（病原生物学专业论文）铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的分子机制研究.pdf

嘏埘大学簿- 氆垃论文稍绿襁蕈熬辩蝰诺酗蹙蘸耪熬静子秘镪瓣 究 铜绿假单腿菌耐喹诺醚类翁物酶分子巍制研究 博士研究生 导师 李学如 贾文祥教授 中文摘要 疆蓿抗童素长鬻大量盛矮( 锈疆瀵翅) ；绥蓠辩蓊菌橡隧之大量蠹 瑰，己成为感染缝疾瘸治疗缺乏疗效的难题之一。细菌的耐药瞧引起 了医学界发社会的极大关注，成为全球普遍关心的公共卫生问题，而 播涛绍菠掰药撰铡被认为是克服绦菌瓣药蠖斡关键之一。 镉绿锻革胞菌因其内在特点，对多种抗菌药物表现出天然躐获得 燃瓣药。鞭效，镧绿瑕零艟蓥囊重瑟拣硪佧巍磅究缨麓瓣药戆分子撬割， 磺究开发挠瓣羹绥蓥药犍的模型藏橡。本鹾究首先扶1 2 8 拣锶缘设单 魏蔷 瓷凑分离耩中，获褥大量对蝰诺瓣爨药稔辩蕊麓椿；接誊辩隧茭 株i i 类拓扑异构酶基因突变与耐喹诺酮类药物的关系，m e x a b o p r m 主动乡 蓑 系统o p r m 结稳鏊嚣酶衰达，m e x r 谖节鏊毽在m e x a b ”o p r m 辨摊系统中的作愆以及g y r a 基因突变与m e x a b o p r m 主动静封 在细菌 生物膜耐辅机制中的作用等进行了较为深入的研究。通过对锕绿假单 脆萤耐骛黪分予稳割一步步戆深入研究，无疑褥期深太髓霹缨靖醚药 住理解。这对于台理使埔抗菌药物，浔拽抗菌药物作用冉勺新靶患，指 黪磺究开发灏懿撬菡嚣物，解决缨萤瓣蓊牲阕蘧等舔其蠢重要意义。 1 2 8 拣锈绿鞭摹艟蘩冁寒分薅拣霹鬻耀拣蘩瑟携豹瓣兹毪鹾突表 制绿徽单胞耐睦_ l 萧酮类药物的分了机制研究 明：铜绿假单胞菌对头孢曲松、诺氟沙星和环丙沙星的耐药率高达 6 95 、5 7 8 和2 6 6 。其中，有】7 椽对四秘疃诺酮类药物呈交叉溅 药，占临床分离株的1 3 3 蹦：1 3 株对实验所用的抗菌药物表现出多熏 耐药性，占临床分离株的l o 2 。可见铜绿假单胞菌临床分离株耐药 的严重性。 用微量棋盘稀释法对喹诺酮与b 一内酰胺类药物联合用药研究晨 示，左氯氟涉星、环丙汐璧与头孢 也啶、蹶拉瑟毒本联合鬻蕊对大多数 临床分离铜绿假单胞菌具有协同或相加作用，其抗菌活性明显增强。 霹茂，摭程攀怼麓蠡冬一悫酸黢类药物与喹诺联类药物联合楚薮治疗锅 绿假单胞菌感染是切实可行的。 对2 0 拣锔绿骰荸慰菌环嚣沙星瓣蕊拣( 然1 2 8 拣镯缘缓单照毯冁 床分离的环丙沙誉耐药株中按每一m i c 浓度梯魔随机挑选3 株) i i 类 拓扑异构酶g y r a 、g y r b 、p a r c 和p a r e 基因的噱诺酮药物耐药决定区 基因突交与耐药憔关系研究结果显示，9 0 的耐药株l i 类拓扑异构酶基 因发生了突变( 2 0 株中有1 8 株) 。突变主要发生在g y r a 基因( 1 8 株) 和p a r c 基因( 1 0 株) 上，箕中g y r a 蕊因的第8 3 往氨基酸密码予袭 现出高频突变( 1 7 株，a c c a t c ，占耐药突变株的9 4 4 ) ，只有2 拣瓣药撩豹g y r b 静p a r e 基瓣分鬻发生荦赢突交。覆菱叟2 个以上簇 因突变的变异株大都是高水平耐药株。在这些i i 类拓扑异构酶基因突 交醚药拣中，套4 楝对联鸯试验匏喹诺臻和凌酸骏类药耱都表瑗爨 高水平的耐药。表明这些耐翁株，除i i 类拓扑异构酶基因突变引起耐 蕊， ，还可能存在其它形式蛉嗽药枫裁。 对2 0 株铜绿假单胞菌喹诺酮类药物耐药株的g y r a 基因p c r 产物进 行r f l p 分析表明，用p c r 扩增铜绿暇荦胞菌g y r a 基因的喹诺酮耐药 决定区，然后用踟删酶切扩增片段，可快速检测g y r a 基因第8 3 位氮 2 叫川人学搏1 学位论文制绿假单胞耐喹诺酮类药物的分了机制研究 基酸密码子发生点突变的铜绿假单胞菌喹诺酮药物耐药株。 用荧光法测定对环丙沙星不同敏感性的铜绿假单胞菌细胞内环丙 沙星蓄积量研究表明，多重耐药株细胞内环丙沙星稳定态浓度显著低 于敏感株：加入能量抑制剂碳酰氰基对氯苯腙，所有菌株细胞内环丙 沙星蓄积量增加，但只有多重耐药株细胞内环丙沙星的浓度增加显著， 表明多重耐药株具有主动外排作用。 m e x a b o p r m 主动外排是导致野生型铜绿假单胞菌对多种抗生素 产生州药性的主要因素。用p c r 和d n a 测序方法，对m e x a b o p r m 外排系统结构基因o p r m 研究表明，所有菌株的o p r m 基因未发生突变 或缺失。用r t p c r 方法研究o p r m 基因表达结果显示，只有多重耐药 株的o p r m 基因能在r n a 水平上高表达，o p r m 基因的高表达导致 m e x a b o p r m 的主动外排。 对m e x a b o p r m 外排系统的调节基因m e x r 的研究结果显示，铜 绿假单胞菌主动外排多重耐药株p n l 和p n l 6 的m e x r 基因编码第6 6 位氨基酸的碱基发生了单点突变；将含有m e x r 突变基因的重组质粒 p m d l 8 一t m e x r 转化到了铜绿假单胞菌敏感菌p a 2 中，重组菌p a 2 获得 了对环丙沙星的部分耐药性。用r t p c r 方法在重组菌p a 2 中扩增出 了o p r m 基因片段。这说明m e x a b o p r m 主动外排系统，可能受m e x r 基因的调控。因此，我们有理由相信，m e x r 基因将有可能成为筛选抑 制主动外排耐药系统药物的分子靶点。 生物膜细菌具有极强的耐药性和抵抗机体免疫系统作用的能力。 用绿色荧光蛋白基因( g f p ) 标记铜绿假单胞菌敏感株，选用特氟隆作为生 物膜形成的附着物，对铜绿假单胞菌g y r a 基因突变和m e x a b o p r m 主 动外排在细菌生物膜耐药中的作用进行研究。结果显示，在生物膜形 成的过程中，生物膜细菌在m b c 浓度的环丙沙星溶液中4 小时的存活 川人学博l j 学位论文制绿假毕胞耐喹诺酮类药物的分了机制研究 率，呈现出一个与细菌生长曲线相似的规律：无论是敏感株，还是 m e x a b o p r m 主动外排耐药株和g y r a 基因突变耐药株，在生物膜培养 的1 2 小时，部分细菌就能在m b c 浓度的环丙沙星溶液中存活，此时 的生物膜细菌就已经开始显示出对抗菌药物的抗性；成熟的生物膜细 菌，在m b c 浓度的环丙沙星溶液中4 小时的存活率都在5 0 以上。在 生物膜形成的过程中，g y r a 基因突变与m e x a b o p r m 主动外排在生物 膜还未完全形成的前期( 7 2 小时以前) ，对生物膜细菌的耐药起一定的 作用。7 2 小时后，生物膜形成，此时，敏感株与耐药株对抗菌药物的 敏感性没有多大差异。这些研究结果，支持生物膜耐药机制的“生物 膜表型一基因”假说。提醒人们，要克服生物膜细菌引起的感染，最 有效的战略是阻止细菌生物膜的形成；在生物膜形成的早期进行防治， 能起到事半功倍的作用。 关键词：铜绿假单胞菌喹诺酮细菌耐药机制 拓扑异构酶i i 基因突变主动外排多重耐药 细菌生物膜 本课题由美国中华医学基金会( c m b ) 资助 p u 川人学博l 学位论义 铜绿假甲胞耐喹诺酮类药物的分了机制研究 m o l e c u l a rm e c h a n i s m so fq u i n o l o n er e s i s t a n c e i np s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ac l i n i c a li s o l a t e s d o c t o rs t u d e n t ：x u e r ul i t u t o r ： p r o f w e n x i a n gj i a a b s t r a c t p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ab r o u g h tm o r ea n dm o r ep r o b l e m si nt h ep a s t c e n t u r yb e c a u s eo fi t si n t r i n s i cr e s i s t a n c et oav a r i e t yo fa n t i m i c m b i a l a g e n t sa n di t sa b i l i t yt od e v e l o pm u l t i d r u gr e s i s t a n c e ( m d r ) q u i n o l o n e s a r eo fp o t e n ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e sa g a i n s tp a t h o g e n i cb a c t e r i aa n da r e u s e df o rt h et r e a t m e n to f p a t i e n t sw i t ht h ev a r i o u si n f e c t i o n s c i p r o f l o x a c i n h a se m e r g e da so n eo ft h em o s te f f e c t i v eq u i n o l o n e sa g a i n s tp a e r u g i n o s a t h ei n t e n s i v eu s eo f t h ea n t i b i o t i ch a sl e dt ot h ee m e r g e n c eo f t h er e s i s t a n c e s t r a i n ，w h i c hs e v e r e l yl i m i t e di t su s e f u l n e s s i nt h i ss t u d y ，w ec o l l e c t e d12 8s t r a i n so fpa e r u g i n o s ai nf r o mc l i n i c s a m p l e s ，a n di n v e s t i g a t e dt h ea c t i v i t yo ft h ea n t i p s e u d o m o n a ls u c ha s n o r f l o x a c i n ，o f l o x a c i n ，c i p r o f l o x a c i n ，l e v o f l o x a c i n ，c e f t a z i d i m e ，c e f i r i a x o n e ， i m i p e n e ma n dp i p e r a c i l l i n t h em a i nm e c h a n i s m so ft h er e s i s t a n c et o q u i n o l o n e so fpa e r u g i n o s ah a v eb e e na n a l y z e df o rm u t a t i o n si nt h et a r g e t g e n e sa n dm u t a t i o n si nt h er e g u l a t o r yg e n ef o rm u l t i d m ga c t i v e e f f l u x - p u m p ss y s t e m sm e x a b - o p r m ，w e a l s oa s s e s s e dt h er o l e so ft h e m u t a t i o no f 脚a n dm e x a b o p r m e f f i u x p u m p ss y s t e m si nt h e p u 川人学博f j 学位论文铜绿假单胞耐喹诺酮类药物的分了机制研究 r e s i s t a n c eo ft h epa e r u g i n o s ab i o f i l m a l lo ft h e12 8s t r a i n so fpa e r u g i n o s a ，t h er e s i s t a n tr a t et oc e f l r i a x o n e ， n o r f l o x a c i nc i p r o f l o x a c i na r e6 9 5 ，5 7 8 a n d2 66 ，r e s p e c t i v e l y 17o f 12 8s t r a i n ss h o w e dc r o s sr e s i s t a n c et o4d r u g so fq u i n l o n e s ；13o ft h e m d i s p l a y e dr e s i s t a n c et oa l la n t i b i o t i c st e s t e d c o m b i n a t i o no fc i p r o f l o x a c i n o rl e v o f l o x a c i nw i t hc e f l a z i d i m eo rp i p e r a c i l l i nh a st h es y n e r g i ce f f e c t ， a n dt h eb a c t e r i c i d a la c t i v i t i e st op a e r u g i n o s ai n c r e a s e dd i s t i n c t i v e l y t h ed n as e q u e n c eo ft h eq u i n o l o n er e s i s t a n c e d e t e r m i n i n gr e g i o n ( q r d r ) o fg y r a ，g y r b ，p a r ca n dp a r eg e n e s ，w h i c hc o d e dt y p ei i t o p o i s o m e r a s e ，w a sa n a l y z e dw i t hp c ra n dd n as e q u e n c i n gi n2 0c l i n i c a l i s o l a t e so ft h ec i p r o f l o x a c i n r e s i s t a n tp a e r u g i n o s a i tw a si n v e s t i g a t e dt h a t t h ec o r r e l a t i o no ft y p ei i t o p o i s o m e r a s em u t a t i o nt od r u gr e s i s t a n c ei n r e s i s t a n c e so fpa e r u g i n o s at h em u t a t i o ni n t y p e l it o p o i s o m e r a s eg e n e s w a sd e t e c t e do u tf o rm o r et h a n9 0 c i p r o f l o x a c i n r e s i s t a n ti s o l a t e s ( 18o f 2 0s t r a i n s ) t h em u t a t i o nw a sf o u n dm a i n l yi ng y r a ( 18s t r a i n s ) a n dp a r c ( 1 0s t r a i n s ) 1 7i s o l a t e sp o s s e s s e dt h em u t a t i o na tt h ec o d o nf o r8 3a m i n o a c i d ( a c c _ a t c ) i ng y r a o n l y2r e s i s t a n t i s o l a t e sh a dt h em u t a t i o ni n g y r ba n dp a r e , r e s p e c t i v e l y 2r e s i s t a n ts t r a i n sd i dn o th a v ea n ym u t a t i o ni n t y p ei it o p o i s o m e r a s eg e n e s m u t a n t si nm o r et h a noneg e n eo ft h et y p e i i t o p o i s o m e r a s eg e n e sd i s c l o s e dt h eh i g hl e v e lr e s i s t a n c et ot h ea n t i b i o t i c s 4 m u t a n t so ft y p ei it o p o i s o m e r a s eg e n eh a v et h eh i g h l e v e lm u l t i d r u g r e s i s t a n c et oa n t i b i o t i c st e s t e d t h er e s u l to f p c r p r o d u c td i g e s t e dw i t he n z y m es a c l ls h o w e dt h a tt h e m u t a t i o n ，b e f a l l e n e da tt h el o c a t i o nc o d e df o r8 3a m i n oa c i di nq r d ro f g y r do f t h ec l i n i c a li s o l a t e so f pa e r u g i n o s ec o u l db ed e t e r m i n e db y 6 川人学博i ? 学位论义制绿假争胞耐囔诺酮类药物的分了 f 【制研究 r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( r f l p ) a n a l y s i s t h ea c c u m u l a t i o n o fc i p r o f l o x a c i na n de f f e c to fc a r b o n y lc y a n i d e m c h l o r o p h e n y l h y d r a z o n e ( c c c p ) o nt h ea c c u m u l a t i o nw e r em e a s u r e db y f l u o r e s c e n em e t h o di npa e r u g i n o s a t h es t e a d y s t a t ea c c u m u l a t i o n c o n c e n t r a t i o no fc i p r o f l o x a c i nw a sh i g h e ri nt h es e n s i t i v et h a nt h a ti nt h e r e s i s t a n to fpa e r u g i n o s at h ec o n c e n t r a t i o no fc i p r o f l o x a c i nc o u l db e i n c r e a s e db y a d d i n gc c c pi n a l lt e s t e ds t r a i n si nt h ec e l l s ，b u to b v i o u s r e s u l t sw e r eg o t t e nf r o mo n l ym u l t i d r u gr e s i s t a n c e o p r mg e n eo ft h em e x a b o p r me f f l u x w a si n v e s t i g a t e db yp c r ， r t _ p c ra n ds e q u e n c i n gi npa e r u g i n o s a n od e l e t i o no rp o i n tm u t i l a t i o n i no p r m g e n ew a sf o u n di nm d ro rs u s c e p t i b l es t r a i n s t h er e s u l to fo p r m g e n ee x p r e s s i o nm e a s u r e db yr t - p c rs h o w e dt h a tt h el e v e lo fo p r mg e n e e x p r e s s i o nw a sh i g h e ri nm d rs t r a i n st h a nt h a ti no t h e rs t r a i n s h i g h e x p r e s s i o n i n o p r mg e n el e a d s t om d ri nc l i n i c a l i s o l a t e so f p a e r u g i n o s a t h em e x rg e n ei sc o n s i d e r e da sa r e p r e s s o ro fm e x a b o p r mo p e r o n t h ed n af r a g m e n to fm e x rg e n ew a si d e n t i f i e db yp c ra n ds e q u e n c i n g t h ep o i n tm u t a t i o na tc o d o nf o f6 6a m i n oa c i do ft h em e x rw a sf o u n d n m d rc l i n i c a ls t r a i n so fpa e r u g i n o s a ar e c o m b i n a n t p l a s m i d p m d l 8 一t m e x rc a r r i e dt h em u t a n tm e x rg e n ew a sc o n s t r u c t e d t h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dw a si n t r o d u c e dt op a 2 ，w h i c hw a s s u s c e p t i b l et o c i p r o f l o x a c i n ，b yt r i p a r e n t a lm a t i n g t h er e c o m b i n a n tp a 2h a dt h ep a r t r e s i s t a n c et oc i p r o f l o x a c i n ，t h ee x p r e s s i o no fo p r mg e n ei nr e c o m b i n a m p a 2h a sb e e nd e t e c t e db yr t - p c r t h em e x rg e n em a yc o n t r i b u t et ot h e r e g u l a t i o no f o p r m g e n ee x p r e s s i o n 了 u u ，i f 人学博1 擘位论文制绿假单胞耐喹诺酮类药物的分了机制研究 b a c t e r i a lb i o f i l m ss h o wv e r ys t r o n ga n t i b i o t i cr e s i s t a n c e ，b u tl i t t l e m o l e c u l a rm e c h a n i s mw a sk n o w n t h ec o n t r i b u t i o no fm d re f f i h xa n d 拶，卅m u t a n tt oa n t i b i o t i cr e s i s t a n c eo fpa e r u g i n o s ab i o f i l mw a se x a m i n e d b yu s i n gt h es u s c e p t i b l es t r a i nc a r r i e dar e p o r tg e n eo ft h eg f pa n dt h e r e s i s t a n tm u t a t i o n si n 野r ag e n eo rm d re f f i u xt of o r mt h eb i o f i l mi nt h e s a m ec o n d i t i o n s t h em i x t u r eo ft h es u s c e p t i b l es t r a i na n dt h em u t a n to fp a e r u g i n o s aw a si n c u b a t e di na s a l i n e t e f l o ns y s t e mt of o r mt h eb i o f i l mo n t h es u r f a c e so ft h et e f l o np i e c e t h es u r v i v a lp a t t e mo fb i o f i l mb a c t e r i a s h o w e dt h es a m ea st h a to fb a c t e r i a lg r o w t hw h i l et h eb i o f i l mb a c t e r i aw e r e i nm i n i m a lb a c t e r i c i d ec o n c e n t r a t i o n ( m b c ) o fc i p r o f l o x a c i nf o r4h o u r s d u r i n gt h ec o u r s eo ff o r m i n gb i o f i l m t h e r ea r es o m es u r v i v a lb a c t e r i ai n m b cc o n c e n t r a t i o no fc i p m f l o x a c i nf o r4h o u r sa f t e r12h o u r si n c u b a t e dt o f o r mb i o f i l m t h es u r v i v a lr a t eo fb i o f i l mb a c t e r i a ，n om a t t e rw h a tb a c t e r i a f o r m e d ，w a sm o r et h a n5 0 i ni t s m b co fc i p r o f l o x a c i nf o r4h o u r sa f t e r3 d a y si n c u b a t e d t h e r e f o r e ，t h ee x p r e s so ft h em e x a b - o p r me f f i u xa n d g y r am u t a t i o no n l yp l a y e dal i t t l er o l ei nr e s i s t a n c eo fpa e r u g i n o s a b i o f i l mt oc i p r o f l o x a c i ni nt h ef o r e p a r to ft h ef o r m i n gb i o f i l m t h eo p t i m a l s t r a t e g i e sf o rt r e a t m e n ti n f e c t i o n sc a u s e db yb i o f i l mb a c t e r i ai st op r e v e n t f o r m i n gb i o f i l ma n dt r e a ti nt h ep r o - p h a s eo ff o r m i n gb i o f i l ma se a r l ya s p o s s i b l e k e yw o r d s ：p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ； q u i n o l o n e ； r e s i s t a n c e m e c h a n i s m ；m u t a t i o no ft y p ei it o p o i s o m e r a s eg e n e ；a c t i v ee f f l u x ； m u l t i d r u gr e s i s t a n c e ；b a c t e r i a lb i o f i l m ； 8 蛐川大学博 学位论文锕绿馥单藏耐睦诺酮类药镪辩分_ 辊糕鹾究 铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的分予机制研究 嚣鞋基 感染浚疾病迄今为止仍然是对人类社会酶一大撬藏，全球注豹缨 菌抗生素耐药性是近1 0 年来，感染性疾病治疗所面临的一大难题“。 细菌的耐药性引起了医学界及社会的极大关注，成为全球普遍关心的 问题“，一些世界知名学者提出了“抗生豢耐药性危机”、“后抗生素 时代”等足以说明细菌对抗生素耐药的现状。而摘清细菌耐药机制被 认为是竞艨缯萤醛药牲熬关键“。 铜绿假单胞菌广泛存在于自然界，正常人的皮肤、肠道和呼吸道 中，是一静箍凑主簸拳觅懿条箨致瘸莹，尤其露凳子落染免疫力低下 及缺陷病患者，该菌也是主要的医源性病原菌之( 6 ) 。由铜绿假单胞菌 ；| 起的医院内感染嵩达3 0 ，丽晔啜遥感染率曼离，屠瘸漾菌之蕾务。 铜绿假单胞菌经常引起菌舡症、肺炎、泌尿系统感染、烧伤感染和囊 憔纤维化继发感染等疾痫。由于锎绿假单胞菌对多种抗麓药物表现出 天然( i n t r i n s i c ) 域获季导燃( a c q u i r e d ) 多重醚药( m u l t i d r u gr e s i s t a n c e ， m d r ) ，使得治疗铜绿假单胞菌感染十分困难慨 m ) 。 瞳漤翳类兹貔是麦萘啶酸发鼹起来鑫冬健学合残获蘩黎，逶过 辔刽 细菌i i 类拓扑异构酶，阻断d n a 复制而产生抗菌作用。拨其抗菌特性 及骈翻懿年代，分爨敬萘捷酸、躐鞭酸、环丙渗攫帮益饯涉星羡代表 分为四代。第一代和第二代喹诺酮药物，在临床上已逐渐被淘汰。通 过对喹诺酮化学蹈构的修饰，研制出了以l ，4 2 ，氯- 4 氧3 氆! 啉酸为基 本结构的第三代氟喹诺酮类药物。如诺氟沙星，氧氟沙星，环丙沙星、 9 蚪川人学博i ：学位论文 锕绿假单胜酣睡诺酮粪药物的分了机制研究 左氧氟沙星等。因其抗菌作用强，抗菌谱广，在组织、细胞内分布广 泛，不是反应轻等优点纛广泛应曩予| 塔藤“1 5 ) 。 环丙沙耀被认为是临床上治疗铜绿假单胞菌感染最有效的药物之 - - ( i g l 7 。毽隧着该旃的广泛俊蠲，镧绿籁鼙腿菌等憾床常觅菌斡耐药 性逐年上升，近年_ 柬临床分离的铜绿假单胞菌对环闲沙星的耐药率上 升至4 0 ，筷至更高，严重影响其临床应用效果( t 8 - 2 0 7 。 铜绿假单胞菌主要通过以下途径对环丽沙星等疃诺酮类药物产生 耐药性：细菌编码喹诺酮类药物作用靶位的d n a 旋转酶和i v 类拓 卦异桷酶基戮突变，改变了酶戆结擒，镬药铹不能与酶一d n a 复合物稳 定结合，从而逃避抗菌药物的作用( 2 1 - 2 4 ) 。膜屏障与主动外排，限制 药物到达馋瑙靶惫，导致锅绿缓蕈稳薤对多耱菝生索表瑗天然或获褥 性多重耐药( 2 5 - 3 2 ) 。在铜绿假单胞菌中，已发现四类主动外排系统，即 m e x a b o p r m 、m e x c d o p r j 、m e x e f o p r n 和m e x x y o p r m 。其中 m e x a b o p r m 主动外排系统是导致野生型铜绿假单胞菌对飚环素类、 氯霉索类、氯基糖替类、大环内酯爽、1 3 一内酰胺类和喹诺酮类等多种 抗生索产生耐药性的主要因綮。m e x c d o p r j 觏m e x e f o p r n 在实验条 件下并不表达，在铜绿假单胞菌的瓣生菌株中，不存在这两种主动泵 基系绫，它绷与镳绿锻蕈照藏故天然多重囊重菱牲无关，只蠢当萁过发 表达时，参与铜绿假单胞菌获得性多重耐药的形成。形成生物膜。 绥蘩生锈貘( b a c t e r i a lb i o f l i m ) 是近年来零| 起黧内外学者高度蘧褫静一种 细菌群体生物学特性，是细菌吸附于惰性或活性材料表面形成的，幽 细鬣和它所分泌的胞外多聚物组成的外观呈膜状的多菡集合体 ( c o m m t m i t y ) 。由予细菌生物膜具静极强的耐药性和抵抗机体免疫系 统作用的能力，感染了细菌生物膜的组织和污染了细菌生物膜的生物 撼辩，器馒後弼玉鬻瓤量残匿售弱药臻迄浚以治愈，成为浚痣上难治 1 0 叫川人学博l 二学位论文 铜绿假单胞耐喹诺酮类药物的分子机制研究 性感染的重要原因之一。“”。近年来的研究表明，6 5 以上的人类慢性感 染与生物膜有关”) ，引起了人们的极大关注。 本研究从i 临床分离的铜绿假单胞菌着手，首先检测了1 2 8 株铜绿 假单胞菌临床分离株对临床上常用喹诺酮类和0 内酰胺类药物的抗药 性；研究了环丙沙星、左氧氟沙星与头孢他啶、哌拉西林的联合抗菌 作用。获得大量临床分离的铜绿假单胞菌喹诺酮类药物耐药菌株，接 着对耐药株i i 类拓扑异构酶基因突变与耐喹诺酮类药物的关系， m e x a b o p r m 主动外排系统o p r m 结构基因的表达，m e x r 调节基因在 m e x a b o p r m 外排系统中的作用以及g y r a 基因突变与m e x a b o p r m 主动外排在细菌生物膜耐药机制中的作用等进行了较为深入的研究。 对细菌耐药性研究的最终目的是为了克服细菌的耐药性。铜绿假 单胞菌由于自身内在原因，其耐药性在所有细菌中，非常典型，耐药 调节机制十分复杂”。因此，通过对铜绿假单胞菌耐药分子机制一步 步的深入研究，无疑将加深人们对细菌耐药性理解。有助于合理使用 抗菌药物，指导研究开发新的抗菌药物，解决细菌耐药性问题，这是 本课题研究的目的之一：更重要的是，通过试验，获得了数株耐药机 制明确、集多种耐药机制一身的铜绿假单胞菌耐药株，这些耐药株必 将是下一步筛选新的抗耐药细菌药物的最好模型菌株。 心川人学博i 。学位论文锕缘靛单胞蓠耐喹诺酮粪药物的分下机制研究 第一部分铜绿缎单熬菌l 悠床分离株 对抗菌药物的耐药性研究 萼l 畜 镄绿籁肇簸麓楚医院及率主会获褥毪惑染懿重要蘩转致爨蓥，嚣英 内程特点对多种抗菌药物呈现天然或获得性夥重耐药( m d r ) 。特别是临 寨上大量抗麓药瀚豹使用，露敬辩药性静上辩，饺治疗镝绿饭荦麓耱 感染+ 分困难裕8 。蠢越对臻寐分褰豹锯绿弦单蕤麓豹瓣重药瞧进括套 效酌巯淤，研究联合用药治疗钢绿缎荦聪黼弓f 起的痰瘸，对合理选雨 最佳涤疗方絮具鸯积极意义。 本试验蠲二镶疆骣法，对1 2 8 糖铜绿暇挚怒藿壤霖分离拣对瞳诺 酮类药物秘1 3 - 内激骏类药物的摭惶送行了掰究：蘑棋蠢稀释法硬究了 左氧氟沙星、环丙沙星与头獭他啶、哌拉烈林的联合抗菌作用。以期 了黧成罄逮嚣镝绿骰攀鼹萤瓣麓漕嚣，为蕊藤援龚褥供参鸯羲撵，漆 时，获得铜绿假荤胞菌耐药株，为避一步研究耐药机制掇供材料。 誊砉料与方法 1 实验麓瓣 1 1 菌株采潦 镧绿设荦胞麓标准秣a t c c 2 7 8 5 3 由潮翊大学华西激浚检验辩掇 供：1 2 8 糕蠛痰分离锶绿假单臌甍分别来自嫂川大学华硬阪院检验科和 传染科，成都蒂嚣大医院箍骚秘，势经本教舔室鉴是。 1 2 旧川人学博i 学位论文铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的分子机制研究 1 2 抗生素 诺氟沙星( n o r ) 、氧氟沙星( o f l ) 、环丙沙星( c i p ) 、左氧氟沙 星( l v x ) 、头孢曲松( c r o ) 、头孢他啶( c a z ) 、亚胺培南( i p m ) 和哌拉西林( p i p ) 由中国药品与生物制品检定所提供。 1 3 培养基 m h 培养基和m h 肉汤用于所有药物敏感性实验。培养基组成： 3 0 0 9 鲜牛肉制成肉汤1 0 0 0 m l ，淀粉1 5 9 ，胰蛋白水解物1 7 5 9 ，p h 7 2 。 2 实验方法 2 1m i c 的测定 先用纸片法初步确定菌株对抗菌药物的敏感性，再用二倍稀释法 确定m i c ，将细菌接种于m h 肉汤中，3 7 0 c 孵育1 8 h 后，转接种到 m h 肉汤中，3 7 0 c 孵育4 - 6 小时，用定量接种器将菌液接种到含有不 同浓度抗菌药物的m h 液体培养基中( 抗菌药物的浓度为：o 0 1 5 、o 0 3 、 0 0 6 2 、0 1 2 5 、0 2 5 、6 4 、1 2 8 m g l ) ，使液体培养基中含菌量为l x1 0 5 c f u m l ，置3 7 0 c 孵育1 8 h 后观察结果以未见细菌生长的最低浓 度为最低抑菌浓度( m i c ) 。 m i c 结果判断参照19 9 7 年n a t i o n a lc o m m i t t e ef o rc l i n i c a l l a b o r a t o r ys t a n d a r d s ( n c c l s ) 公布标准3 孙，铜绿假单胞菌a t c c 2 7 8 5 3 标准株为质控株。抗菌药物的敏感判定值( m g l ) ：诺氟沙星：敏感 8 ；氧氟沙星：敏感 4 ：左氧氟沙星：敏感 2 ；环丙沙星：敏感 1 ； 头孢曲松：敏感 3 2 ；头孢他啶：敏感 8 ；亚胺培南：敏感 4 ；哌 拉西林：敏感 4 为拮抗作用。 结果 1 喹诺酮类药物对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性 四种喹诺酮药物对临床分离的铜绿假单胞菌体外抗菌活性见表1 1 。 在1 2 8 株铜绿假单胞菌中，对诺氟沙星耐药7 4 株( 5 7 8 ) ，对氧氟沙 表1 - 1 四种喹诺酮类药物对1 2 8 株铜绿假单胞菌的体外抗菌活性比较 t a b l e1 - 1i nv i t r oa n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so f 4q u i n o l o n e st o 1 2 8c l i n i c a li s o l a t e so f p a e r u g i n o s a 0 5 - 1 2 81 66 4 0 5 1 2 81 66 4 o 0 6 1 2 823 2 0 0 6 - 1 2 8 2 8 踟 踟 删 嗍 2 6 ” 8 一 一 岍 一 踟 踟 踟 施 m 则 惭 础 m 眦 粕l | 嘶 唧 h 叫j i 人学博士学位论文铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的分予机制研究 星耐药5 6 株( 4 3 8 ) ，对环丙沙星耐药3 4 株( 2 6 6 ) ，对左氧氟沙星耐 药2 5 株( 1 9 5 ) 。 2 铜绿假单胞菌对4 种喹诺酮类药物的交叉耐药 临床分离铜绿假单胞菌对四种喹诺酮类药物的交叉耐药情况见表 1 - 2 。在1 2