（材料学专业论文）蛋白质大分子印迹琼脂糖基聚合物微球的研究.pdf

中文摘要 以琼脂糖为蛋白质大分子印迹基材，色拉油为油相，分别以卵白蛋白( e a ) 、 牛血清白蛋白( b s a ) 和溶菌酶( l y z ) 为模板分子，采用反相悬浮凝胶法制备 了的蛋白质大分子印迹琼脂糖聚合物微球( p a g rm i p m s ) ，优化了成球条件及 模板分子脱除液。研究了e a 。a g rm i p m s 的特异重结合性并探讨了影响因素。比 较了各不同p a g rm i p m s 对各自目标分子的重结合动力学、平衡重结合量和印 迹效率时间曲线，考察了l y z a g rm i p m s 在不同底物浓度中的重结合动力学， 并用e a a g rm l p m s 和b s a a g rm i p m s 做了目标分子交叉重结合实验。采用光 学显微镜观测了微球形貌与粒径大小，用u v 分光光度计检测并尝试了用电导率 仪检测重结合实验中蛋白质浓度的变化。 实验表明，油水比、分散剂、搅拌速度和琼脂糖浓度是影响其粒径和分布的 重要因素，当琼脂糖溶液浓度为2 5 ( w v ) 、油水比为4 1 、搅拌速度为4 2 0 印m 时成球效果最好，此时微球平均粒径为2 4 0 岬，多分散指数为o 2 4 ；s d s ( 0 0 0 1m o l l ) n a c l ( 0 0 0 l m o l l ) 缓冲溶液适合用于大分子印迹琼脂糖的脱除液； 三种印迹微球都有一定的印迹效果，但重结合性因模板分子的不同而不同；研究 还表明环境电解质的种类、温度等因素对e a a g rm l p m s 重结合性能有一定的影 响。 根据三种蛋白质印迹微球对各自目标分子的平衡重结合量、重结合动力学比 较以及b s a a g rm i p m s 与e a a g rm i p m s 的竞争动力学实验和重结合热力学研 究结果，我们讨论了琼脂糖为蛋白质大分子印迹基材时的特点，推测该类印迹微 球重结合过程中印迹孔穴起主导作用。另外，由p a g rm i p m s 的重结合选择性 能分析，b s a a g rm i p m s 和e a a g rm i p m s 都有一定的重结合选择性，其中相 对分离因子p 分别为1 19 和1 3 4 。 关键词：蛋白质大分子印迹；琼脂糖；大分子印迹琼脂糖聚合物微球；蛋白质； 反相悬浮凝胶法；特异重结合；印迹效率；卵白蛋白( e a ) ；牛血清白蛋白( b s a ) ； 溶菌酶( l y z ) a bs t r a c t p r o t e i n m a c r o m o l e c u l a r l yi m p r i n t e da g a r o s e b a s e dp o l y m e rm i c r o s p h e r e s ( p a 矿m i p m s ) w e r ep r e p a r e db yr e v e r s e dp h a s es u s p e n s i o ng e l a t i o n ，u s i n gs a l a do i l a s m e d i u m ，u s i n ge g ga l b u m i n ( e a ) ，b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n dl y s o z y m e ( l y z ) a st e m p l a t e sr e s p e c t i v e l y ，t h ec o n d i t i o n so ft h ep r e p a r a t i o np r o c e s si n c l u d i n g a m o u n to fd i s p e r s a n t s ，r a t i oo fo i lt ow a t e r ，a g a r o s ec o n c e n t r a t i o n ，a n ds t i m n gr a t e w e r eo p t i m i z e d t h er e m o v a ls o l u t i o nf o rr e m o v i n gt e m p l a t e sw a sa l s oo p t i m i z e d t h er e b i n d i n gp e r f b r n l a n c ea n di t s i n f l u e n c i n gf a c t o r so fe a - a g rm i p m sw e r e s t u d i e d f u n h e rm o r e ，t h er e b i n d i n gd y n a m i c sa n dt h er e b i n d i n gc a p a c i t ya n dt h e i m p “n t i n ge 踊c i e n c y ( i e ) o ft h ep - a g rm i p m sm a d eb yd i 仟e ：r e n tt y p e so fp r o t e i nt o o b j e c t i v em o l e c u l e sr e s p e c t i v e l yw e r ec o m p a r e d ，t h e nt h er e b i n d i n gd y n a m i c so f l y z a g rm i p m si n d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ns o lu t i o nw a so b s e r v e d ，a tl a s tt h e r e b i n d i n gc o m p e t i t i o nk i n e t i c so fe a a g rm i p m sa n db s a - a g rm i p m st or e l e v a n t t a 唱e tm o l e c u l e sw a ss t u d i e d t h em o 叩h o l o g yo ft h em i p m sw a so b s e r v e db yo p t i c s m i c r o s c o p e t h e r e b i n d i n gp r o p e r t i e s w e r et e s t e d b y ahi t a c h iu v - 18 0 0 s p e c t r o p h o t o m e t e ra n d ad d s j 一30 8 ac o n d u c t i v i t ym e t er t h er e s u l t so fe x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h er a t i oo fo i lt ow a t e r ，d i s p e r s a n t ， a g a r o s ec o n c e n t r a t i o na n ds t i 州n gr a t ew e r em a i n l yf a c t o r si n f l u e n c i n gt h ep a r t i c l e s i z ea n di t sd i s t r i b u t i o no fm i p m s w h e nt h er a t i oo fo i lt ow a t e rw a s4 1 ，a g a r o s e c o n c e n t r a t i o nw a s2 5 w v ，a n ds t i r r i n gr a t ew a s4 2 0r p m ，t h ea v e r a g es i z ew a s2 4 0 m a n dt h e i rp a r t i c l ed i s t r i b u t i o ni n d e x ( p d l ) w a s0 2 4 t h eo p t i m a ls e l e c t i o no fr e m o v a l s o l u t i o nw a st h eb u f f e rs o l u t i o no fo 0 01m o l ls o d i u md o d e c y ls u l f o n a t e ( s d s ) a n d 0 0 01m o l ln a c l 。a um i p m sw i t hd i 行e r e n tt y p e so fp r o t e i nh a dai m p r i n te f r e c t ， w h i c hw a sd i 仟- e r e n ta st h et e m p l a t e sw a sd i f f e r e n t i na d d i t i o n ，f a c t o r ss u c ha st h e t y p eo fe l e c t r o l ”ei nr e b i n d i n gs o l u t i o na n dt e m p e r a t u r ec o u l dh a v ea ni n f l u e n c eo n i ea n dr e b i n d i n gc a p a c i t ) ，o fm lp m s a c c o r d i n gt ot h ec o n t r a s te x p e r i m e n t so nr e b i n d i n gc a p a c i 够a n dr e b i n d i n g d y n a m i c so fp a 矿m i p m sw i t ht h r e et y p e so fp r o t e i ni m p r i n t e dt oo b j e c t i v e m o l e c u l e sr e s p e c t i v e l y ， r e b i n d i n gc o m p e t i t i o nk i n e t i c so fe a a g rm i p m sa n d b s a a g rm i p m st od i f r e r e n tr e l e v a n tt a 唱e tm o i e c u l e sa n dt h er e s u l t so fr e b i n d i n g t h e n l l o d y n a m i c so fp - a 伊m i p m s ，w ed i s c u s s e dt h ec h a r a c t e “s t i c so fa g a r o s ea c t i n g a st h em a c r o m o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r i cm a t r i xa n dc o n c l u d e dt h a ti m p r i n t e d c a v i t i e sp l a y e dai e a d i n gr o l ed u r i n gt h ep r o c e s so fr e b i n d i n g f u r t h e rm o r e ，a c c o r d i n g t ot h ea n a l y s i so fs e l e c t i v er e b i n d i n ge x p e r i m e n t s ，b o t he a a 舒m i p m sa n db s a - a 旷 m i p m se x h i b i t e da ne f f e c to fs e l e c t i v er e b i n d i n gc a p a c i 吼f o rw h i c ht h es e p a r a t i o n f a c t o r s ( p ) w e r e1 1 9a n d1 3 4r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ： p r o t e i n m a c r o m o i e c u l a r l yi m p r i n t i n g ；a g a r o s e ； m i p m s ( m a c r o m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e rm i c r o s p h e r e s ) ； p r o t e i n ； r e v e r s e dp h a s e s u s p e n s i o ng e l a t i o n ；r e b i n d i n g ；l e ( 1 m p r i m i n ge m c i e n c y ) ；e a ( e g ga l b 啪i n ) ；b s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) ；l y z ( 1 y s o z y m e ) 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：硷言鲁 签字日期：_ 内2 年9 占月哆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：垮穿耳 签字r 期：扪8 年。占月0 日 聊签名谚j 签字日期：梅( 月) 同 第一章绪论 1 1 蛋白质大分子印迹 第一章绪论 1 1 1 分子识别和分子印迹技术简介 分子识别的概念通常认为源自生物学抗原抗体的特异性结合过程，一般是 指特定分子与目标分子间由弱作用力所表现的特异性的分子间相互作用，是整个 生物学普遍存在和特有的现象，广泛存在于不同的生物大分子之间，例如蛋白质 类激素、植物凝集素、外源凝激素或药物与受体之间，蛋白酶与蛋白质底物之间， 在生物进化中起着特殊而重要的作用，是从分子水平研究生物现象的重要化学概 企【l 6 】 j c 尘 。 分子识别是生命体活动赖以进行的精密的分子运动行为，是指生物分子彼此 之间或与小分子之间特异性地结合成复合物的过程【。7 1 ，能够完成分子识别的分子 对之间通常具有特异性识别位点和形状互补性两方面特点，其作用力具有专一性 和特异性1 8 j 。 分子印迹借鉴了生命活动中分子识别的完成方式，力图人工赋予合成材料一 些分子识别的特性，并且通过各种手段，使分子印迹材料的性能在某一方面得到 强化。 分子印迹技术【啦! 1 】( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，m i t ) 是采用人工方法制 备对特定分子( 模板分子) 具有专一性重结合作用的聚合物的技术【7 1 ，这种聚合 物被称为分子印迹聚合物( m i p s ) ，它有三大特点1 1 2 ，1 3 】：( i ) 预定性 ( p r e d e t e m i n a t i o n ) 人们可以根据不同的目的制备不同的m 1 p s ，以满足各种不 同的需要；( ) 识别性( r e c o g n i t i o n ) 因为m i p s 是按照模板分子( t e m p i a t e m 0 1 e c u l e ) 定做的，它具有特殊的分子结构和官能团，能选择性地识别模板分子； ( ) 实用性( p m c t i c a b i l i t y ) 表现在它与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗 原与抗体、受体与激素相比，具有抗恶劣环境的能力，表现出高度的稳定性和长 的使用寿命，且制备过程较简单。 1 1 2 分子印迹技术的原理 第一章绪论 分子印迹聚合物的制备一般包括如下三个过程”】：( 1 ) 使模板分子与 功能单体之间通过共价键( c o v a i e m ) 或非共价( n o n _ c o v a i e n t ) 作用结合，形成 主客体配台物( h o s i 胖mc o m p l “) ( 2 ) 加入交联单体( c r o 挣l i n k e r ) ，在引发 剂、热或光引发下，在模板分子功能单体配合物周围产生聚合反应，聚合物链 通过自由基聚合将模板分子和单体的配合物“捕获”到聚合物的立体结构中；( 3 ) 将聚合物中的模板分子洗脱( e i 吡l o n ) 或解离( d 1 辐o c i 砒m ) 出来，在聚台物中 便留下可识别模板分子的“印迹孔穴”。其基本原理如图ll 所示7 】。 h g1 1s t i a 唾衍s y 岫e s i so f m e p r m e m - i i n p 血l e dp o i 舯日 1 13 蛋白质分子印迹技术 比较成熟的印迹研究工作主要集中在一些构象简单的小分子上，而对大分子 如多肚、蛋白质、晶体1 1 ”甚至病毒和细胞等按照常规的方法对其进行印迹研究 一直相当困难。因为这些物质存在着体积庞大、结构复杂、可结合位点多以及容 易变性失活等因素旧列。 蛋白质分子的检测与分离是蛋白质研究和应用的基础，但与基因相比，蛋白 质的种类相当繁多，其特性也各异，这就给蛋白质的检测和高纯度分离带来了很 大的困难。分子印迹聚合物以其可设计性强、品种丰富、坚固耐用、成本低廉以 及独特的分子识别性能为蛋白质的检测和高纯度的分离提供了新思路。 1l3 l 蛋白质的基本特性 蛋白质分子量一般在l o k d 1 0 0 0 k d 。蛋白质分子颗粒的直径一般在1 1 0 0 n m ， 在水溶液中呈胶体溶液，具有丁铎尔现象、布朗运动、不能透过半透膜、扩散速 c 剁措詈 哪一 m 酗 第一章绪论 度减慢、粘度大等特征。氨基酸是构成一切蛋白质分子的结构单位。蛋白质分子 中存在的二十种左右的氨基酸可分为脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和杂环氨基酸 三大类。氨基酸的化学性质与其分子结构即分子的特殊功能团( 羧基、氨基) 是 分不开的。氨基酸的羧基具有一般羧酸羧基的性质( 如成盐、成酯、成酰胺、脱 羧、酰氯化等) ，氨基具有一级胺( r n h 2 ) 氨基的一切性质( 如与h c l 相结合、脱氨、 与h n 0 2 作用等) 。氨基酸的化学性质皆由这两种基团所产生。 k l i n d e r s t r o m l a n g1 9 5 2 年提出将蛋白质的结构分为一级、二级、三级结构 等的方案。一级结构是指蛋白质分子的基本结构肽链的氨基酸的排列序列。蛋白 质在形成立体结构时，其多肽链部分首先折叠成a 型螺旋和6 型结构，并由此进 一步可折叠成球形。此时，将0 【螺旋和p 型结构称为二级结构。像胰岛素和r - 球蛋 白那样的，即使是由许多条肽链组成，但在其链间有像s 。s 键那样的共价键，这 些链的集合体为三维立体结构，称为三级结构。每条链首先取二级结构，二级结 构的链再折叠成球状而成为三级结构。因此，三级结构是靠链间，特别是其侧链 间起作用的力而使其稳定的。其中包括上述的双硫键，酪氨酸和羧基之间的氢键， 但起最重要作用的是疏水键。因此一旦疏水键被切断，三级结构就被破坏而导致 蛋白质发生变性。像血红蛋白那样的蛋白质是由许多个三级结构的多肽链以非共 价键聚合而成的一个蛋白质分子。此时，多肽链称为原体，其聚合体称为寡聚物 ( o l i g o m e r ) ，该寡聚物所具的立体结构称为四级结构。并且认为保持四级结构的 力，以疏水键为最大。此外，氢键、离子键也与四级结构有关。具有四级结构的 蛋白质，除上述血红蛋白外，还有参与细胞内的代谢的各种酶，这对于代谢的调 节，特别是变构性质的出现，蛋白质的四级结构被认为起着重要的作用。 天然蛋白质分子是由多肽链组成的，维持和稳定蛋白质高级结构的因素主要 有以下几种： ( 1 ) 静电作用组成蛋白质的氨基酸中的多种可解离的侧链基团，在正常 的生理条件下，有带正电荷的，也有带负电荷的。这些解离后的带电侧链，相互 间可能产生静电作用，习惯上也称之为盐键。蛋白质中一些极性的基团，在分子 内其他原子或基团的作用下，也可能诱导成为有一定稳定性的永久偶极。这种永 久偶极之间以及永久偶极和带电的基团之间也能产生静电作用。 ( 2 ) 氢键在蛋白质肽链骨架中存在着大量的羰基和亚胺基团，氨基酸残 基的侧链中有许多是带有极性基团的。这些基团中某些可以作为氢原子的供体， 另一些则作为氢原子的接受者，彼此相互作用，这种作用被称为氢键。 ( 3 ) 范德华力蛋白质中的所有原子都在不断地运动，原子中的电子也绕 着原子核不停地运动。为此，一些原子的正负电荷在一瞬间也可能有相对的偏移， 造成了瞬间偶极。这些瞬间偶极之间也能发生相互作用被称为范德华力。 第一章绪论 ( 4 ) 残基的亲水性和疏水性组成蛋白质的2 0 种氨基酸各自带有不同性质 的侧链基团。有些是极性的，它们很容易和水作用，或是形成氢键，或是融合于 水环境中；另一些残基的侧链却是非极性的，不表现出与水或其他极性基团相互 作用的能力和倾向。疏水键是蛋白质分子中疏水性较强的一些氨基酸侧链( 如缬 氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等的侧链) 避开水相自相粘附聚集在一起的 力。在蛋白质形成二级结构中，疏水作用不是至关重要的，但是在蛋白质的三级 结构的形成和稳定中，疏水作用是位于诸多因素中的首位。 ( 5 ) 配位键一些蛋白质中除了肽链外还含有一些金属，在分类上可称其 为金属蛋白。在蛋白质中已发现的金属有铁、钙、铜、锰、镁、钼等等。这是因 为组成蛋白质的氨基酸中，可参与氢键的很多基团都能和一些金属形成配位键。 这些金属对稳定蛋白质的结构有一定的作用，对它们的功能也有贡献。 ( 6 ) 二硫键二硫键为一个半胱氨酸的s h 基与同链或邻链另一半胱氨酸的 s h 基氧化连接而成，胰岛素及许多其它蛋白质分子中皆有二硫键。 天然蛋白质因受化学或物理因素的影响，其分子内部原有的高度规则性的排 列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，这种作用称为蛋白质的变性。 天然蛋白质分子的规则性紧密结构是由分子中的次级键维持的，很容易被物理和 化学力量所破坏。热( 6 0 7 0 ) 、酸、碱、有机溶剂( 如乙醇、丙酮) 、光( x 光、紫 外线) 、尿素浓溶液、盐酸胍、水杨酸负离子、某些去垢剂( 如十二烷基硫酸钠) 、 高压、剧烈振荡及表面力等均可引起蛋白质的变性。 1 1 3 2 蛋白质浓度的测定 常用的有六种方法，即微量凯氏定氮法、双缩脲法、l o w r y 法、紫外吸收法、 考马斯亮兰( b r a d f o r d ) 法和二喹啉甲酸法( b c a ) 法。 ( 1 ) 微量凯氏定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨( 消化) ，氨又与硫酸作用， 变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液 被中和的程度可计算得样品之氮含量。 ( 2 ) 双缩脲法 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，至令仍广泛采用。在需 要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，对蛋白质提纯的早 期价段是非常有利的。双缩脲法的原理是c u 2 + 与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残 基络合，形成紫蓝色络合物，此物在5 4 0 n m 波长处有最大吸收。双缩脲法常用 于0 5 9 l 1 0 9 l 含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液， 如t r i s 、g o o d 缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积l o 冷的三氯醋 第一章绪论 酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的n a 0 h 溶解沉淀的蛋白质进 行定量测定。 ( 3 ) l o w 巧法 此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即c u 2 + 与蛋 白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷铝磷磷钨酸试剂( 福林 酚试剂) ，结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定 2 0 m g l - 4 0 0 m g l 含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们 的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是， 加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性p h 环境中才稳定，上述提到的还原 反应只有在p h l 0 时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的c u 2 + 蛋白质溶液中时， 必须立刻搅拌，以使磷钼酸磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被c u 2 + 蛋白质 络合物所还原。 ( 4 ) 紫外吸收法 大多数蛋白质在2 8 0 n m 波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪 氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋 白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在2 8 0 n m 处的吸收可用于测定 0 1 o 5 m g m l 含量的蛋白质溶液。 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度 的盐，例如生化制备中常用的州心) 2 s 0 4 等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适 用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不 需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法 测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白 质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。 若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸 的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同 的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一 定的误差。 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因p h 的改变而有变 化，因此要注意溶液的p h 值，测定样品时的p h 要与测定标准曲线的p h 相一 致。 ( 5 ) 考马斯亮兰( b r a d f o r d ) 法 考马斯亮兰g 2 5 0 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰 的位置( a x ) ，由4 6 5 n m 变为5 9 5 n m ，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经 第一章绪论 研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸( 特别是精氨酸) 和芳香族氨基 酸残基相结合。在5 9 5 n m 下测定的吸光度值a 5 9 5 ，与蛋白质浓度成正比。 ( 6 ) 二喹啉甲酸法( b c a ) 法 二喹啉甲酸( b c a ) 法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与l o w e 巧 法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与c u 2 + 络合并将c u 2 + 还原成c u h 。b c a 与c u i + 结合形成稳定的紫蓝色复合物，在5 6 2n m 处有高的光吸收值并与蛋白质 浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与l o w e r y 法相比，b c a 蛋白测定方法灵 敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影 响小。与b r a d f o r d 法相比，b c a 法的显著优点是不受去垢剂的影响。 1 1 3 3 蛋白质分子印迹的特点和难点 蛋白质分子的识别位点处于四级结构外端的分子链段上，从蛋白质分子的整 体结构看，这也是最先发生构象转变的结构。任何可以改变蛋白某一级结构的因 素，比如温度，离子强度和酸度等，都将显著影响识别位点构象的改变；此外， 蛋白质分子具有大量带电官能基团，如氨基和羧基等。在多数情况下蛋白质分子 不呈电中性，整个分子是一个具有几何尺寸的带电体，因此蛋白质分子的电负性 也是分子印迹过程必须考虑的因素。蛋白质的分子量一般在1 0 4 1 0 5 数量级，由于 蛋白质分子体积庞大、本质脆弱、空间结构和化学性质十分复杂，所以对蛋白质 分子印迹的研究思路和实验手段都还处于摸索阶段，实验结果的重现性差，水环 境的识别机理也不清楚。当前蛋白质m i p 的制备主要受以下因素的影响【2 3 1 。 ( 1 ) 印迹特异重结合的机理 人们更多地专注于m i p 的制备方法，对蛋白质分子和聚合物单体官能团间的 相互作用还缺乏系统研究，在识别过程中是孔穴的三维空间结构还是功能基团或 其它方面起更主导作用还存在分歧。v e n t o ndl 【2 4 】推测蛋白质与聚合物作用力是 在聚合中蛋白质表面多余的基团与单体发生了结合作用而生成；另一种观点认为 蛋白质印迹，其重结合作用力应是数目众多的遍及介质的较弱作用力，包括氢键、 电荷转移、微弱的诱导偶极作用和非极性作用等，在蛋白质与底物高度互补，相 互接近进时才能大量形成从而较稳固地结合。选择性识别的机理不清楚使蛋白质 m l p 的研究受到一定制约。 ( 2 ) 热力学因素和空间因素 出于热力学上的考虑，为了准确地“记忆”印迹分子的形状，所选的印迹分子 必须具有一定的刚性，其在印迹过程中的构象形式应尽量保持不变或变化较小， 这对于形成具有良好识别能力的作用位点是十分重要的| 2 5 j ；体积庞大的蛋白质 模板难以自由出入聚合物母体，需要设计具有合适交联孔结构的m l p 使之适合大 第一章绪论 分子蛋白质分子的传质。单从这一点上看，与结构刚性的有机小分子相比，水溶 性的蛋白质分子具有明显的不足，其柔软的结构和多变的构象对聚合过程提出了 苛刻的要求。一方面，蛋白质分子构象在不同的环境下的可变性，使在分子印迹 聚合物中很难产生确定的识别位点；另一方面，通常烯类单体在打开双键时所释 放的大量反应热，将会直接破坏蛋白质分子的三维结构和稳定性。 ( 3 ) 高度选择性介质的选择 目前分子印迹聚合物大多在有机相中进行制备和应用，而天然的分子识别系 统大多是在水溶液中进行的，如何利用特殊的分子间作用力在水溶液或极性溶剂 中进行印迹和高选择性识别仍是一大难题。聚合前的预组装过程要求印迹分子和 功能单体之间要有充分的接触机会和作用环境，以便各相关基团能为将来的特定 识别作用取得必要的空间排列和组合方式，因此要求印迹分子在单体和交联剂体 系中具有一定的溶解度；而众所周知，在常见的各种聚合的烯类单体中，可供挑 选的能与水溶性生物大分子具有良好互溶性的单体不多，可供选择的交联剂则更 少。因此，寻找或合成与水溶性生物大分子能良好互溶的高选择性单体、交联剂 是制备理想蛋白质印迹材料的一个基本前提。 ( 4 ) 水作用环境及温和制备方法的选择 由于生物体内高度特异性分子识别作用大多是在水介质中进行的，因此水环 境中的分子识别作用一直是各相关领域的热门研究课题，但是，由于影响重结合 作用的因素数目众多且互相牵连，致使对该问题的深入研究相当困难。因此，如 何在没有成熟理论或是大量经验数据支持的情况下，有效地实现水环境下的蛋白 质分子与印迹聚合物之间的分子印迹特异重结合作用，规避不利因素的影响，设 计合理的聚合物结构，营造有利于识别作用发挥的局部微环境，是摆在蛋白质分 子印迹研究前面的一个十分重要的问题。蛋白质分子十分脆弱，热( 6 0 7 0 ) 、酸、 碱、有机溶剂( 乙醇，丙酮) 、光、尿素浓溶液、高压、剧烈振荡、表面张力都能 使其变性，使聚合条件受到限制。采用蛋白质本体包埋法制备的m i p 需研磨过筛 方能使用，颗粒均匀性、规整性和强度较差，应用效率大幅度降低。另外，一些 关于介质操作性能也需得到改进，如重结合量、机械强度、孔隙率、流通速率等 直接关系到介质是否能够实用化。因此，更方便及温和的制备方法的选择也是制 备理想蛋白质印迹材料的一个重要因素。 ( 5 ) 氢键作用的发挥 在采用弱相互作用方式的几种分子印迹特异重结合模式中，氢键扮演着十分 重要的角色。与静电相互作用、v a nd e r w a a l s 力和疏水作用相比，由于具有一定 的方向性，氢键的识别选择性要明显地高于前三者。因此，如何协调几种非共价 键作用模式，充分发挥氢键所具有的分子识别能力，是值得深入研究的课题。事 第一章绪论 实上，自然界中高度有序的d n a 三维结构，就是氢键作用向人们所展示的一个 杰作。但是，对绝大多数的人工合成识别材料来说，当分子识别的环境在水介质 中，由于水分子的强大水合能力，氢键在水环境中的作用通常会被大大削弱。根 据文献，如果要想加强水环境中氢键的效能，通常有两个方法可以采用【2 6 j 。 是通过协同作用来克服周围水分子的不利影响，二是改变作用点附近的局部微环 境，以创造出一个利于氢键发挥其作用的外部环境。 ( 6 ) 洗脱方法的选择 模板脱除过程的主要目标是通过调节模板脱除过程参数如洗脱溶液p h 值等 使得基材与模板蛋白质分子之间的作用力解除并迁移至外介质；需要撮胶网络结 构产生扩张，蛋白质自组装解离或体积收缩，使得更多的蛋白质更容易地脱除。 寻找温和有效的洗脱方法也是目前该领域一个亟待解决的问题。印迹分子的洗脱 效果决定了印迹聚合物的重复使用和结合容量，另外洗脱方法选择也应考虑到是 否会对印迹孔穴造成破坏。目前常用的方法有：缓冲溶液、e d t a + 尿素、蛋白 酶、s d s + h a c 等，其中后两种方法是破坏性的。如果结合的印迹分子无法被洗 脱并保持其活性，则蛋白质分子印迹技术的发展就会受到很大的限制。 ll34 蛋白质分子印迹的方法 目前，生物太分子印迹聚舍物的制各方法大致分为：包埋法、表面印迹法和 抗原决定基法。 “一矗 j 老l = ：! = 鼍：s 审 o - a e n “p t i e 玎t i m 呻t i n ，”1 b s u 响c e 油p 柚加矿2 3 ” c 圈12 一些蛋白质大分子印迹的方法 f 1 9 l2s m “s o f p m l e i n p i m ”g ( 1 ) 包埋法 = ：一l + = ：譬 + 羹笸刍 鞋蕊 剐协p e8 p p r 0 h 1 】 譬 第一章绪论 包埋法也称本体聚合法，就是将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按照 一定比例溶解在溶剂中，通过脱气、除氧，经引发聚合后得到块状聚合物，然后 再粉碎，过筛，得到小颗粒，进行后续操作。这种制备方法得到的分子印迹聚合 物具有令人满意的记忆功能，对蛋白质分子具有良好的选择性识别特性，且合成 操作条件易于控制，实验装置简单，便于普及。 h ；e n e n 等利用包埋法，以丙烯酰胺为单体合成了低交联度的凝胶，对血红 蛋白、生长激素、细胞色素、肌红蛋白和核糖核酸酶等进行了印迹，得到了具有 良好选择性的分子印迹聚合物。不同的印迹分子能被相应的凝胶所吸附，而非印 迹蛋白则不被这种惰性的凝胶吸附。 ( 2 ) 表面印迹法 表面印迹技术是使识别位点处在颗粒的表面，以此克服本体聚合的弊端。通 常采用的表面印迹技术是在微球上进行印迹或涂层印迹聚合物，得到的较均匀的 球形颗粒适于各种操作，尤其是色谱操作。 早期的蛋白质表面印迹是g l a d 等将铁传质蛋白在溶液中与硼酸酯硅烷发生 作用，然后在多孔硅胶颗粒上进行聚合。由于硼酸酯基团能与铁传质蛋白上的硅 酸铝发生不可逆反应，因此硼酸酯硅烷与铁传质蛋白的预结合使得硼酸酯基团能 正确排列，从而保证了印迹位点对铁传质蛋白的特异性。通过高效液相色谱 ( h p l c ) 的检测，证明该聚合物对铁传质蛋白具有特异性。 另一种表面印迹技术是在金属离子c u 2 + 、c 0 2 + 或n i 2 + 和核糖核酸酶a 存在的 情况下，利用金属螯合单体在活化的硅胶颗粒上进行聚合。核糖核酸酶a 存在两 个暴露在分子表面的组氨酸，因而可以与两个金属螯合分子进行螯合作用，在聚 合过程中金属螯合分子固定在硅胶表面并生成特异性结合部位。该方法的缺陷是 蛋白质表面必须有暴露的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基、色 氨酸的吲哚基等，从而使该方法的应用范围受到限制。 还有一种表面印迹技术是基于射频发光放电等离子聚合沉积作用。s h i 等首 先将蛋白质吸附在亲水的、分子级平坦的云母表面，然后将一个二糖分子薄层覆 盖在吸附的蛋白质上。一经干燥，该糖层便通过大量的氢键与蛋白质络合。然后 将一个平坦的含氟聚合物薄膜通过发光放电等离子体与糖分子交联而沉积。接着 去除云母并溶解掉蛋白质分子，最终形成一种多糖覆盖的、具有蛋白质形状的纳 米凹坑，并可通过透射电子显微镜、原子力显微镜、x 射线光电子能谱和飞行时 间第二离子能谱来检测。吸附实验显示在混合蛋白质溶液中，白蛋白、免疫球蛋 白、核糖核酸酶a 和溶菌酶的印迹聚合物都能特异性地吸附相应的印迹蛋白质。 目前较新的一种表面印迹方法是在尺寸单分散性的纳米线状聚合物表面印 迹模板分子。w a n g 等首先将模板分子固定在表面覆盖铝膜的硅胶纳米棒或纳米 第一章绪论 管上，然后进行聚合反应，最后用化学方法溶解掉铝膜和硅胶纳米棒或纳米管， 洗除模板分子，在纳米线状聚合物表面上即会留下识别孔穴。实验证明这种表面 印迹聚合物对印迹分子具有较高的选择性。 ( 3 ) 抗原决定基法 a 1 e x a n d r er a c h k o v 提出的抗原决定基法是一种分子印迹的原理。其原理来源 于自然界中的相似方法，即抗体在识别抗原时，抗体只与抗原的一小部分，即抗 原决定基相作用。该法是采用与蛋白质结构中暴露在表面的肽链( 抗原决定基) 相同的短肽作为印迹分子，得到的大孔m i p 不仅可识别该肽，也可以识别整个蛋 白质分子。a l e x a n d r er a c h k o v 采用该法，以m m a 为单体，e g d m a 为交联剂， 首先对y p l g ( t y 卜p r o l e u g 1 n h 2 ) 四肽进行印迹，h p l c 检测表明，以y p l g 为印迹分子得到的聚合物不仅可识别y p l g ，亦可识别以p l g ( p r o l e u g 1 n h 2 ) 为决定基的催产素分子。该法的优点在经济上极为有利，因为小肽通常并不昂贵， 而且比蛋白质易得。但该法只适用于暴露的片断结构非常清楚的蛋白质的模板印 迹和暴露的片断结构不同的蛋白质的分离，对尚不清楚暴露结构的蛋白质显然是 无能为力的。 1 1 4 蛋白质分子印迹凝胶基材 蛋白分子印迹基材多数为天然或聚合物水凝胶的凝胶体系。蛋白分子印迹 凝胶材料的研究源于对生命活动的人工模拟。生物体系功能的实现主要基于水溶 液和胶体环境下分子识别过程得以实现。各种细胞功能如复制、传质、聚集、排 列、贴附、生成组织和生长等，都涉及通过分子间作用，从大量分子中选择合适 的形成分子对的过程。这些特异性作用可以在两个明显的方面加以分析：一是非 特异性胶体作用，通常是受体通过静电作用介入的锁匙特异性作用阶段，比如 带正电的受体蛋白通过选择性结合带负电的d n a 螺旋固化特异性基因；二是特 异性识别过程，即通过识别位点之间形成氢键结合模板分子与基材，比如蛋白与 螺旋连上的官能团的特异性匹配【4 2 1 。 由于蛋白分子和凝胶材料结构的特殊性，以蛋白分子作为模板，聚合物凝胶 为基材进行分子印迹具有更为特殊的规律。 ( 1 ) 尺度和结合位点 从模板与基材的静态特征( 热力学) 方面来看，与小分子相比，蛋白分子体 积庞大，经常达到印迹基材的链段甚至整个分子尺度，模板与其印迹的空间尺寸 效应不容忽略；同时，蛋白分子的表面布满结合位点，其个数远远大于小分子的 结合位点个数，因此，蛋白分子识别过程依靠形状互补和多点识别协调作用完成。 ( 2 ) 分子和链段构象的变化 第一章绪论 从模板分子与基材链段的运动特征( 动力学) 来看，比起小分子印迹体系， 蛋白分子和凝胶基材都具有易变的构象，二者链段上的识别位点因目标作用模式 的不同而时刻发生着变化，以严格的匹配性标准衡量印迹效率的高低已经不再适 用。 为了获得更好的印迹效率和耐用性能，通常对凝胶基材进行修饰与改性。凝 胶材料的改性主要涉及交联度的变化和官能团种类、数量的改变，这些因素直接 与蛋白发生作用，或较大程度影响蛋白构象，因而凝胶的少量改性都会对印迹效 率产生较大影响。 ( 3 ) 蛋白分子的电负性在分子印迹过程中的作用也不容忽视。 蛋白分子中含有大量的氨基和羧基，在不同的p h 值环境中带有正电荷或负 电荷。带有不同电性的蛋白分子可以与基材上的电荷发生作用，形成或吸引、或 排斥的效果。因此，通过调节溶液p h 值可以有效控制模板分子在印迹材料上的 吸附和解离过程。 1 2 蛋白质印迹水凝胶聚合物 以软湿水凝胶体系作为基材，印迹蛋白等生物大分子的尝试已有报道1 4 3 ，矧， 此类应用的印迹基材多为多孔网状水凝胶体系，模板分子则是构象复杂的生物分 子，制备成的分子印迹水凝胶已经具有较好的识别效率。然而也应该看到，此类 模板分子在水凝胶体系中的印迹和识别行为不同于刚性基材上，印迹刚性小分子 的经典规律，而是涉及凝胶基材蛋白模板之间特殊的作用方式、凝胶基材的微 观结构( 孔隙度和凝胶网络交联度等) 以及环境因素的改变等。研究由此产生的 对印迹识别过程的影响，对天然高分子水凝胶特有的印迹行为和控制途径的研 究变得十分重要。 1 2 1 蛋白质分子印迹水凝胶聚合物的特点 蛋白印迹水凝胶聚合物的动力学和热力学规律与小分子体系具有较大差异， 具有该体系自身的特点：近年来广泛采用的天然聚合物水凝胶，含有大量的亲水 基团，具有较好的水溶性，并且与蛋白分子结合力较强，相溶性较好，不会导致 蛋白变性。聚合物水凝胶的凝胶化条件温和、溶剂化性能良好、有比较疏松的网 孔结构，常用其制备蛋白类药物载体，组织工程支架等。因为内含极易变性的蛋 白模板，成型过程常使用比较温和的条件，如使用常温离子交联、戊二醛交联或 二硫键交联、改变离子强度和p h 值等方法。 制备蛋白分子印迹水凝胶材料可以通过化学聚合或凝胶化的方法。 第一章绪论 使用化学聚合或交联的方法制备印迹材料应注意聚合温度的控制，高于常温 的