（化学工程专业论文）酒石酸长春瑞滨相关杂质研究.pdf

摘要 长春瑞滨( v i n o r e l b i n e ，n a v e l b i n e ) 是由p i e r r ef a b r e 公司开发的新型的半合 成的长春碱类抗痛药。在原料的制备、产品的合成和保存等过程中均不同程度 地带入一些杂质，控制杂质的生成或采取措施予以除去是药品质量最为重要的 一环。本研究以酒石酸长春瑞滨相关杂质及其降解杂质为研究对象。通过建立 高效液相与电喷雾质谱联用分析方法。色谱柱v p o d s l 5 0 t 4 6 r a m ，流动相为 0 0 5 m 甲酸铵p h 4 2 缓冲液一甲醇( 4 7 ：5 3 ) ，流速1 5 m l m i n ，检测波长2 6 7 n m ， 柱温3 5 。c ，质谱离子肼e s i m s m s 在线检测。结果表明，建立的l c - m s 测定 相关物质方法简便，重现性好，为评价酒石酸长春瑞滨质量提供了依据。 酒石酸长春瑞滨原料药中4 个未知杂质由制备分离后，由n m r 确定了结 构，分别为2 1 o 去甲基长春瑞滨、2 3 0 去甲基长春瑞滨、6 n 甲基长春瑞滨、 1 7 b r 代长春瑞滨。 酒石酸长瑞滨影响因素试验分别对样品进行了光、热、湿、酸、碱、氧化、 还原降解。实验表明样品在光条件下非常不稳定，热条件下降解明显。光降解 产物主要有光降解杂质、2 3 0 去甲基长春瑞滨；2 1 一0 去甲基长春瑞滨、6 _ n 甲基长春瑞滨则为热降解杂质；而酸、碱降解只产生一个明显的杂质，结构推 测为4 - 0 去乙酰基长春瑞滨；1 7 溴代长春瑞滨则为工艺中副产物。通过影响因 素试验分析了样品中相关杂质产生可能条件，为工艺控制及样品保存等质量控 制提供了必要的理论依据。 a bs t r a c t v i n o r e l b i n e b i t a r t r a t e ，d e v e l o p e db y p i e r r e f a b r e ，i s a u n i q u e s e m i 。s y n t h e t i cv i n c aa l k a l o i da n t i t u m o r s o m er e l a t i v ei m p u r i t i e sc r e a t e dd u r i n gr a w m a t e r i a lp r e p a r a t i o n 、s a m p l ep r o d u c t i o na n ds t o r a g e i ti sc o m p u l s o r yt ot a k es o m e m e a s u r et oc o n t r o lo re l i m i n a t et h e s ei m p u r i t i e s am e t h o do fh i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dw i t he l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r yw a s d e v e l o p e d t o s e p a r a t e a n d i d e n t i f ys a m p l er e l a t i v ei m p u r i t i e so rd e g r a d a t i o n i m p u r i t i e s t h ea n a l y t i c a l h p l cw a sc a r r i e do u to nav p o d sc o l u m n ( 15 0 4 6 m m ) u s i n g 0 0 5 ma m m o n i u mf o r m i c a t e b u f f e r ( p h 4 2 ) a n d m e t h a n o l ( 4 7 ：5 3 ) a sm o b i l ep h a s ea ta f l o wr a t eo f1 5 m l m i n 、t e m p e r a t u r e3 5 * ca n d w a v e l e n g t h2 6 7 n m t h eo n - l i n em a s ss p e c t r o m e t r yw a sp e r f o r m e du s i n gi o nt r a p a n a l y z e rw i t he s is o u r c e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h el c - m sm e t h o dw a ss i m p l ya n d g o o dr e p e t i t i o n f o u ru n k n o w ni m p u r i t i e sw e r ec o l l e c t e da n di d e n t i f i e db yn m r t h ef o u r u n k n o w n i m p u r i t i e s w e r e r e s p e c t i v e l y2 1 - o - d e m t h y l v i n o r e l b i n e 、 2 3 一o - d e m t h y l v i n o r e l b i n e 、6 - n m t h y l v i n o r e l b i n e 、17 - b r o m o v i n o r e l b i n e t h es a m p l ei m p r e s sf a c t o rt e s t i n gw a sp e r f o r m e du n d e rl i g h t 、h e a t 、h u m i d i t y 、 a c i d i t y 、a l k a l i n e 、o x i d a t i o n 、r e d u c t i o n t h es a m p l ew a sv e r yu n s t e a d yd u r i n gl i g h t e x p e r i m e n t a n dt h e m a i n l yi m p u r i t i e s w e r e p h o t o d e g r a d a t i o n a n d 2 3 - o d e m t h y l v i n o r e l b i n e t h es a m p l ew a su n s t e a d yd u r i n gh e a te x p e r i m e n ta n dt h e m a i n l yi m p u r i t i e s w e r e2 1 o d e m t h y l v i n o r e l b i n e 、6 - n m t h y l v i n o r e l b i n e t h e o n l yd e g r a d a t i o np r o d u c tu n d e rt h ea c i d i t yo ra l k a l i n ec o n d i t i o nw a ss p e c u l a t e da s 4 一o - d e a c e t y l v i n o r e l b i n e a l lt h i s d a t ao f f e r e dt h e t h e o r yb a s i so fc o n t r o lt h e p r o d u c t i o na n ds t o r ec o n d i t i o no f t h es a m p l e 塑坚查兰翌主兰生堡皇：烫查墼量童型塞塑茎銎垦旦茎 第一章文献综述 1 1 酒石酸长春瑞滨概述 长春碱类药物是目前最常用的抑制细胞分裂抗癌药之一。二十世纪六十年代开发 了长春碱( v i n b l a s t i n e ，1 - 1 ) ，长春新碱( v i n c r i s t i n e ，1 - 2 ) ，这两种药物直接从长春花 叶予中提取，但因长春花植物中长春碱含量仅为o 0 0 5 ，所以得到这两种药物数量非 常有限b , 3 1 。至1 9 7 5 年p o t i e r ，p 等通过生物模仿连接长春质碱( c a t h a r a n t h i n en o x i d e ) 与长春文朵灵环( v i n d o l i n e ) 首次批量合成了脱水长春碱( a n h y d r o v i n b l a s t i n e ，1 3 ) 。 脱水长春碱再与n b r o m o s u c c i n i m i d e ( n b s ) 、a g b f 4 缩环得到了长春瑞滨“。 3 0 多年来，由天然植物得到的长春碱分别在v i n d o l i n e 、c a t h a r a n t h i n e 两部分进行 了结构改造，相继合成一系列衍生物，并进行了广泛的化学和药理研究，只有少数进入 临床试验阶段 7 1 。目前世界上只有二种药物被广泛应用，长春地辛( v i n d e s i n e ，1 - 4 ) 由e l i f l l yl a b o r a t o r i e s 于1 9 8 3 年开发，长春瑞滨( v i n o r e l b i n e ，1 5 ) 由p i e r r ef a b r e l a b o r a t o r i e s 于1 9 8 9 开发【3 】。 近年来，f a h ye ta 1 强酸条件下从长春瑞滨( v i n o r e l b i n e ) 合成了长春氟宁( v i n f l u n i n e ， 1 6 ) ，它与长春瑞滨区别在于c 1 9 位上由两个氟原予取代了两个氢原子1 9 1 。长春氟宁 在鼠和人体内抗肿瘤作用强于长春瑞滨，百时美施贵宝公司和p i e r r ef a b r e 公司共同研 发的长春氟宁处于三期临床阶段 1 0 , 1 1 i 。 表1 - 1 长春碱类抗肿瘤药物的结构 h 3 化合物 r 1r 2r 3r 4r 5r 6 ”n 2 ) 1 1c 1 3o h0 c h 3o c o c h 3c h 2 c h 3o hl l 一2c h oo ho c h 30 c o c h 3c h 2 c h 3o h1 1 3c h 3o ho c h 3o c o c h 3c h 2 c h 3i 1 4c h 3o hn h 2o hc h 2 c h 3o h1 i - 5c h 30 ho c h 3o c o c h 3c h 2 c h 3o 1 6c h 3o h0 c h 3o c o c h 3c f 2 c h 30 注：”“= ”表示c 3 ，和c - 4 ，间的双键；2 n = 0 表示此处的碳原子被脱去 浙江大学硕士学位论文：酒石酸长春瑞滨相- 芙杂质研究 长春碱类药物的结构修饰在长春质碱环上的c 环和d 环上适当修饰可表现明显的 抗肿瘤活性，1 5 和1 - 6 是典型代表。文朵灵环上修饰主要集中在g 环，大多数c 一3 酰 胺和c 3 联胺衍生物具有药理活性。f 环上的n 1 位是一个新的活性修饰中心，1 1 与 1 2 的结构在n 1 位存在细微不同，但其药理药效差异很大i l “。 研究表明长春碱类药物可干扰细胞周期有有丝分裂阶段( m 期) ，从而抑制细胞的 分裂各和增殖。其细胞毒性是通过与微管蛋白的结合实现的，它们在微管蛋白二聚体上 有共同的结合位点，可抑制微管聚合，妨碍纺锤体微管的形成，从而使分裂于中期停止， 阻止痛细胞的分裂增殖，长春碱类药物作用机理的差别取决于个体分子与细胞微管的精 确的相互作用【1 3 l 。 长春瑞滨由长春碱半合成而来，在长春花碱环上进行了化学修饰，将九元环变为八 元环，导致了本品具有更强亲脂性、更高组织保持力，使其适用范围、毒性与临床应用 的长春碱、长春新碱等不同”“。长春瑞滨抗癌活性高，抗瘤谱广，经国外临床研究，单 药或联合用药治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、恶性淋巴瘤等，己显示突出的疗效。 它对有丝分裂微小管的作用和长春花碱、长春新碱相似，但对神经轴索微小管的作用较 长春新碱和长春花碱弱，因而其抗肿瘤作用强，而与轴索微小管改变有关的神经毒性较 低u 5 , j s 】。研究表明，长春碱类1 7 一位反式结构将导致抗癌活性的降低1 9 】。 本品的代谢属二室或三室模型，初始血药浓度峰衰退快而消除速率相当慢。本品的 主要毒性为骨髓抑制，常见的神经性毒性有便秘和深部腱反射减少，本品能引起轻至中 度的脱发，其程度取定于用药时间的长短。此外，尚有引起肝酶值短暂升高的报道。大 剂量快速注射或外周静脉血管输注时间过长可引起脱皮和皮肤坏死“。1 。 我国长春花类植物主要生长于海南和两广，为一种芳香植物。其中“诺维本”的原 料药长春碱大部分从海南收购。目前，海南有4 家企业从事与长春花开发有关的项目， 但大多数只是种植及对长春碱进行粗提，手中并没有掌握专利技术。海南海梁生物公司 已掌握了长春碱及生物合成的系列重要技术，打破了国外技术垄断”“。海正药业利用 威尔斯迈尔试剂，即氯甲叉二甲基氯化铵使长春碱脱水反应得到脱水长春碱，并合成了 长春瑞滨，总收率由原来的2 0 提高到3 0 ，并申清了专利c n1 5 5 2 7 1 5 、c n l 5 5 2 7 1 6 ”“。 国内市场上原本销售的长春瑞滨主要从法国进口。近几年，国内企业也申请了多种 长春瑞滨剂型专利。杭州华卫制药技术有限公司申请的长春瑞滨粉针剂及制备方法专利 c n l 4 1 6 8 1 4 ，c n l 4 3 7 9 4 2 ”。2 “；海口龙南医药科技开发有限公司申请的长春瑞滨大输液制 浙江大学硕士学位论文：酒石酸长春瑞滨相关杂质研究 剂及制各方法专利c n l5 5 5 8 0 0 0 。 癌症仍然是人类难对付的顽症之一，我国肿瘤引起的死亡率在所有病因中居第2 位， 且发病率呈上升趋势。世界卫生组织2 0 0 1 年报道，世界癌症发病率和死亡率比1 9 9 0 年 上升了2 2 ，今后2 0 年还将上升大约5 0 。药物治疗作为癌症治疗的主要手段之一， 近年来进展迅速。长春瑞滨作为治疗非小细胞肺癌的首选药物，有着巨大的市场潜力。 长春瑞滨的四个氮原子中有两个显碱性，可与适当的酸成盐。酒石酸长春瑞滨易溶 于水、醇，不溶于正己烷，为白色或近似白色粉末，需密封、避光、冷冻保存1 2 矾。 酒石酸长春瑞滨结构式 一：c 甏：一 酒石酸长春瑞滨英文名：v i n o r e l b i n et a r t r a t e 商品名：诺维本( 进口) ；盖诺( 国产) 分子式：c ；。i k n 。0 。2 c 。h b 0 6 分子量1 0 7 9 1 1 c a s ： 1 2 5 3 17 - 3 9 7 化学名：c 一新长春碱，3 ，4 一二去氢一4 去氧一， r 一( r ，r ) 卜2 ，3 双羟丁二二 酸( 1 ：2 ) 盐。或3 ，4 二去氢一4 去氧一8 一新长春碱l 一( + ) 一酒石酸( 1 ：2 ) 盐。 1 2 酒石酸长春瑞滨的合成 1 2 1 脱水长春碱可由酶法、化学法及半合成等方法合成。 1 2 1 1 酶法合成 适量盐酸长春质碱、文朵灵、过氧化物酶( 如f m n ) 及少量的h 2 0 2 、m n c l 2 溶于 t r i s h c l 缓冲液中( 1 0 0 m m o v l ，p h 6 8 ) 中，3 0 。c 反应1 h 后用氨水调至p h 9 5 ，再加 入过量n a b h 4 还原即可得脱水 乏春碱，最高收率4 9 5 2 7 】。 h 3 coch 3 f mnf h2 02 mn c i 2 n h 3h 2 0p h9 5 o c h a t m hc | n a b h 4 3 浙江大学硕士学位论文：酒石酸长春瑞滨相笑杂质研究 1 2 1 2 化学法合成 长春质碱( 硫酸盐) 、文朵灵( 盐酸盐) 、适当浓度的f e c l 3 溶于p h l 4 的盐酸中， 4 “c 反应3 h 后用过量的n a b h 4 终止反应，用氨水碱化、己酸乙酯萃取，处理后得到脱 水长春碱，最高收率6 8 6 f 2 8 1 。 f e c t 3 1 8 + 1 9 + h c ip h l 。4 n a b h 4 n h 3 h 2 0p h 9 5 1 2 1 3半合成 n 2 保护下将长春碱溶于无水d m f ，冰浴冷却下1 0 m i n 内滴入氯化亚砜的d m f 溶 液，室温搅拌反应5 - 9 h 后加入冰水，用氨水调节p h 至9 。经乙醚提取、无水m g s 0 4 干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，残留物加入甲醇，n 2 保护下4 0 c ) 3 1 ：1 热溶解，4 1 2 析晶， 过滤得脱水长春碱，收率为5 2 7 1 2 4 1 。 n 2 s o c t 2c h 3 0 c h 3 1 1 + d m f n h 3 h 2 0 p h 9 。o m g s o 1 2 2 长春瑞滨一般由脱水长春碱制备，文献方法主要有三种。 1 2 2 1 脱水长春碱经邻氯过氧苯甲酸氧化，得n 氧化物，然后用三氟乙酸酐处理开环， 接着在水存在下重排而得 2 9 , 3 0 j 。 1 2 2 2 脱水长春碱经n 一氯代 氟硼银处理缩环得至1 1 1 3 1 , 3 2 。 c l 1 _ 3 c h 2 c l , 。撬吼罨 强等，。 1 2 2 3 脱水长春碱经溴代琥珀酰亚胺( n b s ) 在一7 8 处理得一9 一位溴代物，然后用必氟 浙江大学硕士学位论文：酒石酸长春瑞滨相关杂质研究 硼银处理而得p 列。 n b s 1 - - 3 7 8 比较而言，1 2 2 1 法收率较低，1 2 2 2 法和1 2 , 2 3 法反应机理相同 l 3 酒石酸长春瑞滨分析方法概述 长春碱类药物分析在药物动力学研究方面有大量报道，检测长春瑞滨及其代谢物在 人体或鼠体液中，包括血液、血浆、血清、尿液分布及代谢情况。 0 v a nt e l l i n g e n 。4 1 等用j 下相柱离子交换色谱法再由荧光检测生化体液中长春瑞 滨含量。检测限1 5 i tg l ，尿液中1 0 一5 0 | ll 、血清中5 0 0 ul 可重复回收。 c m o u c h a r d d e l m a s 1 等通过反相o d s 柱加离予对试剂由库伦电位检测兔血降中 长春瑞滨及代谢物含量。流动相p h 3 0 磷酸缓冲液一乙腈一甲醇( 5 0 ：3 0 ：2 0 ) ，血浆中 检测限l n g m l ，线性范围为2 5 5 0 或5 0 一1 0 0 0 n g m l s r a g o t 。”等液相一电喷雾质谱联用检测人体血清中长春瑞滨及代谢物含量，长 春瑞滨定量限达0 5 n g m l ，线性范围至1 0 0 0 n g m l ，回收率达8 0 。 j c v a nh e u g e n ”1 等用液相一串联质谱联用对人体液中长春瑞滨及代谢物进行临 床分析，使用c y a n o 柱子及m i c f o f f i a s so u a t t r o 检测系统，长春瑞滨检测限为2 5 0 p g m l ， 线性范围长春瑞滨至2 0 0 n g m l ，其他代谢物为5 0 n g m l 。 l a e t i t i ab a r t h e 汹1 等用无水毛细管电泳在1 0 分钟内将各1 1 种长春碱类组分完 全分离，方法中毛细管长度为3 8 c m ，缓冲液为5 0 m m 乙酸铵、o 6 m 乙酸在甲醇乙腈 ( 7 5 2 5 ) 混合液中，愠定电压2 5 k v ，压力3 4 4 7 1 0 3 p a ，并在专一性、线性、检测限、 定量限、准确度与高效液相得以比较。无水毛细管电泳在分析时问、分离度方面比高效 液相显现很大的优越性，并且可与质谱仪匹配联用，适用于生物体液分离检测。 以上分离定量方法适用于微量检测，而长春瑞滨制剂及原料药检测则更多采用高效 薄层色谱、高效液相色谱、无水滴定等方法。 a p a c i ”1 等将4 种化合物( v c r 、n v b 、v l b 、v d s ) 在硅胶板上使用自动带状点 样，并在二氯甲烷甲醇( 9 3 7 ) 系统下展开，再通过荧光检测，该方法比液相快速、 便宜。 浙江凡学硕士学位论文：酒石酸长春瑞滨相关杂质研究 硼银处理而得o ”。 7 8 比较而- 5 ，1 2 2 1 法收率较低，1 2 2 2 法和1 2 2 3 法反应机理相同 1 3 洒石酸k 春瑞滨分析方法概述 长春碱类药物分析在药物动力学研究方面有大量报道，检测长春瑞滨及其代谢物在 人体或鼠体液中，包括血液、血浆、f i l 清、尿液分布及代谢情况。 0 v a nt c 、l li n g e n ”等用正相柱离子交换色谱法再由荧光检测生化体液中长春瑞 滨含量。检测限l5ug l ，尿液中1 05 0 p l 、血清中5 0 0 u l 可重复回收。 c m o u c h a r d _ d e l m a s 。”等通过反相o d s 杜加离子对试剂由庠伦电位检测兔| 丌降中 长春瑞滨及代谢物含量。流动相p h 3 0 磷酸缓冲液一乙腈一甲醇( 5 0 ：3 0 ：2 0 ) ，血浆中 检测限l n g m l ，线性范围为2 5 5 0 或5 0 一1 0 0 0 n g r r l l s r a g o t 。”等液相一电喷雾质谱联用检测人体血清中长春瑞滨及代谢物含量，长 春瑞滨定量限达0 a n g m l ，线性范围军1 0 0 0 r i g m l ，回收率达8 0 。 j c v a nh e u g e n ”等用液相串联质谱联用对人体液巾长春瑞滨及代谢物进行临 床分析，使用c y a n o 柱子及m ic r o m a s sq u a t z r o 检测系统，长春瑞滨检测限为2 5 0 p g m l ， 线性范围长春瑞滨至2 0 0 n g m l ，其他代谢物为5 0 n g m l 。 l a e t i t i ab a r t h e “1 等用无水毛细管电泳在1 0 分钟内将各1 i 种k | 春碱类组分完 全分离，方法中毛细管长度为3 8 c m ，缓冲液为5 0 l m 乙酸铵、0 6 m 乙酸在甲醇乙腈 ( 7 5 2 5 ) 混合液中，愠定电压2 5 k v ，压力3 4 4 7 , 1 0 3 p a ，并在专一性、线性、检测限、 定量限、准确度与高效液相得以比较。无水毛细管电泳在分析时问、分离度方面比商效 液相显现很大的优越性，并且可与质谱仪匹配联用，适用于生物体液分离检测。 以上分离定量方法适刚于微量检测，而长春瑞滨制剂及原料药检测则更多采用高效 薄层色谱、高效液相色谱、无水滴定等方法。 a p a c i 。1 等将4 种化合物( v c r 、n v b 、v l b 、v d s ) 在硅胶板上使用自动带状点 样，并在二氯甲烷甲醇( 9 3 7 ) 系统下展开，冉通过荧光检测，该方法比液相快速、 样，并在一氯甲烷甲醇( 9 3 7 ) 系统下展丌，再通过荧光检测，该方法比液相快速、 便宜。 5 祈江大学硕士学位论文：酒石酸长春瑞滨辅关杂质研究 浙江省药品检验所陈瑜”等用i t p l c 方法测定酒石酸长春瑞滨含量，色谱柱( c n 柱z o r b a xs b c n4 6 m m * 2 5 0 m m ) 流动相( 乙腈0 0 5 0 1 5 m 0 1 1 磷酸盐缓冲液= 1 2 磷 酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钾适量，加水至8 0 0 m l ，溶解后加三乙胺2 m l 混匀，用磷酸 调p h 至3 0 - 4 0 ，加水至1 0 0 0 m 1 ) ，流速为1 o m t m i n ，检测波长为2 6 8 n m ，线性范围 为0 2 - 1 o 肛g m l 。 欧州药典( e p ) “”中相关物质检测方法。 色谱柱( 1 5 0 m m * 3 9 m mo d s5 9 m 表面积1 2 5 m 2 g ，孑l 径3 0 n m ，碳装载量7 ) ，柱温 3 5 ，流动相( 溶解1 2 2 9 癸烷磺酸钠溶于6 2 0 m l 甲醇中，加3 8 0 m l 缓冲液一7 8 0 0 5 9 1 磷酸二氢钠用稀磷酸调p h 至4 2 ) ，流速1 o m l m i n ，检测波长2 6 7 n m ，进样量2 0 u 1 1 4 酒石酸长春瑞滨相关杂质研究概述 1 4 】k a z u oy a m a g u c h i “2 。等研究酒石酸长春瑞滨在高湿条件下( 4 0 。c 相对湿度7 5 保 存7 天) 降解产物，通过f r i t f a bl c m s 技术定位分离，由n m r 确认其结构，得到3 种主要降解产物。其中液相系统柱子d e v e o s i lo d sh g 一51 5 0 r i o n * 4 6 i i h t i ，液动相为5 0 m m 乙酸铵甲醇( 1 1 ) 中含1 的甘油，波长2 6 7 n m ：质谱系统中f r i t f a b 接口( m s f f ， j e o l ) 连接质谱仪( j m ss x 0 2 ，j e o l ) ，氙气加速电压为5 k v ，离子加速电压8 k v ；n m r ( a m x - 4 0 0 ，9 4 t ，1 h ：4 0 0 j v l h z ”c ：1 0 0 6 e t z ，b r u k e r ，k a r s r u h e ，g e r m a n y ) 。3 种主 要降解产物结构式如下： h ， v ch o ch3 1 4 。2e p 方法中酒石酸长春瑞滨原料药相关杂质控制： 光降解杂质4 0 3 ，其余单个杂质4 0 2 ，除光降解杂质总杂质4 0 7 。 其中a 为3 ，4 ，7 ，8 - t e t r a d e h y d r o 一3 ，4 一d i d e o x y 一3 ，6 - e p o x y 6 ， 7 - d i h y d r o c n o r v i n c a l e u k o b l a s t i n e ( 光降解杂质) ，b 为4 - 0 去乙酰基长春瑞滨，c 为 1 7 表长春瑞滨，d 为6 一n 一氧长春瑞滨，e 为l e u r o s i n e ，f 为6 一n 一甲基长春瑞滨， 浙江大学碗十学位论文：洒石酸长春瑞滨相关杂质研究 g 为c n o r l e u r o s i n e ，i i 为2 3 0 去甲基长春瑞滨，i 为1 7 一b r 长春瑞滨，j 为3 ，4 一 脱水长春碱。 综上所述，本研究采用的基本研究思路如。f ： ( 1 ) 建立适当的h p l c m s 分析方法，对样品相关杂质分离、m s 及m s m s 分析 ( 2 ) 对酒石酸长春瑞滨的相关杂质进行提取分离和结构鉴定。 ( 3 ) 对酒石酸长春瑞滨进行影响因素试验，分析样品在热、光、湿、酸、碱等条件_ f 的降 解趋势及其杂质，分析降解杂质与成品中相关杂质的相关性。 7 浙江大学硕士学位论文：酒石酸长春瑞滨相关杂质研究 第二章酒石酸长春瑞滨液质联用方法建立 2 1 引言 任何影响药品纯度的物质称为杂质。药品质量标准中的杂质是系在按照国家有关药 品监督管理部门依法审批批准的规定工艺和规定原辅料生产的药品中，由其生产工艺或 原辅料带入的杂质，或经稳定性试验确证的在贮存过程中产生的降解产物。药品杂质按 其来源分为：相关杂质( 包括化学反应前体、中间体、副产物和降解产物等) 、其他杂 质和外来杂质。参考中国药典和i c h ( 人用药品注册技术要求国际协调会) q 3 a ，应对 在合成、纯化和贮存中实际存在的杂质和潜在的杂质，应采用有效的分离方法进行检测。 对于表现含量在o 1 及其以上的杂质以及表现含量在o 1 以f 的具有强烈生物作用的 杂质或毒性杂质，予以定性或确证结构 4 3 , 4 4 1 。 虽酒石酸长春瑞滨安全性已得到验证，但不同研发单位所用的原辅料不同，所采用 的制备路线、制备工艺不同，所引入的杂质不同。因此，有必要对其杂质重新进行研究。 本文利用l c e s i m s 从酒石酸长春瑞滨原料药中分离出7 个组份，再与e s i m s m s 偶 合，得到其加合离子和特征子离子，推测其相应结构。 2 2 实验方法 2 2 1 试剂、样品来源 甲醇色谱纯 甲酸( 分析纯) 甲酸铵( 分析纯) 超纯水：m j1 1 iq( 1 8 2 m q ，2 5 。c ) 酒石酸长春瑞滨样品 2 2 2 高效液相( 分析) m e r c kk g a a 上海新高化学试剂有限公司 上海化学试剂公司 海正本厂生产 a g i l e n t1 1 0 0 系统：包括g 1 3 2 2 a 在线脱气机、g 1 3 1 2 a 二元泵、g 1 3 1 4 a 可变波长检 测器、g 1 3 1 3 a 自动进样器、6 1 3 1 6 a 柱温箱， v p - o d s 反相柱( 1 5 0 4 6 m m ，5 p m ) ，柱温3 5 。c ，波长2 6 7 n m ，进样量2 0 p l ，流动相 a ：0 0 5 m 醋酸铵，用醋酸调p h 至4 2 ，流动b ：甲醇，流动相a b 为4 7 5 3 ， 样品配制：称取3 5 m g 样品至2 5 m l 容量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度。 2 2 ，3 质谱系统 f i n n i g a nl c qa d v a n t a g e 离子肼质谱仪，离子源e s i ，电喷雾电压5 0 k v ，毛细管 浙江大学硕士学位论文：酒石酸长春瑞滨相关杂质研究 温度2 2 0 。c ，氮气喷雾气流速5 0 ，辅助气流速为1 0 ，m s m s 参数优化倾斜能量为3 0 。 2 3 实验结果 2 3 1 色谱系统评价 2 3 i 1 专属性 酒石酸长春瑞滨原料药( 海正批号0 4 0 2 0 1 ) 置于称量瓶中，摊成厚度5 m m 的薄层， 放w d a 药物稳定性检查仪( 天津药典标准仪器厂) ，照度为4 5 0 0 x i 5 0 0 i x 条件下，放 置1 0 天，得光降解杂质长春瑞滨保留时间1 2 4 6m i n ，光降解杂质1 0 8 5m i n ，两者分离 度为2 5 ，柱效4 5 8 0 ，拖尾因子1 0 8 2 3 1 2 线性范围及检测限 精密称取酒石酸长春瑞滨对照品5 0 、1 5 1 、2 5 0 、3 5 2 、4 5 o m g ，置2 5 m l 容量瓶 中加流动相定容，摇匀。每个样品进样3 次，i i ! l 录主峰平均峰面积分别为2 2 3 0 4 5 6 3 、 6 8 9 8 3 0 3 1 、1 1 2 6 7 4 3 3 2 、1 5 9 6 0 4 9 3 6 、2 0 3 3 1 0 3 1 8 ，以峰面积( a ) 对浓度( c ) 线性回归， 得同归方程为a - i * 1 0 8 c + 5 5 3 1 4 ，r = l 。说明在0 2 1 8 m g m l 浓度范围内，线性关系良好。 在卜- 述色谱条件下，酒石酸长春瑞滨的检测限为0 1 5 d g m l ( s n = 3 ) 。 2 3 1 3 精密度和稳定性 取浓度为1 4 m g m l 的酒石酸长春瑞滨样品溶液，连续进样6 次，测得酒石酸长春瑞 滨峰面积的r s d 为0 1 1 。 取浓度为1 4 m g m l 的酒石酸长春瑞滨样品溶液，每隔4 h 进样一次，连续测定2 4 h ， 得峰面积的r s d 为0 3 0 ( n = 6 ) ，表明溶液在2 4 h 内稳定。 取酒石酸长春瑞滨( 批号0 4 0 2 0 1 ) ，共5 份，依法测定，得有关物质含量0 5 4 、0 5 3 、 0 5 5 、0 5 4 、0 5 5 ，r s d 为2 7 1 ( n = 5 ) 。 2 3 2 杂质分离 一撩 。i ；lj ； 二一一* ! 一二2 一j | 一一 = 鬯 j 一1 1 等一一x 巧：j r ，- 一一 ”1 j1 一 图2 - 10 4 0 2 0 1 批酒石酸长春瑞滨h p l c 图 样品分离得7 个峰，峰】为洒石酸，峰5 为光降解产物( 光降解实验见第四章) ， 雪雪窝嗣酒鼍 浙江大学硕十学位论文：洒石酸长春瑞滨相关杂质研究 样品中有4 个未知组份。 表2 - 1 长春瑞滨l c m s 信息 峰标记保留时间相对保留 a r e a分子离子 ( r a i n ) 时间( r a i n ) ( 归一化)( e s i 正信号) 酒石酸 1 1 70 0 9o 0 5 1 4 9 ( 负信号) 相关杂质1 3 1 00 2 5o 0 97 6 5 相关杂质2 6 1 9o 5 00 0 77 6 5 相关杂质38 5 8 0 6 90 1 07 9 3 光降解产物 1 0 7 5o 8 6o 1 57 7 7 长春瑞滨 1 2 。4 6】o9 9 4 67 7 9 相关杂质4 2 5 0 32 00 0 98 5 7 8 5 9 2 3 3m s m s 裂解分析 rt i i im7 7 0 3 口0 口【1 0ou 0 1 1 ：i e 5 j 图2 - 2 长春瑞滨e s i m s m s 在e s i 源中，分子离子为偶电子离子，偶电子离子裂解优先形成一个新的偶电子离 了和中性碎片“。 2 1 一0 去甲基长春瑞滨m + h + 7 6 5 二级碎片主要有z 7 2 l ，相对丰度为1 0 0 ，4 4 中 性丢失推测为2 l 位上一c o o h 脱掉一分子c 0 2 所得。 1 8 、6 0 为小分子中性丢失，1 8 应是3 一o h 与4 一h 结合失去一分子水形成双键所得， 光降解杂质应没有少1 8 的中性丢失；6 0 可能为1 7 位与1 形成双键失去一分子 h c o o c h 3 ，除2 1 一0 去甲基长春瑞滨都有少6 0 碎片。 1 6 2 推测包括4 位上酯键断裂( 少4 2 ) 与1 7 、3 位上失去二分子的h c o o c h 3 所得； 2 3 0 去甲基长春瑞滨和酸碱降解产物应没有1 6 2 的中性丢失。 1 2 1 为奇数中性丢失，应含有奇数个n 元素的中性碎片。假设只含c 、h 、n 二元素， 1 2 1 只有c 8 h ii n 一种组合：同理推测不存有含c 、h 、0 、n 的含奇数个一n 元素的1 2 1 中 性碎片组合。由碎片和分子特征可推测1 2 1 是c a t h a r a n t h i n e 中含n 的7 元环部分断裂， 1 0 m帖“们 rejj，i 浙江大学硕士学位论文：酒石酸长春瑞滨相关杂质研究 脱掉苯并吡咯环( c 8 h 7 n1 1 7 ) ，其余部分重排失去4 个h 得到多二个双键的共轭体系； 除6 一n 甲基长春瑞滨分子中一n 上的甲基取代空间位阻影响了共轭体系的形成外，其余 组份都有此断裂，长春瑞滨e s i - m s - m s 裂解规律推测如图23 。 图2 - 3 长春瑞滨e s i - m s m s 裂解规律推测 浙江大学硕士学位论文：酒石酸长春瑞滨相关杂质研究 表2 - 2 长春瑞滨及相关杂质e s i m sm s 长春瑞滨2 3 0 去甲基6 一n 甲基长光降产物 1 7 一b r 代长酸碱降解 长春瑞滨春瑞滨春瑞滨杂质 m + h +7 7 97 6 57 9 37 7 7 8 5 77 3 7 m + h 0 1 87 6 17 4 77 7 58 3 97 1 9 m + h f - 6 07 1 97 0 57 3 37 1 77 9 76 7 7 m + h + 1 2 1 6 5 86 4 46 5 67 3 66 1 6 卅h + 一1 6 2 6 1 76 3 l6 9 5 v jn d o l i l i e4 5 7 4 4 34 5 74 5 55 3 5 4 1 5 c a t h r a n t h i t i e3 2 3 3 2 33 3 73 2 33 2 33 2 3 4 酸碱降解实验见4 ，6 4 7 2 4 实验过程 l c m s 联用技术，将高分离能力、使用范围广的分离技术与高灵敏、专属及通用的 质谱法结合起来，成为一种强有力的分离分析工具。诸多因素影响l c m s 样品信号：样 品的p k a ，、去溶剂时干燥气体温度与流速，溶剂的性质、p h 、流速及i t p l c 柱子内径等。 将现有的1 1 p l c 方法用于l c m s 应注意，非挥发性的缓冲剂需用挥发性的缓冲剂代替， 且离子强度是个重要参数“”。 2 4 1 流动相p h 的选择 分别配制p h 4 0 、6 0 、8 0 的0 0 1 m 甲酸铵缓冲液，上述缓冲液甲醇( 4 7 5 3 ) 为 流动相。色谱柱：v p o d s4 6 * 1 5 0 m m ，流速：1 5 m l m i n ，波长：2 6 7 n m ，柱温：3 5 。c ， 样品配制：称取3 5 m g 样品至2 5 m l 容量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度。不同p h 值主 峰保留时间、柱效如表2 - 3 。 表2 - 3 不同p h 值对l c 分离的影响 p h 值主峰保留时间( m i n )柱效( n ) 拖尾因子( t ) 4 0 8 2 14 5 8 0 1 0 8 6 0 1 9 2 33 1 6 0 1 3 8 0 3 3 5 8 1 8 2 01 8 长春瑞滨为含一n 元素的碱性药物，随着p h 升高，分子极性降低，在反相柱中出峰 时间推迟，柱效下降，拖尾增加。 2 4 2 离子强度的选择 参照e p 等方法，选择p h 4 2 缓冲液，改变缓冲液中甲酸铵的离子浓度。当使用0 0 1 m 甲酸铵p h 4 2 时，长春瑞滨主峰与其主峰前的光降解杂质分离度为1 2 ：随着缓冲盐浓 度的提高，两者分离度有所提高。当使用0 0 5 m 甲酸铵p h 4 2 缓冲液，长春瑞滨与光解 浙江大学硕士学位沧文：酒石酸长春瑞滨相关杂质研究 杂质分离度为2 5 。 2 4 3 色谱柱的选择 对此产品，尝试用不同品牌的柱子，h g i l e n t 、w a t e r s 、s h i mp a c kc l c o d s 、s h i m p a c k v p 一0 0 s 等，只有v p o d s4 6 * 1 5 0 n n 对此产品柱效高，分离效果好。 2 5 讨论 将制备得到结构确认后的相关杂质按e p 方法定位( e p 方法见1 2 ) 。 表2 - 4e p 方法l c 数据 出峰顺序 样品名称 保留时间( m i n )相对保留时间( m i n ) 1 2 1 一0 去甲基长春瑞滨 2 7 2o 2 0 2 6 - n 甲基长春瑞滨 7 5 80 5 6 3 2 3 0 去甲基长春瑞滨 9 2 6o 6 8 4 光降解产物 1 0 6 6o 7 8 5 长春瑞滨 1 3 5 91 0 6 1 7 一溴代长春瑞滨 2 3 8 91 7 6 e p 方法中流动相中添加癸烷磺酸钠离子对试剂，改变了各组份的相对极性，2 3 0 去甲基长春瑞滨、6 一n 甲基长春瑞滨在e p 中相对保留时间为0 6 8 、0 5 6 ，而在2 2 2 l c 方法中分别为0 5 0 、0 6 9 。 对于e s i m s ，最高的绝对灵敏度只有在尽可能的低流速和最小的柱内径下获得。 当采用较小的柱直径，流出物浓度较高，而且有低流速下，离子化过程的效率增加。当 用窄径柱a g i l e n tz o r b a xs b c 1 8 3 5 p 4 n2 1 * 1 5 0 m 时，各组份的分离效果不佳。方法 中采用v p o d s1 5 0 4 6 m m 柱子。为了保证离子化效率，采用柱后分流，e s r 表现为浓度 型检测器，柱后分流不导致明显的信号丢失；并且只有小部分样品进入离子源，有利于 保持质谱仪清洁。 建立的h p l c 分析方法简便易行，且分离度好，灵敏度高，重复性好，并且可与 质谱仪匹配联用，适用于酒石酸长春瑞滨相关杂质分析。 浙江大学硕士学位论文：酒石酸长春瑞滨相关杂质研究 第三章酒石酸长春瑞滨相关杂质分离制备及结构确认 3 1 分离制备 3 1 1 仪器、试剂与药品 仪器 r - 2 0 0 型旋转蒸发仪 b i ) c h i 2 x z 2 型旋片真空泵 浙江黄岩求真真空泵厂 a g i l e n t11 0 0 制备液相系统 f i n n j