（生物医学工程专业论文）小鼠稀释血及肝癌与健康小鼠血清荧光谱的高斯法研究.pdf

a b s t r a c t d i a g n o s i so fi n c i p i e n tc a n c e ri sai m p o r t a n tr e s e a r c hs u b j e c t s f l u o r e s c e n c es p e c t r ah a s h i g hs e n s i t i v i t ya n dn e e dl o ws a m p l e sw h i c hh a st h ep o t e n t i a lt od e t e c t ee a r l y s t a g e d c a n c e r t oi n v e s t i g a t ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f d i l u t e dm o u s eb l o o db v u s i n gd e r i v a t i v e sp e c t r aa n dg a u s sd e c o m p o s i t i o n u s e i n gt h es a m em e t h o d ，w er e s e a r c h s e r u mf l u o r e s c e n c es p e c t r u mo ft u r n o u ta n dn o r m a lm o u s e f o rd i a g n o s i so f i n c i p i e n tc a n c e r u s i n gt h es e r u mf l u o r e s c e n c es p e c t r u m r e s u l tc a nc l e a r l yr e f l e c t e df l u o r e s c e n ts p e c t r ao f c o n s t i t u t i o nd e t a i la n dc o m b i n a t i o nc o n d i t i o ni nd i l u t e db l o o d t h et u m o u ra n dn o m a l s e r u mf l u o r e s c e n c es p e c t r aa r ed i f f e r e n ti nc e n t e rw a v e l e n g t h ，h a l f - w i d t ha n di n t e n s i t y t h ef l u o r e s c e n ts p e c t r ai se x c i t e db y4 0 7 n m ，w eg e tf l u o r e s c e n c es p e c t r ao fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no fd i l u t e dm o u s eb l o o d t h er e d - s h i f t e ds p e c t r a lp e a k st h a ts i g nc h a r a c t e r i s t i c a b o u tz i n cp r o t o p o r p h y r i na r eo b s e r v e di nf l u o r e s c e n c es p e c t r a , a tt h ec o n c e n t r a t i o nf r o m1 t o10 m u l t i p e a kg a u s sf i to fs p e c t r ai su s e df o rt oa n a l y z e ds p e c t r aa c c o r d i n g t o n u m b e ra n dp o s i t i o no fm i n i m u mt h es e c o n dd e r i v a t i v eo ff l u o r e s c e n c e s p e c t r a t h e p r o c e s sa n dr e s u l tc a nc l e a r l yr e f l e c t e df l u o r e s c e n ts p e c t r ao fc o n s t i t u t i o nd e t a i l a n d c o m b i n a t i o nc o n d i t i o ni nd i l u t e db l o o d t h e s t r e n g t h s o ff l u o r e s c e n c ee m i s s i o no f c h a r a c t e r i s t i cp e a k sa b o u tz n p r o t o p o r p h y r i na n dr o t o p o r p h y r i ni xc h a n g ea c c o r d i n g t ot h e d i l u t e db l o o dc o n c e n t r a t i o nc h a n g e s t h i sa d d i t i v ee f f e c t b r i n g s t 1 er e d s h i f t e d t h e c o n c l u s i o nc a no f f e rag u i d et oab e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h er e d s h i f t e da n dt h es t u d yo n p o t e n t i a lu s e d e r i v a t i v ef l u o r e s c e n c es p e c t r ac a nd i f f e r e n t i a t et h ew e a ks i g n a li nl o w q u a n t i t yo f b l o o d p o r p h y r i n t h e n , t h es e c o n dd e r i v a t i v ef l u o r e s c e n c es p e c t r aa n dg a u s sd e c o m p o s i t i o na r e d o n eo nt h es e r u md e r i v a t i v ef l u o r e s c e n c es p e c t r u mo ft h em o u s e ss e r u mf l u o r e s c e n c e s p e c t r u n ao fl i v e rc a n c e r ，i nc o m p a r i s o nw i t ht h et h en o r m a lc o n t r o lg r o u p t h el i v e rc a n c e r a n dn o r m a ls e r u mf l u o r e s c e n c es p e c t r aa r ed i f f e r e n ti nc e n t e rw a v e l e n g t h 、h a l f - w i d t ha n d i n t e n s i t ya f l e rg a u s sd e c o m p o s i t i o n t h er e s e a r c hi nt h i sp a p e rc a no f f e re v a l u a t i v ev a l u e t o t h ed i a g n o s i so f i n c i p i e n tc a n c e ru s i n gt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r u m t h er e s e a r c hi nt h i sp a p e rc a l lo f f e rt h et h e o r e t i c a lb a s i sa n de x p e r i m e n t a lm e t h o dt o m e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o nb e t w e e nl i g h ta n d b i o l o g i c a lt i s s u e ，t h eo p t i c a lb i o l o g i c a la n d d i a g n o s i so fi n c i p i e n tc a n c e ru s i n gt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r u m k e y w o r d s ：b l o o d ，s e r u m ，l i v e rc a n c e r , f l u o r e s c e n ts p e c t r a ，d e r i v a t i v es p e c t r a , g a u s sf i t 声明尸i 刃 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：社 。扩年6 月名日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： 。f 年o 月确日 硕士学位论文 小鼠稀释m 及肝癌与健康小鼠血清荧光谱的高斯法研究 1引言 1 1 研究背景 光谱学和光谱检测l l 捌是通过物质对光的吸收和发射，来研究光与物质相互作用的 一门科学。通过研究原子和分子光谱，可以对物质结构作出分析，因此在物理、化学、 生物、地质、考古、天文等许多领域起着十分重要的作用。荧光光谱分析是光谱学的 重要组成部分，由于荧光分析的灵敏度很高，并且在物质吸收光后发生荧光这很短的 时间内会发生许多分子过程，会影响到荧光物质的光谱特征，所以荧光分析在生物化 学、医学、工业和化学等研究中的应用越来越广。 生物组织无论是吸收光，还是发出荧光都与其分子结构及其能级结构有关。因而 在有关研究中必将涉及生物大分子的激发态与构象，以及分子内组分之间的相互作用 过程。研究生物大分子的激发态，一方面可以从理论上计算其能级和能量，另一方面， 因为组织的吸光与发光是激发态的一种外部表现，故也可从实验方面进行研究。由于 荧光光谱的获得和测量都较直接，且每一种物质的吸收光谱和荧光光谱相对比较稳 定，并有其特殊性，因而研究生物组织的吸收光谱和荧光光谱，不仅可了解其内部构 成，还可根据光谱特征的变化间接得到其结构变化的规律。可以说，通过检测生物组 织的吸收光谱和荧光光谱变化特征，或外源荧光对生物组织的作用，一方面可以对生 物组织及其变化进行诊断或治疗，另一方面也可以研究光与生物组织的作用的机制。 在组织细胞和体液内，存在大量能够产生荧光的生物大分子，正常组织和异常组 织在一定波长的激光激发下会发出不同的自体荧光，这种荧光是生物组织更为本质的 反映，通过分析自体荧光光谱的形态和强度可以区分不同的组织，达到组织诊断的目 的。 1 2 血液荧光光谱的研究现状 人的疾病大都能在其某些生化指标上得到反映，比如人的血液或尿液。观察病人 的某些生化反映在疾病辅助诊断方面有一定的意义，所以在临床上一直倍受重视。 由于血液在人体中的地位非常重要，其状态的变化直接反映了人的生理状态，研 究血液生化指标的方法有很多，近年来，光谱技术应用于血液诊断成为众多学者研究 的热点。当光照射到血液，会发生散射、吸收和发射等现象，通过检测和分析血液的 散射光谱、吸收光谱和发射光谱，分析这些谱线的结构，能够获得一些反映血液状态 和内部物质构成的信息，以及光子与血液相互作用过程的有关信息。 l 引言 硕 ：学位论文 1 2 1 国内研究概况 国内对于血液的荧光法研究主要用于检测不同病情下荧光光谱的变化，希望找到 一种既快速又准确的诊断方法。研究发现，激光诱发荧光光谱用于诊断结肠癌【3 】有一 定临床价值。临床上用锌原卟啉来评价铁的营养状况t 4 , 5 】和辅助诊断铅中毒【6 ，7 1 。有报 道正常人及乙型肝炎患者血浆标本的荧光光谱存在显著差异【引。采纳经验函数，能够 施行恶性肿瘤的临床筛查【9 j 。吴敏等人利用波长为4 8 8 o n m 的氩离子激光诱导血清的 自体荧光，发现肾病患者血清的荧光峰位虽然较健康人的有红移趋势，但符合率不够 耐1 0 】。临床的血样采集方法大多采用穿刺取样法，这种方法虽然己经非常成熟。然而， 现代医学的发展使无创诊断及治疗成为人们积极探索的目标。国内于常青等人通过比 较皮肤和血液的激光诱导荧光光谱特征，探索用激光诱导荧光光谱技术在体表进行无 创血液成分分析的可行性【l 。孟继武等人对人体皮肤浅表组织内血液中的卟啉进行无 创荧光检测。对人耳垂皮肤浅表组织内血液进行了荧光分析，结果同p p i v 水溶液的 荧光谱一致。 伴随着弱激光照射疗法在我国多个城市用于临床，围绕激光波长的选择、功率大 小的要求及照射方式等问题，让我国许多从事物理光学、光化学、光生物学研究的学 者和医生们找到许多共同课题。临床上应用的h e - n e 激光和半导体激光波长范围在 6 3 0 n m - - 一8 9 0 n m 之间，功率一般为几毫瓦到几十毫瓦。降雨强等人为研究弱激光照射 对人血液携氧能力的影响及机制，用荧光仪分别测量了h e - n e 激光照射前后正常血液 及其组分( 血浆、红细胞) 的荧光光谱，得出h e n e 激光照射可影响血液的携氧能力【l 3 。 陈荣等人研究表明在6 3 2 8 n mh e - n e 激光诱导下，不同血液在6 7 0 、7 3 0 和9 8 1 n m 附 近出现三个荧光峰。荧光强度在一定范围内与照射激光功率呈线性变化关系；随着激 光照射时间的增加，三个峰位上的荧光强度下降，8 m i n 后趋于稳定值【1 4 】。 光动力疗法( p h o t o d y n a m i ct h e r a p y ，p d t ) 是一种国内外正在研究发展中的治疗恶 性肿瘤的新技术。于常青等人利用血红蛋白在5 7 8n l l l 处有吸收峰以及在光动力疗法 治疗鲜红斑痣过程中病变区血液含量减少的特性，根据测得的含有光敏剂的皮肤层激 光诱导荧光光谱，计算了皮肤层光敏剂的荧光强度随时间的变化关系【l 引。s t a d l e r 等研 究波长为6 6 0n m 激光照射对淋巴细胞增殖的影响，发现激光照射可促进淋巴细胞增 殖，而在此过程中，血红蛋白的作用是至关重要的1 1 0 j 。 由于生物的复杂性，至今仍然没有完备的理论可以解释光与生物的相互作用。我 们实验室几年来在血液的荧光光谱研究领域，针对各种激发光源初步讨论了光与生物 组织相互作用的物理机理。 高淑梅等人根据多种波长可见光诱导的小白鼠全血荧光光谱，如图1 1 【l 刀所示， 进而对其产生机理和谱线特胜进行了研究，其结果对l l l i t 和l i f s t 中治疗光波长 2 硕上学位论文 小鼠稀释血及肝癌与健康小鼠血清荧光谱的高斯法研究 的选择具有参考价值。对5 3 2 n m 激光激励血液中红细胞产生荧光的物理机理进行了研 究【1 8 】，当使用波长为5 3 2 n m 的低强度半导体激光抽运n d ：y a g 倍频激光照射血液中 的红细胞时，激光将使红细胞上不对称的c c 键或c - n 键发生非谐振吸收而断裂， 形成未成对电子，由于该种电子的产生而形成的新的荧光团在后续激光的作用下受激 跃迁而产生荧光。波长为4 0 7 n m 的光激发不同浓度离体红细胞可以产生较强的荧光光 谱，并从理论上对这种红移现象的产生机理进行了分析1 1 9 l 。还用可见波段、不同波长 的加+ 激光激发同一浓度红细胞溶液、血红蛋白溶液产生荧光光谱，认为主要是血红 蛋白中存在的卟啉类荧光团的贡献，显示了激光与普通光对生物大分子存在明显不同 的作用特性1 2 0 , 2 1 j 。 图1 14 0 7 n m l e d 诱导的不同浓度的全血溶液荧光光谱 骆晓森等人的研究表明不同波长光与血液相互作用的过程有所不同，因而对血液 的生物效应也会有所差异【2 2 1 ；通过使用5 3 0 r i m 波长的光和h e - n e 激光6 3 2 8 n m 诱发 血液的荧光光谱对比分析，认为相互作用的过程有所不同，因而对血液的生物效应也 会有所差异1 2 3 。 彭长德等人用4 0 8 n m 的l e d 诱导不同浓度人稀释血液的荧光光谱，提出了5 5 6 n m 谱峰不是某一荧光团所产生的特征峰，而是由吸收所造成的假峰的观点；讨论了激励 光散射中心波长偏离激励光中心波长现象的原因，研究结果对光诱导生物组织自体荧 光诊断技术有一定参考价值1 2 4 1 。 1 2 2 国外研究概况 国外临床上，红细胞原卟啉( 包括原卟啉和锌卟啉) 的检测过去常用于红细胞 疾病中：因为血红素合成的减少的疾病( 如缺铁) 2 5 , 2 6 1 、慢性疾病1 2 7 、铅中毒【2 引、红 细胞生成原卟啉症嗍、球蛋白生成紊乱( 如地中海贫血综合症) 【3 0 1 、 n ，c 和h b e 紊 乱等疾病【3 1 ，3 2 3 3 1 。以前曾报道的萃取过程方法各有不刚2 7 ，3 5 1 。 还有用近紫外光( 4 1 0 n m ) 激发自体荧光被用于检查口腔癌患者，有8 5 发现有 3 l 引言 硕十学位论文 卟啉类荧光光谱p 酬。研究卟啉的方法除了荧光法外还有人提出用液相色谱法同步对锌 卟啉和原卟啉定量1 37 。之后有人用液相色谱法，荧光光谱法和血液分光光度计三种方 法研究血液中锌卟啉浓度在正常人和暴露在铅环境工人的统计比例1 3 引。美国纽约爱因 斯坦大学c h e nq 等人用荧光光谱法在红细胞溶血液中检测锌卟啉i x ，原卟啉和 荧光的血红素降解产物，图1 2 给出的荧光光谱在改造基因时，可用作血红蛋白合成 与血红蛋白稳定性生物标志1 3 9 1 。 4 1 04 6 05 1 05 6 06 1 06 6 0 e i 嘶勰i o n w a v e 蚴 图1 23 6 5 n m 激发h b e 基因改造鼠血溶血液荧光光谱 同时，也有怀疑荧光法检测血液的准确度的报道，s i e sc w 等人，对9 个 n o n p r 5 9 w 突变病人的血浆进行荧光扫描，没有检测出潜在的多样卟啉症【加1 。 1 3血清荧光光谱诊断研究概况 由于恶性肿瘤细胞代谢异常，代谢产物及细胞内的非正常分子进入人体组织及血 液，引起血液组份、浓度以及血液微观环境的改变，并且这些变化与癌的位置和恶变 的程度有关。检测血清的光谱，也可能提供细胞癌变的信息。相对于组织切片，血清 样品容易获得，可以避免组织取样及切片制作时的种种限制。 血清的荧光光谱诊断研究在国外进行得较少，国内从二十世纪八十年代末开始对 其进行了研究1 9 8 8 年，孟继武等【4 l 】人在研究血清光谱时发现：在2 9 0 n m 的紫外光激 发下，正常人和癌症患者的血清光谱均在3 4 0 n m 处有一个很强的发射带，而在4 0 5 n m 光源的激发下，两者出现明显差别，癌症患者血清光谱分别在6 3 0 n m 和6 9 0 n m 出现 两个发射峰，而健康人没有，他们认为这是由癌症患者血清中具有特异性的卟啉类化 合物引起的，进一步的研究确定了这种特异性两个发射峰起源于一种卟啉化合物的兀 电子跃迁【4 2 ，4 射，这种卟啉类化合物就是原卟啉，并据此提出了肿瘤诊断的判据。1 9 9 4 年，赵晓杰等【4 4 1 人用氩离子激光器( 5 1 4 5 n m ) 作激发光源，研究了肝癌患者血清的自体 荧光光谱，发现其呈双峰结构( 1 5 0 0 c m - 1 - 1 7 5 0 c m 。1 和2 6 5 0 c m “2 9 0 0 c m 。1 ) ，而正常人和 肿瘤切除者的血清光谱呈单峰结构( 1 4 5 0 c m 1 1 5 0 0 c m 。1 ) ，且肝癌患者的荧光峰相对正 常人出现蓝移。认为肝癌的发病及发病后的血清环境与肝硬变病人有可能完全不同， 4 善君暑州8意2lz爹至-誓 硕士学位论文小鼠稀释血及肝癌j 健康小鼠血清荧光谱的高斯法研究 与肝癌肿瘤切除后病人的血清环境也不同，所以应用荧光光谱能将肝癌与其它病变区 分开来，另外，由于正常人、肝硬变病患者及肝肿瘤切除患者血清的荧光峰值和峰位 几乎相同，所以还不能将其区分开来。1 9 9 7 年，彭燕1 4 5j 用2 0 0 n m ，2 5 0 n m ，2 9 0 r i m 的紫 外光激发消化道癌症患者的血清样品，发现在3 5 0 n m 8 0 0 n m 的波长范围内，光谱呈 现四个发射峰，分别在3 2 0 n m - 3 4 0 n m ，4 0 0 n m - - - 4 6 0 n m ，6 3 0 n m 和6 9 0 n m 。1 9 9 8 年张祖 贻等【硐分析了肺癌患者、良性疾病患者和正常人血清的荧光光谱，以波长6 2 5 n m 处 的荧光强度大于波长6 1 5 n m 处为阳性，小于者为阴性，对肺癌进行了早期荧光诊断， 发现肺癌组阳性率远高于其它组。 1 9 9 7 年，冯兆池等w 7 1 发现正常人血清的荧光谱上叠加了很强的共振拉曼信号， 而癌症患者血清的自体荧光共振拉曼光谱无共振拉曼信号或其强度明显低于正常人， 并认为荧光谱中的共振拉曼信号源于b 一胡罗卜素的基频信号，从而得出癌症患者血清 中b 胡罗b 素的含量明显低于正常人。1 9 9 8 年，高泽红等【4 8 】研究了正常人、癌症患 者血清的可见拉曼光谱和d n a 的紫外线外共振拉曼光谱，发现正常人血清在4 8 8 0n n l 波长的单色光激发下其拉曼光谱的相对强度小于由5 1 4 5 n m 波长的单色光激发的拉曼 光谱的相对强度，而癌症患者则相反。正常人与癌症患者血清拉曼光谱存在差异的信 息。由于人体血清的拉曼频移的平均值分别为1 0 0 6e m 11 6 1c m 1 和1 5 2 6c m ，核 酸中碱基的拉曼频移为1 3 3 7 c m 。1 和1 4 8 5 c m 1 ，所以认为人体血清拉曼光谱不是血清中 的碱基分子产生的。焦锡莹等【4 9 】用氩离子激光( 5 1 4 5 n m ，4 8 8 0 n m ) 激发了注射不同物质 诱导的肝纤维化小鼠肝组织的荧光光谱。发现用5 1 4 5 n m ( 4 0 0 m w ) 激发时，正常组织 在5 2 0 n m - - - 6 4 0 n m 范围内，荧光光谱的荧光的峰值为5 7 4 n m ，注入药物一段时间后， 发现其荧光峰在不同程度上发生蓝移现象，而以c c k 组蓝移最大。且随着时间的增 长，c c h 组蓝移继续增大且峰前较陡，峰后平缓，其它组光谱变化不大。结合病理检 验，指出根据不同程度的蓝移可推断出肝纤维化的不同时期。刘华生等【5 0 】用激光诱导 荧光的方法，研究了药物诱发白鼠肝病变过程中不同阶段的白鼠的血清光谱，实验结 果表明，用5 1 4 5 n m 作激发光源，白鼠从正常经肝纤维化到肝硬化的过程中，血清光 谱的荧光峰有红移现象，而用4 8 8 0 n m 作激光源的光谱之间则无明显的差别。 1 9 9 9 年，g a n e s a n s 等1 5 1 , 5 2 】在4 0 5 n m 的激光下研究了正常人和不同肝病变( 如肝 炎、细螺旋体病、黄疽、肝硬化和肝细胞衰竭等) 血液的固有荧光的特性。发现正常血 液的平均光谱在4 6 4 n m 附近有一个显著的发射峰，而肝病的情况下，主发射峰同相应 与正常情况比发生红移。另外，肝病变时，在6 1 5 n m 附近有一明显的第二发射峰，可 能是内卟啉的存在引起的。对于主发射峰，肝炎时红移最大，肝硬化时最小。而在 6 1 5 n m 附近的第二发射峰在肝硬化的情况下红移比其它情况更显著。指出比参数 1 4 0 5 1 6 1 5 可以区分正常组织和肝异常。此外他们还以4 0 5 n m 的光为激发光源，在可见 光的范围内观察了鼠肝组织再生期间，其血液的自体荧光特征，发现除了在4 4 0 r i m 处 5 硕上学位论文 存在主发射峰外，还在大约6 2 0 n m 处存在第二发射峰，并指出6 2 0 n m 的峰可能源于 内源卟啉。6 2 0 n m 峰的强度在肝切除术后大约1 6 小时达到最大，以后逐渐减小，到 2 4 0 小时时控制组与实验组差别消失。 2 0 0 0 年，孟继武等【5 3 】分析了类胡萝卜素( c 神与卟啉间的敏化荧光，发现c a r 的 荧光光谱与h p d 的激发光谱有很好的重叠，因此c a r ，h p d 之间可能发生能量传递， 即c a r 对h p d 的荧光有敏化作用，卟啉浓度提高了就猝灭了c a r 的发光。由于c a r 与h p d 间的能量传递，使得只有选择激发卟啉才能得到好的结果，因此激发光的光 谱宽度要有一定的限制。应用血清荧光对恶性肿瘤进行诊断这一方法敏感度高、特异 性好，但是由于血液是由诸多生物分子组成的，其它分子的发光必然会对血清荧光恶 性肿瘤的诊断符合率产生影响。通常情况下，血清中存在的具有共扼结构基团的分子 如血清蛋白质、血红蛋白质等蛋白质类和卟啉、类胡萝b 素( c 神等共轭分子在紫外光、 短波可见光的激发下均可能发光。 2 0 0 4 年，李建东等阱j 人对肝硬化的血清荧光光谱进行诊断研究，采用4 7 6 5 n m 的氩离子激发光激发肝硬化患者及健康人血清样品的自体荧光，分析了4 9 0 6 0 0 n m 范 围内的荧光光谱，发现二者光谱的带宽和相对强度比1 4 9 0 1 6 0 0 存在明显差异，同 时使用这两个参量对样品进行分析时，与病理结果相比较得到了7 6 5 的总符合率， 该结果对肝硬化的光谱诊断有一定的参考价值。 2 0 0 6 年，郭兴家等【5 5 】用不同激发波长对人体血清自体荧光光谱分析。利用分子 荧光光度计测定了激发波长分别为4 5 7 9 n m ，4 7 6 5n m ，4 8 8 0 n m ，5 0 1 7 n m 和 5 1 4 5 n r n 光的血清白体荧光光谱，并对这些光谱的特征和产生机制进行了分析。实 验和分析结果表明：在5 0 0 n m - - 7 5 0 n m 的波长范围内，5 1 81 1 1 1 和6 4 0 n m 附近有两个 比较明显的荧光峰；5 9 0 n m 处有一个非常弱的峰。它们可能主要来自于血清中胆红素， 核黄素及其衍生物，b 胡萝素，锌卟啉及原卟啉i x 等的贡献。这些研究结果将为利用 氩离子激光器作为光源进行光谱诊断研究选择最佳激发波长提供一些参考。 应用血清荧光对恶性肿瘤进行诊断这一方法敏感度高、特异性好。但是由于血液 是由诸多生物分子组成的，其它分子的发光必然会对血清荧光恶性肿瘤的诊断符合率 产生影响。通常情况下血清中存在的具有共扼结构基团的分子如血清蛋白、血红蛋白 质等蛋白质类和卟啉、类胡萝b 素等共扼分子在紫外光、短波可见光的激发下均可能 发光。 1 4 本文的主要工作 室温下许多分子的荧光光谱具有宽带的结构，由此限制了常规荧光测定法分辨重 叠谱带的应用。而在荧光混合物中，谱带的重叠现象往往是很严重的。自从2 0 世纪 年代初期引入了导数荧光关普技术应用于分光光度测定后，分光分度法的选择性得到 6 硕士学位论文小鼠稀释血及肝痈与健康小鼠血清荧光谱的高斯法研究 了很大的改善。 二阶导数荧光光谱每个极小值按导数光谱理论应与某些荧光物质相对应。也就是 说，可以近似认为在荧光光谱主要是由峰值处于相应极小值处的几种荧光物质的荧光 叠加而成，因此可考虑以导数光谱中出现的极小值的个数和位置为参数对荧光光谱进 行谱图分离，以确定荧光光谱的结构。 根据国内外研究现状，本文开展对血液以及血清的荧光光谱分析，本文的主要工 作有： ( 1 ) 研究4 0 7 r i m 激发光激发不同浓度小鼠稀释血液获得的荧光光谱，利用导数 光谱技术以及高斯分解法对荧光光谱进行精细光谱分析。 ( 2 ) 用不同激发光激发正常组以及癌症组小鼠血清得到的荧光光谱，用导数光 谱技术以对光谱中的微弱信号的分辨；并对荧光光谱进行高斯分解，区分正常组以及 癌症组小鼠，研究荧光光谱技术用于肝癌早期诊断的可能性。 7 2 荧光光谱的基础理论 硕卜学位论文 2 荧光光谱的理论基础 2 1 光对生物组织作用 光对生物组织作用的主要形式有：生物组织对光的散射、吸收和辐射【5 6 ，5 7 1 。而生 物组织受光照后发生辐射的必要条件是存在能吸收这些光的分子。能吸收相应可见光 和紫外光的物质分子称为生色团( c h r o m o p h o r e ) ，其中有一些能发射荧光的就称其为 发光团或荧光团( f l u o r o p h o r e ) 。发光是激发态的一种外部表现，分子的能量状态与分 子的结构以及分子的运动形式有密切关系。研究分子激发态可以反映分子( 或大分子) 的构象特点及变化，也可了解光对生物组织的作用过程及光产物的形成等等。在光对 生物组织的作用中，所有的过程都有感受光的生色团参与。这些生色团往往是色素与 蛋白质的复合物。 2 1 1 光子能量与分子结构 2 1 1 1 光子能量与光化学过程 紫外光与可见光都是电磁辐射的一部分。从量子理论可知光辐射出的光子能量为 h v ( 单位为e v ) ，其中h 为普朗克常数，v 为光波频率。即波长较短的光波中光子能 量较大，波长较长的光波中光子能量较小。该波长的光子被生物组织吸收后将转变为 分子的振动胄匕_ 热能，所对应的生物效应主要是热效应。从可见光开始都可进行光化 学反应，但波长愈短其热效应愈小。 2 1 1 2 分子轨道与键能 一个化学键占有的分子轨道，是由这个分子中的原子占有的轨道重叠形成。当两 个原子轨道的重叠是沿着结合两个原子的原子核连线，它们的重叠所形成的就是。键 ( 或叫。轨道) ，o 键上的电子与分子结合得很紧密。若是两个原子轨道的重叠是垂 直于沿着两个原子核之间的连线时，就是7 【键。尢键相对。键是弱的相互作用。有些 分子会有一套7 c 轨道形成并覆盖在一系列的原子上，这种兀轨道就叫做非定域的兀轨 道，如共轭环状结构。 在分子轨道模型中，除了组成分子化学键的低能量分子轨道外，每一分子还与一 系列高能量分子轨道缔合，这些轨道在平常是未被占有的，叫做空轨道。当分子中的 电子获得足够能量时可提高到这些轨道，所以叫反键轨道，通常加+ 表示，l l p a * 与，t 等。 在共轭体系中，最高能量的6 或兀轨道与兀+ 之间的能级差是随共轭结构范围的加 大而减小的。因此可知，苯吸收的光波长在2 8 0m 附近，类葫萝卜素吸收的光波长 在4 5 0n m 附近，而一些卟啉化合物则吸收的光波长在6 0 0n l n 附近。 r 硕士学位论文 小鼠稀释血及肝癌与健康小鼠血清荧光谱的高斯法研究 在生物学中，含有碳原子和杂原子的兀共轭体系的离域化具有特别重要的作用， 它往往是决定生物分子在能量传递、吸收与发射中的重要因素。实际上与活体的基本 机能有关的生物分子几乎都由兀共轭体系组成。如细胞中三种基本的结构成份核酸、 蛋白质和高能磷酸物都是共轭分子；核酸中嘌呤和嘧啶碱基都是共轭杂环；蛋白质的 2 0 种氨基酸残基中四种芳香氨基酸残基都是共轭体系，它们在传递能量方面具有重要 作用。蛋白质中的肽链也是一个具有兀共轭作用的片断。此外，细胞色素的血红素辅 基、卟啉、苯醌、类胡萝卜素、视黄醛、黑色素等等都是共轭体系。可见生命的基本 表现和高度共轭体系之间存在有着密切的关系。 2 1 1 3 分子能级 一个分子的总能量等于其电子能级能量、振动能级能量和转动能级能量之和。后 三种能级对应的能量范围分别为：l 2 0e v ，0 0 5 - 1e v 和0 0 5 - 0 0 0 3 5e v 。由于转 动能级的能级及能级差很小，所以在考虑可见光和紫外光辐射时往往不需讨论转动能 级。分子和原子一样有其特征的分子能级图，因而也可产生具有特征的分子光谱。 每一分子的电子态都有一套振动能级，对于非线性分子，振动能级数是3 n 6 ，其 中刀是分子中的原子数。在生理温度下，多数分子与周围环境处于平衡状态，所以是 处于基态的最低振动能级。分子吸收光能后可处于电子和振动态的混合态，若跃迁达喀 到上一电子态中的许多振动能级，就形成宽谱带吸收光谱。在多数情况下，溶液中的 j 生物分子的吸收光谱是由没有多少“结构”的宽吸收带组成，这些无结构的吸收带是许 多重叠振动跃迁的包沿。 2 1 2 分子的激发态 分子吸收光能后可使其能量提高 的一种状态叫做激发态。分子能态与 分子的结构及分子的运动形式有密切 关系。研究分子激发态可以反映分子 ( 特别是大分子) 的构象特点及其变 化，也可了解光对生物损伤和失活的 详情及光生物的形成等。 表示分子的激发态可用势能曲 线，也可用能级，图2 1 给出了反映激 发态与激发态间进行能级跃迁而引起 一些光物理变化过程示意图。 图2 1 分子激发态的能级图及光物理过程 图中1 5 是内转换过程，6 是一种系间交叉 图中以s 表示单线态，t 表示三重态，下脚0 表示基态；下脚l 与2 分别表示最 低激发态与较高激发态。波折线表示内转换，向上的直线表示了吸收过程，而向下的 9 2 荧光光谱的基础理论硕j j 学位论文 直线代表了发光( 包括荧光与磷光) 过程，水平直线t l _ s o 则是系间交叉。 弛豫是从非平衡态向平衡态的转化。当分子处于激发态，由于有较高能量不稳定， 就要将多余能量释放，转入较低激发态或基态，这个过程也是弛豫或叫激发态的衰变 过程。激发态的弛豫主要有两种：一是辐射弛豫，该过程会发光：二是非辐射弛豫， 过程中不发光，多余能量以热能形式释放。 l 非辐射弛豫 非辐射弛豫又有内转换与系间窜跃两种。当分子吸收光子后从基态跃迁到激发 态。若从基态的零振动能级跃迁到最低激发态的零振动能级，称之为0 - 0 跃迁。而从 s o 激发到s l 的较高振动能级，就会发生弛豫振动，在1 0 - 1 4 l o 。2 秒内将振动能量释放 到周围介质中而到达s l 的零振动能级，这种弛豫过程称为内转换。 无辐射衰变的另一途径是向三重态的跃迁，即系间窜跃( 交叉) 。这时高能粒子将 其激发能无辐射地传递给相邻分子，或是把激发能用于某一化学反应，很多生物反应 都涉及一种或多种这样的过程。当分子激发到单线激发态而发射出的是磷光时，必然 有系间窜跃存在。 2 辐射弛豫 辐射弛豫包括荧光与磷光。已到达s 1 的零振动能级的分子返回到基态的不同振动 能级过程中，如果将能量以向外辐射光子的形式释放，此辐射弛豫就叫荧光，常发生 在l o 9 1 0 6 秒内。若分子从最低三重态向外发射一个光子并返回基态，该辐射弛豫 叫做磷光( 1 0 之1 0 z s ) 。 2 1 3 荧光光谱及其特点 任何发荧光的分子都具有两个特征光谱，荧光激发光谱( e x c i t a t i o ns p e c t r u m ) 和 荧光发射光谱( e m i s s i o ns p e c t r u m ) 。它们是荧光分析法进行定性和定量分析的基本参 数和依据1 5 8 , 5 9 , 6 0 1 。 2 1 3 1 荧光激发光谱 固定合适的发射波长与狭缝宽度，改变激发光的波长，测量荧光强度的变化。以 激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光物质的激发光谱。激发 光谱是不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。激发光谱的形状 与测量时选择的发射波长无关，但其相对强度则与所选择的发射波长有关。发射波长 固定在其峰位时，所得激发光谱强度最大。荧光测定中，通常把激发光谱中最大的峰 值波长选用激发样品，因为这可避免较短波长由于光子能量较大，而使样品产生光分 解。 l o 硕士学位论文小鼠稀释血及肝癌与健康小鼠皿清荧光谱的高斯法研究 2 1 3 2 荧光发射光谱 与激发光谱密切相关的是荧光光谱。保持激发光的波长和强度不变，然后扫描发 射波长，以荧光强度对照着荧光波长画成的曲线称为该物质的荧光光谱。即荧光光谱 是指某一激发波长引起物质发射不同波长荧光的相对强度。荧光光谱的形状与激发波 长的选择无关( 个别化合物例外) 。但当激发波长选在远离激发峰的地方，荧光强度 低。 2 1 3 3 荧光光谱特点 尽管几乎所有的物质都有吸收光谱，但不是所有的物质都发荧光。产生荧光必须 具备一定的条件：该物质分子必须与照射光有相同的本征频率，即能吸收激发光的光子 并从基态跃迁到激发态；该物质必须具有较高的荧光效率。照射光越强，被激发到激发 态的光子越多，产生的荧光越强，检测的灵敏度越高。 荧光光谱具有以下特点： 1 荧光发射光谱与激发波长无关，吸收谱可以有几个吸收带，荧光发射仅对应从 s l 的最低振动能级到s o 各振动能级的跃迁。 2 斯托克斯位移，因受激分子在上升和下降的过程中损失了一部分能量，所以荧 光的波长总比激发光的波长稍长。即相对吸收光谱和激发光谱，荧光光谱总是出现在 更长的波长处。激发峰位与荧光峰位间的波长差是一个表示分子发光特性的物理常 数，称为斯托克斯位移( s t o k e ss h i f t ) 。它表示分子回到基态前，在激发态寿命期间能 量的消耗。此位移常用2 1 式表示，单位是厘米。1 ( c m 1 ) 。 斯托克斯位移= l 叭石1 一亡) ( 2 1 ) 式中：k 和分别是校正后的最大激发波长和最大荧光波长，单位是纳米。 3 吸收光谱与发射光谱呈镜像对称关系。 当激发光只能将分子激发到第一激发态的各振动态时，吸收光谱的结构反映第一 激发态的各振动态的情况。当分子由该激发态向电子基态的各振动态跃迁发射荧光 时，荧光光谱结构反映它基态的各振动态跃迁概率。因此，镜像主要来源于基态中各 振动能级的分布与第一激发态的各振动态分布相类似和相互跃迁的几率也相近。 多原子分子特别是生物大分子具有很复杂的能级结构，能级的数目随分子中原子 数目的增加变得非常多，所以生物大分子的荧光光谱不再有线系的外观，因而这种镜 像关系也很难看到。 2 2 荧光光谱的主要参量 荧光分析能给出的信息与测量方式有关，可根据实验目的来选择。常用的一些基 2 荧光光谱的基础理论硕十学位论文 本参数有： 2 2 1 荧光强度与荧光量子产额 荧光强度是荧光分析的最基本参量，指在一定仪器条件下，所测得的荧光强弱。 它和光源强弱( 功率) 、激发与发射波长及单色器的缝宽，样品及其浓度，探测器的 灵敏度等有关。因此实际测得的荧光强度只是一个相对量，作图时，可用任意单位表 示。一般都用测得强度和标准样品在相同测量条件下，测得的强度之比来表示。 荧光量子产额( f l u o r e s e e n c eq u a n t u my i e l d ) 也称荧光效率或量子效率，它表示物 质发射荧光的本领，指发射光子数与吸收光子数的比值，是荧光测定的基本参数之一。 在大分子构象的研究中尤为重要。若用矽代表荧光量子产额，则有 缈：垄塾鍪堂! 墼：垄型垄三墼( 2 2 ) 口= 一= i z z l 激发态的分子数吸收光子数 式中：矽值与物质本身性质和溶剂有关，对于发强荧光分子，比如荧光素，其量 子产率在某些情况下将接近于1 ，而无明显荧光的化学物质其矽值则接近于零；同一 物质的矽还和激发波长有关，比如奎宁0 1 m o l l 硫酸溶液2 5 0 c 下，以3 1 3n n l 光激 发时的伊值为1 ，而以3 4 5n l l l 光激发时缈值为0 9 8 。此外，缈值还与温度有关，一般 温度高时，缈值下降，这种现象称为温度猝灭( t e m p e r a t u r eq u e n c h i n g ) 。 根据l a m b e r t b e e r 定律，吸收前后的光强( 光子数) 为易与厶则 i = 1 0 1 0 一留o( 2 3 ) 式中：为摩尔消光系数；c 为样品浓度；，为光程；e c l 称为光密度。 被吸收光子数l 为 l = 厶一，( 1 一1 0 一贸) ( 2 4 ) 所以，荧光强度f ( 用光子数表示) 应为 f = 九( 1 一1 0 一例) ( 2 5 ) 荧光量子产额与荧光强度是两个不同的概念，够指发光效率，是一个百分数，而 f 则是发光物质所发射的光子数。 当浓度小时，1 0 一留，1 2 3 a c l ，由上式可得 f = 2 3 舛。贸，( 2 6 ) 上式表示f 与c 成正比。但在浓度逐渐增大时，增长减慢，最后达到饱和值。 实际上，由于存在浓度猝灭现象，当浓度达到某一值再继续增大时，荧光强度反而降 低。因此用荧光强度测某物质浓度时，必须利用f 与c 成正比的浓度范围。 2 2 2 峰位和谱带宽度 峰位指激发峰或发射峰的波长，常用符号a 一表示。谱带宽度通常用“半宽”表示。 即峰的强度值一半时，其横坐标上的波长宽度。表示谱带宽度的方法还有多种，如用 1 2 硕士学位论文小鼠稀释血及肝癌与健康小鼠血清荧光谱的高斯法研究 光谱的有效面积除以峰值高度等。 2 2 3荧光寿命 荧光寿命( 1 i f et i m e ) 又l l q 荧光的期间，即处于激发态的时间。它也是荧光特性中 的一个重要参量。它不仅在荧光动力学的计算中很重要，而且还能提供其它许多信息， 如二聚体与激发络合物的形成，能量转移和分子内基团与