（生物医学工程专业论文）基于多光子激发荧光显微系统的荧光相关谱研究.pdf

华中科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p yf f c s ) o r i g i n a l l y f r o m e a r l y 1 9 7 0i sa p o w e r f u lo p t i c a l m e t h o df o rm e a s u r e m e n to fb i o l o g i c a l d y n a m i cp r o c e s s e s d u et o e x t r e m e l yf a s ts p e e d ，r e l a t i v el i t t l eh a r m t ob i o l o g i c a lt i s s u e so rc e l l sa n dh i g hs e n s i t i v i t y f c si su s e dt om e a s u r ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n t , c h e m i c a li n t e r a c t i o nr o t eo rc o n c e n t r a t i o n ，a n d s oo n i nt h i ss t u d y i n g ，w er e b u i l tt h em u l t i - p h o t o ne x c i t a t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e m r c l 0 2 4a n ds e t u pat w o - p h o t o ne x c i t a t i o n f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y f r e e - f c s ) s y s t e mf o ri n v e s t i g a t i n gm o l e c u l a rd i f f u s i o n t ob u i l das e to fi n t e g r a t e df c s s y s t e mi sm u c he x p e n s i v e at p e - f c ss y s t e mb u i l to nm r c l 0 2 4s y s t e mw o u i dg r e a t l y r e d u c ee x p e n s e s ot h er e c o n s t r u c t i o ni sm u c h s i g n i f i c a n ta n di m p o r t a n t at p e - f c s s y s t e m w a ss o tu p d e p e n d i n g o nt h em u l t i - p h o t o ne x c i t a t i o nf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p em r c l 0 2 4 a c c o r d i n g t ot h eb a s i ct h e o r yo f t p e f c s ，m r c l 0 2 4 s y s t e mw a s a n a l y z e di nd e t a i l i tw a sp r e v e dt h a tt h ef e m t o s e c o n dl a s e r , f l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o na n d c o l l e c t i o no p t i cu n i t , a n dd e t e c t o ro f 吸c 1 0 2 4s y s t e mc o u l db eu s e di nt p e - f c s s y s t e m m r c l 0 2 4s y s t e mc a n td e t e c tt h ef l u o r e s c e n c es i g n a lo fl o wc o n c e n t r a t i o n s a m p l e s b e c a u s ei t sf l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y i sm u c hw e a k t od e t e c tt h ew e a k s i g n a l ，t h e s i n g l e p h o t o nc o u n t i n gc i r c u i ti sn e e d e d s ow en e e de l i c i tt h eo u t p u to ft h ed e t e c t o ri n m r c l 0 2 4s y s t e ma n da d dt oo t h e rc i r c u i t st o s a m p l ef l u o r e s c e n c es i g n a l t h e d a t a c o l l e c t i o nu n i to f t p e f c ss y s t e mw 够r e a l i z e dd e p e n d i n go nt h em i c r o c o m p u t e r8 9 c 51 t h a tc o n t r o u e dc o u n t i n ga n dc o m m u n i c a t i n gw i t hp c t h es a m p l e dd a t a 、】l 骷s a v e di np c t h r o u g hs e r i a li n t e r f a c ea tl a s ta n dp r o c e s s e dw i t ha u t o c o r r e l a t i o na n a l y s i s 1 1 1 ed i f f u s i o no f d y em o l e c u l e si ns o l u t i o nw a si n v e s t i g a t e df r o mt p e f c ss y s t e m t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n to fr b d 锄i bm o l e c u l ei ns 1 1 c q c o s e 瓢岬璐s o l u t i o nw a s c a l c u l a t e d m e a n w h i l e , t h ep h e n o m e n o n p h o t o n - b u r s t f r o ms i n g l e r h o d a m i n eb m o l e c u l ew a so b s e r v e da n di n d i v i d u a lm o l e c u l ew a sd e t e c t e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s p r o v et p e - f c ss y s t e mb u i l to nm u l t i - p h o t o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p eh a st h ea d v a n t a g e s o f h a n d yo p e r a t i o n , h i g hr e l i 蜘a n d l o wc o s t t h er e c o n s t r u c t i o nh a sn oa n yd e s t r u c t i o n t om r c l 0 2 4 s y s t e ma n dd o e m 。ta f f e c ti t si m a g i n gf u n c t i o n w e d e v e l o p e d am a t h e m a t i c sm o d e lt od e s c r i b ep h o t o b l e a c h i n ga n dd i s c u s s e di t se f f e c t o nt p e - f c s o nt h eb a s i so f a n a l y s i s ，t h ec o n v e n t i o n a lt h e o r e t i c a la u t o c o r r e l a f i o nf i m c t i o n n 华中科技大学硕士学位论文 w a sm o d i f i e d i tw a sp r o v e df r o mt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t st h a tt h em o d i f i e de q u a t i o n s c o u l dn o t o n l y e l i m i n a t et h ee f f e c to fp h o t o b l e a c h i n go nt p e f c sa n do b t a i ng o o d e x p e r i m e n t a lp r e c i s i o n ，b u ta l s op r o v i d e am e t h o dt om e a s u r et h el i f eo f p h o t o b l e a c h i n g k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y t w o - p h o t o n e x c i t a t i o n s i n g l em o l e c u l e d e t e c t i o n p h o t o b l e a c h i n g m 华中科技大学硕士学位论文 1 绪论 单分子检测( s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ，简称s m d ) 技术已成为生物、医学、物 理、化学、环境、资源等学科研究中的一项重要手段。s m d 能够检测非均匀聚集相 物质中的单分子，并对它们进行识别、分类和定量描述，也可对化学反应的途径进行 实时监测，尤其是在生理条件下能对生物大分子进行探测并提供分子结构和功能之间 的信息；s m d 也可研究分子的特殊过程，如底物结合、水解以及催化过程等。毛细 管电泳( c a p i l l a r y e l e c t x o p h o r e s i s ，c e ) 、原子力显微镜( a t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y ，a f m ) 和荧光相关谱( f l u o r e s c e n c e c o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y ，f c s ) 是三种能够实现单分子检测 的技术。 f c s 是2 0 世纪7 0 年代发展起来的一种荧光检测方法【i 1 0 1 ，最初目的用于研究极 低浓度生物系统的化学动态特性b 4 】。理论与实验研究很快证实f c s 技术不仅能测量 扩散系数【1 2 , 4 1 、化学反应速率、微观浓度【3 7 。1 3 1 ，而且也能研究群居和旋转动态特 性【5 ，9 ，1 0 】，如利用该技术加深了对脂质在细胞膜内扩散运动的理解嘲。f c s 技术由于具 有高时间、高空间分辨率、适合测量低浓度样品、对样品损伤小等众多优点，已成为 生物化学研究中一种重要的技术手段【卜1 3 】，特别适合活细胞或生物组织内动态过程的 测量【l - s 。 现代电子、光学技术的进步推动了f c s 技术的发展和应用【1 4 1 ，如使用高速灵敏 相关卡，可实时计算相关函数；采用高量子效率雪崩光电二极管( 灿 d ) ，能够减少 暗电流和提高探测信噪比；使用飞秒激光器，能够减小激发体积，降低r a y l e i g h 散射 和m b m a n 散射：采用共聚焦探测技术可减少焦点外背景光干扰和提高探测分辨率【1 1 。 这些技术应用到f c s 系统中很容易实现单分子检测，探索活细胞内的生物过程，从而 推动了f c s 技术在生物、化学领域上的应用【悼阍。 f c s 测量不仅需要激发荧光的高性能激光器、会聚激发光和收集荧光的荧光显微 镜及各种滤光片，而且需要高灵敏的探测器、高速放大电路、数字相关卡和进行数据 处理与分析的软件。购置完整的f c s 测量系统需要两百多万元人民币甚至更多，而系 统的维护需要专业人员，从而限制了f c s 技术的广泛应用。 l 华中科技大学硕士学位论文 与f c s 测量系统一样，多光子激发荧光显微系统( m u l t i p h o t o ne x c i m t i o n f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ) 也是激发荧光，探测荧光信号。多光子激发时荧光分子同时 吸收两个或多个光子，每次吸收会产生等同于被吸收光子能量的分子激发，经过能量 弛豫后发出荧光。该技术用低能量光子实现了非线性激发，具有光毒性小、空间分辨 率高等特点【1 7 珈】，能对组织细胞中的自发荧光或荧光探针标记的分子、离子进行长时 间动态观察和检测。f c s 测量系统与多光予激发荧光显微系统( m r c 1 0 2 4 ，b i o r a d ， u s a ) 中的许多设备相同，一些光路和电路设计要求也相似，如果利用m r c l 0 2 4 系 统中的激光器、显微镜、滤光片等一些设备，引出探测信号，基于8 9 c 5 1 单片机进行 数据采集，在m r c l 0 2 4 系统上实现双光子激发f c s 测量，则对m r c l 0 2 4 系统是一 种重要的功能扩展，不仅可进行荧光成像研究，重要的是可进行生物体系动态过程的 测量：同时系统改造费用低廉，本研究因此具有重要现实意义。另外，m r c l 0 2 4 系 统造价3 0 0 多万人民币，结构复杂，建立f c s 系统中可能面临一定的风险。 基于以上目的，本文在多光子激发荧光显微系统上建立了双光子激发f c s 测量 系统，并应用f c s 系统进行一些相关实验研究，验证f c s 测量原理和系统工作性能。 作为研究背景，本章主要介绍f c s 测量原理、技术特点及当前研究现状，同时分析 m r c l 0 2 4 系统的结构、功能及工作原理，讨论系统改造的基础与可能性。 1 1 荧光相关谱测量原理 宏观物理量如浓度是系统中大量分子的统计平均，它不能反映系统的微观动态信 息。当限制研究系统到一定尺寸范围，此时系统的物理量就受到分予动态性影响，因 此要研究微观动态过程，就必须限制研究系统的尺寸。f c s 系统利用当前激光器和物 镜很容易实现微小激发体积的监测【1 5 2 4 ，从而可研究微观动态过程。通常认为高性能 激光器产生的激光束服从高斯分布 2 0 l ，激光通过显微镜物镜在其焦点附近形成一个微 小的开放单元，称之为激发区域或激发体积，如图1 1 椭球区域，q 、吐分别为激光 光束的横向和纵向腰半径。现代光学技术的进步使得激发区域非常小，特别是多光子 激发，激发体积仅有l n ( 1 0 。5 升) 左右 1 5 , 1 7 - 1 9 1 ，因此就达到了监测、研究微观物理量 的技术手段。 2 华中科技大学硕士学位论文 图1 - ! 激光激发体积 f i g i - 1 e x c i t a t i o nv o l u m eo f l a s e r 荧光相关谱技术是荧光波动的统计相关分析【1 ，2 ”。图1 2 展示了f c s 技术可以研 究的其中三类问题：一，做自由扩散运动的染料分子进入激发区域( 图1 2 圆形区域) 时被激发，由于染料分子在激发区域滞留时间( 通常为m s ) 比其激发态寿命( 通常 为一n s ) 大的多，染料分子在该区域被多次激发而发出大量的荧光光子，这种现象称 为“光子爆发”1 2 2 。另外染料分子也会离开激发区域，因此分子自由扩散造成了激发 区域荧光的波动 3 , 8 , 2 3 - 2 5 ，该波动持续的时间受分子扩散快慢制约；二，染料分子定向 流经激发区域时被激发，从而引起荧光的波动【1 0 , 2 3 - 2 4 ，其持续时间受分子流速影响： 三，分子在激发区域发生化学反应口川如由不发光到发光状态的改变，或分子构象发 生变化也会造成激发区域荧光的波动，其荧光波动时间与化学反应速率有关。通过记 录荧光强度的变化并计算荧光波动的自相关函数，可获取粒子浓度、扩散系数等一些 物理化学参数【3 - i o 甜】。 ， 。c h e m i c a l、 j，r e a c t i o n s c 。崔牟。lf 一 飞，。- 7 釜7 6 图l - 2 荧光波动来源 f i g 1 - 2t h eo d g i no f f l u o r e s c e n c ef l u c t u a t i o n 许多机制都会引起激发区域内荧光的波动，实际中应根据分子所处环境来分析处 理。如果在监测荧光波动过程中，存在多种波动则会给研究问题带来很大麻烦，甚至 无法解决。本文仅仅研究分子自由扩散进出激光激发区域引起的荧光波动，所进行的 华中科技大学硕士学位论文 理论分析与实验研究也是基于溶液中作布朗运动的染料分子。 分子进入激发区域被激发，记录的信号f ( f ) 是时间的函数，可用平均项( f ( f ) ) 和 波动项砸( ，) 来描述 f o ) = ( f ( r ) ) + 卵( f ) ( 1 - 1 ) 波动项携带有系统动态信息。f c s 测量中关注的是波动项而不是平均项【”, 2 4 1 。为提取 动态信息，分析这些波动需要采用合适的数学方法，自相关分析就是一种恰当的方法。 荧光波动的自相关函数为 g ( o - - ( 卵( o 卵( f + r ) ) ，( f ( r ”2 ( 1 - 2 ) 自相关函数是在t 时刻荧光波动信号与一定时间7 延迟的荧光波动信号乘积的积分得 到的。由于，( f ) 与激光强度分布函数、光学传递函数、染料量子效率和探测器探测效 率等密切相关，而且不同生物系统造成荧光波动的原因也不同，因此白相关函数理论 表达式的推导应根据扩散方程、激发光强分布及染料分子所处环境等来推导阱0 6 刀】， 求解推导过程很困难，条件不同，表达式的差异也较大。这里不过多涉及理论公式的 数学推导，而是直接给出做布朗运动染料分予荧光波动的自相关函数表达式，也就是 做布朗运动分子荧光波动的传统经典方程。假定激光光强分布服从高斯分布，则自相 关函数为【7 ，2 3 矧 g ( f 卜而葛篇 s ， 其中t 是三态分子占整个分子的比例；矗是三态分子的特征时间，也称驰豫时间： n 是激发体积内分子的平均数目； d a z 和e o ：分别是激光的横向腰半径和纵向腰半 径，激发体积一一5 研：；d 是分子的扩散系数。如果激发区域内不含三态分子， 则方程( 1 - 3 ) 简化为 1 , 7 , 1 5 2 3 烈3 邛8 i g ( r 卜而i 万疵丽 “舢 当限制染料分子在二维空间布朗运动时，方程( 1 - - 4 ) 简化为n 1 5 2 3 斟】 g ( r ) 2 丽习 1 5 华中科技大学硕士学位论文 获得荧光波动自相关函数理论方程后，计算荧光波动实验自相关函数，并用理论 方程拟合实验数据，就可获取扩散系数、浓度等参数 2 4 , 2 9 - 3 0 1 。 1 1 1 扩散系数d 的确定 用荧光波动自相关函数理论表达式拟合实验数据，可得到分子的扩散时间f 。， 即分子在激发区域内的平均滞留时间。对于单光子激发，满足关系d = 脚? 1 4 d 2 4 0 9 】； 对于双光子激发，则f d = c o ? 8 d 2 4 2 6 , 2 9 1 。因此在已知激光腰半径的前提下，可计算出 分子的扩散系数d 。 对于半径为r 、溶液粘度为”的球形粒子在摄氏温度为t ，扩散系数为d 条件下， 满足s t o k e s e i n s t e i n 方程口6 】 d ：旦 6 ，r r r ( 1 6 ) 方程( 1 - 6 ) 中k 是波尔兹曼常数。在r 、t 1 和t 已知的条件下，可计算出分子的扩散 系数d ，作为f c s 测量结果的验证。另外，根据方程( 1 - 6 ) 也可以计算出粒子半径 r 、粘度t 1 等。 叩= 盖或r = 兰 ， 1 1 2 激光腰半径的确定 自相关函数理论方程拟合实验结果，可获得分子的扩散时间d ，如果分子扩散 系数已知或根据方程( 1 - 6 ) 计算出，则由公式r o = 砰4 d 2 r o = 砰8 d 可以计算出 激光腰半径，从而提供了一种计算激光腰半径的新方法。另外，用方程( 1 - 4 ) 拟合实 验数据，也可得到激光腰半径峨和国，。 1 1 3 激发体积或浓度的确定 由于激光激发体积内平均分子数n 与自相关函数成反比( 推导见附录2 ) 。南(1-8) 而n 又等于染料的平均浓度c 与激发体积的乘积。通常染料浓度c 已知，因此利 5 华中科技大学硕士学位论文 用方程( 1 - 8 ) 可确定平均浓度c 和激发体积 c 2 苦2 硼1。g 【0 ) 或= 石n = 而1 丽 ( 1 9 ) 1 2 荧光相关谱技术特点与分类 1 2 1 荧光相关谱技术特点 虽然f c s 基本理论和技术较为成熟，但由于实验样品个体差异较大、微环境不 同，使其应用存在很大差异。如从f c s 测量的数据中不能解释细胞隔室的几何形状等 等，使f c s 应用不具普遍性【2 4 】。另外，f c s 测量研究依赖于对荧光波动自相关函数 理论方程的预测。不同荧光量子态的化学反应、直线扩散或穿过样品区域的流动都会 造成荧光的波动，造成自相关函数理论方程不同。通常自相关函数的推导非常复杂， 要得到解析表达式很困难【2 4 翊。本文研究基于自由扩散运动引起的荧光波动，所参考 的相关函数是传统的经典理论方程。 f c s 技术与荧光漂白恢复技术( f l u o r e s c e n c er e c o v e r ya n e rp h o t o b l e a c h i n g ， f r a p ) 、单粒子跟踪技术( s i n g l ep a r t i c l et r a c k i n g ，s p t ) 是目前仅有几项能够探测 细胞内扩散或化学反应的技术 2 6 1 。f c s 、s p t 和f r a p 三种技术的主要区别有2 6 】：f c s 适于低浓度样品测量，f r a p 通常用于较高浓度样品测量，因而会扰乱样品的平衡体 系，s p t 标记每个分子，进行单个分子跟踪，揭示分子运动的细节：其次，f r a p 实 验需要大功率，会对研究样品尤其是活细胞或组织产生光漂白，目前光漂白的机理还 不清楚，而f c s 产生的光漂白小：从应用领域来看，f r a p 和s p t 主要应用于扩散研 究，如测量粒子扩散系数等，而f c s 不仅能研究扩散问题，而且具有监视分子群居、 旋转动态特性及化学反应的能力，因此应用更加广泛。 1 2 2 荧光相关谱技术分类 f c s 技术是基于荧光激发的灵敏检测技术，根据其工作方式和测量特点可以分为 不同种类。从工作方式来看，f c s 有三种工作模式【2 7 】：常规工作方式、扫描工作方式 6 华中科技大学硕士学位论文 和成像工作方式；按测量通道可分为单色f c s 和双色f c s i i 2 4 j 。 常规工作方式是最先发展的一种工作模式，该方式固定激光光束，让激光一直照 射样品，探测器监测激发区域荧光的波动2 ”。该方式最初用于膜系结构的测量，如果 染料分子是非流动的，则聚焦激光可能给样品漂白一个“洞”。任何与荧光分子波动 无关的机械运动都会造成荧光的波动，实验应避免其它机械运动【27 1 。另外应选择恰当 的生物样品和采样时间，以便在实验合理时间内采集足够多的数据点，反映荧光波动 的来源和揭示荧光波动的信息或内容。本文以常规工作方式为基础建立f c s 测量系 统。扫描荧光相关谱( s c a n n i n g - f c s ) 是第二种工作方式，它能克服常规工作方式的 缺点。实验中需要扫描聚焦激光光束或扫描样品，此时记录的荧光波动信号不仅是时 间的函数，也是测量位置的函数口7 1 。通过周期性扫描能够提高测量的灵敏度，其波动 的自相关函数中也将携带更多信息。除了分析时间自相关外，还可在短距离内分析粒 子空间特性，但这种工作方式的控制和操作变得很复杂。成像荧光相关谱 ( i m a g i n g f c s ) 是第三种工作方式，它利用c c d ( c h a r g e c o u p l ed e v i c e ) 记录荧光二 维强度分布，把图像中不同象素中的信号在空间上进行自相关运算。相对第一种工作 方式，它在每次采样间获得的不是单个数据，而是大量数据。成像荧光相关谱技术不 需要快速移动样品或移动光学设备1 2 7 1 。 s _ l a e 口爿舅篁k 图1 - 3 单色f c s 测量系统 f i g 1 3 a u t o c o r r e l a t i o n s e t u po f f c s 从测量通道上来看，单色f c s 使用一个激发探测通道监测激发区域内荧光波动， 如图1 - 3 单色f c s 测量系统。激光通过二色镜直接进入物镜汇聚到待测荧光样品上， 7 华中科技大学硕士学位论文 样品发出的荧光被相同物镜收集，经二色镜和发射滤光片到达共聚焦探测小孔( 对于 多光子激发，保留探测小孔没有意义，可把小孔直径调节到最大值i l 8 ”】) ，它能阻挡 焦点外的荧光和其它杂散光，实际上起空间滤波作用。而后荧光到达单光子模式探测 器& p d ( 雪崩二极管) 或光电倍增管( p m t ) 上，探测器输出的光电流经鉴别和放大 后，光电流信号变成数字信号送到相关卡中，相关卡完成荧光信号的记录和自相关函 数的计算。通过软件拟合理论方程，获取样品有关参数和环境信息。针对本所多光子 激发荧光显微系统m r c l 0 2 4 的特点，本文拟建立单色f c s 测量系统。 图l - 4 双色互相关测量系统 f i g 1 - 4 d u a l - c o l o rc r o s s - c o r r e l a t l o n s e t u po f f c s 双色f c s 测量系统使用两个独立的激发探测通道监测同一激发区域内荧光的波 动，如图1 4 【1 , 2 4 。如在测量酶与基质反应时，由于基质与酶基质复合体质量变化比 较小，其扩散时间相差一般不超过2 倍，利用单色f c s 研究二者特性非常困难。此时 可标记两种不同颜色的染料，用两种不同激光来激发。通过二色境将荧光分离到两个 通道中，如一个红光探测通道，一个绿色探测通道，并记录荧光波动信号。对两个通 道的信号进行互相关运算，就可测量二者的反应效率【l 】。因此双色f c s 测量系统需要 两套探测系统和两种波长的激光，而且要求两种波长激光的光路必须重合，以便使激 发体积重合，利用双光子激发技术可以很好的解决光束重叠问题。建立双色f c s 测量 系统成本更高，从而限制了其实际应用。 r 华中科技大学硕士学位论文 1 3 荧光相关谱技术研究概况 徽鼹繇境中分子运动或分子溺爱痤静实对、稳定、离精度溺量一直是簪内矫科 技入烫关注酌重要前沿谦题。1 9 7 4 年e l s o n 等掇出的荧先稠关谱概念和原理1 3 “， 为探索粒子运动规律提供了可能，但当时许多技术达不捌或设备非常昂贵，制约了 荧光相关谱的发展和应用。当时筒临的基本问题是，荧光波动仪发生在一个微小的 体积内，背景很高，粒子运动或化学反应又很快，很难快速有效检测荧光信号。单 光子激发光束腰半径达到微米水平，光束纵向却不受限制，因艇f c s 技术早期仅 局限予二维系绞款测基，翅磷究纲慰膜串脂鹱搽铃竣扩散，搜鬟薄榉品霹黢裁缎两 ( z 辘) 必寸【2 6 】。近年来菸聚焦探测技术应翔到荧光相关谱中，残功遮解决了体积 限涮瀚题，实现了厚样品的三维扩散研究。键是，共聚焦探测技术由于采用探测小 孔限制探溯体积以提高其分辨率，从而会降低荧光收集，不幂u 于低浓度样品或活体 实验的测量f 2 6 】。利用双光子激发技术，可实现对厚样品中亚体积的激发，使f c s 测 量拥有多光子激发的众多优点，适合活细胞内动态过程的测攫 2 6 , 2 8 - 2 9 l 。 现代电子光学技术的进步推动了f c s 技术快速发展謦珏推广应用【h l ，凭偻其寒灵 敏度积光遴选择性熬伐点，f c s 技术曩蕊广泛应媚到物璞、纯学、生物镁蠛 3 0 - 3 瓠。 基藩毒场上已推出裔晶化缀嵩敢产品，懿z e i s s 公司磷毹的c o n f o c o r 2 系统，可以实 袋菸聚焦捐描成像_ 襁共聚焦f c s 灏量，其有集成程度商、功能强大、操作简便等优 点静懿。 目前f c s 原理与技术实现较为成熟，国外研究主要侧重于该技术的推广应用， 发表了多篇影响因子很高的论文，如p n a s 、b i o p h y s j 等杂志。这些研究多集中在数 学模型的建立、相关解释及应用该技术研究薮问题，如测蹩粒子童径、稀溶波p h 值 等。国内仅奏渍华大学开鼹f c s 磷究，主要磺究鸯：利用m o n t ec a r l o 方法模拟激光 梯度场下糍剥粒子瓣东襄运动 3 7 1 ，分橱梯度场对f c s 测羹得到静扩教瑟闷、粒予数 等参数的影确释瓤。国蠢滏来开展该技术在生物、仡学等领域静实际应粥。药物筛选等 功麓的实现，使入裘越来越意谈到f c s 技术具有广阔的市场和应用空间，广大需求会 为开发与究善该技术撼供用之不竭的市场动力。 9 华中科技大学硕士学位论文 1 4 多光子激发荧光显微系统简介 1 4 1 多光子激发荧光显微系统 图1 5 是本所多光子激发荧光显微系统( m r c l 0 2 4 ，b i o - r a d ，u s a ) 。m r c l 0 2 4 系统可进行多光子激发荧光扫描成像和单光子激发共聚焦扫描成像 3 9 1 。两种成像功能 的主要区别是激光光源的不同和探测器p m t 前面的探测小孔i r i s 。共聚焦成像的激光 光源是几个m w 的连续光，而多光子激发使用的是峰值功率为几百万瓦的超短脉冲。 m r c l 0 2 4 系统基本工作原理是：软件l a s e r s h a r p 控制打开激光快门，让激光通过物 镜照射生物样品，焦点处的样品被激发出荧光，荧光被探测器p m t 接收，探测器输 出信号经放大和计算机处理得到该点荧光强度，由计算机控制振镜扫描光束实现x y 方向扫描和通过电机旋转显微镜焦距获得z 方向扫描，借助计算机图像处理技术，从 而获得二维或三维图像。m r c l 0 2 4 系统自带的控制处理软件l a s e r s h a r p ，可以很方便 控制、操作实验测量，完成组织或细胞层面扫描和三维图像重建等工作【3 9 】。 f 哪l f l 酣 图1 5 多光子激发荧光显微系统 f i g 1 5 s c h e m a t i cd i a g r a mo f m u l t i - p h o t o ne x c i t a t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e m r c l 0 2 4 系统中多光子激发光源是t i ：s a p p h i r e 飞秒激光器，平均功率达i w ，瞬 时功率可达2 5 0 m w ；i v i r c 1 0 2 4 系统还带有一，+ 激光器( 有4 8 8 n m 和5 1 4 r i m 两条激 1 0 华中科技大学硕士学位论文 发谱线，输出功率为2 5m w ，采用气体冷却方式，a m e r i c a nl a s e rc o r p o r a t i o n ) 用于 单光子激发成像。通过软件l a s e r s h a r p 可方便选择两种激光器，并通过转动中性滤光 片n df i l t e r 来选择激发功率。 扫描由振镜( g a l v o m e t e rm i r r o r ) 控制实现，扫描尺寸是从1 2 8 1 2 8 象素到 1 2 8 0 x 1 0 2 4 象素。最慢扫描速度是6 s 获得一副1 2 8 0 x 1 0 2 4 的图像，最快的扫描速度是 o 5 s 获得一副1 2 8 x 1 2 8 的图像。在显微镜的聚焦手柄上装有一个步进电机，由 l a s e r s h a r p 自动控制步进电机，实现z 方向上的扫描，z 方向扫描间距最小为0 1 埘。 扫描系统可完成x y 、x y z 、x y t 、】【z 等不同方式的扫描【3 针。 m r c l 0 2 4 系统配有三个高灵敏度p m t ( i m e r n a ld e t e c t o r ) 收集荧光，分别收集红 光、绿光、红外光三个波段的荧光，还有一个p m t 收集样品透射光，给实际实验操 作带来很大便利。这些p m t 的偏置电压都可通过软件l a s e r s h a r p 来调节。另外， m r c l 0 2 4 系统还带有三个外部探测器p m t ，可在减少光损失的情况下更高灵敏度的 检测荧光，其偏置电压由外置控制器来调节【3 9 l 。 1 4 2 m r c l 0 2 4 系统改造可行性分析 从光源上看，m r c l 0 2 4 系统带有两套高性能激光器：一套是t i ：s a p p h i r e 飞秒激 光器，波长在6 9 0 1 0 5 0 r i m 之间连续可调，可满足多种荧光染料的多光子激发。另一 套是连续光a r + 激光器；从光汇聚与荧光收集看，m r c l 0 2 4 系统拥有高档显微镜 1 r e 2 0 0 0 ( n i k o n ，j a p a n e s e ) ，显微镜带有不同数值孔径的物镜供选择：从光束分离上看， m r c l 0 2 4 系统带有多种滤光片，能满足不同波长激发光与荧光的分离；从信号探测 上来讲，m r c l 0 2 4 系统拥有不同特性的探测器p m t ，可满足特定波长荧光的收集。 所有这些设备也是f c s 测量系统必需的，这就为系统的改造提供了可能。 m r c l 0 2 4 系统需要扫描才能获取荧光图像，其图像分辨率就由光源和光学系统决 定。而f c s 关注的是激光激发微小区域内荧光的波动，它只需光束一直照射样品，监 测激发区域内荧光的变化。因此，f c s 关注的区域就是激光扫描成像中的一个扫描点。 要在m r c l 0 2 4 系统上进行f c s 测量，就必须阻止光束扫描。通过测试发现，m r c l 0 2 4 系统自带软件l a s e r s h a r p 具有锁定光束扫描的功能，通过选择p a r kb e a m 菜单选项可 阻止光束扫描，从而为系统改造节省了时间和开支。 l l 华中科技大学硕士学位论文 f c s 测量的是低浓度荧光样品，其荧光信号非常微弱，需要单光子计数技术，因 此探测器p m t 之后的电路部分和信号处理与荧光成像方式完全不同，需要另外建立 单光子计数电路完成荧光波动信号的检测。但是，m r c l 0 2 4 系统中的激光器、滤光 片、探测器可以利用，如果在m r c l 0 2 4 基础上引出信号，基于8 9 c 5 1 单片机建立数 据采集和控制系统，只要系统拥有足够快的速度和较大的动态范围就可实现激光激发 区域内荧光波动信号的监测。因此，m r c l 0 2 4 具备改造f c s 测量系统的许多有利条 件，进行f c s 测量和荧光成像可以使用相同的激光器、显微镜、各种组合滤光片及探 测器，因而可在同一光路上实现两种功能的测量，既能节省实验室空间，又能降低设 备成本。但是，m r c l 0 2 4 系统复杂，价格昂贵，完成这样的改造具有一定的风险。 1 5 本文主要研究内容 荧光相关谱技术已成为生物物理、生物化学领域一颗璀璨的明星【悼1 6 1 。f c s 融入 当今最新技术，满足当前灵敏探测的需求，越来越受到广泛应用。本文探讨了荧光相 关谱测量原理和技术实现要求，在分析多光子激发荧光显微系统m r c l 0 2 4 基础上， 利用其激光器、显微镜、滤光片和探测器等一些设备，建立了双光子激发荧光相关谱 测量系统，并利用该系统研究了染料分子r h o d a m i n eb 在蔗糖溶液中的扩散运动，验 证f c s 测量原理和系统工作性能。本文内容概述如下： 第l 章绪论，首先介绍了荧光相关谱测量原理、技术特点以及该技术测量分类和 国内外研究现状。随后分析了多光子激发荧光显微系统m r c l 0 2 4 的工作原理和内部 系统结构，评估和总结出m r c l 0 2 4 系统中许多设备器件可以用于双光子激发荧光相 关谱测量。 第2 章从工程技术角度详细分析了多光予激发荧光显微系统m r c l 0 2 4 ，重点分 析其光路部分、探测电路、系统控制及系统特性参数等。在分析测试基础上，建立了 双光子激发f c s 测量系统。f c s 系统中的数据采集硬件部分主要基于单片机8 9 c 5 1 ， 由其控制对光脉冲盼计数，通过8 9 c 5 1 内部串行i o 端口与p c 机进行通信，并把采 集到的数据保存到p c 机中，进行自相关分析和处理。利用b o d a a d c + + 语言编译开发 了数据采集应用程序，可在监视器上实时显示数据采集过程。最后测试了双光子激发 1 2 华中科技大学硕士学位论文 f c s 系统参数，并对测量系统进行了噪声分析。 第3 章利用搭建的双光子激发f c s 系统测量出r h o d a m i n b 在溶液中的扩散系数， 实现了r h o d a m i n eb 分子的双光子激发，观察到“光子爆发”现象。利用该系统研究 了探测器p m t 前探n d , 孑l 对双光子激发f c s 测量的影响，实验结果与理论分析相一 致。通过实验数据分析，证明基于m r c l 0 2 4 系统建立的f c s 系统是成功的，且具有 可靠性高、费用低廉等优点。另外，对f c s 测量过程中发现的一些问题进行了讨论， 以便更深刻地理解和认识荧光相关谱技术。 第4 章探讨了光漂白对双光子激发荧光相关谱测量的影响，发展了一种利用荧光 相关谱技术分析光漂白的方法。光漂白是荧光诱导中普遍存在的现象，这里假设存在 光漂白，建立了一种数学模型描述光漂白，并分析了光漂白对荧光相关谱测量的影响。 在实验基础上对传统理论方程进行修正，从而保证在有光漂白的条件下荧光相关谱测 量的准确性。 第5 章是全文的总结。 1 3 华中科技大学硕士学位论文 2 荧光相关谱测量系统设计与建立 多光子激发荧光显微系统m r c l 0 2 4 由光源、激发与收集光学系统、扫描控制系 统及信号检测系统组成，可以提供多种波长的激发光，能获取多种样品二维或三维荧 光图像1 3 9 1 。荧光成像与荧光相关谱都是以荧光诱导为基础，激发荧光染料、从激发光 中分离出荧光信号，因此m r c l 0 2 4 系统中一些设备可用于荧光相关谱测量。本章以 f c s 测量原理为指导，从工程技术角度详细分析m r c l 0 2 4 光路部分、探测电路、系 统控制及特性参数等，进而总结m r c l 0 2 4 系统中哪些单元器件可用于f c s 测量。分 析研究m r c l 0 2 4 系统是本课题的重点，只有分析处理好才能有效的建立f c s 测量系 统，避免破坏m r c l 0 2 4 系统。在分析测试基础上，引出探测信号，随后本文基于单 片机8 9 c 5 1 建立了控制和数据采集系统，信号通过串口保存到p c 机中作自相关分析。 最后对所搭建的f c s 系统进行参数测试和噪声分析。 2 1 荧光激发与荧光收集 由于f c s 关注的是激发区域内荧光强度的变化，如果光源自身发生抖动势必会 给监测带来虚警信息，在此基础上开展任何研究都毫无意义，因此保证光源的稳定性 是f c s 测量成功的先决条件。一般要求激光器稳定度不低于1 【3 6 】，m r c l 0 2 4 系统 中的t i ：s a p p h i r e 激光器满足激发光源的要求 2 6 , 3 9 ，而且其输出波长连续可调，能满足 不同染料分子的激发。利用m r c l 0 2 4 系统自带软件l a s e r s h a r p ，可方便选择中性滤 光片( p o w e r = 1 ，2 ，一，8 0 ，1 0 0 ) ，获得不同功率的激发光。实验中应根据样品选 择恰当的激发功率从而避免漂白样品。 p m t f i i t 盯 d i e h r o i er o b r a t o b j e c t i v e s m n p l e 图2 - l m r c l 0 2 4 系统激发与荧光收集光路 f i 9 2 1o p t i c a ld i a g r a mo f m r c l 0 2 4 1 4 几芊芑一 口毛一 回 华中科技大学硕士学位论文 图2 - 1 是m r c l 0 2 4 系统的激发与荧光收集光路【3 9 1 ，光源、激发光和荧光共面， 属于共线性设计，这种设计为采用高数值孔径的物镜提供了可能。激光通过显微物镜 后形