（环境工程专业论文）粘红酵母利用纤维素水解液发酵制备微生物油脂的研究.pdf

摘要 能源与环境问题是当今世界各国所面临的两大难题。伴随着日趋严重的全球性能源 短缺与环境恶化，从环境保护与资源开发的角度出发，积极开发替代化石燃料的可再生 新能源是一种必然趋势，如生物柴油就是一种具有很大发展潜力的可再生清洁能源。目 前，生物柴油原料油脂的主要来源是动植物脂肪以及餐饮废油，存在成本高以及收集和 运输困难的问题，因此寻找一种廉价的原料成为了生物柴油产业化的关键。某些微生物 能将五碳糖和六碳糖转化为油脂，这一特性适用于对木质纤维素水解糖化液的利用。因 此微生物油脂可为生物柴油的制备提供更加廉价而广泛的原料。 本文首先考察了粘红酵母a s 2 1 0 7 在摇床及1 l 发酵罐上的发酵特性。结果表明： 葡萄糖浓度在1 0 0 9 l 以下范围内不会对菌体造成抑制。有机氮为氮源时生物量高于以 无机氮为氮源，但其油脂产量低于后者。以k n 0 3 为氮源能够显著促进细胞的生长和油 脂的积累。最佳的钾离子浓度为4 9 l 。在1 l 发酵罐上粘红酵母细胞生物量可达1 7 7 9 l ， 油脂产量可达6 4 9 l ，最优化的培养条件为p h 为6 ，温度为3 0 ，装液量为7 0 0 m l ， 通气量为l v v m ，转速为5 5 0r p m 。 研究了补料培养对粘红酵母细胞生长及油脂积累的影响，补糖有利于油脂产量的提 高。最佳的补料方式为：发酵4 8 小时一次补加1 4 9 l 的葡萄糖。采用该补料策略，细 胞生物量可达1 6 8 9 l ，油脂产量可达9 1 9 l 。 研究了粘红酵母以工业木糖及混合糖为碳源发酵生产微生物油脂特性。结果表明， 高的初始木糖浓度对粘红酵母细胞生长有一定的抑制作用，确定初始木糖浓度为3 5 l ， 硝酸钾和酵母粉作为混合氮源，酵母粉浓度为4 9 l ，碳氮比为5 5 ，接种量为1 5 。h z p 0 4 。 的浓度为6 9 l 。 当以混合糖为碳源，酵母粉最佳浓度为4 9 l ，碳氮比为5 5 ，接种量为1 0 ，萄糖 抑制粘红酵母对木糖的代谢，最佳的木糖和葡萄糖比例为2 5 ：1 。当木糖和葡萄糖的比 例按照2 5 ：1 ，补料时间为发酵7 2 8 4 小时，补料浓度为1 5 2 5 l 时，细胞生物量、 油脂产量和油脂含量可分别达到1 9 5 l 、1 1 6 9 l 和5 9 5 。 本文还考察了木质纤维素水解液中糠醛和乙酸对菌体生长的影响。当糠醛和乙酸浓 度大于2 9 l 时菌体完全不生长，糠醛和乙酸浓度为l g l 以下，随着糠醛浓度的降低， 菌体生物量呈上升趋势，此时，糠醛对菌体生长的抑制作用大于乙酸。采用减压蒸馏脱 出糠醛，并以浓缩的蔗渣和玉米芯水解液为碳源发酵制备微生物油脂，其生物量分别达 到1 5 1 9 l 和1 3 7 9 l ，油脂含量分别达到3 2 5 和2 9 2 。因此，当甘蔗渣和玉米芯等 纤维素原料水解并脱除糠醛和乙酸后，可以作为粘红酵母a s 2 1 0 7 发酵制备油脂的原料。 将微生物油脂作为原料，采用超临界反应制备生物柴油，对产物成分进行气相色谱 分析表明微生物油脂可作为制备生物柴油的原料。 关键词：粘红酵母，纤维素水解液，发酵，微生物油脂，生物柴油 a b s t r a c t a tp r e s e n t ，t h ew o r l da r ef a c i n gw i t ht h es e r i o u se n e r g ya n de n v i r o m e n t a lp r o b l e m w i t h t h ep r o b l e mo fg l o b a le n e r g ys h o r t a g ea n de n v i r o n m e n t a ld e t e r i o r a t i o nb e c o m em o r ea n d m o r es e r i o u s l np e o p l ea r ee x p l o r i n gt h er e n e w a b l ee n e r g yt os u b s t i t u t et h ef o s s i lf u e l b i o d e s e li ss u c hak i n do fc l e a na n dr e n e w a b l ee n e r g yw i t hg r e a td e v e l o p m e n tp o t e n t i a l t h e r a wm a t e r i a l so fb i o d i e s e la r ev e g e t a b l eo i la n dw a s t eo i la tp r e s e n t h o w e v e r ，t h eh i g h m a t e r i a lp r i c eo fv e g e t a b l eo i la n dw a s t eo i ll e dt ot h eh i g hp r o d u c t i o nc o s to fb i o d i e s e l p r o d u c t i o n s od e v e l o pc h e e pm a t e r i a l sa r ev e r yi m p o r t a n tf o rt h eb i o d i e s e li n d u s t r i a l i z a t i o n s o m es t u d i e sf i n dt h a tm a n ym i c r o b eh a v eag r e a td e a lo fl i p i di nt h eb o d ya n dc a n c o - f e r m e n t a t eg l u c o s ea n dx y l o s es i m u l t a n e o u s l y , s op r o d u c t i o no fl i p i dm a t e r i a lb ym i c r o b i a l f e r m e n t a t i o n u s i n gh e m i c e l l u l o s i ch y d r o l y s a t ec a np r o v i d eaw i d er a n g ea n dc h e a pr a w m a t e r i a l sf o rb i o d i e s e l f i r s to fa l l ，t h eb a t c ha n df e e d b a t c hf e r m e n t a t i o ni ns h a k e ra n df e r m e n t o rb yf e r m e n t a t i o n o fg l u c o s ew i t hr h o d o t o r u l ag u t i n ia s 2 10 7w a si n v e s t i g a t e dr e s p e c t i v e l y t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h ey e a s tg r o w t hw i l ln o tb ei n h i b i t e db yg l u c o s ew h e nt h es u g a r c o n c e n t r a t i o nu n d e r10 0g l ，a n dt h eo p t i m u mi n i t i a lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni sa b o u t5 0 9 l ， t h eb i o m a s so fu s i n go r g a n i cn i t r o g e ni sh i g e rt h a ni n o r g a n i cn i t r o g e nb u tt h el i p i dc o n t e n to f l a t e ri sh i g h e rt h a nt h ef o r m e r ，b e c a u s eo fo f f e r i n gah i g h e rk a l i u ma n dl o w e rn a t r i u mf o rt h e c e l l ，u s i n gp o t a s s i u mn i t r a t eu n d e r4 9 la sn i t r o g e ns o u r c ew i l lp r o m o t el i p i d sa c c u m u l a t i o n ， t h eb i o m a s sa n dl i p i dc a nr e a c h17 7 9 la n d6 4 9 lw h i l eg r o w i n gi n1lf e r m e n t o r i nw h i c h t h eo p t i u mo p e r a t i o ni st h a tv e n t i l a t i o nw a sl v v m ，p hi s6a n ds t i r r e rs p e e dw a s5 5 0r p m t h ef e e d b a t c hf e r m e n t a t i o ni ns h a k e rb yf e r m e n t a t i o no fg l u c o s ew i t hr h o d o t o r u l ag u t i n i a s 2 1 0 7w a si n v e s t i g a t e d t h eb i o m a s sa n dl i p i dc a nr e a c h16 8 9 , la n d9 1g lw h i l ea d d i n g g l u c o s e ( 14g l ) i nt h em e d i u ma t4 8 hd u r i n gf e r m e n t a t i o n t h eb a t c hf e r m e n t a t i o ni ns h a k e rb yf e r m e n t a t i o no fx y l o s ew i t hr h o d o t o r u l ag u t i n i a s 2 10 7w a si n v e s t i g a t e d t h ee f f e c t so ff e r m e n t a t i o no p e r a t i o np a r a m e t e r so nf e r m e n t a t i o n p r o c e s sa n dl i p i ds y n t h e s i z ew e r ed i s c u s s e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h ey e a s tg r o w t hw i l lb e i n h i b i t e db yt h eh i g hc o n c e n t r a t i o no fx y l o s e ，b o t ho ft h eb i o m a s sa n dc o n t e n to fl i p i dw e r e m a x i m u mw h e n x y l o s ec o n c e n t r a t i o ni sa b o u t3 5 9 l ，k n 0 3a n dy e a s tw e r eu s e da s n i t r o g e n s o u r c e ，t h ey e a s tc o n c e n t r a t i o ni s a b o u t4 9 l ，t h er a t i oo fc a r b o na n dn i t r o g e nw a s5 5 ， i n o c u l a t i o na m o u n tw a s15 a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fk h 2 p 0 4i s6 9 l t h eb a t c hf e r m e n t a t i o ni ns h a k e rb yc o f e r m e n t a t i o no fg l u c o s ea n dx y l o s ew i t h r h o d o t o r u l ag u t i n ia s 2 1 0 7w a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：b o t ho ft h eb i o m a s s a n dc o n t e n to fl i p i dw e r em a x i m u mw h e nt h er a t i oo fx y l o s ea n dg l u c o s ei s2 5 ，t h et o t a l c o n c e n t r a t i o no fs u g a ri sa b o u t5 0 l ，k n 0 3a n dy e a s tw e r eu s e da san i t r o g e ns o u r c e ，t h e y e a s tc o n c e n 仃a t i o ni sa b o u t4 9 l ，t h er a t i oo fc a r b o na n dn i t r o g e nw a s5 5 ，w h e ng r o w no n m i x e ds u g a rc o n t a i n i n gg l u c o s e ( 15 9 l ) a n dx y l o s e ( 3 5 9 l ) u n d e rf e e d b a t c hf e r m e n t a t i o n w h i c ha d d i n g15 - 2 5 9 ls u g a r ( r a t i oo fx y l o s ea n dg l u c o s ei s2 5 ) 7 2 - 8 4 ha f t e rb e g i n n i n g f e r m e n t a t i o n b i o m a s sa n dl i p i dc o n t e n tw e r e l 9 5g la n d5 9 5 r e s p e c t i v e l y t h ei n f l u e n c eo ff u r f u r a la n da c e t i ca c i do nr h o d o t o r u l ag l u t i na s 2 10 7g r o w t hw a s i n v e s t i g a t e d t h ey e a s tw i l ls t o pg r o w t hw h e nt h e i rc o n c e n t r a t i o n se x c e e d e d2g l w h e n g r o w no nb a g a s s ea n dc o r n c o b ，b i o m a s sw e r e l 5 1 9 la n d1 3 7 9 l ，l i p i dc o n t e n tw e r e3 2 5 a n d2 9 2 s ot h eh e m i c e l l u l o s i ch y d r o l y s a t ec a nb eu s e da sr a wm a t e r i a lt op r o d u c e m i c r o b i a ll i p i dw h e nr e m o v a lo ft o x i nf r o mi t t h el i p i dp r o d u c e db yf e r m e n t a t i o nw h i c h u s i n gl i g n o c e l l u l o s i ch y d r o l y s a t ea sr a wm a t e r i a li sa l s oc a n b e u s e dt op r e p a r eo fb i o d i e s e l k e yw o r d s ：r h o d o t o r u l ag u t i n i ，h e m i c e l l u l o s i ch y d r o l y s a t e ，f e r m e n t a t i o n ，m i c r o b i a l l i p i d ，b i o d i e s e l l l 论文独创性声明 本人声明：本人所呈交的学位论文是在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。除论文中已经注明引用的内容外，对论文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本论文中不包含任何 未加明确注明的其他个人或集体己经公开发表的成果。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 每良捌年岁月矽日 论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属学 校。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权 利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成 果时，署名单位仍然为长安大学。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 导师签名： 亏连谁朋矽日 翻瑶夕哆年夕月哆日 长安大学硕士学位论文 1 1 引言 第1 章绪论 我国是全球最大的能源消费市场之一，是仅次于美国的全球第二大能源消耗国。2 0 0 3 年以来，我国就出现了能源紧缺的局面，而且能源消耗增长潜力巨大。据统计，2 0 0 4 年中国 人均一次能源消费量1 0 8 t 油当量，为世界平均水平1 6 3 t 油当量的6 6 ，是美国人均8 0 2 t 油 当量的1 3 4 ，日本人均3 8 2 t 油当量的2 8 1 。n 2 0 5 0 年，我国石油耗量预计将超过8 亿吨， 而国内产量由于资源和生产能力的限制，将稳定在年产2 亿吨左右，进口依存度将达 7 5 。鉴于我国正处于飞速的工业化进程中，一旦达到全球能源消耗水平，就将意味着我 们对能源的需求量将成倍增长，然而我们的能源储备却是非常有限的。目前我国石油剩余 可采储量为2 3 8 亿吨，储采比仅为1 3 4 ，远低于世界石油5 8 6 的平均储采比，储备和开采 能力日益窘迫。可见我国能源储量与未来几十年的发展需求之间的缺口有越来越大的趋 势。 当前世界上所使用的能源主要是由史前时代的动植物腐烂后经过数百万年沉积而 成的煤炭、石油、天然气3 种化石燃料。这些化石燃料在燃烧过程中都要放出二氧化硫、 一氧化碳、烟尘、放射性飘尘、氮氧化物、二氧化碳等，不仅会直接危害人畜，导致机体 癌变，使生物受辐射损伤，而且还会产生酸雨，形成温室效应，使生态环境遭到破坏，人 畜生活受到危害。我国是除美国外的世界第二大c 0 2 排放国，覆盖四川、贵州、广东、广 西、湖南、湖北、江西、浙江、江苏和青岛等省市部分地区，面积达2 0 0 多万k m 2 的酸雨 区就是世界三大酸雨区之一。环境的破坏使我们的一些城市成为世界上污染最为严重的 地方，在世界十大污染城市中，就有8 个在中国。据联合国评比，各种类型的污染所造成的 损失相当于我国每年国内生产总值的8 。而2 0 0 5 年2 月1 6 日京都议定书的正式生效， 使我们在面对环境污染的时候更加强烈地意识到逐步停止使用化石燃料，尽快走上可持 续发展的能源道路的必要性。 能源是维系社会、经济和环境协调发展的基础，也是人类生存和发展的前提。人类对 煤炭、石油和天然气等矿物能源的开发和利用，在推动社会文明进步和经济繁荣的同时， 也带来了系列诸如资源枯竭和环境污染等社会与生态问题。在此背景下，开发清洁的可 再生能源已成为迫切需求，国家中长期科学和技术发展规划纲要指出可再生能源在 2 0 2 0 年我国能源消费中的比重将达到1 6 。而利用可再生的生物质资源生产生物柴油是 第1 章绪论 一个很好的选择。 目前国内外对于生物柴油制备的研究主要集中于植物油或餐饮废弃油脂方面，但利 用植物油为原料成本高，其成本占到总生产成本的7 0 一- - 8 5 ，以餐饮废弃油为原料， 也存在原料难以收集和运输的困难，这些都严重地制约了生物柴油的产业化进程，因此 寻找一种廉价的原料成为了生物柴油产业化的关键。许多微生物，如酵母、霉菌和藻类等， 在一定条件下能将碳水化合物转化为油脂贮存在菌体内，称为微生物油脂。过去曾因为技 术经济原因，单细胞油脂很少有规模化生产的报道。但是，随着工业生物技术的发展，微生 物油脂发酵从原料到过程都不断取得新进展。最近，美国国家可再生能源实验室( n e l l ) 的报告特别指出微生物油脂发酵可能是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向。 1 2 产油微生物和微生物油脂简介 1 2 1 微生物油脂的概念及特点 某些微生物在一定条件下能将碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等碳源转化为菌 体内大量贮存的油脂，如果油脂含量能超过生物总量2 0 ，即称为产油微生物【2 】。细菌、 酵母、霉菌、藻类中都有产油菌株，但以酵母菌和霉菌类真核微生物居多。以上所述的 微生物油脂，以甘油三酯为主，约占8 0 以上，磷脂约占1 0 以上。以这些微生物为出 发菌，通过诱变而获得的具有更高产脂能力或富含较高经济价值的不饱和脂肪酸的变异 株也在不断增加。产油微生物资源丰富，能在多种培养条件下生长，进行工业规模生产 和开发有着巨大的潜力。 微生物油脂 3 1 ( m i c r o b i a lo i l ) 又叫单细胞油n 旨( s c o ，s i n g l ec e l lo i l ) ，是酵母、霉菌和藻 类等产油微生物在一定条件将碳水化合物转化并储存在菌体内的油脂，主要是由不饱和 脂肪酸( p u f a s ) 组成的甘油三酯( t a g ) ，在脂肪酸组成上与植物油如菜籽油、棕榈油、大 豆油等相似，是以c 1 6 和c 1 8 为主的脂肪酸。有的干菌体含油量高达6 0 以上。 多不饱和脂肪酸( p u f a s ：p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ) 含有两个或两个以上双键且碳 原子数为1 6 至2 2 的直链脂肪酸，主要包括y 亚麻酸( g l a ：g a m m al i n o l e n i ca c i d ) 、双高度 丫亚麻酸( d g l a ) 、花生四烯酸( a r a ) 、二十碳五烯酸( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) 。 p u f a s 可以广泛应用于医药、食品、化妆品和饲料等领域，其主要来源有植物、鱼油、 微藻和微生物。由于微生物具有生长周期短、培养简单、p u f a s 含量高等特点，因而利用 微生物生产p u f a s 成为近年来国内外的研究热点。 微生物细胞增殖快，生产周期短，生长所需的原料丰富，价格便宜，如淀粉、糖类、 2 长安大学硕士学位论文 特别是食品工业和造纸行业的废弃物都可以加以利用，从而保护了环境；用微生物方法 生产油脂比农业生产油脂所需的劳动力少，同时不受季节、气候变化的限制；微生物油 脂能连续大规模生产，生产成本低；并且可以利用细胞融合、细胞诱变等高科技方法， 使微生物生产出比动、植物油脂更符合人们需要的高营养油脂或某些特定脂肪酸的油脂 1 4 。某些脂肪酸还具有特殊的功能，主要可归纳为以下几个方面：抗炎症作用 5 】；抑制 肿瘤细胞的形成、扩散和转移【6 】；预防和治疗心血管疾病，尤其是糖尿病患者的心血管 疾病【7 】降血脂、降血压等功能【8 】；多不饱和酸还能调节皮肤正常的生理功能，具有护 肤作用等。 1 2 2 微生物发酵产油脂的优点 作为植物油品和动物油品的替代品，产油微生物正在得到广泛的研究和应用。微生 物油脂有植物油脂和动物油脂不可比拟的优势：微生物油脂资源是可无限再生产的资 源，而石油的开采量仅供人类5 0 年的使用。因此，石油化工产品逐渐向油脂化学产品转 移也是必然的；与大豆油、棕榈油、葵花籽油等商品油相比，微生物油脂营养价值更 高；能利用便宜的或零成本的原料进行生产，把农副产品及其食品工业、造纸工业中 产生的废弃物都可加以利用，保护了环境；微生物油脂的生产不受季节、气候、地理 环境的限制；微生物油脂含有植物、动物不能合成或少量合成的脂肪酸，如y 一亚麻酸 ( g l a ) 、亚油酸、花生四烯酸( a r a ) 、二十碳五烯酸( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) 等；微生物有氧化、脱饱和、氢化等新陈代谢能力，能改进p u f a s 的结构，且能形成 油脂及其他产品如蛋白质、维生素、抗氧化剂、微量元素等；利用产油微生物的突变 株，可以获得微生物的独特油品或新的脂肪酸；微生物油脂中的p u f a 可以作为功能 性食品，而大量的其他脂肪酸可以研制成微生物柴油，作为新的生物质能源。 1 2 3 产油微生物油脂含量及脂肪酸组成 大多数微生物油脂以甘油三酯为主，还有其它各种脂肪酸。产油酵母细胞内含大量 甘油三酯，其组成与植物来源食用油脂相似，能在多种碳源上生长，如蔗糖、糖蜜、乳 糖、酒精等。一些产油霉菌以葡萄糖为碳源，在胞内合成以甘油三酯为主的脂质，不同 霉菌的脂肪酸组成有很大差别【9 1 。脂肪酸以油酸、棕榈酸、亚油酸的含量最高，其它脂 肪酸，如亚麻酸【l o 】、花生酸、花生油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸( e p a ) 、二十二碳 六烯酸( d h a ) 以及一些特殊脂肪酸存在于一些变异株中，且含量差异较大【】。一些常见 的产油微生物，其脂肪酸组成如表1 1 所示。不饱和脂肪酸，特别是高不饱和脂肪酸， 由于其重要的生理功能和较高的经济价值，已成为产脂微生物定向育种的发展方向。 3 第1 章绪论 表1 1 产油微生物的油脂含量和组成 1 2 4 国内外研究进展 微生物产生油脂研究已有半个多世纪的历史。国外对于微生物油脂的研究工作起步 较早，最早可追溯到第一次世界大战期间，当时德国准备利用内孢霉属和单细胞藻类镰 刀属的某些菌种生产油脂以解决食用油匮乏问题，后因战争爆发而中止研究。随后美国、 日本等国也开始研究微生物油脂的生产。第二次世界大战前夕，德国科学家筛选到了高 产油脂的斯达氏油脂酵母，粘红酵母属，曲霉属以及毛霉属等微生物，并进行规模生产。 后来发现利用微生物生产普通油脂成本太高，无法与动、植物来源的油脂相竞争。有关 微生物油脂的探索此后一度集中在获取功能性油脂，如富含多不饱和脂肪酸的油脂。 1 9 8 6 年，日本和英国等国家率先推出含微生物g l a 油脂的保健食品、功能性饮料和高级 化妆品等产品，微生物油脂实用化已迈出了第一步【l2 1 。进入9 0 年代，特种油脂的发展越 4 长安大学硕士学位论文 来越受人们的重视。s t e w d a n s k 筛选到产生a r a 的真菌，它们总脂中a r a 的含量达到 4 2 - - - - 5 5 1 ”】：1 9 9 6 年，s i n g h 等在优化培养基上对t h r a u s t o c h yt r i u m a t c c 2 8 2 1 0 进行培 养，5 d 后d h a 产量达到1 0 6 1 m g l 。研究者还发现某些海藻和硅藻也能生产出较高产量 的e p a $ 1 d h a t l4 1 。 我国在6 0 年代就有生产油脂的报导，但研究较多的是在9 0 年代，其研究重点也集中 在开发功能性油脂方面【1 5 】。1 9 9 5 年，罗玉萍等【1 6 1 分离到一株高产棕榈油酸的酵母，总脂 中棕榈油酸含量高达5 0 1 4 ；1 9 9 8 年菌物系统报道，以拉曼被孢霉s m 5 4 1 为原始菌株， 经过紫外线复合氯化锂诱变处理，得到突变株s m 5 4 1 9 ，其生物量由1 2 6 9 l 提高到 2 8 8 e e l ，油脂含量由5 8 9 l 提高到1 5 7 9 l ，花生四烯酸含量哇t 3 2 1 m g l 增加到6 2 3 m l 【1 7 】。2 0 0 3 年施安辉、周波通过对粘红酵母g r l 5 3 1 生产油脂发酵条件的探讨发现，油脂 产量可达菌体干重的6 7 2 。清华大学吴庆余、缪晓玲通过异养转化细胞工程技术获得 了脂类含量高达细胞干重5 5 的异养藻细胞【1 8 】。曲威等以斯达氏油脂酵母为出发菌株， 经紫外线诱变选育出了一株高产油脂的优良酵母菌株，生物量可达2 4 2 l ；油脂量1 4 6 g l 1 9 】。李永红等采用均匀设计和单因子实验法，通过摇瓶培养所得菌体油脂含量高达 7 6 1 ，脂肪得率系数可达2 2 7 t 2 0 1 。王莉等对发酵性丝孢酵母发酵产油脂条件的初步优 化，菌体生物量为1 8 2g l ，干细胞的油脂含量为6 8 5 t 2 1 1 。孔祥莉等研究了斯达氏油脂 酵母利用葡萄糖一木糖混合糖为碳源生长和油脂积累特性。发酵1 2 0h 后混合糖利用率、 生物量和菌体油脂质量分数分别达9 9 5 、1 9 0g l 和1 5 2 6 2 2 】。 随着生物柴油产业的兴起，微生物油脂作为生物柴油的油源已引起人们的关注。墨 玉欣等【2 3 】以一株酵母菌为产油菌株，利用其发酵的油脂，通过甲醇转酯化在碱催化剂下 制备生物柴油，经气相色谱分析，其生物柴油的组成主要四软脂酸甲脂、硬脂酸甲酯、 油酸甲酯、亚油酸甲酯，其相对含量分别为1 9 7 7 、2 1 3 2 、4 2 5 1 、6 8 9 。里伟 等【2 4 】以一株高产油脂圆红冬孢酵母菌( r h o d o s p o r i d u mt o r u l o i d e sy 4 j f j ) 干菌粉为原料，分 别研究了无溶剂体系中三步甲醇法及在叔丁醇介质体系中脂肪酶催化合成生物柴油，生 物柴油得率可达9 0 左右。 由于一些产油微生物具有转化五碳糖为油脂的性质【2 5 】【2 6 1 ，这一特性尤其适用于木质 纤维素的全糖利用。而木质纤维素资源又具有来源丰富，品种多，再生时间短等优点。 因此，利用产油微生物转化木质纤维素水解液为微生物油脂再通过转酯化制备生物柴油 可降低生物柴油的成本，同时也将秸秆、高梁杆、蔗渣等废弃物进行了合理利用。 近年来，随着现代生物技术的发展，利用物理化学诱变已获得具有高产油能力的产 s 第1 章绪论 油微生物资源。目前，日本、德国、美国等国目前已有商品菌油或相应下游加工产品面 市。因此，微生物油脂是具有广阔前景的新油脂资源，有望从根本上解决制备生物柴油 的原料问题。 1 3 微生物合成油脂的生化过程与代谢调控机理 1 3 1 微生物油脂的生物合成 综合目前国外的研究，粘红酵母油脂合成的机理可分为四个环节：两个前体乙酰 c o a 和3 磷酸甘油的形成；甲羟戊酸的合成，乙酰c o a 形成脂酰c o a 和鞘脂；以甲羟戊 酸为前体合成甾醇、类胡萝b 素和碳水化合物；以乙酰c o a 和3 磷酸甘油为前体合成磷 脂酸、甘油二脂、甘油三脂和磷脂。由此可见，在酵母细胞内油脂合成的多少，乙酰c o a 起了主导作用，而乙酰c o a 的形成又受到氮源多少、a m p 和异柠檬酸脱氢酶活力等诸多 因素的影响【2 7 】。 微生物产生油脂的过程，本质上与动植物产生油脂的过程相似，都是从乙酰c o a 羧化酶催化羧化的反应开始，然后经过多次链延长，或再经过去饱和作用等完成整个生 化过程。在此过程中，有两个主要的催化酶，即乙酰c o a 羧化酶和去饱和酶。其中乙酰 c o a 羧化酶催化脂肪酸合成的第一步，是第一个限速酶。此酶是由多个亚基组成的复合 酶，结构中有多个活性位点，因此该酶能为乙酰c o a 、a t p 和生物素所激活。去饱和酶是 微生物通过氧化去饱和途径生成不饱和酸的关键酶，该过程称为脂肪酸氧化循环【2 8 】。 生物合成t a g 是在动、植物和微生物界广泛存在的多酶催化过程【2 9 1 ，属初级代谢的 一部分( 见图1 1 ) 。目前研究表吲3 们，t a g 的合成代谢中关键的两个中间产物是磷脂 酸( p a ) 和甘油二酯( d a g ) 。酿酒酵母( s c e r e v i s i a e ) 细胞中p a 的合成与其他真核细胞中 p a 合成类似，存在两条合成途径，即甘油3 磷酸( g 3 p ) 途径和磷酸二羟丙酮( d h a p ) 途 径。甘油3 磷酸途径通过其酰基转移酶( g a t ) 在s 刀1 位酰化，形成溶血磷脂酸( l p a ) 。 同样地，d h a p 在其相应的酰基转移酶( d h a p a t ) 催化下在s n 1 位酰化，生成的 1 - a c y l d h a p 被其还原酶( a d r ) 还原也生成l p a 。最近在分子水平上研究t a g 的生物合 成时还发现，g a t l p 和g a t 2 p 均能以g 3 p 和d h a p 为底物，而表现为双重底物特性的s 珂1 位酰基转移酶【3 1 1 。溶血磷脂酸在相应脂肪酰转移酶( a g a t ) 作用下在s n 2 位酰化，形成 p a 。另外p a 也可以磷脂为前体在磷脂酶d 作用下生成。 磷脂酸在磷脂酸磷酸酶( p a p ) 作用下去磷酸化形成d a g ，这是d a g 形成的主要途 径。另外，d a g 也可由磷脂酶c 催化水解磷脂得到。研究表明，d a g 转化为t a g 时的酰 6 长安大学硕上学位论文 基转移反应并不是由单一的脂肪酰基转移酶完成的【3 2 1 。酿酒酵母d a g 酰化生成t a g 主 要有两个酶d g a l p $ 1 l r o l p 参与催化，前者是标准的甘油二酯酰基转移酶( d a g a t ) ，同 t a g 合成途径中另外两个酰基转移酶一样以脂肪酰c o a 为酰基供体；后者则以卵磷脂为 酰基供体，表现为磷脂：甘油二酯酰基转移酶( p d a t ) 的活性，将供体分子中s n 2 位酰基 转至t a g 的s 1 1 3 【3 引。最近的研究发现还有两个具有脂肪酰c o a 胆箔醇酰基转移酶 ( a c a t ) 活性的蛋白质a r e l p 和a r e 2 p ，可能也用脂肪酰c o a 为酰基供体，参与d a g 酰化 反应【3 4 1 。另外，放射性同位素标记实验发现酿酒酵母的微粒体成份能以d a g 和游离脂肪 酸为底物合成t a g ”】。但到目前为止，尚未见分离或详细生物化学表征这种利用游离脂 肪酸为酰基供体的酰基转移酶的报道。关于产油酵母t a g 合成多酶体系的研究工作直到 最近才开始【3 引。实验表明粘红酵母( r g l u t i n i s ) t a g 合成多酶体系存在于细胞溶胶中， 主要通过蛋白质间相互作用复合在一起。实验中分离出的多酶体系包含酰基载体蛋白 ( a c p ) 、酰基a c p 合成酶、a g a t 、p a p 和d a g a t 。该多酶体系不仅能利用l p a 和脂肪 酰c o a 合成t a g ，而且还可接受游离脂肪酸，合成t a g 及其相关中间体。有趣的是，后 来还发现一个铁超氧化物歧化酶( f e s o d ) 也和t a g 合成多酶体系复合在一起，其作用可 能是防止底物( 如不饱和脂肪酸) 和多酶体系中的蛋白质受到活性氧化物的损害【了7 1 。e m s 基因突变法使粘红酵母细胞溶胶t a g 合成多酶体系失活，导致细胞生长和t a g 生物合成 速率下降3 8 】。 酰基辅酶a 一辅酶a 酰基辅酶a 一辅酶a腺三磷一腺二磷 。、 i g 3 pl p a 、 、j r l ， u 1 一 k 刀 k 磷 j 甘 油 a d r 脂 磷脂酶c 酸 酯 酶 、 ， 酶 ?t a g d h a p a t d 酰基辅酶a 一辅酶a d h a p 1 - a c y l d h a p 磷脂 图1 1 微生物油脂的生物合成 可见，微生物t a g 的生物合成途径中仍然存在着许多富有挑战性的研究课题，尤其 对产油微生物t a g 合成途径的研究还刚起步。比如，p a 合成时不同途径的生理功能及 其相互关系问题；t a g 合成时两条主要途径的生理功能、相互关系以及其它旁路在甘油 三酯生物合成代谢中的作用问题等。对这些问题的深入研究非常有利于将来在生产实践 7 第1 章绪论 中应用产油微生物资源。 1 3 2 微生物油脂合成代谢调控 微生物高产油脂的一个关键因素是培养基中碳源充足，其他营养成分，特别是氮源 缺乏。在这种情况下，微生物不再进行细胞繁殖，而是将过量的碳水化合物转化为脂类。 虽然阐明从脂肪酰c o a 合成t a g 的途径在油脂合成中非常重要，但该途径并不是产油微 生物所特有的。事实上，产油微生物对油脂积累的重要调控元件是有关脂肪酸合成的一 些因素。 目前，人们对产油酵母和产油霉菌利用葡萄糖为碳源积累t a g 的代谢途径已有比较 深入的认识，图1 2 简要说明了产油酵母中与t a g 合成代谢调控相关的一些重要步骤。 当产油微生物培养基中可同化氮源耗尽并且可同化碳源丰富的情况下，其t a g 积累过程 被激活。这个过程牵涉到微生物代谢和与代谢相关的一系列生理生化过程的变化。首先， 当氮源枯竭时，产油微生物的腺苷一磷酸( a m p ) 脱氨酶活性增加，a m p 脱氨酶将a m p 大量转化为肌苷一磷酸( i m p ) 和氨，相当于微生物对缺氮的一种应激反应【3 9 1 。通常产油 酵母线粒体中异柠檬酸脱氢酶( i c d h ) 都是a m p 依赖性脱氢酶，细胞内a m p 浓度的降低 将减弱甚至完全停止该酶的活性【4 0 1 。因此，异柠檬酸不再被代谢为a 酮戊二酸，三羧酸 ( t c a ) 循环陷入低迷状态，代谢路径发生改变。线粒体中积累的柠檬酸通过线粒体内膜 上的苹果酸柠檬酸转移酶转运进入细胞溶胶中【4 ，在a t p ：柠檬酸裂解酶( a c l ) 的作用下 裂解生成乙酰c o a 和草酰乙酸。这样，微生物在氮源枯竭、蛋白质合成停滞的情况下仍可 将葡萄糖有效地代谢为乙酰c o a ，并在脂肪酸合成酶( f a s ) 的作用下完成脂肪酰c o a 的合 成。然而，在产油真菌mc i r c i n e l l o i d e s 和ma l p i n a 中i c d h 的体外活性并不完全依赖于 a m p 4 2 1 。当环境氮源耗竭后a m p 的浓度降低，仍然会减量调节i c d h 的活力，激活这些真 菌的油脂积累代谢。在产油接合菌( z y g o m y c e t e s ) 中，只有当无细胞抽提物中检测不出 i c d h 活性时，油脂的积累过程才会启动【4 3 1 。如果能发展一种选择性抑制产油微生物 i c d h 的工具，也许可以在更宽松的培养基条件下使微生物在菌体内大量富积油脂。然而 到目前为止，产油微生物在响应限氮条件时a m p 脱氨酶的上游信号传导机制还很不明 确。另一个很基础的问题是，产油微生物为什么选择a m p ，而不是体内其它更易得到的 含氮有机分子，作为氮的补充来源? 产油微生物油脂合成代谢调控中有两个关键酶，且 j a c l 和苹果酸酶( m e ) 。柠檬酸裂 解酶在细胞溶胶中催化柠檬酸裂解反应，提供油脂合成所需的乙酰c o a 。a c l 的活性与产 长安人学硕士学位论文 油微生物的油脂积累的能力具有很强的相关性，还没有发现微生物能积累t a g 超过其生 物量的2 0 却没有a c l 活性的例子。然而有- - + 部分的酵母菌具有a c l 活性，但油脂的 积累仍然不会超过生物量的1 0 。因此，柠檬酸裂解酶是油脂积累的一个先决条件，但并 不是有这种酶的微生物都是产油微生物【4 4 1 。在不同酵母和真菌中也没有发现油脂积累 的程度和a c l 的活性具有明确的定量关系。 葡萄糖 图1 2 产油酵母油脂积累代谢调控途径简图 p d h ：丙酮酸脱羧酶；p y c ：丙酮酸羧化酶：c s ：柠檬酸合成酶；i c d h ：异柠檬酸合成酶；a c l ：a t p ： c i t r a t el y a s e ：柠檬酸裂解酶：m d h ：苹果酸脱氢酶；m e ：苹果酸酶；f a s ：脂肪酸合成酶。 a c l 催化反应的另一产物草酰乙酸首先由苹果酸脱氢酶( m d h ) 还原成苹果酸，再在 m e 作用下氧化脱羧得到丙酮酸，并释放n a d p h 。其中丙酮酸可透过线粒体膜进入线粒体， 参与新一轮循环，而n a d p h 作为脂肪酸合成酶进行链延伸必不可少的辅助因子留在细胞 溶胶中。线粒体中的丙酮酸既可以通过丙酮酸脱氢酶( p d h ) 产生乙酰c o a ，又可在丙酮酸 羧化酶( p y c ) 的作用下产生草酰乙酸。这两个产物在柠檬酸合成酶( c s ) 催化下合成柠檬 酸，且o a c l 的底物，完成产油微生物t a g 合成调控最重要的代谢循环。值得注意的是，线粒 体中的乙酰c o a 无法直接穿透线粒体内膜而进入细胞溶胶中参与脂肪酸合成。 脂肪酸合成不仅需要连续供给乙酰c o a 用于碳链延伸，还需要提供足够的n a d p h 。 每一个乙酰c o a 单元在新生脂肪酸碳链上延伸时需消耗两当量的n a d p h 用于还原反 应。研究表明，产油微生物油脂积累的多少与m e 的代谢调控有关，如果m e 受到抑制，则油 9