（遗传学专业论文）非纯培养物细菌蛋白酶dna的克隆与表达.pdf

四川大学硕士毕业论文 非纯培养物细菌蛋白酶i ) n a 的克隆和表达 专业：遗传学 硕士生：葛琴雅指导教师：张义正教授 摘要 蛋白酶在细胞的新陈代谢中起着重要的作用，并被人类广泛应用于洗涤剂、 食品、医药、纺织、皮革、垃圾处理等领域，目前已有大量蛋白酶基因被克隆。 本室在已有的研究中成功地克隆到溶栓蛋白酶、脱毛蛋白酶以及胶原蛋白酶等 基因。为了构建更多的基因工程菌，同时也为了进行蛋白酶基因的直接进化研 究，以便获得具有新特性的蛋白酶基因，因此开展了本论文的研究工作，期望 能从非纯培养细菌中获得各种蛋白酶d n a 片段。 根据蛋白酶数据库m e r o p s 己作的蛋白酶家族氨基酸联配图，从丝氨酸蛋 白酶s 8 家族中选择具有代表性的枯草杆菌类蛋白酶，从g e n b a n k 中获取相应 的d n a 序列，设计并合成了1 0 条引物。 从自然界先后采集了2 l 份样品，使用脱脂牛奶平板富集所有的胞外蛋白酶 产生菌，将它们混合培养并提取了1 2 个总d n a 。用6 对引物在降落p c r ( t o u c h d o w np c r ，t d p c r ) 条件下对1 2 个总d n a 样品分别进行了蛋白酶 编码序列的扩增，获得4 7 个片段。选取1 9 个8 0 0 1 2 0 0 b p 长的扩增片段进行测 序，测序结果及同源性分析显示：8 个为蛋白酶d n a 片段；3 个能在数据库找 到同源但非蛋白酶基因序列：其余8 个在数据库中没有找到同源基因。 对8 个蛋白酶片段编码序列的进一步分析发现，它们实际上是4 种不同的蛋 白酶d n a 序列。其中有同1 对引物扩增得到的d n a 序列差异性达到3 2 ，说 四川大学硕士毕业论文 明使用p c r 方法从混合菌中获得新蛋白酶基因是可行的。 克隆到的蛋白酶d n a 片段( 3 2 与碱性蛋白酶e ( g e n b a n k n o ：a j 5 3 9 1 3 3 ) 的编码区几乎相同，与其他蛋白酶d n a 序列最多有9 4 的相似性，至少有2 0 个氨基酸的差异，目前尚没有人对其产物的性质进行具体的研究。将它插入大 肠杆菌表达载体p t w i n l ，获得的重组质粒在大肠杆菌e r 2 5 6 6 中进行表达。 结果表明：表达时诱导物i p t g 的终浓度为0 3 m m o l l ；在3 7 。c 和2 8 下的表 达产物都主要以包涵体形式存在于大肠杆菌细胞中；1 8 过夜表达产生的可溶 产物分泌到培养基中，能在牛奶平板上产生水解圈，对大肠杆菌有致死作用： 根据成熟蛋白酶在银染的s d s p a g e 电泳图上不能观察到，但在牛奶平板上能 形成较大的水解圈，可以初步判断该酶具有较强的蛋白水解活性。 【关键词】非纯培养物蛋白酶基因克隆降落p c r序列同源分析 碱性蛋白酶e基因表达 v 四川大学硕士毕业论文 c l o n i n g a n d e x p r e s s i o no fb a c t e r i a lp e p t i d a s e sd n a f r a g m e n t sf r o mi m p u r ec u l t u r e m a j o r ：g e n e t i c s c a n d i d a t e ：q i n - y ag et u t o r ：p r o f y i - z h e n gz h a n g a b s t r a c t p e p t i d a s e sp l a yi m p o r t a n tr o l e si nb o t hc e l l u l a rm e t a b o l i cp r o c e s sa n di n d u s t r i a l c o m m u n i t y l o t so ft h e i rg e n e sh a v eb e e nf o u n da n dc l o n e d o u rl a bh a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d p e p t i d a s e - c o d i n gg e n e s w i t h f i b r i n o l y t i e ，d e h a i r i n g o r c o l l a g e n l y t i ca c t i v i t y ，e t c i no r d e rt oc o n s t r u c tm o r er e c o m b i n a n ts t r a i n sp r o d u c i n g p e p t i d a s e s ，a sw e l la st om a k ed i r e c t e de v o l u t i o no f p e p t i d a s eg e n e s ，w h o s ep r o d u c t s a r ee x p e c t e dt os h o ws o m en e w p r o p e r t i e s ，t h ec l o n i n go fp e p t i d a s ed n af r a g m e n t s f r o mi m p u r ec u l t u r ew e r ec a r r i e do u t s u b t i l i s i n so fs e r i n ep e p t i d a s ef a i m l ys 8w e r es e l e c t e da c c o r d i n gt oa m i n oa c i d m u l t i p l ea l i g n m e n ti nd a t a b a s em e r o p sa n dt h e i rd n a c a l n ef r o mg e n b a n k t e n p r i m e r sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d ，a i m i n ga tc o d i n gs e q u e n c e so ra tm a t u r e p e p t i d ed n a o f t h o s ep e p t i d a s e s t w e n t y - o n es a m p l e sr i c hi nm i c r o o r g a n i s m sw e r ec o l l e c t e df r o md i f f e r e n tp l a c e s b a c t e r i ap r o d u c i n ge x t r a c e l l u l a rp e p t i d a s e sw e r ee n r i c h e do nd e f a t t e dm i l kp l a t e s ， a n dt h e nc u l t u r e dt o g e t h e rf o rt o t a ld n ae x t r a c t i o n t w e l v ed n a sw e r ep r e p a r e d ， e a c ho n ew a su s e df o rt o u c h d o w np c r ( t d - p c r ) u s i n g6p a i r so fp r i m e r s t h e r e w e r et o t a l4 7d n af r a g m e n t so b t a i n e da n d1 9w i t h8 0 0 1 ，0 0 0 b pi nl e n g t hw e r e s e l e c t e df o rs e q u e n c ea n a l y s i s a m o n gt h e m ，8f r a g m e n t sa r ep e p t i d a s ed n a s ，3 h a v es e q u e n c e sh i g h l ys i m i l a rt ot h o s eb u tn o tp e p t i d a s eg e n e si ng e n b a n k ，o t h e r8 v 1 i i 四川大学硕士毕业论文 a r en o ts i m i l a rt oa n yk n o w ns e q u e n c e f u r t h e ra n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e8p e p t i d a s ef r a g m e n t sb e l o n gt o4g e n e sa n d d i f f e r e n c eb e t w e e nt w on u c l e o t i d es e q u e n c e sa m p l i f i e db yt h es a m ep r i m e r sr e a c h e s t o3 2 ，w h i c hp r o v e st h ef e a s i b i l i t yo fc l o n i n gn e wp e p t i d a s e - e o d i n gg e n e sf r o m i m p u r ec u l t u r em e r e l yb y p c r g 2f r a g m e n ti sa l m o s ti d e n t i c a lt oc d so fa l k a l i n ep r o t e a s ee ( o e r d 3 a n kn o ， a j 5 3 9 1 3 3 ) ，a n dh a st h em o s ts m i l a r i t yo f9 4 t oo t h e rh o m o l o g o u sg e n e si n n u c l e o t i d e s ，a n da tl e a s td i f f e r e n c eo f2 0a m i n oa c i dr e s i d u e s n or e p o r ty e tw a so n t h ec h a r a c t e r i s t i c so fi t sp r o d u c t g 2f r a g m e n tw a se x p r e s s e du s i n gp t w r n li n e s c h e r i c h i ac o l ie r 2 5 6 6a n dt h er e s u l t sw e r es h o w na sf c l l o w s ：f i n a ic o n c e n t r a t i o n o fi p t gn e e d e df o ri n d u c t i o nw a so 3 m m o l l ；p r o d u c tw a sm a i n l yi n c l u s i o nb o d i e s e i t h e ra t3 7 c o ra t2 8 w h i l es o l u b l ea n da c t i v ea f t e ro v e m i g h ti n d u c e da t1 8 c a c t i v ep r o d u c t sw e r el e t h a lt oe c o l i s e c r e t e di n t ot h em e d i u m b e c a u s et h eb a n do f t h em a t u r ee n z y m ew a sn o tc l e a ro nt h es i l v e r - s t a i n e dp o l y a c r y l a m i d eg e l ，a n dt h e e n z y m ep r o d u c e dab i gh y d r o l y z e dz o n eo nt h ed e f a t t e dm i l kp l a t e ，a p r es e e m e dt o h a v eas t r o n gp r o t e o l y t i ca c t i v i t y 【k e yw o r d s 】i m p u r ec u l t u r ep e p t i d a s e sg e n ec l o n i n g t d - p c r h o m o l o g ya n a l y s i sa p r eg e n ee x p r e s s i o n i x 四川大学硕士毕业论文 1 引言 国际生化和分子生物学联盟命名委员会( n c i u b m b ) 建议将酶分成6 类， 第3 类“水解酶”中作用于肽键的称为蛋白酶( p e p t i d a s e ) 口4 1 。蛋白酶依靠强亲 核体使肽键在毫秒内水解，而如果没有酶的催化，中性p h 下肽键水解需要 1 0 1 0 0 年【6 1 。 自然界中大约有2 的基因编码蛋白酶，这些蛋白酶积极参与细胞的新陈代 谢，如孢子的形成、分裂、酶与激素的成熟、蛋白质的降解、提供细胞u 丁以吸 收的水解物掣划。 人类对蛋白酶的开发和利用始于1 9 1 3 年，b o h m 将胰蛋白酶作为洗涤浸泡 剂。蛋白酶现在已经进入了食品、医药、纺织、皮革、垃圾处理等领域，展现 出广阔的应用前景和巨大的经济效益【1 4 】。 全世界许多实验室都在对蛋白酶进行研究，每年大约有8 ，0 0 0 篇相关论文发 表叫。随着分子生物学技术的发展，人们已不满足于从原始产生生物中提取和 利用蛋白酶，而是希望得到编码这种酶的基因转入大肠杆菌等宿主进行高 效低成本的表达；通过改造遗传密码予，使蛋白酶获得某些新的性质，比如提 高用作洗涤剂的蛋白酶的耐碱能力凋f 究者从样品中分离纯化到目标蛋白酶后， 往往先进行n 一端测序，然后与已知蛋白酶进行同源性分析。如果相似性较低， 就只有通过建库、杂交等方法得到d n a 片段，最后拼接成完整的目的 d n a 1 8 , 2 t ；如果相似性较高，就可以根据已知序列的d n a 设计引物，通过聚 合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 克隆目标d n a 2 7 , 2 8 】。由于p c r 设计简便、操作简单、结果快速，只要情况允许，在众多克隆d n a 的方法中 研究者会首选p c r 。 p c r 是在模板d n a 、引物和4 种脱氧核苷酸存在的情况下依赖于d n a 聚 合酶的体外酶促d n a 合成过程，它通过变性、退火、延伸3 个步骤的数十次 重复，使产物的量按照2 。方式得到扩增。在不影响d n a 聚合酶活性的前提下， p c r 对模板的纯度要求并不高，因此我们考虑使用非纯培养物d n ap c r 技 术即从自然界采集样品，不必对单个菌种进行分离鉴定，而直接提取样品 四川大学硕士毕业论文 中众多微生物的d n a 用特异引物扩增研究者感兴趣的片段。 迄今为止，多种常见生物的基因组测序已经完成，通过序列比较发现，具有 新特性的许多酶都是已知酶的变异体，比如有强纤溶活性的s u b t i l i s i nn a t 就与 s u b t i l i s i ne 的基因都来自b a c i l l u ss u b t i l i s ，两者的相似性高达9 9 5 拉。本实验 室获得的一些研究结果也有类似的情况。如果拥有一套可以覆盖常见基因的较 为齐全的引物，就可以先用这套引物对样品直接进行p c r 扩增，确实不能得到 目的基因，方才依照蛋白酶的纯化、n 端测序等传统步骤。由于蛋白酶的数量 相当大，对所有已知序列都合成引物并不现实，我们希望能根据同源序列的相 似性设计具有较好兼容性的嵌合引物，使l 对引物能够同时满足数条乃至更多 序列的扩增。这种思路依赖的原理是：p c r 反应的成败虽然在很大程度上取决 于模板与引物的相似性，但在一些条件如使用特殊的引物、采取较低复性 温度等情况下，模板与引物一定程度的错配是允许的。 结合上述的非纯培养与嵌合引物p c r ，就可能从1 份样品中同时获得较多 的蛋白酶d n a 片段，这样，实验室可以快速拥有较为丰富的蛋白酶基因资源； 可通过s h u f f l i n g 等d n a 重组技术获得具有新特征的蛋白酶：还可以根据1 种 酶的多个突变体了解到对于酶的性质，每个残基的影响以及数个残基的共同效 应。这些数据对于蛋白酶工程学非常重要。目前，随机突变仍然是蛋白酶性质 研究的主要手段，制造突变的工作相当繁重，以枯草杆菌蛋白酶为例，仅仅是 氨基酸的单突变就可以造成大约5 5 0 0 个突变体，双突变可产生3 x 1 0 7 个，而只 有约3 0 的单碱基替换的突变体被人们制造了出来埔j 。p c r 可以直接提供自然 界的随机突变体，对我们的研究提供许多便利。从这个角度考虑，p c r 扩增过 程易产生的误配也是有利的。 丝氨酸蛋白酶s 8 家族的枯草杆菌类蛋白酶( s u b t i l i s i n ) 得名于首先纯化出胞 外丝氨酸蛋白酶的枯草芽孢杆菌，现在已经成为杆菌属胞外蛋白酶的总称1 5 。 这类蛋白酶在已知的领域都有开发应用，是工业蛋白酶制剂的一个重要来源。 根据本实验室的主要研究对象，我们选出一些具代表性的s u b t i l i s i n ，根据d n a 相似程度将它们进行分组，给每个组设计并合成了l 对p c r 引物，用从采集的 样品中提取的混合菌d n a 为模板进行p c r 反应，获得了4 个彼此有差异的蛋 白酶d n a ，并在大肠杆菌e r 2 5 6 6 中表达了其中1 个片段。该片段可认为是碱 四川大学硕士毕业论文 性蛋白酶e ( a l k a l i n ep r o t e a s ee ，a p m ) 的编码区( c o d i n gs e q u e n c e ，c d s ) ，虽然 a p r e 的c d s 在2 0 0 3 年被c a r s t e n 等从b a c i l l u ss u b t i l i sa t c c6 6 3 3 中获得 ( g e n b a n k 序列号a j 5 3 9 1 3 3 ) ，但只有其在激活抗菌肽s u b t i l i n 中的作用被报导， 自身的性质没有被研究。而在m e r o p s ( h t t p ：m e r o p s s a n g e r a c u k ) 这个著 名的蛋白酶数据库里，a j 5 3 9 1 3 3 仍然被归于u n a s s i g n e d ，即是其性质还有待生 化实验确定。a p r e 与其他蛋白酶最多为9 4 的d n a 相似性，在氨基酸上至少 有2 0 个的差异。研究发现单残基突变也经常导致酶的性质的改变哺j ，因此2 0 个氨基酸足以使a p r e 拥有与其他相似蛋白酶不同的性质或功能：这正是我们 对之产生兴趣的原因。 四川大学硕士毕业论文 2 材料与方法 2 1 样品 样品采自垃圾堆、屠宰场、下水道、堆肥等富含微生物的地方。 2 2 克隆表达使用的菌株与载体 本实验使用的大肠杆菌菌株和载体列于表1 ，2 个载体的物理图谱见图1 和 图2 。 2 3 培养基。” 2 3 1l b 培养基( 1 0 0 0 m l ) 胰蛋白胨1 0 9酵母粉 5 9 n a c i 1 0 9 加6 6 m ll m o l ln a o h 调p h 到7 5 ，1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ：固体培 养基为相应的液体培养基加1 5 琼脂粉。本实验的牛奶培养基即l b 加入1 0 灭菌脱脂牛奶加入l b ( 1 1 5 c 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ) 至终浓度1 。 2 3 2 l m 培养基( 1 0 0 0 m l ) 胰蛋白胨 1 0 9 酵母粉 5 9 n a c i o 5 8 9m g s 0 42 4 6 9 加3m ll m o l l n a o h 调p h 到7 0 ，1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i r a 固体培养 基为相应的液体培养基加1 5 琼脂粉。 2 3 3 s o b 培养基( 1 0 0 0 m l ) 胰蛋白胨 2 0 9 n a c i o 5 8 9 1 0 0 m g “母液 1 0 m l 酵母粉 k c l 5 9 0 3 8 9 加3 m l1 m o l f l n a o h 调p h 到7 0 ，1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 1 0 0 m g + + 母液( 1 0 0 m l ) m g c l 2 6 h 2 0 2 0 3 3 9m g s 0 4 7 h z o 2 4 6 5 9 四川大学硕士毕业论文 表1本实验使用的菌株及载体 菌株载体性质用途来源 载体： p m d l 8 t 2 , 9k b ，a m p , l a c z p t w i n 1 7 4 k b ，a m p ，l a c z , t 7 p r o m o t e r ，s s pd n a bi m e i n ， c h i t i n - b i n d i n gd o m a i n 蛋白酶 d n a 片段克隆 大连宝生生物 工程有限公司 蛋白酶基北京纽英伦生 因表达物技术有限公司 2 3 4s o c 培养基 灭菌s o b + 2 0 m m o l l 葡萄糖( 1 1 5 c 高压蒸汽单独灭菌2 0 m i n ) 2 4 主要试剂2 1 2 4 1 溶液i 1 葡萄糖，5 0m m o l le d t a ( p h 8 o ) ，2 5m m o l lt r i s - h c i ( p h 8 0 ) 2 4 2 溶液1 1 0 2m o l l n a o h ，l s d s ，使用时新鲜配制 5 四川大学硕士毕业论文 m 捌i j m i m m n m m 嚣一。撕靴 8 n a h i j j 期糠 m 扁埔t - ：篡篇嚣7l l l ”i l l l l l i l ”l l l “l l l 。撕州翩7 鞴j 图1 p m d l 8 - t 物理图谱及多克隆位点区 5 篮j 址址啦上k n i 工k t t & c gg 舫 c r b 队盯cb 0 “g t th t s ”d 峨j m e nf w l t dp m - l i l l i n 一s ，0 加j e i n c “n n i l - 5 p 1 1 1 “1ms “fr i g “tg t gc c “c “二 t t t t i 己盈叫t “c t ck t tg t c “c n i m g i 口h “g i # 0 1 # 删6 1u ，l 釉- g l y 铀rs i r 吼f 1 功rg i ， 锄l 出l 赶l “l 蛆l 蓝l c 蓝盐直_ i 工二d l 茁诺l l e ct 越 r 亡航g 6 “t s 曲 oj i o l i e c o r l 帅i 轴p i l _ t 1 i 。c l 盟i i 工rg c cc hc c “00 w 缸：t c g6 t c 6 上虹l 鲨_ 坚l 虹- 宣蛙 s 畦f一 h e i n 1r e w r s ep i i i ，er 图2 p t w i n l 物理图谱及多克隆位点区 6 勰 腻蛳 幽f 一 四川大学硕士毕业论文 2 4 3 溶液i i i 3 m o l lk a c ( p h 4 8 ) 2 4 4 裂解液 溶液i 加溶菌酶( 终浓度l m g m l ) 2 4 5t b 缓冲液 2 5 0 m m o l lk c l ，5 5 m m o l lm n c l 2 ，1 5 m m o l lc a c l 2 。1 2 5 m m o l lk m e s p h6 7 2 4 6 t e 缓冲液 1 0 m m o u lt r i sp h 8 0 ，l m m o l le d t a p h 8 0 2 4 7 酶及主要试剂盒 分子克隆工具酶均购自大连宝生物工程公司，d n a 胶回收试剂盒购自成 都元太生物科技有限公司；p c r 产物纯化试剂盒为杭州v - g e n e 生物科技有限 公司提供。 2 4 8 聚丙烯酰胺凝胶电泳用溶液 2 4 8 1 聚丙烯酰胺母浪 3 0 丙烯酰胺，0 8 亚甲双丙烯酰胺 2 4 8 2 4 t r i s c i s d s ( p h8 8 ) 在3 0 0 m l h 2 0 中溶解9 1 9 啊s 碱( 1 5 m o l l ) ，用1 m o l l h c l 调节p h 值 至8 8 ，补加h 2 0 至总体积5 0 0 m l 。再加入2 9s d s ，于46 c 可以保存1 个月。 2 4 8 3 4 t r i s c i s d s ( p h6 8 ) 在4 0 m lh 2 0 中溶解6 0 5 9t r i s 碱( 0 5 t o o l l ) ，用1 m o l lh c i 调节p h 值 至6 8 ，补加h 2 0 至整体积达到1 0 0 m l 。再加入0 4 9s d s ，于4 c - i 以保存 1 个月。 7 四川丈学硕士毕业论文 2 4 8 4 s d s 电泳缓冲液( 5 ) t r i s 碱f o 1 2 5 m o l l ) 1 5 1 9 甘氨酸( o 9 6 m o l l ) 7 2 0 9 s d s 5 0 9 加去离子蒸馏水至1 0 0 0 m l ，使用前稀释至lx s d s 电泳缓冲液。 2 4 8 5 s d s 样品缓冲演( 2 ) 4 i r i s c 1 s d s ( p h 6 ，8 )2 5 m l 甘油 2 0 ( w v ) 2 0 m l d t t 3 ，l g 溴酚蓝lmg 加去离子蒸馏水至t 0 0 m l 并混匀。等量分装成l m l 并于一7 0 。c 贮存。 2 4 9 s d s 聚丙烯酰胺凝胶的银染溶液 2 4 9 i 固定液 乙醇 5 0 ( v v 、 冰乙酸 1 0 ( v v 、 1 2 04 0 可于室温保存一个月。 2 4 9 2 漫泡波 7 5 m l 无水乙醇，1 7 9 醋酸钠，1 2 5 m l2 5 戊二醛，0 5 9n a 2 s 2 s 0 4 5 h 2 0 d h 2 0 定容至2 5 0 m l 2 4 。9 。3 银染溶液 0 ，2 5 9 硝酸银，5 0 a l 甲醛，dh 2 0 定容至2 5 0 m l 2 4 9 4 显色溶液 6 2 5 9 碳酸钠，2 5 此，甲醛，dh 2 0 定容至2 5 0 m l 8 四j i i 大学硕士毕业论文 2 4 9 5 终止反应液 3 6 5 9e d t a - n a 2 2h 2 0 ，dh 2 0 定容至2 5 0 m l 2 5 方法 2 5 1 样品中胞外蛋白酶产生菌的混合培养 将采集的每份样品分别取1 0 9a n 盛有9 0 m l 无菌水的三角瓶中，伴以涡 旋振荡充分摇匀，悬浊液在牛奶平板上划线，3 7 c 过夜培养，挑取所有产水解 圈的菌落混合接种于5 0 m ll b 液体培养基中，3 7 。c 和1 8 0 r m i n 过夜摇瓶培养。 2 5 2 总d n a 的提取“ 将上述终培养液倒入5 0 m l 离心管，4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清。用溶 液i 洗涤菌体1 次后，加少量裂解液悬浮菌体，再补充到4 m l 充分分散菌体， 3 7 c 摇床轻缓摇动1 h 。加入1 1 0 体积的1 0 s d s ，6 0 c 水浴保温1 0 m i n 左右 至透明澄清。加入3 m lt e 缓冲液稀释菌体裂解物后加入等体积饱和酚氯仿 异戊醇混合液( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，摇匀，离心，取上清。加入1 1 0 体积的溶液i i i ，2 倍体积的2 0 无水乙醇沉淀d n a 。将沉淀出的丝状d n a 用玻棒挑出，7 0 乙 醇洗涤沉淀2 次，室温干燥，d d h 2 0 溶解，6 0 c 处理3 0 m i n 以除去可能混杂的 d n a 酶。一2 0 保存d n a 。 2 5 3d n a 电泳 待检测d n a 样品的分析和大小测定采用o 7 琼脂糖凝胶电泳。取适量的 d n a 样品与1 0 x 上样缓冲液混合，小心地加入琼脂糖凝胶点样孔中。接通电源， 在大约4 6v c m 的恒压下电泳至溴酚蓝染料离凝胶底部1 3 l 4 处，切断电 源。将凝胶置于溴乙锭水溶液( 1l i g m l ) 中染色1 0 3 0m i n ，取出凝胶直接在 紫外灯下观察。若需测定d n a 片段的大小或浓度，用g d s 8 0 0 0 凝胶图像分析 系统照像并用g e l w l d 软件分析d n a 片段的大小和含量。 2 5 4 降落i c r ( t o u c h d o w np c r , t d p c r ) 扩增反应8 反应体系如下： 9 四川大学硕士毕业论文 模板 1 0 x 缓冲液 引物 d n t p m g c l 2 t a q 酶 灭菌去离子水 模板为非纯培养胞外蛋白酶产生菌d n a ，每l 份模板制备6 个反应体系， 体系各自的引物见表3 、垂。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。 t d p c r 参数设置如下：d n a 模板在9 4 解链5 m i n 后进入p c r 循环；第 1 次循环为9 4 * ( 2 变性0 5 m i n ，5 0 复性o 5 m i n ，7 2 延伸1 5 m i n ；以后复性温 度每3 次循环降低1 度，其他条件不变，复性温度降到3 5 后，反应再在5 0 。c 复性温度下进行2 8 个循环；最后于7 2 终延伸1 0 m i n 。 2 5 5p c r 产物纯化 p c r 产物纯化步骤依照试剂盒供应商提供的方法，略有改动： 在p c r 反应液中加入1 0 0 1 t l 的b u f f e rp c r a 。d n a - p r e pt u b e 置于2 m l m i c r o f u g et u b e 中，将步骤1 中的混合液移入d n a - p r e pt u b e ，3 ，6 0 0 r p m 离心 l m i n ，将滤液再加入d n a p r e pt u b e ，重复离心1 次。弃滤液，将d n a p r e pt u b e 置回原2 m lm i c r o f u g et u b e 中，加入5 0 0 1 1 l 的b u f f e rw l ，3 ，6 0 0r p m 离心3 0 s e c 。 弃滤液，将d n a - p r e pt u b e 置回原2 m lm i c r o f u g et u b e 中，加入7 0 c l 旺已加无 水乙醇的b u f f e rw 2 ，于3 ，6 0 0 r p m 离心3 0 s e e 后重复洗涤1 次。1 2 ，0 0 0 r p m 离心 i m i n 。将d n a p r e pt u b e 置于另一洁净的1 5 m l 离心管，在s i l i c a 膜中央加入 2 5 1 x l 去离子水。室温静置1 r a i n ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 r a i n 以洗脱d n a 。将得到的 d n a 溶液置于6 0 c 处理3 0 r a i n ，除去可能混杂的d n a 酶。- 2 0 c 保存d n a 。 2 5 6d n a 片段与载体的连接 0 雄一 叫 一 嚣麓叫 ( ( 四川大学硕士毕业论文 依照t 4 连接酶供应商推荐的方法。 2 5 7 大肠杆菌的转化。1 ” 接种1 环e s c h e r i c h i ac o l i 受体菌于2 m ls o b 液体培养基中，3 7 振荡培 养1 2 1 5 h 。取o ，5 m l 活化的菌液于5 0 m ls o b 液体培养基中，1 8 。c 振荡培养 1 8 2 4 h ，使a 6 0 0 约为0 6 。培养物在冰上放置1 0 r a i n ，倒入预冷的5 0 m l 离心 管中，4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，收集菌体。加入1 5 m l 预冷的t b 缓冲液，4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，再加入5 m lt b 缓冲液，轻轻混匀，加入2 8 0 9 ld m s o ，使其终 浓度为7 。在冰上放置1 0 r a i n ，将感受态细胞分装于1 5 m l 离心管中，每管 0 5 i m l 。立即浸于液氮中，至少5 m i n 。取出细胞，使之在冰浴中融化，分装 0 2 m l 管。连接产物与d d h 2 0 以1 ：3 稀释混匀后，以5 皿加入感受态细胞中， 轻微搅动混匀，冰上放置3 0 m i n ，每隔1 0 r a i n 轻微搅动，注意不要使e p 管露出 冰浴。4 2 热冲击3 0 s e c ，在冰浴上放置1 2 m i n ，加入o 8 m ls o c ，混匀，3 7 振荡培养。5 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，倒去约o 8 m l 上清液，将细胞和余下的上清 液混匀后涂在l m 平板( 含1 0 0i t g m l 氨苄青霉素) ，3 7 。c 培养过夜。 2 5 8 质粒d n a 的提取” 用牙签挑取转化子单菌落于2 m l l b 液体培养基( 含1 0 0 9 9 m l 氨苄青霉素) 中，3 7 振荡培养1 2 1 5 h ，取l m l 菌液于1 5 m l 离心管，1 2 ，0 0 0 r p m 离心o 5 r a i n ， 弃上清。加入o 1 m l 溶液i ，充分混合，加入0 2 m l 溶液i i ，颠倒混匀，置于 冰浴5 r a i n ，加入0 15 m l 溶液i i i ，颠倒混匀后置于冰浴1 0 m i n 。1 2 ，0 0 0 r p m 离 心5 r a i n ，将上清移至新的1 5 m le p 管，加入2 倍体积的无水乙醇，混匀后室 温静置1 0 m i n 。1 2 ，0 0 0 r p m 离心5 r a i n ，弃上清液，加入7 0 7 , 醇振荡洗涤沉淀， 1 2 0 0 0 r p m 离心2 r a i n ，重复1 次。弃上清液后，室温干燥沉淀，加入5 0 此含 有l m g m l r n a s e 的t e 溶解沉淀，6 0 。c 处理3 0 r a i n 后放于一2 0 。c 保存。 2 5 9 质粒d n a 限制酶酶切反应与插入片段大小检测 质粒d n a 限制酶单双酶切反应采用限制酶供应商推荐的方法，插入片段大 小的检测采用常规琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶分离系统g d s 上观察拍照。 四川大学硕士毕业论文 2 s 1 0d n a 序列测定 插入片段的d n a 序列测定由上海博亚生物技术有限公司进行。 2 5 1 l 蛋白酶d n a 片段的扩增 为从p m d l 8 一t 载体中回收确定为蛋白酶d n a 的片段g 2 ，反应体系如下： 模板( p m d l 8 t - g 2 ) 2 5 n g 1 0 缓冲液2 5 u l 引物 ( 各) 0 2 a n o l l d n t p ( 各) 2 0 0 i t m o l l m g c l 2 1 5 m m o l l t a q 酶 1 u 灭菌去离子水 加至2 5 9 l p c r 参数设置为：9 4 c 变性5 m i n 后开始循环；9 4 。c 变性0 5 r a i n ，5 8 。c 退火 0 5 m i n ，7 2 。c 延伸1 5 m i n ，3 2 个循环；7 2 。c 终延伸1 0 m i n 。 2 5 1 2 从琼脂糖凝胶中回收d n a 片段 按琼脂糖凝胶回收试剂盒供应商的说明将预做表达的片段从p c r 扩增产物 中回收。 2 5 1 3 大肠杆菌的诱导表达 将表达质粒通过常规方法转化大肠杆菌。挑选单菌落接种于2 m ll b 培养 基( 含1 0 0 p g m l 氨苄青霉素) 中，3 7 。c 培养1 2 h 。将0 5 m l 培养物转接于5 0 m l l b 培养基( 含1 0 0t t g m l 氨苄青霉素) 中，3 7 。c 摇床培养至o d 6 0 0 为0 5 0 7 ， 加i p t g 至终浓度0 3 m m o l l ，3 7 。c 培养6 h ，2 8 。c 培养6 h ，1 8 c 培养1 2 h 。 2 5 1 4 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳r s d s p a g e ) 2 】 用2 块干净的玻璃平板和垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌 四川大学硕士毕业论文 胶支架上。在2 5 m l 量杯中先后加入5 2 5 m lh 2 0 和3 7 5 m l4 x t r i s c i s d s ， p h 8 8 ；6 0 0 m l 聚丙烯酰胺母液，混匀后加入o 0 5 m l1 0 过硫酸铵和o 0 1 m l t e m e d 。将配好的分离胶溶液沿夹层中一片垫片的边缘加入于玻璃夹层中。分 别从两边垫片往夹层中缓慢加入一层重蒸去离子水。让凝胶在室温下聚合 3 0 6 0 r a i n 。倒去顶层的水，并以l t r i s c i s d s ，p h 8 8 缓冲液冲洗凝胶的顶部 表面。在2 5 m l 量杯中混匀3 0 5 m l h ：o ：1 2 5 m l 4 x t r i s c i i s d s ，p h 6 _ 8 和o 6 5 m l 聚丙烯酰胺母液，混合后加入o 0 2 5 m l1 0 过硫酸铵和0 0 0 5 m lt e m e d 。将配 好的积层胶溶液沿夹层中一片垫片的边缘加入于玻璃夹层中，直至离夹层的顶 部约l c m 高为止。将梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时再补加积层胶溶 液充盈剩余空间。让积层胶在室温下聚合3 0 4 5 r a i n 。在具螺口盖的微量离一t l , 管 中，用2 x s d s 加样缓冲液按l ：l ( v v ) 稀释待测蛋白质样品。于1 0 0 煮沸3 - 5 m i n 。 用同样的缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。小心地拔出梳子，避免撕裂聚 丙烯酰胺凝胶的加样孔。将玻璃平板安装在电泳装置上，倒入l s d s 电泳电极 缓冲液，使之淹没凝胶的加样孔。微量注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加 入到样品孔中，对照孔中加入蛋白质分子量标准样品，若有空置的加样孔、须加等 体积的空白1 s d s 样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。连接电源，先在 1 0 m a 恒流下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电流调至1 5 m a 至 溴酚蓝到达凝胶底部为止。关闭电源并撤去导线，弃去电极缓冲液。在不损坏 凝胶的基础上，将凝胶剥离出来并切去凝胶的一角做上标记。接着就可以进行 蛋白质的检测。 2 5 1 5s d s 聚丙烯酰胺凝胶的银染 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后，用至少5 倍于凝胶体积的银染固定液固 定蛋白质，其间应于室温平缓摇动4 - 1 2 h 。废弃固定液，加入不少于5 倍凝胶 体积缦泡液，室温平缓摇动3 0 m i n 。重复步骤2 。废弃乙醇液，加入l o 倍凝胶 体积的去离子水，于室温平缓摇动1 0 r a i n 。重复步骤4 两次。废弃最后一批洗 涤用水。戴上手套，加入5 倍凝胶体积银染溶液( o 1 硝酸银) ，于室温缓缓 摇动温育3 0 m i n 。废弃银染溶液，用去离子水多次流动冲洗凝胶两面( 每次 2 0 s e e ) 。加入5 倍凝胶体积的新鲜配置的显色溶液( 2 5 碳酸钠、o 0 2 甲醛) ， 四川大学硕士毕业论文 于室温缓缓摇动进行温育。仔细观察凝胶，数分钟内可以呈现蛋白染色带， 继续温育直至达到所需对比度。用1 乙酸洗涤凝胶数分钟以终止显色反应， 然后用去离子水洗涤凝胶数次( 每次1 0 m i n ) 。 2 5 1 6 表达产物活眭检测 将1 8 c 过夜表达产物与2 个对照空载体诱导以及表达质粒未诱导的 培养液分别滴入含3 种抗生素( 1 0 0 p , g m l 氨苄青霉素，1 7 肛g m l 氯霉素， 1 0 1 t g m l 卡那霉素) 的牛奶平板的小孔内，2 5 。c 静置2 4 h 。将含有载体片段的 大肠杆菌和含空载体的大肠杆菌接种在同一个含o 3 m m o l li p t g 的氨苄青霉 素平板上，在1 8 。c 、2 5 或3 7 培养4 8 h 。 四川大学硕士毕业论文 3 结果 3 1 非纯培养物蛋白酶d n a 克隆和表达的策略 从非纯培养物