（材料物理与化学专业论文）生物酶法生产13丙二醇过程研究.pdf

摘要 摘要 目前，克雷伯杆菌发酵法生产1 ，3 一丙二醇( 简称1 ，3 - p d ) 成为人们研究的热点，其中，提高 发酵的产物浓度、相对于甘油的转化率及生产强度等是发酵工艺改进的目标。本文研究了生物酶法 生产1 ，3 丙二醇的过程工艺，主要内容如下： 通过正交实验分析了碳、氮、磷等营养物质对发酵的影响程度，然后通过批式流加发酵考察了 细菌生长速率和产物合成速率的关联，以及丁艺改变对最终发酵产物浓度及生产强度的影响。实验 结果表明：三大营养源( c 、n 和p ) 对细菌生长和消耗甘油能力的影响人小为：c n p 。确定以 营养基质氮源限制性流加的发酵工艺，过低的氮源浓度，细菌生长受到限制，影响产物1 ，3 - p d 的 合成；过高的氮源浓度，细菌浓度增加，但1 ，3 - p d 的转化率降低，用于生长和维持代谢所消耗的 甘油量增加；以0 4 1 9 ( l h ) 的氮源流加速率，残余氯化铵浓度在0 1g l 时，转化率和生产强度最高。 发酵2 5 h - - 一2 8 h 后，1 ，3 丙二醇最终浓度达到5 2 0 3g l ，生产强度为2 0 4g ( l h ) ，相对于甘油的摩 尔转化率为0 6 6 ，分别比氮源限制前提高了2 8 0 、3 5 1 及2 9 4 。 分析了克雷伯杆菌代谢过程中3 种关键酶( 甘油脱氢酶( g d h ) 、甘油脱水酶( g d h t ) 和l ， 3 丙二醇氧化还原酶( p d o r ) ) 的变化曲线，发现3 种酶活分别在7h 1 0h 内达到最佳水平。 通过研究甘油、葡萄糖、l ，3 丙二醇及乙酸对发酵过程中3 种关键酶活的影响，实验表明：甘 油浓度在3 0 9 l s 0 9 l 可以很好地促进3 种关键酶活，有利于提高产物的浓度和转化率：较低浓度 的乙酸和1 ，3 丙二醇能促进3 种酶活，在保存培养基中这二者还能较好地诱导及保持酶活。在优 化的保存培养基条件f ，克雷伯杆菌生长能力和生产能力提高。 开展含氮化合物( 尿嘧啶、氯化月且碱及l 一谷氨酰胺等) 、表面活性荆类( c t a b 、曲拉通x 一10 0 、 o p - 1 0 及t w e e n - 8 0 等) 及抗生素类( 青霉素和氨苄青霉素) 对发酵中细菌生长和酶活的影响实验。 实验结果表明：尿嘧啶、o p 一1 0 及氨苄青霉素都能较好地促进3 种关键酶活，并能提高最终l ，3 - 丙二醇浓度及转化率。 0 0 1 9 l - o 2 9 l 的尿嘧啶显著促进了g d h 活性，当浓度继续增大时g d h 活性开始降低，而在 这个浓度范围内g d h t 的活性也有一定的提高：尿嘧啶的适宜添加时间在8i 卜1 2h 。 1 9 l - 。2 9 lo p - 1 0 对g d h 和p d o r 有促进作用，浓度高时对p d o r 效果更明显，而对g d h t 有稍微地抑制作用，o p 1 0 的适宜添加时间8h 1 2h 。低浓度的氨苄青霉素( 低于1 0 0m g l ) 能够 促进g d h 和g d h t 的活性，青霉素的适宦添加时间1 0h 1 4h 。通过t e m 照片发现，o p - 1 0 和氨苄 青霉素都可以改善细胞通透性，促进细菌生长和产物合成。 5l 发酵罐中，在适宜时间流加尿嘧啶、o p 1 0 及氨苄青霉素后，1 ，3 丙二醇浓度及相对于甘 油的摩尔转化率较空白都有明显增长，最大可达到5 6 2 9 l 、0 7 0 m o i m o l ，分别增长了1 7 8 及2 0 7 。 关键词：1 ，3 丙二醇，克雷伯杆菌，酶活，工艺调控，表面活性剂，抗生素 东南人学硕士学位论文 a bs t r a c t a tp r e s e n t , t h ef e r m e n t a t i o no f1 , 3 - p r o p a n e d i o l ( 1 ，3 - p d ) p r o d u c t i o nb yk l e b s i e l l ap n e u m o n i a eh a s a t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o n ，a n di te x h i b i t saw i d er a n g eo fp o t e n t i a lu t i l i z a t i o n s ，e s p e c i a l l ya sm o n o m e rf o r t h es y n t h e s i so fp o l y p r o p y l e n et e r e p h t a l a t e ( p p t ) i nf e r m e n t a t i o n , i m p r o v i n gt h ef i n a l1 , 3 一p d c o n c e n t r a t i o n , t h ev o l u m e t r i cp r o d u c t i v i t ya n dm o l a rc o n v e n t i o ny i e l do fl ，3 - p da r et h eg o a lo ft h e f e r m e n t a t i o np r o c e s s t h ep r o c e s so f t h eb i o l o g i c a la n de n z y m a t i cp r o d u c t i o no f1 , 3 一p dw a ss t u d i e di nt h i s p a p e ra sf o l l o w s ： t h ed e g r e eo fi n f l u e n c eo nt h ef e r m e n t a t i o nf r o mc a r b o n , n i t r o g e n , p h o s p h o r u sa n do t h e rn u t r i e n t s w e = c l - es t u d i e db yo r t h o g o n a it e s t s f r o mt h ee x p e r i m e n t s ，i tw a ss h o w nt h a tp r o d u c tf o r m a t i o nd i r e c t l y l i n k e dt oc e l lg r o w t h ，t h ei n f l u e n c e so ft h r e em a j o rn u t r i t i o ns o u r c e so nc e l lg r o w t ha n dg l y c e r o l c o n s u m p t i o nw e r ef o l l o w e db yc a r b o n ，n i t r o g e n , a n dp h o s p h o r u s e x c e p tc a r b o n , n i t r o g e nc o u l dc o n s t i t u t e al i m i t i n gf a c t o rf o rm a n i p u l a t i n gc e l lg r o w t hb yc o n t r o l l i n gn h 4 c ic o n c e n t r a t i o n u n d e rl e s sn i t r o g e n c o n c e n t r a t i o n , b i o m a s sy i e l dd e c r e a s e dr e s u l t i n gal e s s1 , 3 - p dy i e l d u n d e re x c e s sn i t r o g e nc o n c e n t r a t i o n , a ni n c r e a s eo fb i o m a s sy i e l da n ds p e c i f i cg r o w t hr a t ed i dn o th e l pp r o d u c t i o n , t h i sw a sa t t r i b u t e dt om u c h m o r ec o n s u m p t i o no fg l y c e r o lo nc e l lg r o w t ha n dm e t a b o l i z e i tw a sc l e a r l ys h o w nt h a tt h ev o l u m e t r i c p r o d u c t i v i t ya n dm o l a rc o n v e r t i o ny i e l dr e a c h e dah i g hl e v e lb yc o n t r o l l i n gn i t r o g e ns u p p l yw i t ht h e n 心c if e dr a t eo f0 41g ，( l h ) a n dt h er e s i d u a lc o n c e n t r a t i o nb e l o wo 1g l a f t e r2 5 - 2 8h o u r s ，t h ef i n a l c o n c e n t r a t i o n ，t h ev o l u m e t r i cp r o d u c t i v i t y , m o l a rc o n v e n t i o ny i e l do f1 , 3 一p di nf e d - b a t c hf e r m e n t a t i o n u n d e rn u t r i e n tl i m i t e dc o n d i t i o n sw e r e5 2 0 3e e l ，2 0 4g ( l h ) ，o 6 6r e s p e c t i v e l y ，i n c r e a s e d2 8 0 ，3 5 1 a n d2 9 4 o v e rc o n t r 0 1 d u r i n gt h ef e r m e n t a t i o np e r i o d ，t h et h r e ek e ye n z y m e s ，i n c l u d i n gg l y c e r o ld e h y d r o g e n a s e ( g d h ) ， g l y c e r o ld e h y d r a t a s e ( g d h t ) a n d1 ，3 一p do x i d o r e d u c t a s e ( p d o r ) ，w e r em e a s u r e di n f i x e dt i m e ，a n d e v i d e n c ew a sp r o v i d e dt h a tt h et h r e ek e ye n z y m e sa c t i v i t i e sa c h i e v e da no p t i m a ll e v e lb e t w e e n7 ht o10 h e x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t e dt h a tg l y c e r o lc o n c e n t r a t i o nb e t w e e n3 0 9 lt o5 0 9 n c o u l dw e l lp r o m o t et h e t h r e ek e ye n z y m e sa c t i v i t i e si nf a v o ro fi m p r o v i n gt h ep r o d u c tc o n c e n t r a t i o na n dm o l a ry i e l d l o w e r c o n c e n t r a t i o no fa c e t i ca c i da n d1 ，3 - p dc o u l dp r o m o t et h et h r e ek e ye n z y m e sa c t i v i t i e ，i nt h ep r e s e r v a t i o n m e d i u mb o t hw h i c hw e l li n d u c e da n dm a i n t a i n e da c t i v i t i e s u n d e ro p t i m a ls t o r ec o n d i t i o n , t h ea b i l i t i e so f g r o w t ha n dp r o d u c t i o nf r o mk l e b s i e l l ab a c t e r i u mi n c r e a s e d t h ee f f e r t so fn i t r o g e nc o m p o u n d s ( u r a c i l ，c h o l i n ec h l o r i d ea n dl g l u t a m i n e ，e t c ) ，s u r f a c t a n t s ( c t a b ，t r i t o nx - 1 0 0 ，o p 一1 0a n dt w e e n 一8 0 ，e t e ) a n da n t i b i o t i c s ( p e n i c i l l i na n da m p i c i l l i n ) o nb a c t e r i a l g r o w t ha n de n z y m e sa c t i v i t i e si nt h ef e r m e n t a t i o nw e r es t u d i e d i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ep e r f o r m a n c e s o f u r a c i l ，o p 一1 0a n da r n p i c i i l i nw e r ed e p e n d e n to nt h ea d d i n gc o n c e n t r a t i o na n dt i m e ，l e a d i n gt oe n h a n c i n g t h et h r e ek e ye n z y m e sa c t i v i t i e sa n di n c r e a s i n gt h e1 , 3 - p dc o n c e n t r a t i o na n dm o l a r y i e l d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tu r a c i lb e t w e e n0 0 1 9 lt o0 2 9 lc o u l da c c e l e r a t et h ea c t i v i t yo fg d h s i g n i f i c a n t l yb u tw h i c hw o u l dd e c r e a s ew h e nu r a c i lc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d , a n dt h e ng d h tc o u l di n c r e a s e ab i ta ta b o v ec o n c e n t r a t i o n t h eo p t i m i z e da d d i n gt i m eo f u r a c i li sa t8 h - 1 2 h a na d e q u a t ea m o u n to fo p - 1 0e n s u r e dh i g ha c t i v i t i e so fg d ha n dp d o rw i t hal i t t l ei n h i b i t o nt o g d h t o p t i m i z e da c t i v i t yo ft h ec e l l sw a sm a n i p u l a t e dw i t h1 o g n ，2 0 9 lo fo p - 1 0a n da d d i n gb e t w e e n 8 ht o12 h , a s s o c i a t e dw i t ht h ef i n a l1 , 3 一p dc o n c e n t r a t i o na n dm o l a ry i e l di n c r e a s e dg r e a t l y i nc o n t r a s t , a m p i c i l l i nb e l o wl o o m g lc o u l di n c r e a s et h ea c t i v i t i e so f g d ha n dg d h te f f e c t i v e l yd u r i n g1 0 ht o1 4 h a b s t r a c t i h ed e s t r u c t i o no f m e m b r a n es t r u c t u r eb ya d d i n go p - 1 0a n da m p i c i l l i ni ss e e nt h r o u g ht e m i ti s 锄 e f f e c t i v ew a yt oi m p r o v ec e l lg r o w t ha n d1 , 3 - p dy i e l dw i t hr e g u l a t i o no fc e l l u l a rp e r m e a b i l i t y a d d i n gu r a c i l ，o p - 10a n da m p i c i l l i nr e s p e c t i v e l ya ta p p r o p r i a t et i m et h el ，3 - p dc o n c e n t r a t i o na n d m o l a ry i e l dr i s e dg r e a t l yw i t hc o m p a r i s o nt oc o n t r o lg r o u pi n5 lf e r m e n t o r , i no p t i m i z e dc o n d i t i o nb o t h w h i c hr e a c h e d5 6 2 9 la n do 7 0 m o l m 0 1 i n c r e a s e d17 8 a n d2 0 7 o v e rc o n t r 0 1 k e y w o r d ：1 , 3 一p r o p a n e d i o l ，k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ，e n z y m ea c t i v i t y , p r o c e s sc o n t r o l ，s u r f a c t a n t , a n t i b i o t i c i i i 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：菡鱼查垒 e l 期：上盟业可9 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文 的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文 档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅 和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：莹墨! 主导师签名：呈羔 日期：知7 t 计 第一章文献综述 第1 章文献综述 1 ，3 丙二醇是一种重要的化工原料，目前利用生物法合成1 ，3 。丙二醇有着许多化学合成法无 法比拟的优势，比如，利用可再生资源、产品选择性好、转化率高及产物分离简单等特点。克雷伯 杆菌发酵代谢途径中的3 个关键酶活性对发酵指标有着重要的影响，关于这3 个酶的单体结构、作 用机理及代谢过程中变化的研究成为工艺改进的关键。另外，在发酵过程中添加外源物可以提高发 酵的产物浓度及转化率，也开始被人们广泛关注。 1 11 ，3 丙二醇的性质及发展现状 l ，3 丙二醇( 1 ，3 p r o p a n e d i o l ，简称1 ，3 - p d ) 在常温下是一种无色或淡黄色粘稠液体，略有 刺激的咸味，与水、乙醇、丙酮、氯仿( 三氯甲烷) 、醚等多种溶剂混溶，难溶于苯。其物理性质如 下：比重1 0 5 5 4 ；熔点2 7 ；沸点2 1 0 2 1 2 ；密度( 2 0 ) 1 0 5 9 7 ；折光率( 2 0 1 2 ) 1 4 3 9 8 。 1 ，3 丙二醇的化学结构式为h o c h 2 c h 2 c h 2 0 h ，由于其具有双官能团而且位于两端，它能够 和其他物质聚合形成连续的甲基链，使得聚合物具有良好的伸缩性和回复性。作为一种重要的化 工原料，l ，3 丙二醇( 1 ，3 - p d ) 可用于抗冻剂、洗涤剂、多种增塑荆、防腐剂和乳化剂的合成原料， 也可用于食品、化妆品和制药等行业【l , 2 1 。它也可以替代1 ，4 丁二醇和新戊二醇等中间体用于生产 多醇聚酯以及作为碳链延伸剂；特别是1 ，3 丙二醇可与对苯二甲酸反应，聚合成聚酯纤维( f y l 广r ) ， 是目前合成纤维新品种开发的热点1 3 。5 】。另外，以1 ，3 - p d 为原料合成的油漆，具有很好的弹性和硬 度，用途广泛，如用作蛇管外层涂料、罐头油漆和粉末喷涂等，其品质优良，目前只有价格昂贵的 二醇类( 主要是1 ，6 - 己二醇) 才能与之相媲比1 6 j 。1 ，3 p d 还可用于生产热塑性聚氨酯和用作p v c 的 高分子型增塑剂。 p 1 r t 是继2 0 世纪5 0 年代聚对苯二甲酸乙二醇酯( p e t ) 、7 0 年代聚对苯二甲酸丁二醇酯( p a t ) 之后新实现工业规模的可成纤的聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型聚酯材料。p 1 y r 与 p e t 、p b t 相比，除具有聚酯的耐化学性外，还具有其他更优良的特性，如似尼龙那样的弹性回复 性，在全范围无需添加特殊化学药品即能呈现良好的连续印染特性，抗紫外、臭氧和氮氧化合物， 抗内应力，低水吸附，低静电以及良好的生物降解，可循环利用性等。p 1 阿的优良性能决定了其广 阔的市场前景，但直到1 9 9 5 年才由荷兰s h e l l 公司首先完成p t t 的商品化，商品名为“c o r t e r r a ”1 3 。 此前，l ，3 - p d 生产技术难度大、成本高是限制p t t 大规模生产的主要冈素。 l ，3 - p d 成本的高低直接影响了p t t 的工业化生产和应用规模。目前仅有d u p o n t 和s h e l l 公司 采用化学合成法进行l ，3 - p d 的小规模工业化生产，技术路线分别是德国d e g u s s a 公司的丙烯醛合 成法专利技术和s h e l l 公司自行开发的环氧乙烷合成法。目前国内仅有少量企业和几家科研单位( 黑 龙江石油化工研究院、中科院兰州化物所) 在进行化学法的小规模生产和技术研发，化学合成法设 备投资大、工艺要求严格、操作条件苛刻、副产物多、产品提取难度大、废液处理成本高。此外， 化学合成法的最初原料是不可再生的石油，使得p d 的成本随石油资源的减少、油价的上升而上升。 微生物发酵法生产1 ，3 - p d 具有操作简便、反应条件相对温和、副产物少、污染少且容易处理 等优点，引起了国内外相关企业和研究单位的高度重视。近年来德国生物工程研究中心( g b f ) ，美 国d u p o n t 、g e n e n c o r 公司【7 】，我国清华大学、东南大学、天津大学、大连理工大学、抚顺石油化工 研究院等单位对生物法生产1 ，3 - p d 进行了广泛深入的研究，研究工作集中在细菌代谢机理、关键 酶、动力学特性、基因工程菌构建等方面。目前在欧州己进行过2m 3 单罐规模的l ，3 - p d 发酵中 试，湖南海纳百川生物工程有限公司与清华大学等单位合作研发的将生物柴油副产物粗甘油直接发 东南大学硕上学位论文 酵生产1 ，3 丙二醇工业性试验，于2 0 0 6 年6 月通过了验收鉴定，鉴定意见为“达到了国际先进水 平”、填补了生物法生产l ，3 丙二酵的国内空白”。安徽绩溪的立兴化工有限公司正在进行克雷伯 杆菌的工艺改进及2 吨发酵罐的中试，取得了突破性的进展。 1 1 1 化学合成法 目前化学合成法制备l ，3 丙二醇主要有环氧乙烷羰基化法、丙烯醛水合法、烯醛缩合、醇醛 缩合等。其中前两种方法被人们研究得较多。 1 1 1 1 环氧乙烷法 环氧乙烷法可以一步生成产物，反应以环氧乙烷为原料，与合成气( c o ，h 2 ) 反应生成l ，3 丙二醇。环氧乙烷主要以乙烯氧化制备的，有空气氧化法和氧气氧化法。两步法是首先主要合成为 3 羟基丙醛( 3 h p a ) ，再接着加氢成为1 ，3 丙二醇。两步法采用常规的镍催化剂加氢米合成，比 一步法在催化剂的寿命、成本、回收等方面有较大的经济优越性。s h e l l 公司的1 ，3 丙二醇制各过程 将两步合成一步，中间产物较少。反应过程中使用有机溶剂，用水可从反应混合物中将l ，3 丙二醇 萃取出来。两步法反应步骤如下： 环氧乙烷与c o 、h ：反应生成3 h p a ( c h 2 h o + ( c o + h 2 ) 一h o c h 2 c h 2 c h o 3 羟基丙醛催化加氢制得1 ，3 丙二醇 h o c h 2 c h 2 c h o + h 2 _ h o c h 2 c h 2 c h 2 0 h 环氧乙烷法的关键是催化剂的制备与选择。s h e l l 公司对此做了详细的丁作，最新的专利表明用 改进的钴双瞵配体催化剂和助催化剂体系环氧乙烷羰基化制备3 h p a ，再用传统的催化加氢法生成 l ，3 - p d ，得到很高的产率，这就是所谓的环氧乙烷二步法。该工艺条件为：将环氧乙烷、催化剂、 助催化荆、溶剂置于一高压釜内，加热至适当温度后引入c o 和h 2 ，经过一个管式反应器，反应物与 催化剂接触发生反应，温度在7 0 c 11 0 ，压力为3 4 5m p a 2 0 7m p a ，所得产物可用常规方法 分离【8 , 9 1 。 环氧乙烷法设备投资大，但产品成本价格较低，而且原料比较容易得到，也易于储运，所得产 品的羟基含量较丙烯醛法低；但环氧乙烷路线技术难度大，特别是其催化剂的制备与选用较为复杂。 1 1 1 2 丙烯醛水合法 德国d e g u s s a 公司开发出了以丙烯为原料生产1 ，3 丙二醇的工业化路线i l 州。首先是丙烯氧化 生产丙烯醛，然后在酸性催化剂如酸性离子交换树脂、酸性分子筛或同载的矿物酸的存在下，丙烯 醛水合生成3 羟基丙醛( 3 - h p a ) ，最后加氢成为1 ，3 丙二醇。反应步骤如下： 丙烯氧化为丙烯醛( 3 5 0 、0 2 m p a 下，以钼作为催化剂氧化) c h 2 = c h c h 3 + 0 2 _ c h 2 = c h c h o 丙烯醛水合得到3 羟基丙醛 c h 2 = c h c h o + h 2 0 一+ h o c h 2 c h 2 c h o 3 羟基丙醛催化加氢制得1 ，3 丙二醇 h o c h 2 c h 2 c h o + h 2 +h o c h 2 c h 2 c h 2 0 h 其中丙烯醛法中丙烯醛水合制3 羟基醛，一般采用酸性催化剂，3 习弪基丙醛经过加氢还原为l ， 3 丙二醇。用钠涂布的离子交换树脂为催化剂，反应温度5 0 ，停留时间4 h 时，可以获得较好的 反应效果，丙烯醛转化率为8 9 1 ，3 羟基丙醛重量收率为8 5 1 蚶l 。 商业获得丙烯醛法的方法为丙烯氧化法，d e g u s s a 在负载磷酸的催化剂上通过甘油气相加氢合 成，丙烯醛的第一次商业生产是d e g u s s a 于1 9 4 2 年实现的。它以负载于硅胶上的硅酸钠作催化剂， 2 第一章文献综述 反应温度3 0 0 c 一- 3 2 0 c ，通过乙醛与甲醇气相缩合。1 9 5 9 年s h e l l 公司在氧化铜催化剂上进行丙烯 的气相氧化成丙烯醛。现有烯醛生产都是以含铋、铝等多组分复合催化剂通过丙烯与空气氧化制备 的。 丙烯醛路线反应条件比较温和，技术难度也不是很大，但成本较高。另外，丙烯醛本身也是一 种重要的有机中间体，而且属剧毒易燃易爆物品，难于储存和运输1 2 1 。 1 1 2 微生物法生产1 ，3 丙二醇 尽管化学法是生产1 ，3 - p d 的主要方法而且下艺成熟，但它消耗了人类不可再生的有限资源， 而且造成了环境的污染，生物法则利用可再生物质为原料，反应条件温和，因此人们把目光转移到 生物法生产，并进行了大量的研究工作【l3 1 。生物发酵法是利用某些微生物以适当的有机物质为底物， 将其转化为l ，3 - p d 。目前有三种可行的方法1 1 4 , 1 5 ：( 1 ) 以葡萄糖作底物，用基因工程菌生产1 ， 3 - p d ；( 2 ) 用肠道细菌将甘油歧化为1 ，3 - p d ；( 3 ) 杜邦公司在g e n e n c o r 工业酵母素公司的协作下， 以用d n a 的办法生产出一系列的微生物和酵母素，以谷物糖浆为原料生产出1 ，3 - p d 。 杜邦公司采用单糖( 如葡萄糖和果糖) 、多糖( 如淀粉、纤维素等) 碳水化合物作为原料，在 适当的发酵条件下制备l ，3 丙二醇。2 0 0 6 年11 月2 7 日，d u p o n t 公司在美国田纳西州洛顿市联合 建立了一套生物材料处理设备，在满负荷运作情况下，这套设备以玉米为原料，每年能生产1 亿磅 ( 约合4 5 4 万吨) 1 ，3 - p d ，相当于节省了1 , 0 0 0 万加仑( 约合4 5 6 0 万升) 汽油。利用玉米为原料， 成功实现了1 ，3 - p d 的规模化生产，这标志着以可再生生物资源为基础的l ，3 。丙二醇正式进入商 业化生产阶段。而欧共体国家( 如德国、法国、丹麦等) 也在进行利用过剩的甘油为原料进行发酵生 产1 ，3 丙二醇的研究。由于微生物法在生产条件、生产成本及环境保护等方面具有较强的优势， 因而极具竞争力。 清华大学刘德华等对以克雷伯氏菌发酵生产1 ，3 - p d 进行了研究，发现单独以葡萄糖作为底物 发酵时不生成1 ，3 - p d ；以葡萄糖和甘油为混合底物时，菌体浓度显著提高及转化率显著提高。在 甘油为底物的发酵中，初始发酵培养基中添加5g l 葡萄糖、并在4h - - , 4 0h 进行葡萄糖与甘油混合 液连续流加的条件下，1 ，3 丙二醇浓度、产率及得率较单一甘油为底物的流加发酵结果分别提高 4 1 2 ，3 8 6 和8 3 1 1 6 1 。 大连理工大学环境与生命学院修志龙等开发出以玉米为原料经两步发酵生产l ，3 - p d 新t 艺 1 r l 。他们首先将玉米淀粉变成糖化液；然后用假丝酵母、酿酒酵母、芽孢杆菌、曲霉等好氧菌将葡 萄糖转化为甘油；再用克雷伯氏杆菌( k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ) 和梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i ab u t y r i c u m ) 等 厌氧菌将甘油进一步转化为l ，3 - p d 。其中第一步发酵所得到的发酵液可离心或过滤除去菌体，上 清液可直接进入第二步发酵或者经浓缩后作为第二步发酵的批式添加液，部分菌体可在连续发酵时 循环使用；第一步发酵液也可不离心经灭菌直接进行第二步发酵。2 0 0 4 年1 2 月1 9 日，修志龙教授 主持完成的“微生物发酵法中试生产1 ，3 丙二醇”项目通过鉴定，该项目采用的发酵和分离技术具有 明显的创新性，总体处于国际先进水平。 2 0 0 6 年成立的湖南海纳百川生物工程有限公司利用湖南传统的农业优势，依托清华大学等科研 院所雄厚的科研实力，围绕农业林业可再生资源及废弃物的生物转化和综合利用，进行了1 ，3 丙 二醇的微生物发酵的工业化生产，产品纯度达到9 9 9 2 。产品和样品分别经用户试用，可满足p 1 t 聚合生产的要求。 随着石油价格不断上涨，生物法生产1 3 丙二醇的成本逐渐接近化学法。为替代日趋紧缺的石 油、煤、天然气等化石资源，推进以生物质工程技术为核心的绿色生态材料的发展，生物基多元醇 l ，3 - 丙二醇的技术开发已列入2 0 0 8 年国家发改委生物基材料高技术产业化专项规划。 3 东南人学硕上学位论文 1 2 甘油发酵产1 ，3 丙二醇的代谢途径 甘油发酵的代谢途径可分为两部分1 9 i ：在还原途径中，甘油先后在甘油脱水酶( g d h t ) 和l ， 3 丙二醇氧化还原酶( p d o r ) 的作用下合成产物1 ，3 丙二醇；在氧化途径中，甘油经过甘油脱氢 酶( g d h ) 、二羟基丙酮激酶等酶的催化，经过丙酮酸生成乙酸、乙醇等副产物，并提供a t p 和n a d h 2 给还原途径。两者相辅相成，不可分割。 1 2 1 菌种简介 自然界中已发现几种能以甘油为底物发酵生产1 ，3 - p d 的菌种，但还没有发现可以利用其它有 机物质为底物产生l ，3 - p d 的菌种。主要有 2 0 - 2 2 1 ：肠道细菌中的肺炎克雷伯杆菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 、产气克雷伯氏菌( k l e b s i e l l aa e r o g e n e s ) 、弗氏柠檬菌( c i t r o b a c t e r f r e u n d i i ) 、及肠球 菌( e n t e r o b a c t e r a g g l o m e r a n s ) 、乳杆菌属的短乳杆菌( l a c t o b a c i l l i b r e v i s ) 和布氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l i b u c h n e r i ) 、梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i ab u t y r i c u m ) 和巴氏梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i a p a s t e u i a n u ) ，其中克雷伯杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、弗氏柠檬菌具有较高的甘油耐受强度、转化率 及生产强度，是研究得比较多的3 种菌种1 1 3 1 。 甘油作为微生物发酵的碳源和能源物质，经过微生物代谢后除产生目的产物外，还可能产生乙 酸、乙醇、丁酸、2 ，3 丁二醇、乳酸等副产品，副产物的晕一般较少( 小于5 ) 。发酵的底物、目 的产物及副产品都是微生物生长的抑制剂，对目的产物的转化有重大影响。克雷伯杆菌、丁酸梭状 芽孢菌比弗氏柠檬菌具有较高的甘油耐受力，发酵速度较快。克雷伯杆菌与弗氏柠檬菌属于兼性菌， 而丁酸梭状芽孢杆菌要求严格的厌氧条件。并且克雷伯氏菌的生化特性与大肠杆菌非常相近，这就 为菌种的基因改良和利用基因工程构建新的菌种提供了便利。 1 2 2 甘油发酵的代谢途径 甘油发酵的代谢途径如图1 1 所示。甘油作为唯一的碳源和能源物质，除了一部分形成生物量 外，其余沿着氧化和还原两个平行路径代谢，产生目的产物和副产物。通过氧化途径，甘油在甘油 脱氢酶( g d h ) 的作用下形成二羟丙酮，进一步代谢生成丙酮酸，这一代谢过程是以甘油为底物生长 的微生物的共同代谢途径，为微生物生长提供a t p 和还原当量n a d h 2 ；通过还原途径，甘油在以 维生素b 1 2 为辅酶的甘油脱水酶( g d h t ) 的作用下生成3 兹基丙醛，然后在l ，3 - p d 氧化还原酶( p d o r ) 的作用下生成目的产物1 ，3 - p d 。还原途径所需的还原当量n a d h 2 由氧化途径提供。g d h 、p d o r 、 g d h t 这三个酶的活性对l ，3 p d 的形成产生重要的作用。 在氧化途径中丙酮酸代谢是重要的一步。在有氧的情况下，丙酮酸形成乙酰- c o a 后转入三羧 酸循环。在厌氧的情况下丙酮酸有多个代谢途径，丁酸梭状芽孢杆菌的丙酮酸在铁蛋白氧化还原酶 的作用下产生乙酰c o a ，释放出二氧化碳和氢气；克雷伯杆菌的丙酮酸在丙酮酸- 甲酸裂合酶的作 用下裂解产生少量甲酸和乙酰c o a ，甲酸被甲酸裂解酶分解成氢气和二氧化碳，在肺炎杆菌的丙酮 酸到乙酰一c o a 代谢过程中与丙酮酸一甲酸裂合酶同时并存着另外一种酶，即丙酮酸脱氢酶，该酶被 认为在厌氧的情况下仍能发挥重要作用，尤其在甘油过量的情况下，对产物l ，3 - p d 的最大理论转 化率有较大影响 2 3 , 2 , 1 1 。乙酰一c o a 进一步代谢，丁酸梭状芽孢杆菌最终产生的主要是乙酸和丁酸， 克雷伯杆菌则主要产生乙酸和乙醇，也可能产生少量2 ，3 丁二醇、乳酸。肺炎杆菌在低p h 下发酵 2 ，3 丁二醇的量明显增加【2 5 1 。 4 第一章文献综述 甘油 3 一羟基丙醛 1 ，3 一丙二醇 a d p n a d a t p n a d h 立2 0 生物量 h 二羟基丙酮 i v 二羟基丙酮磷酸 磷酸烯丙醇丙酮酸 c 0 2 二三一丁二酸 7 孓一l 殴 2 n a d h a t p2 n a d ，a d p 7 孓一乳酸 n a d i h n a d 乙酰c o a 瞄 图1 1 甘油发酵生产1 3 丙二醇代谢图 f i g 1 - 1m e t a b o l i cp a t h w a yo fl ，3 - p df e r m e n t a t i o nf r o mg l y c e r o l i 甘油脱水酶，l ，3 丙二醇氧化还原酶，甘油脱氢酶，二羟丙酮激酶 1 2 3 代谢的重要中间物及关键酶 由图1 1 可知代谢过程中的重要中间产物有： ( 1 ) 3 羟基丙醛。3 一羟基丙醛为还原途径中的重要代谢中间物，由甘油在甘油脱水酶( g d h t ) 5 阱 岫 m 队 nk i 酸刈卅1 砸叫叫酮 东南人学硕上学位论文 的作用下生成，并在1 ，3 丙二醇氧化还原酶作用下还原为目的产物l ，3 丙二醇，同时细菌消耗了 氧化途径上生成的过量的还原当量( n a d h 2 ) ，维持了代谢过程的平衡。 ( 2 ) 磷酸二羟基丙酮。研究表明代谢中间物磷酸二羟基丙酮( d h a p ) 的迸一步代谢是非常重要 的，正是它为l ，3 丙二醇的生成提供了还原当量，并为细菌的生长和d h a 的磷酸化提供了必需的 a t p 2 6 ，2 7 1 。 ( 3 ) 丙酮酸。代谢过程中丙酮酸裂解成乙酰c o - a 和c 0 2 是由与丙酮酸有关的酶来催化的：其 中包括铁氧还原蛋白氧化还原酶和丙酮酸甲酸裂解酶。在甘油过量的条件下，丙酮酸氧化成乙酰 c o - a 的过程中产生的还原型铁氧还原蛋白并未全部裂解成h 2 和氧化型铁氧还原蛋白，而是一部分 铁氧还原蛋白的还原能力在产生n a d h 2 中被转移给了n a d + 【2 引。而在由丙酮酸甲酸裂解酶催化裂 解丙酮酸时所产生的还原当量被封闭在甲酸中不能转移给n a d + ，因此丙酮酸在铁氧还原蛋白氧化 还原酶的作用下更有利于还原当量的产生。 甘油歧化过程所涉及到的酶主要有：甘油脱水酶( g d h t ) ，l ，3 丙二醇氧化还原酶( p d o r ) ，甘 油脱氢酶( g d h ) ，二羟基丙酮激酶( d h a k ) ，丙酮酸脱氢酶系( p d h ) ，丙酮酸甲酸裂解酶( p f l ) 等。其 中g d h 、g d h t 、p d o r 这三个酶的活性对1 ，3 丙二醇的形成至关重要。甘油脱水酶是还原途径生 成产物的关键性限制酶【2 啦叼o j ，其活性的增加有助于整个代谢过程的加快以及产物的生成。v b l 2 在 甘油或氧气存在下发生自杀失活，其中的c o - c 键发生不可逆断裂，形成5 慌氧腺苷和烷基钴胺素 类似物；被修饰的v b l 2 和甘油脱水酶紧密结合，使酶失去活性，在再激活蛋白、a r p 、m f + 和游离 v b l 2 存在下被修饰的v b l 2 能够被完整的v b l 2 替代，可复活由甘油或氧气引起失活的甘油脱水酶。 丙酮酸激酶是甘油氧化代谢途径的限速酶。研究发现，即使丙酮酸代谢所需要的酶处于过量表达状 态，经过这些酶的代谢通量也是被严格控制着的。因而丙酮酸的裂解就成了代谢水平上的限速步骤， 严重限制了还原当量的产生，并且可能影响细胞生长，所以提高该酶的活性对1 ，3 - p d 的生产将会 非常有利。 1 3 发酵的工艺调控及高产策略 克雷伯氏杆菌是微生物发酵甘油生产1 ，3 丙二醇的菌种之一，在厌氧及好氧条件下均可代谢 甘油生产l ，