elisa免疫测定PPT课件.ppt

ELISA检测技术要点与常见问题,1,内容,ELISA的概念酶联免疫吸附试验的反应原理及操作中注意事项常见问题原因分析及解决结果的报告解释,2,ELISA的概念,ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，操作过程简单易行并可以定量，从而使其在免疫学检测中得到了广泛的应用。,ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,3,抗原抗体反应,可逆性,抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+AbAgAb,抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=AgAbAgAb,AgAb的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。,4,特异性,抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。,5,最适比例,6,敏感性,化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。,7,常见问题,ELISA技术掌握不好-较大的技术难题白板花板灰区假阴性假阳性,8,9,白板,10,花板,11,均板,12,灰区,13,竞争法,14,ELISA检验方法相关项目,乙肝抗原、抗体丙肝抗体梅毒抗体艾滋抗体-,15,ELISA常见类型,1.双抗体夹心法（用于测抗原）HBsAg2.间接法（用于测抗体）HBsAb3.竞争法（用于测小分子抗原/半抗原和抗体）HBeAb4.捕获法（用于测血清中某抗体的亚型）特异IgG,16,17,一般情况下的双抗体夹心法ELISA反应,抗原过量时一步法ELISA反应会出现钩状效应,钩状效应（hookeffect）,18,钩状效应强阳性-假阴性方法：稀释后再测特点：不易发现避免：结果回顾、诊断提示、临床沟通,19,20,抗原的纯度对间接法测抗体的影响,正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体对间接法的影响,间接法的影响因素,21,正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体对间接法的影响,假阳性鉴别结果回顾、诊断提示、临床沟通复检必要时另一试剂盒复检,22,小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点,23,抗原的固相化既可以直接进行，亦可以通过相应特异抗体而间接固相化,24,酶及底物,25,对照设定,阳性对照品阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。阴性对照品阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。,26,ELISA操作中的注意事项,标本采集、保存试剂准备加样温育洗板显色比色结果判断,27,溶血标本及混有红细胞的血清易产生假阳性,因溶血血清中含有过氧化酶,造成假阳性受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,造成假阳性在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深,造成假阳性EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性,造成假阴性标本凝固不全,形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果标本中有内源性干扰物,不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其他物质等,标本采集、保存,28,试剂的准备,选择高质量的试剂是保证结果准确的关键室温平衡所用蒸馏水或去离子水应保证质量,试剂准备,29,加样,应将所加物加在ELISA板孔的底部。每次加标本应更换吸头。震荡充分混匀。从滴瓶中滴加试剂，要注意滴加角度和滴加速度。避免标本“交叉污染”问题。,加样,30,温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。温育时间足够。保温的方式一般采用水浴或电热块。温育的温度和时间应按规定力求准确。,保温,31,洗板,分离游离的和结合的酶标记物洗板的方式：自动洗板仪；手工操作有浸泡式和流水冲洗式倾倒液体的方式甩干孔内液体：应注意交叉污染和个人防护吸干孔内液体：吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸（推荐）如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。,32,显色,显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。OPD底物显色一般在37反应20-30分钟。TMB约40分钟显色达顶峰。,33,比色,加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀。正确选择波长和参比波长。酶标仪使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。,34,结果判定,定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的简单回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。“阳性”表示该标本在该测定系统中有反应。“阴性”则为无反应。定性测定结果确定的依据在于阳性阴性判定值（Cut-off）的建立。在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S）和阴性对照（N）的A值后，计算S/N值。,35,定量测定的结果判定是每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线，根据标本的吸光度值不同来确定待测物的浓度。在间接法和夹心法ELISA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。,36,灰区概念把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性）。,37,酶标仪是垂直光路测定吸光度。垂直光的特点是样本吸光度受液体浓缩或稀释的影响小，不足之处是易受被测样本液面是否水平，酶标板透光性孔底是否平整等的影响较大。酶标仪在用单波长测定吸光度时，受到测定干扰（样本的浊度、干扰色等）、电路干扰（包括噪音、漂移、电压等）和液体表面张力的影响也很大。,酶标仪单、双波长检测的比较,38,双波长的测定时采用两个不同波长(测定波长450和参比波长630)同时测定一个样品的吸光度，它们的差值是样品相对准确的吸光度，这样就会减少了测定干扰和电路干扰。双波长差吸光度法具有可以克服一些外界环境的影响共存组分吸收谱叠加的干扰，以及减少比色的光学不均一性等特点，吸光度在一定的范围内有良好的线性关系。双波长测定明显比单波长更适合于生物活性测定实验，其可以提高实验结果分析的准确度，减少实验误差。,39,结果的解释,乙肝五项的结果解释1,3,5或1,3大三阳1,4,5或1,5小三阳全阴或Sb阳性除此之外一律复查,40,丙肝抗体ELISA检测试剂现已发展至第三代试剂，第三代试剂的灵敏度和特异性比前两代试剂都高。第一代试剂利用来自HCV病毒基因组中的部分NS3和NS4区重组表达抗原（C100）作为固相包被进行检测；第二代试剂利用来自HCV基因组NS3区的C33C和部分NS4区的融合表达抗原（C200）、再加上C区的核心抗原C22-3作为固相包被进行检测；第三代试剂在第二代抗原的基础上，又加入了来自NS5区的重组表达抗原，另外，部分公司的产品中又引进了合成肽抗原。,41,初筛用的HIVELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板，以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用，特异性有了很大提高。第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体，进一步提高了敏感性。第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测，把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板，可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。,42,梅毒螺旋体感染的免疫测定非特异性实验（类脂质抗原血清学实验）梅毒螺旋体在破坏机体组织的过程中，体内释放出一种心磷脂抗原，这种抗原可刺激机体产生相应的抗体即反应素，其与牛心中提取的心磷脂在体外可产生免疫结合反应。此类试验包括VDRL,USR(显微镜观察)RPR,TRUST(肉眼观察)RPR主要用于治疗效果的监测。,43,特异性试验梅毒螺旋体抗体检测主要包括荧光密螺旋体抗体吸收试验FTA-ABS、梅毒螺旋体血凝试验TPHA、梅毒螺旋体明胶凝集试验TPPA和ELISA。临床中常用的有TPPA试验和ELISA法。,44,TPPA结果的判定方法反应图像判定粒子成纽扣状凝集，呈现出外周边缘均匀且光滑的圆形（-）粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形（）粒子环明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱地聚集在周围（+）产生均一的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延展（+）,45,H