚轴中皂苷的含量，指出遗传因素对a 族大豆皂苷含量的影响要大于 环境因素。同时分析了大豆种子中的a 族皂苷含量，指出大豆皂苷a a 型约占a 族总含量的为 1 6 6 ，而大豆皂苷a b 型约为7 6 1 。从食品加工方面出发，大豆中的a 族大豆皂苷含量越少 越好，因为此类大豆皂苷是造成大豆不良风味( d m f ，d r y m o u t hf e e l ) 的主要原因物质，据 日本文献报导，通过遗传育种可选育出不含a 族大豆皂苷的大豆品种。总之，a 族大豆皂苷主 要分布于大豆种子的胚轴中，其组成以及含量会随品种以及环境而异。 有关b 和e 族大豆皂苷在大豆中的分布，与a 族大豆皂苷一样，不同部位其种类和含量也 不一样。其中大豆胚轴中含有大豆皂苷b a 和b b 两种，而子叶中含有大豆皂苷b b 、b c 、b b 和 b c 四种。s h i m o y a m a d a 等( 1 9 9 0 ) 检测了几种栽培大豆中皂苷的含量，指出胚轴中含有率为 0 5 1 9 ，而子叶中为0 0 3 - 0 3 。另外，胚轴中的皂苷含量受栽培品种的影响较大，而子 叶中则受栽培条件影响较大。因此，也与a 族大豆皂苷相似，胚轴中的b 族皂苷含量主要受遗 传的限制。 d d m p 大豆皂苷的组成和含量也随大豆种子的部位和品种而异。y o s h i k i 等( 1 9 9 4 ) 比较 了栽培种大豆与野生大豆中的大豆皂苷含量，指出野生大豆的d d m p 皂苷含量平均为4 3 5 ， 比人工栽培种( 1 8 3 ) 要高得多，几乎为后者的两倍。在野生大豆的胚轴中大豆皂苷的含 量高达7 ，其组分为大豆皂苷0 q g 、隆和p a ，而栽培大豆胚轴中大豆皂苷a g 和陀则较少。然 而，子叶的皂苷构成成分中已检出皂苷p g 、胁、丫g 、弘和昭，品种间特别是野生种间其含量 存在显著的差别。y o s h i k i 等还详细地检测了大豆中的皂苷组成成分，指出栽培大豆中主要成 分为大豆皂苷陷，野生种中p g 、y g 和丫a 含量较高，并且，其组成随地域差异也有所不同。 1 2 4 生理功能及应用 大豆皂苷具有较强的生理功能。很早以前人们就知道大豆皂苷因具有溶血作用被视其为 抗营养因子；同时大豆皂苷具有苦昧，为大豆制品具有苦涩味的主要原因，所以在加工大豆 制品时，人们总是寻求一些方法将其除去，因此2 0 世纪7 0 年代对于大豆皂苷的研究，主要 局限于对抗营养因子及不良风味因子的研究。进入8 0 年代，许多学者发现大豆皂苷具有降低 胆固醇和抗血栓等功效。9 0 年代中期对于大豆皂苷的各种组分及化学结构，特别是d d m p 结合皂苷的发现使得大豆皂苷的研究取得了较大的进展。近年来国内外的大量研究结果显示， 大豆皂苷的毒副作用很小。这既为传统豆类食品提供了安全可靠的佐证，也为大豆皂苷的广 泛应用提供了安全保障。大豆皂苷的生物学、生理学和药学的活性试验都证明，大豆皂苷对 人体无毒害作用，而且还有许多有益的生理功效。 大豆皂苷在药理学的效应作用主要表现在以下几个方面：( 1 ) 大豆皂苷可以抑制血清中 7 东北农业大学工学硕七学位论文 i i 脂类的氧化，抑制过氧化脂质的生成，并降低血中固醇和甘油三酯的含量。日本学者认为大 豆皂苷能明显抑制过氧化脂质的生成，同时还具有降低体内转氨酶含量，抑制不饱和脂肪酸 的过氧化，抑制因肾上腺素作用造成的脂类分解，降低血浆中胆固醇和甘油三脂含量等功能。 ( 2 ) 溶血性。大豆皂苷在高浓度时能导致红血球破坏具有溶血作用，是由于皂苷与细胞膜上 的胆固醇结合使细胞膜破裂导致的。( 3 ) 抗癌作用。大豆皂苷是人们从食物中摄入的主要皂 苷，不被吸收，约在消化道中停留2 4 h ，它与肠上皮细胞膜作用引起的生理作用可降低结肠 癌的发病率。( 4 ) 扩张心、脑血管，改善心肌缺氧功能。对大豆皂苷的药理研究证实，大豆 皂苷可减少冠状动脉和脑血管阻力，增加冠状动脉和脑的血流量，改善心、脑供血不足，并 可减慢心率，并对缺血性改变有明显的促进作用。( 5 ) 抑制血小板凝聚作用。大豆皂苷在体 内毒素诱发的播散性血管内凝血实验中，可激活纤维系统，增强纤维蛋白原降解产物，进而 强烈地抑制血小板的凝聚，表现出较强的抗凝血作用。( 6 ) 钙离子通道阻滞作用。大豆皂苷 具有钙离子通道阻滞作用，通过向培养的大白鼠乳鼠的心肌细胞的培养基中加入大豆皂苷， 发现大豆皂苷可使心肌细胞群落的自发性搏动呈现具有一定的抑制作用，同时伴有心肌细胞 动作电位的各项参数的减少，如继续用常规培养基洗脱掉大豆皂苷，或使用钙能使肾上腺素 增加细胞外钙的浓度，则可使上述抑制发生逆转，说明大豆皂苷具有钙离子的通道阻滞作用。 ( 7 ) 大豆皂苷对中枢心血管系统的药理作用研究的较多，目前一致的结论是大豆皂苷可使血 压升高，心率加快，通过向动物侧脑室注射大豆皂苷，研究者发现，大豆皂苷可加强中枢交 感神经活动，使血管收缩，加快心率和增强心肌的收缩力而引起的血压升高( 马杰等，2 0 0 7 ) 。 大豆皂苷可以用于食品，如作为食品添加剂。应用于食品添加剂及保健食品大豆皂苷具 有发泡性和乳化性，可在食品、药品、化妆品中作添加剂广泛应用。向啤酒中添加大豆皂苷 可增加泡沫的体积，保持泡沫的稳定性，同时有利于改善啤酒的风味。日本的一些学者在此 领域研究较为深入，开发研制了含有大豆皂苷的保健食品、减肥食品及皂苷汁、皂苷饮料等 并申请了专利( s a t o s h iwe ta l ，2 0 0 3 ) 。大豆皂苷应用在化妆品中，可阻止由脂质过氧化引 起的皮肤疾患，减少皮肤病的发生，日本学者研究含有大豆皂苷的化妆品，其效果在临床已 得到了证实( m a r kae ta l ，2 0 0 0 ) 。 1 3 大豆异黄酮研究概况 大豆异黄酮是属于黄酮类化合物中的异黄酮成分，其分子结构骨架是3 苯基色原酮。它 是一种混合物，目前发现的大豆异黄酮主要有十二种，分三类，即黄豆苷类( d a i d z i ng r o u p s ) 、 染料木苷类( g e n i s t i ng r o u p s ) 、黄豆黄素苷类( g l y c i t i ng r o u p s ) ，以游离型、葡萄糖苷型、 乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等四种形式存在，其中游离型占异黄酮总量的 2 3 ( k u d o ue ta l ，1 9 9 1 。其结构式见图1 4 、图1 5 和表i 5 。 8 引言 h h 图1 _ 4 大豆异黄酮苷元化学结构 f i g 1 - 4c h e m i c a ls t r u c t u r e so fi s o f l a v o n ea g l u c o n e s h 图1 5 大豆异黄酮葡萄糖苷化学结构 f i g 1 5c h e m i c a ls t n l c t u r e so fi s o f l a v o n ec o n j u g a t e sa n dg l u c o s i d e s 大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，它主要分布于大豆种子的子叶和胚 轴中，种皮中含量极少。8 0 毋o 的异黄酮存在于子叶中，浓度为o 1 如3 。胚轴中所含 异黄酮种类较多且浓度较高，为1 0 o 2 ，但由于胚轴只占种子总重量的2 ，因此尽管浓度 很高，所占比例却很少( 1 0 0 0 - 2 0 ) ，大豆各部分异黄酮含量见表l - 6 。 表1 5 大豆异黄酮化合物的分子结构 t a b 1 5t h em o l e c u l a rf o r m u l ao fs o y b e a ni s o f l a v o n ec o m p o u n d s 9 东北农业大学工学硕士学位论文 大豆异黄酮主要来源于豆科植物的荚豆类，其中以大豆中含量最高，墨西哥的小白豆、 苜蓿和绿豆等植物中异黄酮含量也较高。 不同生产工艺对大豆食品中异黄酮的含量和成分影响较大。研究表明，加工中可造成异 黄酮显著损失，浸泡损失为1 2 、热加工为4 9 、豆腐制作为4 4 ( w a n ga n dm u r p h y , 1 9 9 6 ) 。 如果不去掉乳清，则豆腐制品中的异黄酮不会减少( 如内酯豆腐) ( d w y e re ta l ，1 9 9 4 ) 。大豆 蛋白分离碱提取为5 3 ，浸泡和加热使丙二酰异黄酮苷减少而相应的乙酰异黄酮苷和游离苷 元增加，发酵和碱提取也可以使游离苷元增加( w a n ga n dm u r p h y , 1 9 9 6 ) 。 表1 - 6 大豆各部位的异黄酮含量( 扯g 百1 ) t a b ，l 6c o n t e n t so fi s o f l a v o n ei ns o y b e a n 注：用乙醇循环提取1 5 h ，采用h p l c 定量各组分( 津崎真一，1 9 9 6 ) 1 4 大豆低聚糖研究概况 大豆低聚糖是指大豆中含有的对人体有益的可溶性糖类，主要成分是水苏糖、棉籽糖和 蔗糖。棉籽糖是三糖，它是半乳糖i f , ( 1 6 ) 糖苷键与蔗糖的葡萄糖基连接；水苏糖是四糖， 它是棉籽糖的半乳糖基以a ( 1 6 ) 糖苷键与半乳糖连接，因此棉籽糖和水苏糖也是半乳糖类 的低聚糖。其化学结构如下： 图1 - 6 水苏糖的化学结构 f i g 1 - 6c h e m i c a ls t r u c t u r e so f s t a c h y o s e 1 0 引言 图l - 7 棉籽糖的化学结构 f i g 1 7c h e m i c a ls t r u c t u r e so fm f f i n o s e 图1 8 蔗糖的化学结构 f i g 1 - 8c h e m i c a ls t r u c t u r e so f s u c r o s e 大豆低聚糖的甜度约为蔗糖的7 0 ，且甜味柔和甘美，热值为蔗糖的5 0 ，因此大豆低 聚糖可代替部分蔗糖作为低热量甜味剂。从大豆低聚糖中除去蔗糖后，由水苏糖、棉籽糖构 成的大豆低聚糖的甜度约为蔗糖的2 2 ，其生理作用主要是促进双歧杆菌的增殖。由于人体 内缺乏分解大豆低聚糖的消化酶( 洳胁半乳糖苷酶) ，所以他们可以不经消化吸收直接到达 大肠内为双歧杆菌所利用，是双歧杆菌的有效增殖因子。随着年龄的增加，人体内双歧杆菌 的含量大幅降低，所以低聚糖的作用显得尤为突出。同时大豆低聚糖还具有抑制病原菌、防 止便秘、腹泻、保护肝脏功能、降低血清胆固醇、降低血压、增强免疫功能、抗癌作用等多 种生理功能，对糖尿病人可作为糖的替代品，因此在食品中加入大豆低聚糖对促进人体健康 具有重要意义。特别是用于婴幼儿配方奶粉中，不但可以保证各种营养成分的平衡吸收，更 可以使这种双歧杆菌的增殖因子作用效果更加显著( 方伟辉等，2 0 0 4 ) 。 1 5 大豆皂苷检测方法研究概况 由于大豆皂苷种类繁多以及性质差异等原因给它定性定量分析所带来的困难，所以目前 没有较理想的既稳定又准确简便的检测方法。大豆皂苷常用的检测方法有比色法、薄层色谱 法、紫外分光光度法、高效液相色谱法( h p l c - u v 、e l s d 、d r j 和h p l c m s ) 等。 1 5 1 齐墩果酸分光光度法 香草醛一硫酸法和香草醛一高氯酸法能与皂苷反应形成特征的红色，是目前最广泛采用 东北农业大学工学硕士学位论文 的皂苷显色法( 黄贤校等，2 0 0 5 ) 。紫外扫描结果表明，大豆皂苷以高氯酸体系显色后的 最大吸收是5 6 0 n m ，硫酸体系显色后的最大吸收是5 4 0 n m ，前者的空白